Автореферат и диссертация по медицине (14.04.01) на тему:Фармакогностическое изучение Ribes rubrum L., Punica Granatum L., Oenotherae biennis L. и разработка технологий получения субстанций на их основе

На правах рукописи

005012739

Хомик Анна Сергеевна

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ RIBES RUBRUM L, PUNICA GRANATUML, OENOTHERAEBIENNISL, И РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИЙ ПОЛУЧЕНИЯ СУБСТАНЦИЙ НА

ИХ ОСНОВЕ

Специальности 14.04.01 - технология получения лекарств 14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата фармацевтических наук

Москва 2012

1 2 map 2012

005012739

Диссертационная работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов» (РУДН) на кафедре общей фармацевтической и биомедицинской технологии (заведующий кафедрой академик РАМН и РАСХН В,А. Быков), на кафедре ботаники, физиологии растений и агробиотехнологии (заведующий кафедрой член-корреспондент РАН Вл.В. Кузнецов) и в Центре коллективного пользования Научно-образовательном центре РУДН (директор P.A. Абрамович)

Научные руководители:

Кандидат фармацевтических наук, доцент Кандидат фармацевтических наук, доцент Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук кандидат фармацевтических наук Ведущая организация:

Вандышев Виктор Васильевич Суслина Светлана Николаевна

Баландина Ирина Анатольевна Охотникова Валентина Федоровна

ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова)) МЗ и СР РФ.

Защита диссертации состоится 26 марта 2012 года в 14:00 на заседании диссертационного совета Д. 006.070.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН (117216, г. Москва, ул. Грина, 7) по адресу: 123056, г. Москва, ул. Красина, д.2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЛАР по адресу: 117216, г. Москва, ул. Грина, 7.

Автореферат разослан 16 февраля 2012 года

Ученый секретарь диссертационного совета Д 006.070.01

доктор фармацевтических наук

Громакова Алла Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Одно из перспективных направлении фармацевтических исследований связано с поиском новых видов сырья для расширения ассортимента жирных масел медицинского применения. Абсолютное большинство Olea pinguia получают, используя метаболомы плодов и семян растений из различных семейств. За последние двадцать лет, учитывая биохимическую классификацию жирных масел, особый интерес стали представлять природные источники тех из них, метаболом которых обогащен полиненасыщенными жирными кислотами. Масла, состоящие из триацилглпцеринов с ненасыщенными высшими кислотами, стали часто применяться для нужд диетологии, профилактической медицины и лечебной косметологии. Наиболее востребованы жирные масла, обогащенные эссенциальными высокомолекулярными ю-3 и ш-6, а также конъюгированными, кислотами. Эти полиненасыщенные кислоты, обладают F-витаминной активностью: участвуют в процессах внутриклеточного дыхания, входят в состав фосфолипидов мембран животных клеток, служат предшественниками простаноидов (простагландинов, простациклинов, тромбоксанов, лейкотриенов), а так же арахидоновой кислоты, стимулирующей репаративные процессы. Лекарственные средства, на основе ш-З и ш-6 - ряда и конъюгированных кислот, позиционируются производителями в качестве эффективных и безопасных средств лечения такого сложного заболевания как атопический дерматит, для терапии и предотвращения других кожных заболеваний, для смягчения побочных действий цитостатиков.

Обострившаяся в мире проблема уменьшения природных ресурсов официнальных растений для производства фармацевтических препаратов, служит основанием для поиска способов более полной утилизации метаболома промышленных видов сырья. Получение липидных комплексов из новых видов растительного сырья должно сопровождаться также разработкой методов конверсии отходов, которые могут служить источниками других групп БАВ. Разработка технологий по глубокой переработке отходов может позволить сократить потребность в воспроизводстве растительных ресурсов, необходимых для получения новых природных фракций метаболома растений, пригодных для использования в фармации и применения в медицине.

Учитывая вышесказанное, исследование липидных комплексов и гидрофильных компонентов метаболомов трёх растений; энотеры двулетней, смородины красной, выращиваемых в России, и гранатника, а также фармакогностическое изучение плодов и семян этих растений, содержащих ценные масла, обогащенные жирными (ш-З, ш-6, конъюгированными) кислотами; исследование отходов от получения жирных масел и разработка методик для контроля качества новых видов лекарственного растительного сырья, жирных масел и спиртовых экстрактов с использованием современной приборной базы, является актуальным в научном и прикладном отношениях.

Цель и задачи исследования.

