Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фармакогностическое изучение и стандартизация листа малины (Rubus ideus L.) и сухого экстракта

На правах рукописи

Казначеева Елена Вячеславовна

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ЛИСТА МАЛИНЫ (ливт ЮЕНЬ Ь.) И СУХОГО ЭКСТРАКТА

14.04.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Москва 2011 г

Диссертационная работа выполнена в ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений» Российской Академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВИЛАР РАСХН)

Научный руководитель:

Доктор фармацевтических наук

Давыдова Валентина Николаевна

Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук

Лякина Марина Николаевна

Кандидат фармацевтических наук

Семкина Ольга Александровна

Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет Росздрава»

Диссертационного совета Д 006.070.01 при ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений» (ГНУ ВИЛАР РАСХН 117216, г. Москва, ул. Грина, 7) по адресу: 123056, г. Москва, ул. Красина, 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВИЛАР РАСХН по адресу: 117216, г. Москва, ул. Грина, 7

Автореферат разослан «_»_20 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

Защита состоится «_»

20 г. в 14 часов на заседании

Д 006.070.01,

доктор фармацевтических наук

Громакова Алла Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Острые респираторные и вирусные инфекции - наиболее часто встречающаяся проблема в жизни современного человека, т.к. это самые распространенные заболевания, наносящие огромный урон здоровью населения и экономике страны. С особой частотой они поражают детей и лиц старшего возраста. Эти инфекции способствуют формированию хронических заболеваний дыхательных путей, являясь одной из причин возникновения пневмонии, отягощают течение других хронических заболеваний, способствуя их неблагоприятному исходу.

Для лечения такого рода заболеваний, актуальной является разработка лекарственных препаратов на основе лекарственного растительного сырья, которые выгодно отличаются от синтетических аналогов широким спектром терапевтического действия, малой токсичностью и связанной с этим возможностью длительного применения. Весьма эффективными при профилактическом и терапевтическом использовании являются многокомпонентные препараты, содержащие биологически активные вещества, относящиеся к различным классам химических соединений, оказывающих комплексное воздействие на основные звенья патогенетического процесса. Комплексное лечение химиотерапевтическими средствами и растительными препаратами повышает эффективность лечения и снижает проявление побочных эффектов. Применение растительных средств также возможно в педиатрии и геронтологии, они безопасны при длительном применении.

На основании вышеизложенного, а также учитывая ограниченность ассортимента подобных препаратов в Государственном Реестре лекарственных средств, можно считать целесообразным и своевременным разработку нового лекарственного средства растительного происхождения, рекомендуемого для использования при указанных заболеваниях.

Листья малины (КиЬш /с/аеш Ь.) издавна используют в народной медицине разных стран. Согласно данным литературных источников, листья малины имеют богатый химический состав, что делает их ценным источником БАВ. Наибольшее значение имеют фенольные соединения, в том числе дубильные вещества и флавоноиды, обладающие противовоспалительным действием. Кроме того листья малины содержат сахара, органические кислоты, витамины.

Отвары и настои из листьев малины широко применяются при лечении бронхитов, ларингитов, при кашле. В связи с несовершенством лекарственной формы в форме настоя и сложностью дозирования и хранения, целесообразна разработка технологии получения малины листьев экстракта сухого.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы является фармакогностическое изучение малины листьев, разработка технологии получения сухого экстракта из листьев малины изучение его химического состава и внедрение современных

Г&Г\

1 2012 —

методик стандартизации качества растительного сырья и экстракта. Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Изучить морфолого-анатомические признаки целых листьев малины и измельченного сырья и выявить диагностически значимые.

2. Исследовать химический состав малины листьев и сухого экстракта на его основе.

3. Оценить влияние различных факторов на процесс экстракции и определить оптимальные параметры экстракции.

4. Разработать технологию получения экстракта сухого из листьев малины.

5. Разработать методику количественного определения суммы флавоноидов в растительном сырье и экстракте сухом листа малины.

6. Разработать и оформить проект ТУ на малины листья, лабораторный регламент (ЛР) на технологию получения экстракта сухого малины листьев, проект нормативного документа на экстракт малины листьев фармакопейную статью (ФС).

Новизна работы

1. На основании макро- и микроскопического анализа выявлены диагностические признаки в анатомическом строении целых и измельченных малины листьев, подтвержденные оригинальными микрофотографиями.

2. Проведено химическое изучение биологически активных веществ (БАВ) в малины листьях и сухом экстракте с помощью физико-химических методов: хроматография в тонком слое сорбента (ТСХ), высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), спектрофотомертрия, ЯМР.

3. Изучен качественный и количественный состав фенольных соединений в экстракте малины листьев сухом.

4. Разработаны технологические параметры способа получения сухого экстракта из растительного сырья, что подтверждено последующей количественной оценкой содержания БАВ в сухом экстракте с учетом данных изучения параметров экстракции (степень измельчения, тип экстрагента, соотношение сырьё - экстрагент, температурный режим).

5. Впервые предложена методика сквозной стандартизации растительного сырья и экстракта сухого малины листьев.

6. Впервые разработана НД на малины листья и малины листьев экстракт сухой.

Практическая значимость работы.

