Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фармакогностическое изучение бурачника лекарственного Borago officinalis L.

ЛЯШЕНКО СВЕТЛАНА СЕРГЕЕВНА

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ БУРАЧНИКА ЛЕКАРСТВЕННОГО BORAGO OFFICINALIS L.

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

М-

1 2 МАЙ 2011

ПЯТИГОРСК 2011

4846241

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, профессор

Денисенко Олег Николаевич

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор

Степанова Элеонора Федоровна

кандидат фармацевтических наук Козлова Виктория Вячеславовна

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение

высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия Росздрава»

Защита состоится «26» мая 2011 года в 900 часов на заседании диссертационного совета Д.208.069.01. при ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава (357532, Ставропольский край, Пятигорск, пр. Калинина, 11).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Пятигорской ГФА Росздрава».

Автореферат разослан » ЛЛр^МЯ- 2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Е.В. Компанцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Для профилактики и лечения сердечно-сосудистых и ряда других заболеваний в настоящее время широко используются препараты полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК). Применение таких кислот началось в середине прошлого столетия. Одним из препаратов был витамин F, представляющий собой смесь эссенциальных жирных кислот. Основными источниками данных кислот являются липиды растений. Известно, что в растительных липидах синтезируются главным образом ПНЖК ряда Cis, среди которых высокой биологической активностью обладает гамма-линоленовая кислота (18:3, 6,9,12-октадекатриеновая кислота, ю-6 типа). В значимых количествах у-линоленовая кислота (ГЛК) содержится в жирных маслах семян растений смородина черная Ribes nigrum L., энотера двулетняя Oenothera biennis L., энотера Ламарка Oenothera lamarckiana Ser. и бурачник лекарственный Barago officinalis L. Наиболее богатым источником у-линоленовой кислоты являются семена бурачника лекарственного семейства бурачниковые Boraginaceae, которые накапливают до 40% жирного масла с содержанием у-линоленовой кислоты около 25%. Данный вид является однолетником, засухо- и морозоустойчивым, не требует особых условий возделывания. Масло из семян этого растения применяется в медицине и параф ар мани и, цветки и листья являются оффицинальными во многих странах. Бурачник лекарственный выращивается для получения жирного масла в Англии, США, Канаде, Китае и других странах. Однако при широком применении жирного масла, другие биологически активные соединения (БАС) растения практически не используются, поскольку изучены недостаточно. Но известно, что отходы после первичной переработки сырья могут служить источником получения новых лекарственных средств. Это дает возможность удешевить продукцию и делает производство более рентабельным.

В нашей стране бурачник лекарственный встречается во флоре средней полосы европейской части России и Кавказа и применяется только в народной медицине / при неврозах, бессоннице, депрессии, ревматизме, как отхаркивающее

противосудорожное средство, при кожных заболеваниях, нарушениях обмен веществ и диабете. Сведения о химическом составе бурачника лекарственного произрастающего на территории России, в научной литературе крайне ограничены не определены возможности интродукции, оптимальные сроки заготовки сырья диагностические признаки. Изучение этих вопросов позволит включить номенклатуру лекарственных растений новый вид сырья и расширить источни получения полиненасыщенных жирных кислот, в том числе ГЛК и других БАС Поэтому фармакогностическое исследование бурачника лекарственного являете актуальной задачей для фармацевтической науки и практики. Цель и задачи работы

Цель настоящей работы - интродукция бурачника лекарственного условиях Ставропольского края и экспериментальное обоснование его применени как сырьевого источника масла, содержащего ■у-линоленовую кислоту; проведени химических исследований шрота семян после извлечения масла и надземной час растения для изучения возможности комплексного использования сырья.

Для реализации поставленной цели необходимо решение следующих задач:

1. Провести исследования по интродукции бурачника лекарственного на баз ботанического сада Пятигорской ГФА;

2. Выделить и изучить различные классы липидов семян бурачник лекарственного;

3. Изучить возможность получения фракции жирных кислот, максимальн обогащенной ГЛК;

4. Изучить основные группы БАС шрота семян после извлечения масла;

5. Провести фотохимическое исследование надземной части растения;

6. Провести предварительные фармакологические исследования жирног масла и спиртового извлечения из шрота семян растения;

7. Провести морфолого-анатомические исследования с целью установлен диагностических признаков, а также определить товароведчески показатели сырья (надземной части и семян);

4

8. Разработать нормативную документацию на масло из семян и траву бурачника лекарственного.

Научная новизна полученных результатов

Проведены исследования по интродукции бурачника лекарственного в

условиях Ставропольского края: изучена всхожесть семян в лабораторных (99,5%) и полевых условиях (90%), особенности развития и урожайность бурачника лекарственного. Доказано, что семена и липиды семян интродуцированного и коммерчески доступного бурачника лекарственного практически идентичны. Впервые установлен состав БАС репродуктивных и вегетативных органов интродуцированного бурачника лекарственного. Разработана методика обогащения фракции жирных кислот у-линоленовой кислотой с помощью метода перекристаллизации комплексов включения жирных кислот с мочевиной, в результате которого получена фракция, содержащая до 64% ГЛК.

В траве и шроте семян бурачника лекарственного определено количественное содержание фенольных соединений, сапонинов, полисахаридов, алкалоидов, водорастворимых антиоксидантов, макро- и микроэлементов, аминокислот; в надземной части (траве) кроме того - аскорбиновой кислоты и пигментов. Выявлен компонентный состав фенольных соединений изучаемых видов сырья.

Проведено морфолого-анатомическое изучение надземной части и семян бурачника лекарственного, установлены их диагностические признаки и товароведческие показатели.

Установлено, что масло и спиртовое извлечение из шрота семян являются веществами 4 класса токсичности, т.е. малотоксичными и проявляют выраженное противовоспалительное действие. Масло семян бурачника лекарственного не оказывает местнораздражающего действия и обладает ранозаживляющей активностью.

Практическая значимость

В результате проведенных экспериментальных исследований химического состава липидов семян бурачника лекарственного доказана целесообразность его

применения как источника жирного масла с высоким содержанием у-линоленовой кислоты, обладающего ранозаживляющим и противовоспалительным действием. Изучение химического состава извлечений из надземной части и шрота семян растения свидетельствуют о перспективности их дальнейших фармакологических исследований с целью разработки лекарственных средств противовоспалительного и антидепрессантного действия.