Цель паботы состоит в фармакогностическом изучении новых видов растительного сырья: энотеры двулетней, смородины красной и гранатника для создания нормативных документов, а так же в разработке технологий получения фармацевтических субстанций из этих видов сырья и их исследовании.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- провести анализ современной номенклатуры лекарственных средств на основе жирных масел и жирных кислот;

- изучить морфолого-анатомические признаки семян энотеры двулетней; плодов и семян смородины красной; семян гранатника разного происхождения;

- разработать разделы «Внешние признаки», «Микроскопия» для проектов НД на новые отечественные виды масличного сырья: семена энотеры двулетней; жом плодов и семена смородины красной; жом плодов и семена гранатника;

- провести определение содержания жирного масла в новых видах сырья;

- разработать способ получения жирного масла из жома плодов смородины красной, из жома гранатника и изучить основные показатели качества выделенных масел современными не разрушающими и разрушающими пробу физико-химическими методами,

- разработать экспресс-методику установления подлинности жирных масел энотеры, смородины красной, гранатника методом спектрометрии в БИК области на приборе BRUKER модель «МРА FT-NIR Spectrometer»;

- провести фитохимический анализ обезжиренного сырья энотеры двулетней, смородины красной и гранатника на наличие в нём основных групп БАВ;

- разработать способ получения сухого экстракта энотеры двулетней и изучить некоторые показатели качества новой фармацевтической субстанции «Энотеры двулетней семян экстракт сухой».

Научная новизна.

На основании макро- и микроскопического анализа впервые выявлены диагностические признаки в анатомическом строении тканей цельных, измельченных и обезжиренных: семян энотеры двулетней, полученных при культивировании растения в Подмосковье; свежих, замороженных плодов, жома плодов и семян смородины красной; семян гранатника из плодов различных сортов и происхождения. Получены объективные иллюстрации этих признаков в виде оригинальных микрофотографий.

Впервые обоснована и разработана технология оформления в НД микрофотографий с диагностическими признаками в анатомическом строении ЛРС, выполненных с использованием цифровой и компьютерной техники, с масштабной линейкой, без указания увеличения.

Разработана методика установления подлинности свежих и замороженных сочных плодов, трав, листьев, побегов и подземных органов лекарственных растений методом микроскопии.

С помощью СЭМ в сравнительном аспекте впервые изучены семена рода Oenotherae L. различного происхождения и разных видов, семена смородины красной, семена гранатника различного происхождения. Результаты этих исследований иллюстрированы оригинальными микрофотографиями.

Предложена гравиметрическая методика количественного определения содержания жирного масла в метаболомах сырья энотеры двулетней, смородины красной и гранатника с помощью аппарата Сокслета по массе выделенного масла.

Выделенное из изученных метаболомов жирное масло охарактеризовано с помощью разрушающих (ГХ-МС, ТСХ, определение йодного числа) и не разрушающих (ЯМР, спектроскопия средней ИК области, рефрактометрия) методов анализа.

Создана база данных спектров поглощения лнпидных комплексов в БИК области и разработана экспресс-методика для установления подлинности жирных масел энотеры двулетней, смородины красной н гранатника на основе этой базы.

Впервые изучен качественный состав основных групп БАВ в семенах энотеры двулетней, культивируемой в Подмосковье, в жоме плодов смородины красной, выращенной в Подмосковье, в семенах гранатника нз Турции.

Разработана методика получения сухого экстракта из обезжиренных семян энотеры двулетней с выходом 26%, содержащего катехинпроизводпые.

Практическая значимость. На основании проведенных исследований разработаны:

- Проект ОФС «Определение содержание жирного масла в ЛРС»;

- Проект дополнения к ОФС «Техника микроскопического исследования лекарственного

растительного сырья» по технике проведения микроскопии свежих видов ЛРС;

- Проект разделов ФС на семена энотеры двулетней;

- Проект разделов ФС на жом плодов и семена смородины красной;

- Проект разделов ФС на жом плодов и семена гранатника;

- Создана база данных БИК спектров и разработана методика установления подлинности жирных масел, масляных экстрактов, масляных растворов на их основе;

- Разработан способ получения субстанции «Энотеры двулетней семян экстракт сухой», оформленный в виде лабораторного регламента.

Положения, выдвигаемые на защиту:

- Результаты фармакогностического исследования новых видов ЛРС: «Энотеры двулетней семена», «Смородины красной семена» и «Смородины красной плодов жом», «Гранатника семена», «Гранатника плодов жом»;

- Результаты выделения и изучения жирных масел энотеры двулетней, смородины красной и гранатника;

- Результаты создания базы спектров жирных масел с помощью БИК спектрометра;

- Результаты фитохимического изучения состава групп БАВ шрота семян энотеры двулетней, шрота семян смородины красной, шрота семян гранатника;

- Разработка технологии получеши и исследование сухого экстракта обезжиренных семян энотеры двулетней.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на конференциях, конгрессах, съездах:

IV Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов» (Москва, 2007г); итоговой конференции СНО медицинского факультета РУДН «Клинические и теоретические аспекты современной медицины (Москва, 2007г); IX международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» «Влияние космической погоды на биологические системы в свете учения А.Л. Чижевского» (Москва, 2008); 2-й международной студенческой научной конференции с участием молодых ученых «Клинические и теоретические аспекты современной медицины» (Москва, 2010); IV Всероссийской конференции-школе «Фундаментальные вопросы масс-спектрометрии и её аналитические применения» (Звенигород 2010) - доклад был отмечен дипломом.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 научных работ, в том числе 5 статей в журналах, входящих в перечень периодических изданий, рекомендуемых ВАК.