На основании проведенных исследований разработаны:

- Проект ТУ «Малины листья»

- Проект ФС «Малины листьев экстракт сухой»

-Лабораторный регламент ЛР 33150849-43-2011 на производство экстракта из листа малины.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Результаты фармакогностического исследования цельных и измельченных малины листьев.

2. Результаты фитохимического изучения состава БАВ малины листьев и малины листьев экстракта сухого.

3. Результаты разработки технологии получения малины листьев экстракта сухого.

4. Результаты разработки методик стандартизации и контроля

качества малины листьев и получаемого из него экстракта.

Апробация работы

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ в научных журналах и сборниках международных конференций.

Объём и структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на 124 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы (глава 1), четырех глав экспериментальной части, выводов, списка литературы, включающего в себя 126 источников, в том числе 20 иностранных, 3 приложений. Работа содержит 32 рисунка и 33 таблицы.

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, представлены научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе на основании данных литературы описаны этиология и патогенез простудных заболеваний, приведены сведения о наиболее часто применяемых методах лечения, проанализирован фармацевтический рынок противопростудных средств. Приведены данные о распространенности в природе малины, применении в медицине, химическом составе плодов и листьев малины, методах обнаружения и количественного определения БАВ, преимуществе использования сухих экстрактов для производства лекарственных препаратов.

Вторая глава посвящена изученю морфолого-анатомических признаков целого и измельченного сырья малины листьев, выявлены наиболее значимые диагностические признаки. С целью определения критериев подлинности растительного сырья проведено исследование анатомо-диагностических признаков и предложены качественные реакции для обнаружения основных групп БАВ. Разработана методика стандартизации растительного сырья по сумме флавоноидов спектрофотометрическим методом.

В третьей главе освещены вопросы химического изучения сухого экстракта. Приведено его качественное исследование, результаты количественного изучения различных групп БАВ: фенольных соединений, в том числе флавоноидов, дубильных веществ, а также органических кислот, методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Разработана методика количественного определения суммы флавоноидов

спектрофотометрическим методом.

В четвертой главе изложены данные по разработке технологии получения сухого экстракта. Проведен подбор оптимальных условий экстракции БАВ, описана технологическая схема получения экстракта сухого из листьев малины.

Пятая глава посвящена разработке проектов нормативной документации па растительное сырье и сухой экстракт на основании проведенных исследований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

Объектами исследования служили образцы опытных партий: целые и измельченные листья малины обыкновенной собранные в Тульской и Московской области.

Отбор проб лекарственного растительного сырья (JIPC) и их анализ проводили по методикам ГФ XI и разработанными нами методами качественного и количественного определения БАВ.

Макроскопический анализ проводили на бинокулярной лупе МБС - 1 при увеличении х 2; х 4.

Микроскопический анализ цельного и измельченного сырья проводили согласно статье «Техника микроскопического и микрохимического исследования лекарственного растительного сырья» ГФ XI изд., вып. 1., с. 277-285, на микроскопе МБИ - 3 при увеличении х 105; х 140; х 200; х 210; х 225; х 300; и х 450. Результаты фиксировали в виде фотографий. Для экстракции БАВ и приготовления хроматографических систем использовали растворители марки «ч» и «хч». Приготовление реактивов, используемых в экспериментальной части работы осуществляли согласно ГФ XII вып. 1 и 2. Концентрирование извлечений и отгонку растворителей осуществляли в вакуум-выпарном ротационном испарителе марки ИР-12.

Для выделения индивидуальных соединений использовали метод хроматографии на колонках с силикагелем Chemapol 40/100 ц (ЧССР). Для хроматографического контроля на этапах предварительной оценки элюатов и чистоты полученных веществ применяли метод хроматографии в тонком слое сорбента на пластинках «Silufol UV 254» размером 15x15 и пластинках «Sorbfil ПТСХ-ПА» размером 10x10 см. Хроматографирование выполняли при температуре (19-23) "С в герметически закрытых вертикальных стеклянных камерах. Нанесение исследуемых растворов на хроматографические пластинки осуществляли при помощи микро шприца фирмы Hamilton (10 мкл).

Для тонкослойной хроматографии использовали следующие системы растворителей:

Хлороформ-метанол (8:2)

Хлороформ-метанол-вода (61:32:7)

Этилацетат-ацетон-вода (5:4:1)

Обнаружение зон адсорбции фенольных соединений производили после высушивания хроматограмм и обработки 1 % спиртовым раствором железа окисного хлорида, при необходимости с последующим нагреванием до 70- 100й С.

Соотношение растворителей учитывали в объемных частях. Все значения Rr обнаруженных соединений рассчитаны как средние из пяти измерений.

При разработке методик качественного и количественного определения биологически активных веществ использован стандартный образец рутина фирмы «Sigma», кат. № С1251.

Спектры поглощения снимали на спектрофотометре UNICA 3810 (США) в кюветах с толщиной поглощающего слоя 1 см.