Внедрение результатов исследования

Методики анализа масла семян бурачника лекарственного, включенные в проект ФСП «Масло бурачника для наружного применения», апробированы в ГУЗ «Республиканский центр контроля качества и сертификации лекарственных средств Министерства Здравоохранения РСО-Алания» (акт апробации от 04.03.2011г.). Метод получения фракции жирных кислот, обогащенной у-линоленовой кислотой, из жирного масла растительного происхождения апробирован научно-производственным объединением «Альпика» (г. Ставрополь) (акт о внедрении от 23.11.2010 г.). Материалы информационного письма «Получение фракции, обогащенной у-линоленовой кислотой, методом перекристаллизации комплексов включения жирных кислот с мочевиной» включены в лекционный курс и практические занятия кафедры органической химии ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава по курсу: «Липиды» (акт о внедрении от 25.02.2011г.). Разработана «Инструкция по сбору и сушке травы и семян бурачника лекарственного» (утверждена ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава 16.03.2011 г.). Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО Пятигорской государственной фармацевтической академии Росздрава (номер государственной регистрации 01200112164) и в свете реализации совместной с Уфимским Научным Центром РАН Программы по поиску источников у-линоленовой кислоты. Апробация полученных результатов

б

Основные положения диссертационной работы доложены на VII Всероссийской конференции с молодежной научной школой «Химия и медицина, 0рхимед-2009» в июле 2009 года (г. Уфа); Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы фармацевтической науки и практики» в октябре 2009 г. (г. Владикавказ); Международной научно-практической конференции «Молодые ученые в решении актуальных проблем науки» в мае 2010 г. (г. Владикавказ); 64-й международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Актуальные проблемы современной медицины» в ноябре 2010 г. (г. Киев, Украина); научных конференциях Пятигорской ГФА «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» в январе 2009, 2010 и 2011 г. (г. Пятигорск). По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, в т.ч. 3 - в журналах, рекомендованных ВАК. Положения, выносимые на защиту

1. Обоснование применения семян бурачника лекарственного в качестве сырья для получения жирного масла с высоким содержанием ГЛК,

2. Результаты изучения липидов семян бурачника лекарственного и получение фракции жирных кислот, обогащенной у-линоленовой кислотой.

3. Результаты фитохимического изучения шрота после извлечения жирного масла из семян и надземной части бурачника лекарственного.

4. Результаты интродукционных исследований бурачника лекарственного в условиях ботанического сада Пятигорской ГФА.

5. Результаты морфолого-анатомических исследований надземной части и семян бурачника лекарственного.

6. Результаты предварительных фармакологических исследований жирного масла и извлечения из шрота семян бурачника лекарственного.

Структура и объем диссертации

Работа изложена на 151 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, 4 глав собственных исследований, общих выводов, списка цитируемой литературы,

7

включающего 207 источников, из которых 112 иностранных авторов и приложени Диссертация иллюстрирована 18 рисунками и 55 таблицами.

Основное содержание работы

С целью выбора объекта исследования были проанализированы сведения

растениях отечественной флоры, отличающихся высоким содержанием ГЛК (вид

рода энотера, смородина и бурачник). Из них наибольший интерес у нас вызв

бурачник лекарственный (б. лекарственный) - Borago officinalis L., который и бь

выбран для изучения. Объектом исследования явились семена (коммерчес

доступные (I) и собранные с интродуцированных растений (П)), шрот семян и трав

образцы которой представляли собой надземную часть (30-40 см) растен

заготовленную в фазу созревания семян с. опытных делянок ботанического с

Пятигорской ГФА. Сбор гербария и образцов сырья б. лекарственного проводили

период с 2007 по 2010 гг.

- Изучение химического состава вегетативных и репродуктивных органа

бурачника лекарственного ; Изучение липияов семян бурачника лекарственного

Количественное содержание жирного' масла в семенах б. лекарственно

коммерчески доступных - 36,5±0,32% и. собранных с интродуцированных растени

39,1±0,44% при влажности 7,9±0,09%, и 8,0±0,08% соответственно, свидетельству

об их высокой масличности. ■

•Определение основных показателей выделенных масел (табл.1) показало,

образцы практически не отличаются друг от друга.

Таблица 1 - Основные показатели масел семян бурачника лекарственного коммерческих источников (I) и интродуцированных растений (II)

Образцы Плотность, г/см3 Показатель преломления Индекс охислепности Кислотное число, мг/КОН Содержание пигмента мг%

хлорофишгав каротиноид

I 0,9073-0,9186 1,473-1,479 0,69-0,72 0,7 8,8±0,07 7,7±0,

п 0,9050-0,9089 1,470-1,476 0,74-0,76 1,5 5,9±0,04 9,3 ±0,0

Для определения содержания ГЛК изучали состав жирных кислот масл выделенного разными способами (табл.2) методом ГЖХ на хроматографе «в

8

2014» (БЫшаёги), капиллярная колонка «Оте§а\уах 250» длиной 30,0 м, диаметром 0,25 мм, сорбент - полиэтиленгликоль, г колонки - 205°С, I испарителя - 250°С, t детектора - 260°С, газ-носитель - гелий, скорость подачи газа - ЗОмл/мин. Таблица 2 - Состав жирных кислот масел семян бурачника лекарственного из

коммерческих источников (I) и интродуцированных растений (II)

Жирные кислоты Способ получения масла

экстракция гексаном в аппарате Сокслета (36,5 и 39,1%)* Настаивание, (экстракция гексаном) (35,6 и 36,0%)* Настаивание, (экстракция хлористым метиленом)* (34,2%) экстракция хлористым метиленом в аппарате Сокслета* (35,4%) Холодное прессование (34,3%)*

(I) (II) (1) (И) (И)" (II)*** (II)

Лауриновая (12:0) 0.2 - - 0,1 0,5

Пальмитиновая (16:0) 10,9 10,5 11,1 10,7 10,2 10,4 10,0

Пальмитолеиновая (16: IX - 0,5 - 0,4 - 0,2 -

Стеариновая (18:0) 5,3 ' 5.4 5,3 5,5 4,2 4,9 3,2

Олеиновая (18:1) 19,9 20,1 20,6 20,5 22,9 21,9 20,0

Линолевая(18:2) 37,7 36,9 37,0 36,6 36,6 37,5 39,1

у-линолеиовая (у-18:3) 18,7 18,6 17,7 18,1 16,1 18,0 19,8

а-линоленовая (а-18:3) 0,3 0,2 од 0,2 - - - ■

Стеаридоновая (18:4) 0,4 0,7 1,3 0,6 - 0,1 0,9

Нонадеценовая (19:1) - 0,3 0,2 0,3 . . - - . 0,3

Арахиновая (20:0) 3,9 4,1 4,0 4,2 4,0 4,2 3,9

Эйкозеновая (20:1) 0,3 0,1 0,2 0,1 -

Бегеновая (22:0) Сл. 0,2 0,2 0,2 - - ' '

Докозеновая(22:1) 2,4' 2,4 2.3 2,6 ■ - 2,3-

11.% 203 20,2 20,6 20,6 24,4 22,3 17,6

2 2.% 79,7 79,8 79,4 79,4 75,6 77,7 82,4

Примечание:

1 * в скобках указан выход липидов

2** в составе ЖК присутствует 6% 17:0 кислоты,

3 *** в составе ЖК присутствует 2,7% 17:0 кислоты.

4 £ 1 - сумма насыщенных жирных кислот

5 2 2 ~ сумма ненасыщенных жирных кислот

Результаты исследования показали, что. наибольший выход липидов наблюдается при экстракции в аппарате Сокслета с использованием в качестве экстрагента гексана. При этом состав жирных кислот и количественное содержание ГЛК масел образцов I и II, полученных экстракцией в аппарате Сокслета и настаиванием, практически не отличались (18,7 и 18,6 % соответственно) (табл.2). Состав жирных кислот масел, выделенных гексаном различными способами, также существенно не отличался, но следует отметить, что в масле, полученном холодным прессованием, количество ненасыщенных жирных кислот (82,4%), в том числе и ГЛК (19,8%), было выше, чем в образцах, полученных другими методами. При

экстракции хлористым метиленом методом настаивания получили масло с наибольшим содержанием насыщенных жирных кислот (75,6%), в том числе гептадекановой кислоты (6%) при содержании ГЛК до 16,1%. Экстракция тем же растворителем в аппарате Сокслета была более эффективна в отношении ненасыщенных жирных кислот (77,7%) и ГЛК, содержание которой достигало 18%.