Связь исследования с проблемным планом фармацевтических паук. Диссертационная работа выполнена в Российском университете дружбы народов № темы 030601-2-073 по Государственному контрасту ГК П555/05.08.2009 - НК-97П. Проект: «Биоинженерия как основа мобилизации адаптивного потенциала биообъектов-суперпродуцентов БАВ». В соответствии с Федер&чьной целевой программой «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг., в рамках реализации мероприятия № 1.2.1 «Проведение научных исследований научными группами под руководством докторов наук» и при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (Гос. контракт№16.552.12.7002).

Объём н структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на 230 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, четырех глав экспериментальной части, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 156 источников, в том числе 56 иностранных, 6 приложений. Работа содержит 88 рисунков и 28 таблиц.

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследования, представлена научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе представлен обзор литературы по теме диссертации. Освещено современное состояние использования жирных масел растительного происхождения в фармации и медицине. Приведены различные классификации жирных масел, рассмотрены методы контроля качества, современные способы получения жирных масел, применяемых для изготовления лекарственных форм. Дана характеристика жирных масел, содержащих полиненасыщенные жирные кислоты. Приведено описание растений, химический состав и применение сырья: энотеры двулетней, смородины красной и гранатника. Сделаны выводы о перспективности изучения этих растений, как источников ценных жирных масел.

Во второй главе приведены сведения об объектах изучения, о методах и приборах, использованных в экспериментах.

Третья глава посвящена фармакогностическому изучению сырья энотеры двулетней, смородины красной и гранатника, установлению показателей, позволяющих идентифицировать сырье и контролировать его качество.

В четвертой главе представлены данные о разработке технологий получения и изучении липофильных фрагментов метаболома генеративных органов энотеры двулетней, смородины красной и гранатника.

Пятая глава содержит результаты исследований гидрофильного фрагмента метаболома обезжиренного сырья и разработку способа получения сухого экстракта семян энотеры двулетней.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РЛВОТЫ 1. Объекты Ii методы исследовании.

Объекты исследования - 5 образцов опытных партии семян энотеры двулетней (Oenotlierae biennis L.) урожая 2005 г., выращенные в Подмосковье, семена энотеры различного происхождения и разных видов (Oenotherae stricta Perto из Португалии, Oenotlierae biennis L. и Oenotlierae erytrosepala L. нз Японии); замороженные плоды смородины красной (Ribes rubrum L.) урожая 2006 г. (собранные в Тверской области), свежие плоды смородины красной (Ribes rubrum L.) урожая июля и сентября 2009 г. (собранные в Московской области); жом плодов гранатника (Púnica granatum L.) сорта Половша урожая 2007 г. (из Азербайджана), семена нз плодов гранатника (Púnica granatum L.) различного происхождения (сорт Мелес, из торговой сети, «горький» и «сладкий» из Ливана) урожая 2009г.

С помощью оптического микроскопа «Ломо, МИКМЕД- 1», сканирующего электронного микроскопа JEOL JSM - 6490LV и бинокулярной лупы МБС-10 проводили макроскопический и микроскопический анализы сырья. Ситовой анализ проводили по ГФ XI изд. Определение показателя преломления осуществляли в соответствии с ГФ XI вып. 1 стр. 29 - 30 при помощи рефрактометра ИРФ - 454Б2М. Для изучения состава жирного масла и его характеристик применяли методы: ЯМР спектрометрии (спектрометр Gemini фирмы Varian с рабочей частотой 200 МГц и спектрометр Jeol «JNM-ECA 600» с рабочей частотой 600 МГц.); ТСХ (пластинки Снликагеля фирмы Merck 20x20см, система растворителей хлороформ : гептан (7:3), проявляли пластинки в УФ свете на длинах волн 254нм и Зббнм, а так же в йодной камере в течении 15 минут); ГХ-МС (газовый хроматограф Agilent 6890N, капиллярная колонка DB-5MS [длина 30м, внутренний диаметр 0.25мм, толщина фазы 0.32 мкм], газ-носитель-гелий, скорость газа-носителя 1,5 мл/мин, оснащенный хромато-масс-спектрометром JMS GCmate II, JEOL, Япония); спектроскопии средней ИК области (ИК-Фурье спектрометр Varian «Excalibur НЕ 3100), спектроскопии БИК области (ИК-Фурье спектрометр BRUKER модель «МРА FT-NIR Spectrometer»). Определение групп БАВ в шротах проводили с помощью общепринятых качественных реакций с водными и спиртовыми извлечениями. Из обезжиренного сырья получали экстракты методом проточной экстракции на колонке (растворитель 95% спирт, вода дистиллированная). Изучение характеристик экстрактов проводили методами: УФ спектрофотометрии (спектрофотомет Сагу 100 Scan Varian, кювета толщиной 1см); ТСХ (пластинки Sorbfil ПТСХ-ПА в системе растворителей хлороформ : этанол : вода (26:14:3)); масс-спектрометрии (прибор масс-спектрометр Jeol «JMS-T100LP-DART 100» с времяпролетным масс-анализатором высокого разрешения для расчета возможного элементного состава). Для обработки полученных данных использовали статистический анализ.