Исследование методом высокоэффективной жидкостной хроматографии осуществляли на ВЭЖХ хроматографе высокого давления фирмы «Waters» с УФ детектором. Колонка из нержавеющей стали, заполненная сорбентом: кромасил С18 (250x46 мм) с размером частиц 7 мкм. Подвижная фаза (ПФ): ацетонитрил - 1% кислота уксусная (7:18). Скорость потока подвижной фазы 1,0 мл/мин. Длина волны 254 нм. Для качественного определения БАВ методом ВЭЖХ были использованы достоверные образцы и стандартные образцы: рутин, галловая кислота - Fluka, кат. №48630, эллаговая кислота, салициловая кислота, кофейная кислота, кверцетин, гиперозид.

'Н-ЯМР-спектр метанольных растворов веществ снимали на приборе Gemini 200 Varían с рабочей частотой 200 МГц с использованием в качестве внутреннего стандарта тетраметилсилан фирмы «Merck».

Определение макро- и микроэлементного состава, включая микроэлементы проводили на спектрографе ДФС-8 с плоской дифракционной решеткой методом эмиссионного спектрального анализа.

Разработанные для количественного определения методики УФ-спектрофотометрии были подвергнуты валидации. Было проведено экспериментально обоснованное доказательство их пригодности для получения результатов, имеющих достаточную точность, прецизионность (воспроизводимость), линейность и специфичность в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 и проектом ОФС «Валидация фармакопейных методов». Статистическая обработка результатов количественного определения проводилась в соответствии с требованиями ГФ XI изд. вып. 1, с. 199 - 207.

2. Фармакогностическое изучение сырья листья малины обыкновенной и разработка методов контроля его качества

Сырье листья малины обыкновенной, используемое в народной медицине и для производства БАД, до сих пор системному фармакогностическому изучению не подвергалось.

На основании изучения морфологических характеристик сырья 5 опытных партий составлено описание внешних признаков сырья листья малины обыкновенной.

Проведенный анализ позволил выявить следующие диагностические признаки: сухое цельное лекарственное растительное сырье представляет собой листья, непарноперистосложные с 3 или 5 короткочерешковыми сидячими листочками. Прилистники нитевидные. Жилкование перистое, край неравнопильчатый. Форма листочков - яйцевидная, заостренная. Верхняя сторона гладкая, нижняя войлочно опушена, черешки покрыты редкими

мелкими шипиками. Цвет листьев с верхней стороны - темно-зеленый, с нижней - серо-белый; цвет черешков - светло-зеленый, красновато-фиолетовый. На верхней стороне цельного листа видны сетчато расположенные жилки. На каждом зубчике края листа располагается большое количество крупных волосков, направленных к верхушке зубчика. Каждый зубчик имеет пигментированную красно-коричневую верхушку своеобразной сосочковидной формы. Крупные волоски расположены вдоль крупных жилок на поверхности листа. Черешок покрыт мелкими волосками. На нижней стороне цельного листа видно войлочное опушение. Особо крупные волоски располагаются по крупным жилкам. При рассмотрении под бинокулярной лупой измельченного сырья также видны сетчато расположенные мелкие светло-зеленые жилки, крупные волоски, расположенные по жилке и на зубчиках. Последние также имеют пигментированную верхушку. Нижняя сторона войлочно опушена, имеются крупные волоски по жилке.

При микроскопическом исследовании для тонких листьев готовят препарат листа с поверхности, выявляя диагностические признаки в анатомическом строении листа. При рассмотрении листа с поверхности видны с верхней стороны многоугольные полигональные клетки эпидермиса с прямыми, слабоизвилистыми и извилистыми стенками, длиной 20 - 62 мкм, шириной 8-33 мкм; с нижней стороны - клетки со слабоизвилистыми, извилистыми стенками. Клетки эпидермиса вдоль жилок вытянуты прямоугольной, веретеновидной и комбинированной формы. Видны простые волоски, устьица. Кутикула с обеих сторон листа ровная. Устьица аномоцитного типа обильно расположены с нижней стороны листа (длиной 75 - 92 мкм, шириной 8-21 мкм; на зубчиках листа устьица более крупные - гидотоды. Волоски двух типов: простые и головчатые. Простые волоски одноклеточные двух типов: 1) Тонкостенные нитевидные, сильно извивающиеся и переплетающиеся между собой, образующие войлокоподобный слой (длиной до 1150 мкм); 2) Толстостенные одиночные, почти прямые (длиной до 500 мкм). Нередко у основания волосков образуется розетка из клеток эпидермиса. С верхней стороны листа волоски встречаются очень редко (0 - 13 на 1 мм"), толстостенные волоски почти не обнаруживаются, только ближе к краю пластинки листа и по краю, где они прижаты по направлению к вершине зубчика листа. Нижняя сторона листа обильно опушена простыми волосками обоих типов, причем опушенность листа увеличивается от вершины к его основанию. Головчатые волоски редко встречаются с верхней стороны листа, в основном по жилкам (длиной 20 - 65 мкм). Они имеют многоклеточную ножку (длиной 37 - 42 мкм) и многоклеточную головку (длиной 37 - 50 мкм, шириной 29 - 42 мкм). В мезофилле содержатся идиобласты с крупными друзами оксалата кальция (диаметром 2-25 мкм). Мезофилл состоит из одного-двух рядов палисадной паренхимы и трех-семи рядов губчатой паренхимы, состоящей из клеток округлой формы. Жилка представлена закрытым коллатеральным пучком. Под эпидермисом с нижней стороны располагается 1 - 3 ряда пластинчатой