Таким образом, проведенные исследования показали, что наибольший выход жирного масла наблюдается при экстракции гексаном в аппарате Сокслета (39,1%), а наибольшее содержание ГЛК - в масле, полученном холодным прессованием (19,8%).

Для выделения нейтральных липидов (НЛ) измельченные воздушно-сухие

семена экстрагировали гексаном исчерпывающе методом настаивания при

комнатной температуре. Используя препаративную тонкослойную хроматографию

(ГГТСХ), НЛ, полученные из обоих образцов, разделили на составляющие классы

соединений (табл.3). Из шрота, оставшегося после отделения НЛ, смесью

хлороформ-метанол (2:1) выделили полярные липиды (ПЛ), которые методом ПТСХ

разделили на фосфолипиды (ФЛ) и гликолипиды (ГЛ) (табл.3).

Таблица 3 - Состав липидов семян бурачника лекарственного из коммерческих источников (I) и интродуцированных растений (II)

Классы липидов Содер I жание, % II.

Нейтральные липиды 1,60±0,03 1,80±0,05

Сложные эфиры тритерпеновых соединений (СЭТТС)

Триацилглицериды (ТАГ) 88,70±0,72 90,50±0,22

Свободные жирные кислоты + токоферолы (СЖК) 3,60±0,03 3,30±0,03

Диацилглицериды+ стерины (ДАТ) 3,50±0,05 3,80±0,06

Моноацилглицериды (МАГ) 2,60±0,03 0,60±0,009

Полярные липиды

Фосфолипиды (ФЛ) 0,03±0,001 0,02±0,0009

Гликолипиды (ГЛ) 0,49±0,01 . 0,25±0,009

По составу и содержанию отдельных классов НЛ образцов I и П были близки.

ГЛ в образце I содержалось больше, количество ФЛ в образцах практически не

отличалось. Методом ГЖХ в приведенных выше условиях определили состав

жирных кислот в классах НЛ и ПЛ (табл. 4).

ю

Таблица 4 - Состав жирных кислот ацилсодержащих фракций липидов семян бурачника лекарственного из коммерческих источников (I) и интродуцированных растений (II)

Жирные кислоты еэтте ТАГ СЖК ДАТ МАГ ГЛ ФЛ

I II I II I 11 I И I II I II I 11

12 0 4,6 1,4 - - 2,0 - 2,9 6,5 28,4 22,5 . - -

13 0 1,1 - - - - - 2,6 6,5 10,3 2,5 - 2,1 -

14 0 0,1 - - - 0,61 3,6 1,8 3,8 Сл. 6,4 5,0 0,4 -

14 1 - - - - - - - - - - 2,6 - - -

15 0 0,3 - - - 0,2 - - - - 7,1 - 3,2 -

16 0 10,6 21,2 10,9 10,3 28,0 21,0 15,8 13,2 15,6 13,2 33,9 18,1 33,4 26,2

16 1 1,7 1,4 - - 0,8 4,8 2,0 - 7,5 - 0,3 3,3 5,6

17 0 0,8 1,5 - - 0,4 - - - - - 2,4 - 2,4 -

18 0 2,5 5,8 5,5 5,3 11,1 8,1 4,8 12,0 7,3 5,7 8,0 10.0 11,0 15,7

18 1 6,6 28,3 19,9 21,4 28,4 27,6 15,0 16,2 10,4 14,6 13,0 20,0 9,8 16,7

18 2 67,4 18,9 37,7 36,8 21,8 26,1 37,2 26,0 18,7 19,6 15,1 31.0 26,9 26,4

у-18:3 4,0 1,7 18,9 17,8 3,0 2,5 15,0 10,2 5,6 7,7 2,6 11,9 3,8 7,2

И-1Е.З - 2,5 - - 0,8 - - - - - - 0,3 - -

18:4 0,2 3.9 0,4 Сл. 1.5 - - - - - - 1,4 - -

20:0 0,2 5,2 4,1 4,6 1,4 1,8 1,7 2,0 - - - 3,3 - 2,2

20:1 - - - 1,2 - - - 5,8 - - 7,8 - 4,1 -

22:0 0,2 - - - - 4,5 1,8 - - - - - - -

22:1 - - 2,6 2,6 - - 2,0 1,7 - - - 2,8 - -

23:0 2,7 - - - - - - - - - 0,5 - -

24 :0 - 5,5 - - - - - - - - - - - -

% 20,3 43,3 20,5 21,4 43,7 39,0 28,8 40,1 57,8 58,1 66,6 32,3 56,2 44,1

79,7 56,7 79,5 78,6 56,3 61,0 71,2 59,9 42,2 41,9 33,4 67,7 43,8 55,9

Примечание:

1 I) - суммарное содержание насыщенных жирных кислот 21,2 - суммарное содержание ненасыщенных жирных кислот

Общее содержание насыщенных и ненасыщенных жирных кислот (в т.ч. и ГЛК) обоих образцов в ТАГ и продуктах их метаболизма (СЖК, МАГ) практически не отличается. Основное количество ГЛК находится во фракции ТАГ, которая составляет от 88,7 до 90,5% в сумме нейтральных липидов.

Методом ТСХ и качественными реакциями в составе ГЛ идентифицировали моногапактозилдиглицериды, гликозиды стеринов, дигалактозилдиацилглицериды и сульфохиновозилдиацилглицериды; в составе ФЛ - М-метилфосфатидил-этаноламин, фосфатидилглицерин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилхолин, фосфатидилинозитол и фосфатидовую кислоту.

В неомыляемой фракции, количество которой составило 1,1% от массы масла,

методом хромато-масс-спектрометрии на квадрупольном жидкостном хромато-масс-

спектрометре ЬСМ8-2010 ЕУ (БЫтаски) идентифицировали 7 компонентов

циклических тритерпеновых спиртов, в том числе 4,4' - десметилстеролы: [5-

и

ситостерол, а-стерол, у-стерол, фукостерол, кампестерол; 4 — монометилстеролы: обтусифолиол и 4,4' - диметилстеролы: циклоартенол.

Известно, что к практически значимым БАС растительных масел, помимо •жирных кислот, относится также сквален, который влияет на метаболизм стероидов, проявляет антиоксидантную активность, выводит из организма липофильные ксенобиотики. Общеизвестна и ценность витамина Е. Количественное содержание сквалена в масле, установленное иодхлорметрическим методом, составило 0,06±0,001%, витамина Е, определенное методом ВЭЖХ на хроматографе «Милихром 4» с УФ - детекцией, - 13,56 мг/100 г, что сопоставимо с его содержанием в оливковом масле.

В промышленности для разделения жирных кислот по степени ненасыщенности широко используется метод перекристаллизации комплексов включения жирных кислот с мочевиной в различных растворителях, оптимальных для каждого объекта. Используя этот метод, мы изучили влияние спиртов метилового и этилового на обогащение фракции жирных кислот ГЛК, что позволило унифицировать известную методику (табл.5,6).

Таблица 5 - Жирнокислотный состав маточного раствора и кристаллов, полученных

при перекристаллизации с раствором мочевины в спирте этиловом

Жирные кислоты Исходное масло 1-ая кристаллизация 2-ая кристаллизация 3-я кристаллизация

маточник кристаллы маточник кристаллы маточник кристаллы

16:0 10,7 оа 15,1 1,1 4,1 1,2 5,9

16:1 0,4 5,0 - 31,7 1,2 9,7

18:0 5,5 - 7,8 - - -

18:1 20,5 1,4 26,0 2,2 11,8 2,7 6,5

18:2 36,6 28,5 37,8 28,6 34,1 31,5 39,2

18:3у 18,1 63,7 3,5 63,4 18,3 55,3 30,8

18:3« 0,2 - 4,7 - - -

18:4 0,6 0,3 0,3 - - - -

19:1 0,3 0,4 - - - - -

20:0 4,2 - 5,4 - - - -

20:1 0,1 - 0,7 - - - -

21:1 - 0,5 - - - - -

22:0 0,2 - 3,4 - - 7,9

22:1 2,6 - - - 871 -

£„% 20,6 0,2 31,7 1,1 4,1 1,2 13,8

79,4 99,8 68,3 98,9 95,9 98,8 86,2

Таблица 6 - Жирнокислотный состав фракций маточного раствора и кристаллов,

полученных при перекристаллизации с раствором мочевины в спирте метиловом

Жирные кислоты Исходное масло 1-ая кристаллизация 2-ая кристаллизация 3-я кристаллизация

маточник кристаллы маточник кристаллы маточник кристаллы

16:0 10,7 3,5 0,2 0,2 4,7 0,3 2,6

16:1 0,4 0,4 - 0,3 - 0,6 -

18:0 5,5 1,9 9,0 - 1,9 - 0,8

18:1 20,5 7,7 7,4 3,2 28,2 1,7 8,3

18:2 36,6 32,1 40,3 48,4 57,7 39,8 73,7

18:3у 18,1 51,7 21,5 44,2 1,9 55,0 10,6

18:3а 0,2 _0,2 0,3 - 0,7 0,4

18:4 0,6 1,0 1.1 1,5 - 0,2 -

19:0 - - 1,7 - - - -

19:1 0,3 0,9 0,3 1,1 1,5 0,4 -

20:0 4,2 0,1 10,5 0,3 3,1 1,3 0,7

20:1 0,1 - - - - - 2,7

22:0 0,2 0,5 8,0 0,5 1,0 - 0,2

22:1 2,6 - - - - - -

£„% 20,6 6,0 29,4 1,0 10,7 1,6 4,3

% 79,4 94,0 70,6 99,0 89,3 98,4 95,7

Примечание:

1 £| - суммарное содержание насыщенных жирных кислот 2- суммарное содержание ненасыщенных жирных кислот В результате исследований установлено, что наибольшее обогащение

маточников ГЛК происходит при первой перекристаллизации с раствором мочевины

в спирте этиловом (63,7%).

Методика определения ГЛК в масле б. лекарственного с использованием ГЖХ

валидирована по показателям: предел обнаружения (0,95 мкг); предел

количественного определения (3 мкг); аналитическая область методики (от 1,5 до

7,5 мкг ГЛК во вводимой пробе); линейность (зависимость площадей пиков от

содержания ГЛК в аналитической области методики линейна, что подтверждается

коэффициентом корреляции г = 0,993>0,99).

Исследования по изменению органолептических показателей и состава

жирных кислот позволили установить оптимальный срок хранения масла - 2 года.

Изучение химического состава шрота семян бурачника лекарственного После выделения жирного масла из семян остается значительное количество шрота, изучение которого представляет интерес, что и подтвердили проведенные кспериментальные исследования, в результате которых были обнаружены и

количественно определены фенольные соединения, сапонины, алкалоиды, аминокислоты (табл.7).

Таблица 7 — Количественное содержание основных групп БАС шрота семян

бурачника лекарственного

Биологически активные соединения Содержание, % (на абсолютно сухое сырье)

Фенольные соединения -флавоноиды (в пересчете на рутин) -дубильные вещества -фенолокислоты (в пересчете на кислоту феруловую) 0,53±0,02 3,52±0,12 5,04±0,14

Сапонины (в пересчете на кислоту олеаноловую) 1,01±0,03

Алкалоиды 0,26±0,001

Аминокислоты 1,59

Методом ВЭЖХ на приборе «Gilston» с УФ - детекцией в шроте семян б.

лекарственного при наличии доступных стандартов идентифицировали 8 веществ фенольной природы, превалирующими среди которых являются кемпферол (39,78%), галловая кислота (33,89%), танин (13,13%) и рутин (5,51%) (табл.8).

Таблица 8 - Состав фенольных соединений шрота семян бурачника лекарственного

№ Время, мин Высота пика, mV Площадь пика, тУхсек Содержание, % Название соединения

1 3,78 175,68 1897,48 13,13 Танин

2 3,88 508,47 4896,56 33,89 Галловая кислота

3 6,11 0,40 7,22 0,05 Цикориевая кислота

4 9,86 1,97 62,50 0,43 Неохлорогеновая кислота

5 11,57 4,58 426,71 2,95 Феруловая кислота

6 20,02 12,18 794,91 5,51 Рутин

7 21,90 1,00 37,63 0,26 Лютеонин - 7 - гликозид

8 60,08 43,27 5747,06 39,78 Кемпферол

Амперометрически на приборе «Цвет Яуза-01-AA» установлено, что

наибольшая суммарная концентрация антиоксидантов содержится в извлечении, полученном с помощью 20%-ного спирта этилового (4,69 мг/г в пересчете на кверцетин).

На аминокислотном анализаторе Amino acid analyzer Т339М определено общее содержание аминокислот в шроте семян б. лекарственного - 15,99 г/кг, из которых 27,5% составляют незаменимые. В числе незаменимых аминокислот преобладают валин (2,19 г/кг), лейцин (1,34 г/кг) и фенилаланин (0,93 г/кг), в числе заменимых - серин (2,97 г/кг), аланин (1,89 г/кг) и глицин (1,57 г/кг).

Используя метод эмиссионного спектрального анализа на спектрографе ДФС-

8 в шроте семян обнаружено 7 макро- и 19 микро- и ультрамикроэлементов. В

числе макроэлементов преобладали кремний (30%), кальций (10%), калий (5%), в

числе микроэлементов - железо (0,5%), стронций (0,2%) и барий (0,15%).

Изучение химического состава надземной части бурачника лекарственного Поскольку б. лекарственный обладает большой биомассой, было

целесообразно изучить фитохимический состав его надземной части с целью

обоснования возможности комплексного использования ценного сырья. В траве б.

лекарственного обнаружили и определили количественное содержание

тритерпеновых сапонинов, фенольных соединений, аминокислот, аскорбиновой

кислоты, полисахаридов, алкалоидов (табл.9).

Таблица 9 - Количественное содержание основных групп биологически активных

соединений травы бурачника лекарственного

Биологически активные соединения Содержание, % (на абсолютно сухое сырье)

Фенольные соединения -флавоноиды (в пересчете на рутин) -дубильные вещества -фенолокислоты (в пересчете на кислоту феруловую) 0,93±0,03 . 1,39±0,02 3,68±0,07

Полисахариды 9,89±0,17

Сапонины (в пересчете на кислоту олеаноловую) 2,48±0,04

Аскорбиновая кислота 0,39±0,01 л

Алкалоиды 0,015±0,0005

Аминокислоты 2,38

Пигменты -хлорофиллы -каротиноиды 7,39±0,04 мг% 3,96±0,08 мг%

Методом ВЭЖХ определили компонентный состав фенольных соединений (табл. 10).