колленхимы. В паренхиме жилки встречаются друзы оксалата кальция. Эпидермис черешка представлен вытянутыми по длине черешка клетками многоугольной (ближе к основанию листа), прямоугольной, веретеновидной и комбинированной формы с ровными или слабо извилистыми четко видно утолщенными стенками. Кутикула ровная. В паренхиме содержатся идиобласты с крупными друзами оксалата кальция. На эпидермисе черешка встречаются железки и простые волоски такие же, как на листе. Кроме того, на поверхности черешка встречаются простые волоски с многоклеточным основанием, которые чаще обламываются, оставляя на поверхности черешка многоклеточные основания. На поперечном срезе черешка видены закрытые сосудисто-волокнистые проводящие пучки. Со стороны флоэмы в виде колпачков расположена склеренхима, в которой встречаются друзы оксалата кальция. Друзы также наблюдаются в паренхиме черешка. Под эпидермисом располагается 2-7 рядов пластинчатой колленхимы. Сердцевина черешка заполнена паренхимой. Измельченные листья и черешки могут иметь один какой-либо признак или комбинацию признаков (устьица, волоски, друзы). Рисунок 1.

Рисунок 1.

1. Малины листья. Верхний эпидермис. Многоугольные полигональные клетки с прямыми стенками. Просвечивающие друзы. 2. Нижний эпидермис. Простые тонкостенные волоски, места их прикрепления, устьица. 3. Простые тонкостенные, сильно извивающиеся волоски, переплетающиеся между собой, образующие войлокоподобный слой. 4. Головчатые волоски. 5. Вид с поверхности. Верхний эпидермис снят, видны друзы оксалата кальция в мезофилле. 6. Малины листья. Поперечный срез через главную жилку. Пластинчатая колленхима под эпидермисом. 7. . Малины лист. Эпидермис черешка с устьицем. 8. Малины лист. Поперечный срез черешка с сосудисто-волокнистыми пучками.

Изучение химического состава, установление подлинности и разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в сырье

На основании данных литературы и экспериментальных данных для установления подлинности растительного сырья (PC) малины листья нами предложено использовать качественные реакции на обнаружение в сырье основных групп БАВ: дубильные вещества (с раствором железа окисного хлорида) и флавоноиды (с раствором алюминия хлорида в кислой среде). Объектом исследования были три типа извлечений из листьев малины, полученных водой, 20 % этанолом и 40 % этанолом. Для анализа фенольных соединений использовали высоко эффективную жидкостную хроматографическую систему (ВЭЖХ) с диодным детектором (ДД), а также ВЭЖХ систему с масе-спектрометрическим детектором.

Изучение состава и УФ спектров фенольных соединений экстракта из листьев малины проводили с помощью La Chrom Merck-Hitachi системы для ВЭЖХ с диодным детектором (ДД) для регистрации спектров разделяемых соединений в области 190 - 700 нм. Для разделения фенольных соединений использовали колонку XBridge (С 18, 100 х 2.1 mm i.d., 3.5 |im,Waters, Ireland). При элюции фенольных соединений использовали градиент двух растворов: (А) 0.2 % водный раствор муравьиной кислоты; (Б) 0.2 % раствор муравьиной кислоты в ацетонитриле. Профиль элюции: 0-5 мин, 2 % Б в А; 5 - 50 мин, 2 - 30 % Б в А (линейный градиент); 50 - 70 мин, 30 - 70 % Б в А (линейный градиент); 70 - 80 мин, 70 % Б. Скорость элюции - 0.3 мл в мин;

детектирование при 280, 315 и 345 нм. УФ спектры (230 - 400 нм) регистрировались автоматически на вершине каждого пика. Объем хроматографируемого образца - 10 мл.

Для масс-спектрометрической идентификации фенольных соединений использовали ВЭЖХ систему Agilent 1200 с BRUKER micrOTOF-Q-MS детектором. Хроматографические условия аналогичны системе La Chrom Merck-Hitachi. Объем хроматографируемого образца - 10 мл. MC условия: электроионизация в распыленном состоянии (ESI), регистрация отрицательных ионов в области 50 - 2000 m/z, напряжение на игле 4000 V, температура азота 200 °С, скорость потока газа 8.0 л/мин.

Сравнительное изучение трех извлечений из сырья с помощью ВЭЖХ показало, что извлечение, полученное с помощью 20 % этанола характеризуется лучшим разделением фенольных соединений (Рисунок 2). Повышение концентрации этанола до 40% отрицательно влияет на эффективность разделения фенольных соединений на колонке, а использование воды, как экстрагента, увеличивает в извлечении количество сопутствующих полярных метаболитов.

А 1 L - А

1 Б

¡.. .->-.. ■ V«» ? U.J . «А,«..!,. . „.NUI.

в [ ___ Д| 1

U«\W« I'

Рисунок 2 Состав фенольных соединений в извлечениях из сырья малины листья, полученных с использованием воды (А), 20 % этанола (Б) и 40 % этанола (В). ВЭЖХ - ДД анализ, детектирование при 280 нм.

В извлечениях из сырья обнаружено 4 основных пика фенольных соединений и 5 пиков фенолов, присутствующих в относительно низких количествах. Рисунок 3.

Рисунок 3 Состав фенольных соединений в извлечении из сырья малины листья, полученном 20 % этанолом. ВЭЖХ - ДД анализ, детектирование при 280 мм

Регистрация УФ спектров разделяемых фенольных соединений с помощью диодного детектора позволяет достаточно точно определить их принадлежность к определенному классу фенолов: оксибенэойные кислоты и их производные, оксикоричные кислоты и их производные, или флавоноиды.

Количественное содержание фенольных соединений в извлечениях из сырья малины листья, полученных водой, 20 % этанолом и 40 % этанолом в мг на 100 мг сухого извлечения представлены в таблице 1, где: Мал 1 - водное извлечение, Мал 2 - извлечение 20 % этанолом, Мал 3 - извлечение 40 % этанолом.

Таблица 1

Количественное содержание фенольных соединений

1омер Название Время мин. Детектировани е нм. Мал1 | Мал2 | МалЗ

Содержание: иг на 100 мг сухого экстракта

Ф1 Неохлорогеновая кислота 14.05 315 0.61 0.44 0.29

Ф2 Педункулагин-димер, изомер 1 18.10 222 0.28 0.02 0.02

Ф4 Педункулагин-димер, изомер 2 24.83 222 0.13 0.07 0.06

Ф5 Педункулагин-димер, изомер 3 26.97 222 0.41 0.63 0.46

Фба Эллаговая кислота 27.85 222 0.74 0.75 1.14

Ф7 Ламбертианин «А» 28.62 222 0.45 0.49 0.63

Ф8 Кверцетин-3-глюку роноп иранозид 29.84 345 3.87 3.46 4.45

Ф9 Кемпферол-3-глюкуронопиранозид 33.32 345 0.34 0.30 0.40

Общее содержание 6.85 6.17 7.45

В результате ВЭЖХ анализа установлено, что в извлечении из сырья малины листья общее содержание фенольных соединений составляет 6 - 7 % (таблица 1). При этом около 60 - 65 % фенольных соединений приходится на долю флавоноидов.

Для количественного определения суммы флавоноидов в сырье малины листья был применен спектрофотометрический метод. За основу была взята методика количественного определения суммы флавоноидов в траве зверобоя (ГФ XI). С целью разработки методики количественного определения содержания суммы флавоноидов в сырье малины листья, проведены экспериментальные исследования. Был применен спектрофотометрический метод после проведения реакции комплексообразования с алюминия хлоридом, который вызывает батохромный сдвиг полосы поглощения фенольных соединений с 330 - 350 нм до 380 - 410 нм. Это позволяет применить в качестве контроля испытуемый раствор без реактива и тем самым . исключить влияние окрашенных сопутствующих веществ, а, следовательно, исключить стадию очистки вытяжки от экстрактивных веществ. Для получения более воспроизводимых результатов, реакцию комплексообразования вели в кислой среде.

В ходе исследований были подобраны оптимальные условия экстракции: экстрагентом является 50 % этиловый спирт, соотношение сырье - экстрагент 1:30, при нагревании при температуре 50 °С в течении 30 минут на водяной бане с обратным холодильником.

В качестве стандартного вещества был выбран рутин, дифференциальный спектр поглощения которого с алюминием хлоридом в предлагаемых условиях совпадает с дифференциальным спектром поглощения флавоноидов листьев малины. Рисунок 4

Рисунок 4. Спектр поглощения спиртового извлечения из листьев малины после реакции с алюминия хлоридом (1), спектр поглощения СО рутина после реакции с алюминия хлоридом (2).

Расчет содержания суммы флавоноидов в пересчете на рутин осуществляли с использованием удельного показателя поглощения, значение которого установлено экспериментально на стандартном образце рутина.

Метрологические характеристики разработанной методики свидетельствуют об сс удовлетворительной воспроизводимости. Таблица 2.

Таблица 2

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин листе малины сухом.

Г Ях ОЛСр р,% 1(Р,0 Дх Е%

4 0,876 0,0063 95 2,78 0,008 0,42

Из таблицы 2 видно, что ошибка единичного определения составляет 0,42%.

Отсутствие систематической ошибки доказали проведением опытов с использованием метода добавок рутина. Результаты анализа представлены в таблице 3.

Таблица 3

Результаты количественного определения суммы флавоноидов с использованием метода добавок.

№ образц а Найдено флавоно идов г/100г Введено рутина г Должно быть в сумме флавонои дов и рутина г/100 г Найдено в сумме флавонои дов и рутина г/100 г Абсол ютная ошибк а Относи тельна я ошибк а

1 1,877 0,38 2,257 2,317 +0,060 +2,59

2 1,881 0,85 2,731 2,656 -0,075 -2,82

3 1,867 0,90 2,767 2,691 -0,076 -2,82

4 1,882 0,55 2,432 2,362 -0,070 -2,96

5 1,872 0,30 2,172 2,178 +0,006 +0,28

На основании полученных данных установили пределы содержания суммы флавоноидов в пересчете на рутин не менее 1,8 %.