Таблица 10 - Состав фенольных соединений надземной части бурачника

лекарственного

№ Время, мин Высота пика, тУ Площадь пика, тУ*сек Содержание, % Название соединения

1 3,84 8,49 119,19 6,32 Танин

2 4,02 59,56 609,81 32,35 Галловая кислота

3 11,71 0,55 13,56 0,71 Феруловая кислота

4 14,40 1,11 24,33 1,29 Лютеолин - 7 - гликозид

5 17,63 0,44 12,90 0,68 Рутин

6 27,06 0,95 37,56 1,99 Нарингенин

7 34,27 0,14 531 0,28 Кумарин

8 52,55 1,44 ¿8,04 4,67 Кемпферол

При наличии доступных стандартов в надземной части бурачника лекарственного идентифицировано 8 веществ фенольной природы, превалирующими среди которых были галловая кислота (32,35%), танин (6,32%), кемпферол (4,67%) и нарингенин (1,99%).

Амперометрически установлено, что наибольшая концентрация антиоксидантов содержится в извлечении из надземной части, полученном с помощью 50% спирта этилового (0,41 мг/г в пересчете на кверцетин).

На аминокислотном анализаторе Amino acid analyzer Т339М определили общее содержание аминокислот в надземной части б. лекарственного - 23,74 г/кг, из которых 34,9% составляют незаменимые. В числе незаменимых аминокислот преобладают треонин (2,54 г/кг), фенилаланин (1,96 г/кг) и лейцин (1,65 г/кг), в числе заменимых - глютамин (3,62 г/кг), глицин (2,4 г/кг) и аланин (2,09 г/кг).

Используя метод эмиссионного спектрального анализа в надземной части обнаружено 27 макро-, микро- и ультрамикроэлементов. В числе макроэлементов преобладали калий (30%), натрий (20%) и кальций (10%), в числе микро - и ультрамикроэлементов - железо (0,3%), барий (0,1%) и марганец (0,06%). Мышьяк в сырье не был обнаружен, содержание свинца, никеля и цинка не превышает ПДК, установленных. СанПиН.

Результаты проведенных исследований состава травы и шрота семян свидетельствуют о перспективности комплексного использования б. лекарственного (семена, шрот семян и трава).

Интродукция бурачника лекарственного на Северном Кавказе

Известно, что для проведения ^продукционных исследований значительный интерес вызывает изучение семенной репродукции растения. Именно поэтому нами определялась всхожесть семян б. лекарственного в лабораторных (99,5%) и полевых условиях при посадке семян в мае 90,3%, в июне - 88,3%. Посев семян б. лекарственного на опытные делянки ботанического сада Пятигорской ГФА производили рядовым способом в 4 срока (в мае, июне, июле и августе). Вегетационный период растений майского срока посева составил 93 дня, июньского

16

- 98 дней, июльского - 90 дней и августовского - 85 дней. Феноспектр б. лекарственного в условиях интродукции приведен на рисунке 1.

июнь

Фаза появления всходов; Фаза бутонизации;

июль аог/ст сентябрь

-/ Фаза розетки (появления листа);

7Фаза цветения; Фаза созревания семян

Рисунок 1 - Фенологический спектр б. лекарственного майского срока посева Данные по семенной продуктивности и урожайности надземной части б. лекарственного в условиях интродукции представлены в таблице 11. Таблица 11 - Семенная продуктивность и урожайность бурачника лекарственного

Сроки посева Семенная продуктивность фактическая Урожайность надземной части (г/м2)

г/м2 г/растение свежей биомассы Биомассы, высушенной до воздушно-сухого состояния

май 73±2,5 4,6±0,18 3120±28 . 125,ШЪ

июнь 62±2,1 3,9±0,15 2960±40 688,4±21

июль 50±1,7 3,1±0,16 3040±35 707,0±8

август 57±2,3 3,6±0,16 2760±44 641,9±18

Таким • образом, наибольшая всхожесть • семян, биомасса и семенная продуктивность наблюдалась у растений майского срока посева.

Морфолого-шштомическое изучение надземной части и семян бурачника лекарственного и установление норм качества предлагаема видов сырья

Одним из основных этапов стандартизации сырья яаояется определение его подлинности на основании анатомо-диагностических признаков.

Для стебля б. лекарственного диагностическими признаками являются: проводящая система пучкового типа (пучки открытые коллатеральные); сердцевина полая; трихомы, представленные щетинистыми одноклеточными и многоклеточными грубобородавчатыми волосками; сосуды ксилемы спирального и лестничного типа (рис.2).

Для листа: дорсивентральное строение, гипостоматический, аномоцитный тип устьичного аппарата. Основные клетки эпидермы изодиаметрические.

17

Антиклинальные стенки основных клеток верхней эпидермы извилистые, нижней -сильноизвилистые. Устьица. овальной формы, окружены 4-8 околоустьичными клетками. Часто расположенные трихомы представлены одно-, дву- и трехклеточными коническими или изогнутыми щетинистыми волосками с бородавчатой поверхностью с розеткой из 6-8 клеток у основания. Базальные клетки многоклеточных волосков приподнимаются над поверхностью эпидермы (рис.3).

Рисунок 3 - А — верхняя эпидерма; Б - нижняя эпидерма Для семян: семенная кожура многослойная, антиклинальные стенки экзотесты извилистые, клеточная стенка суберинизирована; клетки мезотесты паренхимные; эндосперм не развит; клетки зародыша паренхимные с каплями жирного масла, проводящая система пучкового типа (рис.4).

А

Рисунок 4 - А - зародыш семени; Б — теста семени 18

Рисунок 2 - А - грубобородавчатый волосок; Б - продольный срез стебля

Нормативная документация на ЛРС предусматривает обязательное определение числовых показателей, регламентирующих качество сырья. В связи с этим нами на 6 сериях проведены товароведческие исследования и разработаны нормы качества (числовые показатели) для сырья б. лекарственного (табл.12).

Таблица 12 - Числовые показатели травы, семян и шрота семян б. лекарственного

Показатели Методы Нормы качества

трава семена шрот семян

Влажность ГФ XI, вып.1, с.285 не более 10% не более 9% не более 5%

Золы общей ГФ XI, вып.1, с.24 не более 6% не более 8% не более 6%

Золы нерастворимой в растворе кислоты хлористоводородной 10% ГФ XI, вып.1, с.25 не более 2% не более 2% не более 1%

Экстрактивных веществ (трава) / масличность (семена) ГФ XI, вып.1,с.295 Не менее 17% (экстрагент вода очищенная) Не менее 37% Не менее 12% (экстрагент 20% спирт этиловый)

Органической примеси ГФ XI, вып.1, с.276 не более 2% не более 2% -

Минеральной примеси ГФХ1, вып.1, с.276 не более 1% не более 0,6%

Частиц, не проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 7 мм ГФ XI, вып, 1, с.275 не более 11% -

Частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 0,5 мм ГФХ1, вып.1, с.275 не более 9% не более 6%

Пожелтевших, побуревших и почерневших частей растения ГФ XI, вып.1, с.276 не более 4% не более 1% -:

Фармакологические исследования масла и спиртового извлечения из шрота семян бурачника лекарственного В результате исследований установлено, что масло и спиртовое извлечение из

шрота семян по классификации К.К. Сидорова и в соответствии с ГОСТом 12.1.007

- 76 являются веществами 4 класса токсичности, т.е. малотоксичньши. Изучение

противовоспалительной активности на модели «ватно-шариковой гранулемы»

показало, что величина отека при применении масла б. лекарственного была на 11%

достоверно ниже, а процесс синтеза соединительной ткани на 43% достоверно более

выражен, чем в контрольной группе. В сравнительном аспекте влияние масла б.