Разработка нормативной документации на сырье малины листья На основании проведенных исследований оформлены и утверждены технические условия ТУ на новый вид лекарственного сырья «Малины листья». В данном нормативном документе установлены следующие показатели: содержание флавоноидов в пересчете на рутин не менее 1,8%, влажность не более 7%; содержание золы общей не более 8%; содержание золы, нерастворимой в 10% растворе кислоты хлористоводородной не более 1%; содержание других частей растения не более 5 %, содержание частиц, не проходящих через сито с отверстиями 7 мм не более 10%, содержание

пожелтевших, почерневших и побуревших листьев не более 1 % и содержание минеральной примеси не более 1 %. Установлен срок годности -2 года.

3. Химическое изучение малины листьев экстракта сухого Получение сухих экстрактов является одним из наиболее рациональных способов переработки лекарственного растительного сырья (ЛРС), позволяющем сохранить в сухом экстракте весь комплекс биологически активных элементов. Для изучения качественного и количественного состава БАВ был использован водный экстракт из малины листьев.

На основании проведенных исследований, было установлено наличие в листьях малины БАВ фенольного происхождения, которые обусловливают его биологическую активность. Идентификацию веществ осуществляли с помощью качественных реакций, тонкослойной хроматографии, УФ-спектрофотометрии, данных 'Н-ЯМР - спектров. Для разделения веществ использовали колоночную хроматографию, метод ВЭЖХ.

Малины листьев экстракт сухой представляет собой порошок от светло-коричневого до темно-коричневого цвета, со специфическим приятным запахом, вяжущим вкусом, гигроскопичный.

Были проведены качественные реакции: на наличие дубильных веществ с раствором железа окисного хлорида, наблюдали появление фиолетово-черного окрашивания раствора; на наличие флавоноидов с 5% раствором алюминия хлорида в кислой среде. Наблюдали появление желтого окрашивания, характерного при наличии флавоноидов.

При нанесении суммарного экстракта на линию старта хроматографической пластинки «Силуфол» и ряда свидетелей: кислота галловая, кислота кофейная, кислота эллаговая, кверцетин, гиперозид; наблюдали наличие характерных пятен, схожих по цвету и местоположению на пластинке, что говорит о присутствии веществ - свидетелей в экстракте. Рисунок 5.

Рисунок 5 ТСХ суммарного экстракта листа малины.

Яо- исследуемый образец кверцетин

- галловая кислота Яз- кофейная кислота

1^4 - салициловая кислота 115- гиперозид

Методом колоночной хроматографии были выделены: кверцетин, гиперозид, кислота салициловая, кислота эллаговая, кислота кофейная, кислота галловая, подлинность которых, была подтверждена данными УФ-спектров и 'Н-ЯМР спектров путем сравнения с достоверными образцами (таблица 4).

Таблица 4

Данные УФ и 'Н-ЯМР спектров веществ, выделенных из малины листьев экстракта сухого.

Выделенное вещество 'Н-ЯМР УФ- спектр X шах, нм

Кофейная кислота 6,22 м. д., д., 15,9 Гц и 7,53 м. д., д, 15,9 Гц, -СН=СН-; 6,77 м. д., д., 8,2 Гц, Н-5; 6,94 м. д., дд., 8,2 Гц, 1,9 Гц, Н-6; 7,03 м. д., 1,9 Гц, Н-2 327

Галловая кислота 7,05 м. д., е., Н-2 и Н-6 273

Кверцетин 6,20 м.д., и 6,43 м. д., д., 2 Гц, Н-6 и Н-8; 6,88 м. д., д., 8,5 Гц, Н-5'; 7,63 м. д., дд., 8,5 Гц, 2,2 Гц, Н-6'; 7,74 м. д., д., 2,2 Гц, Н-2' 257,268

Гиперозид 6,22 м. д., 6,43 м. д., д., 2 Гц, Н-8 и Н-6; 6,83 м.д.,д., 8,5 Гц, Н-5; 7,70 м. д., дд., 8,4 Гц, 2,2 Гц, Н-6'; 7,55 м. д., д. 2,2 Гц,Н-2' 258, 266

Салициловая кислота 7,86 м. д., дц., 7,7 Гц, 1,4 Гц Н-6; 7,46 м. д., м„ 7,2 Гц, 1,7 Гц Н-4; 7,88 м. д., м., Н-3 и Н-5. 238, 307

Эллаговая кислота 7,55 м. д., д., Н-2 и Н-6 204, 255, 364

Для количественного определения выделенных веществ в малины листьев экстракте сухом использовали метод ВЖЭХ. В работе были использованы свидетели: кверцетин, гиперозид, кислота салициловая, кислота эллаговая, кислота кофейная, кислота галловая. Работа проводилась на ВЭЖХ хроматографе высокого давления фирмы «Waters» с УФ детектором. Колонка из нержавеющей стали, заполненная сорбентом: кромасил С18 с размером частиц 7 мкм. Подвижная фаза (ПФ): ацетонитрил - 1% кислота уксусная(7:18). Скорость потока подвижной фазы 1,0 мл/мин. Длина волны 254 пм. Рисунок 6

Рисунок 6. ВЭЖХ - хроматограмма флавоноидов и органических кислот

В результате анализа методом ВЭЖХ время выхода идентифицируемых соединений составило:

1. Галловая кислота - 2,5 минуты

2. Гиперозид - 4,5 минуты

3. Кофейная кислота - 14 минут

4. Салициловая кислота - 15,5 минут

5. Кверцетин-21 минуту

6. Эллаговая кислота - 27,5минут

Данные о количественном содержании индивидуальных выделенных веществ в малины листьев экстракте сухом приведены в таблице 5.

Таблица 5

Количественное содержание выделенных и идентифицированных соединений в малины листьев экстракте сухом

Серия кверцетин кислота салициловая гиперозид кислота эллаговая кислота галловая кислота кофейная

010908 0,024% 0,038% 0,6% 0,74% 0,052% 0,028%

020908 0,021% 0,037% 0,5% 0,75% 0,053% 0,030%

030908 0,022% 0,037% 0,5% 0,74% 0,052% 0,031%

040908 0,024% 0,036% 0,4% 0,76% 0,054% 0,028%

050908 0,022% 0,037% 0,5% 0,74% 0,052% 0,029%

Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин методом УФ-спектрофотометрии

Для стандартизации малины листьев экстракта сухого использовался спектрофотометрический метод после проведения реакции комплексообразования с алюминия хлоридом. В анализе использовался также раствор плацебо. За основу была взята разработанная нами методика определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин в растительном сырье малины листья. Рисунок 7.

Г)

Рисунок 7. УФ-спектр фенольных соединений малины листьев экстракта сухого, раствора рутина и раствора плацебо.

1. Раствор рутина СО с алюминием хлоридом,

2. Испытуемый раствор,

3. Растворитель (плацебо).

В качестве стандарта выбран раствор рутина стандартного образца, максимум поглощения спектра комплекса которого с алюминия хлоридом совпадает с таковым извлечением из малины листьев экстракта сухого.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин должно быть не менее 7,0 %.

Метрологические характеристики разработанной методики свидетельствуют об удовлетворительной ее воспроизводимости. (Таблица 6)

Таблица 6

Метрологические характеристики разработанной методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин

{ ХСр Эх.р Р,% «Р,0 Дх Е%

4 7,47 00147 95% 2,78 0,04 0,53

Для проверки отсутствия систематической ошибки методики были представлены эксперименты с добавками. (Таблица 7)

Таблица 7

Результаты опытов с добавками

Взято экстракта в г Добавлено рутина в г Должно быть в г Найдено в г Ошибка абсолютная в г Ошибка относитель ная %

0,0747 0,0186 0,0933 0,0924 - 0,0009 -0,01

0,0747 0,0372 0,1119 0,1125 +0,0006 + 0,006

0,0747 0,0558 0,1305 0,1317 +0,0012 + 0,01

0,0747 0,0747 0,1494 0,1483 -0,0011 - 0,008

Для того чтобы удостовериться, что разработанная методика правильна и воспроизводима, проведена валидация методики. По результатам валидации установлено, что данная методика является специфичной для определения содержания суммы флавоноидов в пересчете на рутин, характеризуется точностью, воспроизводимостью, линейной зависимостью.

4. Разработка технологии получения малины листьев экстракта сухого

При получении сухого экстракта основными факторами, влияющими на скорость и полноту извлечения биологически активных веществ, являются: тип экстрагента, соотношение фаз сырье - экстрагент, температура экстракции, степень измельчения, продолжительность и гидродинамические условия.

При выборе оптимальных условий экстракции использовался метод математического планирования эксперимента, позволяющий при минимальном количестве экспериментов в многофакторном процессе (каковым является процесс экстракции), получить статически обоснованное решение.

В качестве параметра оптимизации использовался выход экстрактивных веществ от содержания их в сырье, в качестве экстрагента использовалась вода.

Как известно, размер частиц сырья обуславливает полноту и скорость перехода экстрактивных веществ.

В результате экспериментальных исследований установлена закономерность полноты экстракции БАВ от степени измельчения листьев малины, она составляет 3-5 мм.

Результаты эксперимента по выбору соотношения фаз, кратности экстракции, продолжительности и температурном режиме приведены в таблице 8.

Таблица 8

План оптимизации экстракции и результаты эксперимента.

Уровни факторов Факторы Выход экстрактивных веществ в %

№ п/п Соотношение фаз Число экстракции Время экстракции в часах Температура °С

1 1:10 2 2 50 53

2 1:15 1 2 50 77

3 1:10 1 2 80 57

4 1:15 2 2 80 86

5 1:10 1 1 50 57

6 1:15 2 1 50 71

7 1:10 2 1 80 57

8 1:15 2 1 80 88

Согласно экспериментальным данным, при коэффициенте поглощения 3 и соотношении фаз1:10 выход экстрактивных веществ растет только при повышении температуры экстракции с 50 °С до 80 "С. При этом количество экстракций и время экстракции существенно не влияет на выход экстрактивных веществ. Увеличение соотношения сырье:экстрагент до 1:15 значительно увеличивает выход экстрактивных веществ. Увеличение температуры с 50 °С до 80 °С так же ведет к повышению эффективности экстракции. В свою очередь, количество экстракций и время экстракции не оказывают существенного влияния на выход экстрактивных веществ. Дополнительно были проведены эксперименты при соотношении фаз сырьс:экстрагент 1:20 и температуре 80 °С. В ходе экстракции выход экстрактивных веществ увеличился незначительно, однако, в этом случае имеет место дополнительное увеличение энергетических затрат по выпарке экстракта.