лекарственного и облепихи (препарата сравнения) на экссудативную и

пролиферативную фазы воспалительного процесса не носило достоверного

различия. На модели каолинового отека показано, что и масло и спиртовое

извлечение из шрота семян достоверно тормозят развитие отека через 5 часов

наблюдения на 28,8% и 33,5% соответственно по сравнению с контролем, окончанию опыта величина отека на фоне масла и извлечения из шрота была на и 16% соответственно ниже, чем в контроле. По сравнению с действием м ' календулы (препарата сравнения) антиэкссудативный эффект исследуемых объект был несколько менее выражен (на 5-10%). Исследование ранозаживляющ активности показало, что укорочение срока заживления ран животных, лечень маслом бурачника, относительно контрольной группы, составило 47,1° относительно препарата сравнения (масла облепихи) - 24%.

Микробиологические исследования свидетельствуют о том, что мае проявляет антимикробную активность по отношению к штаммам стафилококков бацилл:

Общие выводы

1. Проведены исследования по интродукции бурачника лекарственного условиях Ставропольского края. Показано, что семена и липйды семя интродуцированного и коммерчески доступного бурачника лекарственног практически идентичны. Это является обоснованием того, чт интродуцированный бурачник лекарственный может быть промышленны сырьевым источником жирного масла, содержащего у-линоленовую кислоту.

2. Изучен химический состав нейтральных и полярных липидов семян бурачник лекарственного в условиях интродукции в ботаническом саду Пятигорско ГФА. Установлено, что в составе жирных кислот главными являютс линолевая (37-39%) и у-линоленовая (18-20%). Методика ГЖ количественного определения ГЛК в масле бурачника лекарственног валидирована по показателям: предел обнаружения; предел количественного определения; аналитическая область методики; линейность. В неомыляемой фракции определены 7 соединений стероидной природы, витамин Е и сквален. Методом перекристаллизации комплексов включения жирных кислот с мочевиной получена фракция, обогащенная ГЛК (63,7%).

3. В шроте после экстракции жирного масла из семян определено количественное содержание флавоноидов (0,53±0,008%), гидролизуемых дубильных веществ (3,52±0,02%), фенолокислот (5,04±0,07%), тритерпеновых сапонинов (1,01±0,03%), алкалоидов (0,26±0,001%), аминокислот (1,59%), суммарное содержание антиоксидантов. Установлен качественный состав фенольных соединений, аминокислот и элементный состав.

4. Из надземной части растения выделены флавоноиды (0,93±0,01%), фенолокислоты (3,68±0,07%), гидролизуемые дубильные вещества (1,40±0,02%), полисахариды (9,89±0,11%), тритерпеновые сапонины (2,48±0,04%), кислота аскорбиновая (0,39±0,01%), хлорофиллы (7,39±0,04 мг%), каротиноиды (3,96±0,08 мг%), аминокислоты (2,38%), алкалоиды (0,015±0,0005%). Изучен качественный состав фенольных соединений, аминокислот и элементный состав.

5. Установлено, что масло и спиртовое извлечение из шрота семян являются веществами 4 класса токсичности, т.е. малотоксичными ; и проявляют выраженное противовоспалительное действие. Масло семян бурачника лекарственного не оказывает местнораздражающего действия и обладает ранозаживляющеи активностью.

6. Определена семенная продуктивность (50 - 73 г/м2) и урожайность надземной части (2760 - 3120 г/м2) бурачника лекарственного в условиях интродукции. Определена всхожесть семян в лабораторных (99,5%) и полевых (90%) условиях. Экспериментально установлено, что оптимальным сроком посева является май.

7. Установлены макро- и микроскопические признаки сырья и определены его товароведческие показатели (семян, шрота семян и надземной части).

8. Разработана ФСП «Масло бурачника для наружного применения» и проект «Инструкция по сбору и сушке травы и семян бурачника лекарственного».

Список опубликованных по теме диссертации работ

1. Ляшенко, С.С. Оценка перспективности использования бурачника

21

лекарственного с точки зрения его экологической чистоты и возможное введения в культуру / С.С. Ляшенко, О.Н. Денисенко // Известия Самаре, нау центра РАН. -2010. - Т. 12, № 1(8). - С. 2076-2078.

2. Липиды семян Borago officinalis L. (сем. Boraginaceae) / С.С. Ляшенко, С. Юнусова, М.С. Юнусов, Е.Г. Галкин, О.Н. Денисенко // Башкир, химич. жур -2010.-№4.-С. 24-28.

3. Ляшенко, С.С. Изучение «острой» токсичности и местнораздражающег действия жирного масла семян бурачника лекарственного Borago officinalis

/ С.С. Ляшенко, С.А. Кулешова, О.Н. Денисенко // ТоксикоЛ. вестн - 2010. № 5 (104). - С.56-57.

4. Ляшенко, С.С. Липиды семян бурачника лекарственного (Borago officinalis L сем. Boraginaceae) / С.С. Ляшенко, С.Г. Юнусова, О.Н. Денисенко // Химия медицина, 0рхимед-2009: тез. докл. VII Всерос. конф. с молодеж. науч школой 1-5 июля 2009 г. — Уфа, 2009. - С. 209-210.

5. Ляшенко, С.С. Изучение жирного масла семян Borago officinalis L. / С.С Ляшенко, С.Г. Юнусова, О.Н. Денисенко // Разработка, исследование маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2009.- Вып. 64.-С. 78-79.

6. Ляшенко, С.С. Интродукция бурачника лекарственного в условиях ботанического сада Пятигорской ГФА и изучение посевных качеств его семян / С.С. Ляшенко, О.Н. Денисенко // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2010. - Вып. 65.-С. 84-85.

7. Ляшенко, С.С. Фитохимическое изучение надземной части перспективного источника линоленовой кислоты - бурачника лекарственного / С.С. Ляшенко // Молодые ученые - медицине: аспирант, чтения - материалы докл. Всерос. конф. - Самара, 2010. - С. 255-257.

8. Ляшенко, С.С. Аминокислотный состав надземной части бурачника лекарственного (Borago officinalis L.) / С.С. Ляшенко // Молодые ученые в

22

решении актуальных проблем науки: сб. работ молодых ученых междунар. науч.-практич. конф. - Владикавказ, 2010. - С.123-125.

9. Ляшенко, С.С. Изучение элементного состава вегетативных и репродуктивных органов бурачника лекарственного / С.С. Ляшенко, О.Н. Денисенко // Актуальные проблемы фармацевтической науки и практики: сб. науч. тр. Всерос. науч.-практич. конф. - Владикавказ, 2010. - С. 52-56.