Как видно из результатов экспериментальных исследований, наиболее оптимальным режимом процесса экстракции является отношение фаз 1:15, количество экстракций - 2, время экстракции - 1 час, температура экстракции - 80 °С.

При предварительном фармакологическом исследовании экстракта малины листа сухого, полученного с использованием в качестве экстрагента воды очищенной, спирта этилового 20 % и спирта этилового 40 %, не было выявлено существенных различий. Поэтому выбор воды очищенной в качестве экстрагента представляется наиболее оптимальным.

Все подобранные параметры процесса экстракции были положены в основу проведения серии балансовых загрузок в лабораторных условиях. На основании данных по проведенным загрузкам оформлен и утвержден лабораторный регламент на производство малины листьев экстракта сухого ЛР 33150849-43-20011.

Технологическая схема получения малины листьев экстракта сухого включает в себя стадии экстракции, упаривания полученного извлечения, сушки и просеивания полученного экстракта.

Разработка показателей качества сухого экстракта

Готовый продукт - малины листьев экстракт сухой представляет собой аморфный порошок светло-коричневого до темно- коричневого цвета со специфическим запахом и вяжущим горьковатым вкусом. Установлен срок годности сухого экстракта - 2 года. На основании проведенных экспериментов разработан и оформлен проект фармакопейной статьи (ФС) «Малины листьев экстракт сухой». ФС включает в себя следующие разделы: описание подлинность, массовая доля влаги, тяжелые металлы, микробиологическая чистота, количественное содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин, упаковка, маркировка, срок годности.

Технологическая схема получения сухого экстракта.

СЫРЬК

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. На основании экспериментальных данных впервые установлены диагностические признаки целого и измельченного сырья малины обыкновенной листьев.

2. В листьях малины и в экстракте сухом из листьев малины с помощью методов ТСХ, и УФ-спектрофотометрии было установлено присутствие фенольных соединений. Методом колоночной хроматографии была разделена смесь БАВ и выделены фенолкарбоновые кислоты и флавоноиды, подлинность которых определили с помощью методов ТСХ, УФ-спекров,

'Н-ЯМР спектров путем сопоставления с достоверными образцами. Методом ВЭЖХ было определено количественное содержание выделенных БАВ в малины листьев экстракте сухом.

3. Разработана технология получения малины листьев экстракта сухого. Экспериментально обоснованные оптимальные условия экстрагирования сырья - малины листьев позволили получить готовый продукт со стабильными показателями качества.

4. Разработаны методики качественного и количественного определения БАВ в листьях малины и сухом экстракте.

Методом УФ-спектрофотометрии определили количественное содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин, которое в малины листьях составляет не менее 1,8 %, а в экстракте сухом малины листьев составляет не менее 7%.

Проведена валидация методики количественного определения суммы флавоноидов.

5. На основании проведения комплекса экспериментальных исследований разработана нормативная и технологическая документация на «Малины листья», ФС «Малины листьев экстракт сухой» и JIP на производство малины листьев экстракта сухого. Установлен срок годности сырья малины листья и малины листьев экстракт сухой - 2 года.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Казначеева Е.В., Давыдова В.Н. Современные аспекты технологии получения сухого экстракта листа малины. XVI Российский национальный конгресс "Человек и лекарство" Сборник материалов конгресса. Тезисы докладов Москва 6-10 апреля 2009 г. С. 669

2. Казначеева Е.В., Давыдова В.Н. Маркетинговые исследования рынка сиропов. XVI Российский национальный конгресс "Человек и лекарство" Сборник материалов конгресса. Тезисы докладов Москва 6-10 апреля 2009 г. С. 669

3. Казначеева Е.В., Савина A.A., Шейченко В.И., Сокольская Т.А., Давыдова В.Н. Изучение химического состава сухого экстракта листа малины. VII Международный симпозиум по фенольным соединениям: фундаментальные и прикладные аспекты. Материалы докладов - Москва: Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, 2009. - С. 324.

4. Е.В. Казначеева, Т.Б. Шемерянкина, A.A. Савина, Т.А. Сокольская, В.Н. Давыдова Фенольные соединения в составе сухого экстракта листа малины, их определение методом ВЭЖХ. Пятигорский государственный институт. Пятигорск 2009 г. С. 527

5. Казначеева Е.В., Савина A.A., Шемерянкина Т.Б., Сокольская Т.А., Давыдова В.Н. Лаская О.Ф. Изучение состава фенольных соединений в сухом экстракте листа малины. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2011 - № 3. - С. 3 - 4.

6. Казначеева Е.В., Давыдова В.Н., Сокольская Т.А., Самылина И.А. Разработка методов сквозной стандартизации количественного определения суммы флавоноидов в листе малины и в сухом экстракте листа малины. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2011.— №5.- С. 18-21.

?о

2010294988

2010294988