Ю.Липиды интродуцированных в условиях Ставропольского края семян Borago officinalis / С.Г. Юнусова, С.С. Ляшенко, М.С. Юнусов, О.Н. Денисенко // Актуальные проблемы химии природных соединений: сб. тез. конф. 12-13 октября 2010 г. - Ташкент, 2010. - С. 116.

11.Получение фракции, обогащенной у-линоленовой кислотой, из жирного масла семян бурачника лекарственного / С.С. Ляшенко, С.Г. Юнусова, М.С. Юнусов, О.Н. Денисенко // Вестн. Пермс. гос. фармац. акад. - 2010. - № 7. - С. 121-124.

12.Ляшенко, С.С. Исследование суммарного содержания антиоксидантов в шроте после выделения масла из семян бурачника лекарственного / С.С. Ляшенко, М.И. Кодониди // Украин. научн.-мед. молодеж. журн. Спец. вып. - 2010. - № 4.-С.509.

13.Морфолого-анатомическое исследование травы бурачника лекарственного / С.С. Ляшенко, М.А. Галкин, О.Н. Денисенко // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2011,- Вып. 66.-С. 146-149.

14.Изучение противовоспалительной активности жирного масла семян бурачника лекарственного (Borago officinalis L.) / С.С. Ляшенко, С.А. Кулешова, О.Н. Денисенко // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины: материалы 68-й открытой научн.-практ. конф. молодых ученых и студентов с междунар. участием, посвященной 75-летию ВолГМУ 9-13 сент. 2010. - Волгоград, 2010. - С. 181.

Приносим большую благодарность за консультативную и практическую помощь старшему научному сотруднику, канд. хим. наук Юнусовой С.Г. и директору института органической химии Уфимского научного центра РАН, действительному члену академии наук РФ Юнусову М.С.

23

ЛЯШЕНКО СВЕТЛАНА СЕРГЕЕВНА

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ БУРАЧНИКА ЛЕКАРСТВЕННОГО BORAGO OFFICINALIS L.

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Подписано к печати » 1 г., формат 60 х 84 1/16

Бумага книжно-журнальная. Печать - ротапринтная. Усл. печат. л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ № Ц£>3.

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ПЯТИГОРСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ ФЕДЕРАЛЬНОГО АГЕНТСТВА ПО ЗДРАВООХРАНЕНИЮ И СОЦИАЛЬНОМУ РАЗВИТИЮ» (357532, г Пятигорск, пр. Калинина, 11) 24

Актуальность темы

Для профилактики и лечения сердечно-сосудистых и ряда других заболеваний в настоящее время широко используются препараты полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК). Применение таких кислот началось в середине прошлого столетия. Одним из препаратов был витамин F, представляющий собой смесь эссенциальных жирных кислот. Основными источниками данных кислот являются липиды растений. Известно, что в растительных липидах синтезируются главным образом ПНЖК ряда С is, среди которых высокой биологической активностью обладает гамма-линоленовая кислота (18:3, 6,9,12-октадекатриеновая кислота, со-6 типа). В значимых количествах у-линоленовая кислота (ГЛК) содержится в жирных маслах семян растений смородина черная Ribes nigrum L., энотера двулетняя Oenothera biennis L., энотера Ламарка Oenothera lamarckiana Ser. и бурачник лекарственный Borago officinalis L. Наиболее богатым источником у-линоленовой кислоты являются семена бурачника лекарственного семейства бурачниковые Boraginaceae, которые накапливают до 40% жирного масла с содержанием у-линоленовой кислоты около 25%. Данный вид является однолетником, засухо- и морозоустойчивым, не требует особых условий возделывания. Масло из семян этого растения применяется в медицине и парафармации, цветки и листья являются оффицинальными во многих странах. Бурачник лекарственный выращивается для получения жирного масла в Англии, США, Канаде, Китае и других странах. Однако при широком применении жирного масла, другие биологически активные соединения (БАС) растения практически не используются, поскольку изучены недостаточно. Но известно, что отходы после первичной переработки сырья могут служить источником получения новых лекарственных средств. Это дает возможность удешевить продукцию и делает производство более рентабельным.

В нашей стране бурачник лекарственный встречается во флоре средней полосы европейской части России и Кавказа и> применяется -только в народной медицине при неврозах, бессоннице, депрессии, ревматизме, как отхаркивающее и 6 противосудорожное средство, при кожных забрлеваниях, нарушениях обмена веществ и диабете. Сведения о химическом составе бурачника лекарственного, произрастающего на территории России, в научной литературе крайне ограничены, не определены возможности интродукции, оптимальные сроки заготовки сырья, диагностические признаки. Изучение этих вопросов позволит включить в номенклатуру лекарственных растений новый- вид сырья и расширить источники получения полиненасыщенных жирных кислот, в том числе ГЛК и других БАС. Поэтому фармакогностическое исследование бурачника лекарственного является актуальной задачей для фармацевтической науки и практики.

Цель и задачи исследования

Цель настоящей работы — интродукция бурачника лекарственного в условиях Ставропольского края и экспериментальное обоснование его применения как сырьевого источника масла, содержащего у-линоленовую кислоту; проведение химических исследований шрота семян после извлечения масла и надземной части растения для изучения возможности комплексного использования сырья.

Для реализации поставленной цели необходимо решение следующих задач:

1. Провести исследования по интродукции бурачника лекарственного на базе ботанического сада Пятигорской ГФА;

2. Выделить и изучить различные классы липидов семян;

3. Изучить возможность получения фракции жирных кислот, максимально . ' .Ч ! П'НОЛ V!'! U ! Я ■ * V; !'": обогащенной ГЛК;

4. Изучить основные группы БАС шрота семян после извлечения масла;

5. Провести фотохимическое исследование надземной части растения;

6. Провести предварительные фармакологические, исследования жирного масла и спиртового извлечения из щрота семян растения;

7. Провести морфолого-анатомические исследования с целью установления диагностических признаков, а также определить товароведческие, показатели сырья (надземной части и семян);

8. Разработать нормативную документацию на -масло из семян и траву бурачника лекарственного.

Научная новизна

Проведены исследования по интродукции бурачника лекарственного в условиях Ставропольского края: изучена всхожесть семян в лабораторных (99,5%) и полевых условиях (90%), особенности развития и урожайность бурачника лекарственного. Доказано, что семена и липиды семян интродуцированного и коммерчески доступного бурачника лекарственного практически идентичны. Впервые установлен состав БАС репродуктивных и вегетативных органов интродуцированного бурачника лекарственного. Разработана методика обогащения фракции жирных кислот у-линоленовой кислотой с помощью метода перекристаллизации комплексов включения жирных кислот с мочевиной, в результате которого получена фракция, содержащая до 64% ГЛК.

В траве и шроте семян бурачника лекарственного определено количественное содержание фенольных соединений, сапонинов, полисахаридов, алкалоидов, водорастворимых антиоксидантов, макро- и микроэлементов, аминокислот;- в надземной части (траве) кроме того - аскорбиновой кислоты и пигментов. Выявлен компонентный состав фенольных соединений изучаемых видов сырья.

Проведено морфолого-анатомическое изучение надземной части и семян бурачника лекарственного, установлены их диагностические признаки и товароведческие показатели.

Установлено, что масло и спиртовое извлечение из шрота семян являются веществами 4 класса токсичности, т.е. малотоксичными и проявляют выраженное противовоспалительное действие. Масло семян бурачника лекарственного не оказывает местнораздражающего действия и обладает ранозаживляющей активностью.

Практическая значимость 1 .'1 1

В результате проведенных экспериментальных исследований химического состава липидов семян бурачника лекарственного доказана целесообразность его применения как источника жирного масла с высоким содержанием у-линоленовой кислоты, обладающего ранозаживляющим и противовоспалительным действием. 8

Изучение химического состава извлечений из надземной части и шрота семян растения свидетельствуют о перспективности. их дальнейших фармакологических исследований с целью разработки лекарственных средств противовоспалительного и антидепрессантного действия.

Внедрение результатов исследования Методики анализа масла семян бурачника лекарственного, включенные в проект ФСП «Масло бурачника для наружного"применения», апробированы в ГУЗ «Республиканский центр контроля качества и сертификации лекарственных средств Министерства Здравоохранения РСО-Алания» (акт апробации от 04.03.2011г.). Метод получения фракции жирных кислот, обогащенной у-линоленовой кислотой, из жирного масла растительного происхождения апробирован научно-производственным объединением «Альпика» (г. Ставрополь) (акт о внедрении от 23.11.2010 г.). Материалы информационного письма «Получение фракции, обогащенной у-линоленовой кислотой, методом перекристаллизации комплексов включения жирных кислот с мочевиной» включены в лекционный курс и практические занятия кафедры органической химии ГОУ -ВПО Пятигорской ГФА Росздрава по курсу: «Липиды» (акт о внедрении от 25.02.2011г.). Разработана «Инструкция по сбору .и сушке травы и семян бурачника лекарственного» (утверждена ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава 16.03.2011 г.).

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО Пятигорской государственной фармацевтической академии Росздрава (номер государственной регистрации 01200112164) и в свете реализации совместной с Уфимским Научным Центром РАН Программы по поиску источников у-линоленовой.кислоты. .

Положения, выдвигаемые на защиту 1. Обоснование применения семян бурачника лекарственного в качестве сырья для получения жирного масла с высоким содержанием ГЛК.

2. Результаты изучения липидов семян бурачника лекарственного и получение фракции жирных кислот, обогащенной у-линоленовой кислотой.

3. Результаты фитохимического изучения шрота после извлечения жирного масла из семян и надземной части бурачника лекарственного.

4. Результаты интродукционных исследований бурачника лекарственного в условиях ботанического сада Пятигорской ГФА.

5. Результаты морфолого-анатомических исследований надземной части и семян бурачника лекарственного.

6. Результаты предварительных фармакологических исследований жирного масла и извлечения из шрота семян бурачника лекарственного.

Апробация работы и публикации

Основные положения диссертационной^,-работы ■ доложены на VII Всероссийской конференции с молодежной научной школой «Химия и медицина, 0рхимед-2009» в июле 2009 года (г. Уфа); Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы фармацевтической науки и практики» в октябре 2009 г. (г. Владикавказ);. Международной научно-практической конференции «Молодые ученые в решении актуальных проблем науки» в мае 2010 г. (г. Владикавказ); 64-й международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Актуальные проблемы современной медицины» в ноябре 2010 г. (г. Киев, Украина); научных .конференциях Пятигорской ГФА «Разработка, исследование и маркетинг- новой фармацевтической продукции» в январе 2009, 2010 и 2011 г. (г. Пятигорск). По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, в т.ч. 3 - в журналах, рекомендованных ВАК. Объем и структура диссертации

Работа изложена на 151 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, 4 глав собственных исследований, общих выводов, списка цитируемой литературы, включающего 207 источников, из которых 112 иностранных авторов и приложения.

Диссертация иллюстрирована 17 рисунками и 55 таблицами. ю

СОКРАЩЕНИЯ

ПНЖК — полиненасыщенные жирные кислоты

ГЛК — у-линоленовая кислота

НЛ - нейтральные липиды

МЭЖК - метиловые эфиры жирных кислот

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

СЭТС - сложные эфиры тритерпеновых соединений

ТАГ - триацилглицериды

СЖК - свободные жирные кислоты

ДАГ - диацилглицериды

МАГ - моноацилглицериды

ГШ - полярные липиды

ГЛ - гликолипиды

ФЛ - фосфолипиды

ТСХ - тонкослойная хроматография

ГЖХ - газо-жидкостная хроматография

ПТСХ - препаративная тонкослойная хроматография

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Проведены исследования по интродукции бурачника лекарственного в условиях Ставропольского края. Показано, что семена и липиды семян интродуцированного и коммерчески „доступного бурачника лекарственного практически идентичны. Это является обоснованием того, что интродуцированный бурачник лекарственный может быть промышленным сырьевым источником жирного масла, содержащего у-линоленовую кислоту.

2. Изучен химический состав нейтральных и полярных липидов семян бурачника лекарственного в условиях интродукции в ботаническом саду Пятигорской ГФА. Установлено, что в составе жирных кислот главными являются линолевая (37-39%) и у-линоленовая (18-20%). Методика ГЖХ количественного определения ГЛК в масле бурачника лекарственного валидирована по показателям: предел обнаружения; предел количественного определения; аналитическая область методики; линейность. В неомыляемой фракции определены 7 соединений стероидной природы, витамин Е и сквален. Методом перекристаллизации комплексов включения жирных кислот с мочевиной получена фракция, обогащенная ГЛК (63,7%).

3. В шроте после экстракции г -жирного" -масла'" из семян определено количественное содержание флавоноидов (0,53±0,008%), гидролизуемых дубильных веществ (3,52±0,02%), фенолокислот (5,04±0,07%), тритерпеновых сапонинов (1,01±0,03%), алкалоидов (0,26±0,001%), аминокислот (1,59%), суммарное содержание антиоксидантов. Установлен качественный состав фенольных соединений, аминокислот и элементный состав.

4. Из надземной части растения выделены флавоноиды (0,93±0,01%), фенолокислоты (3,68±0,07%), гидролизу емые дубильные вещества (1,40±0,02%), полисахариды (9,89±0,11%), тритерпеновые сапонины (2,48±0,04%), кислота - аскорбиновая (0,39±0,01%), хлорофиллы (7,39±0,04 мг%), каротиноиды (3,96±0,08 мг%), аминокислоты (2,38%), алкалоиды

0,015±0,0005%). Изучен качественный состав фенольных соединений, аминокислот и элементный состав.

5. Установлено, что масло и спиртовое извлечение из шрота семян являются веществами 4 класса токсичности, т.е. малотоксичными и проявляют выраженное противовоспалительное действие. Масло семян бурачника лекарственного не оказывает местнораздражающего действия и обладает ранозаживляющей активностью.

6. Определена семенная продуктивность (50 - 73 г/м2) и урожайность надземной части (2760 - 3120 г/м ) бурачника лекарственного в условиях интродукции. Определена всхожесть семян в лабораторных (99,5%) и полевых (90%) условиях. Экспериментально установлено, что оптимальным сроком посева является май.

7. Установлены макро- и микроскопические признаки сырья и определены его товароведческие показатели (семян, шрота семян и надземной части).

8. Разработана ФСП «Масло бурачника для наружного применения» и проект «Инструкция по сбору и сушке травы и семян бурачника лекарственного».