2. Фармакогностическое изучение сырья п разработка методов контроля его

качества.

На основании изучения микроструктур замороженных плодов смородины красной разработана методика приготовления микропрепаратов из свежих и замороженных сочных плодов. Так же было изучено анатомическое строение некоторых официнальных видов сырья, использующихся в свежем виде, относящихся к разным морфологическим группам. На основании данных исследований разработан проект дополнения к ОФС «Техника микроскопического исследования лекарственного растительного сырья» по технике проведения микроскопии свежих видов J1PC. Фрагменты разработанной методики изложены в статье №5 списка работ, опубликованных по теме диссертации.

Методика размещения масштабной линейки на фотографиях. После фиксации изображения объекта под микроскоп помещается объект микрометр, шкала которого фотографируется при тех же увеличениях, что и объект. Увеличение фотоаппарата при этом не меняется. Далее, оба изображения совмещают в программе для их обработки, линейку редактируют и подписывают ее масштаб.

Макроскопический анализ сырья энотеры двулетней. Установлено, что для семян энотеры двулетней, выращенной в России, характерна гетероспермия, их форма может быть разнообразной: многогранно-угловатой или овально-односторонней. Окраска семян красно-коричневая, длина 1-2мм, ширина 0,5-1,25мм, толщина 0,5-1,25мм. В семенах энотеры двулетней нет эндосперма, они состоят из семенной кожуры и крупного зародыша. Поверхность семенной кожуры грубобугорчатая. Запах измельчённых семян слабый, своеобразный.

Микроскопический анализ сырья энотеры двулетней. Изучение анатомического строения семян энотеры двулетней показало, что семенная кожура состоит из 6 слоев. Экзотеста представлена полигональными клетками, содержащими пигмент. Боковые стенки клеток мелкоскладчатые (рис.2), наружная стенка утолщена (рис.3) и имеет ямчатую поверхность. Мезотеста представлена радиально вытянутыми крупными клетками с толстыми стенками, пронизанными порами. В ребрах семени клетки мезотесты расположены в несколько слоев. Эндотеста состоит из радиально вытянутых тонкостенных клеток, которые заполнены кристаллами оксалата кальция различной формы. Тегмен состоит из 3 слоев: наружного механического слоя, состоящего из мелких толстостенных клеток; среднего слоя, состоящего из деформированных тонкостенных клеток и внутреннего слоя, клетки которого имеют тонкие стенки и вытянуты вдоль оси семени (рис.1). На продольном срезе семени видно, что зародыш имеет хорошо развитые семядоли (рис.4). Их паренхимные клетки округлые, тонкостенные, содержат капли жирного масла, что подтверждается реакцией с раствором Судана III (капли жирного масла окрашиваются в оранжево-розовый цвет). При микроскопическом изучении обезжиренного сырья капель жирного масла не обнаруживалось.

Рисунок - 1. Фрагмент поперечного среза семени энотеры двулетней в межреберной области

Рисунок - 2. Клетки экзотесты семени энотеры двулетней в плане

1а

Рисунок - -?. Фрагмент поперечного среза экзотесты семени энотеры двулетней

Рисунок - 4. Зародыш семени энотеры двулетней

Обозначения к рисункам 1-4: 1-экзотеста; 1а - утолщенная наружная стенка клеток экзотесты; 2-мезотеста; 3-эндотеста; 4а - наружный слой тегмена; 46 - средний слой тегмена; 4в -внутренний слой тегмена; 5 -капли жирного масла.

Изучение особенностей микроархитектуры семян энотеры двулетней с помощью СЭМ. Изучены и иллюстрированы оригинальными микрофотографиями в сравнительном аспекте: особенности микроархитектуры поверхности семян Энотеры разных популяций и видов, а также различных мест культивирования этого растения: выявлены диагностические признаки, позволяющие идентифицировать семена энотеры двулетней от семян других изученных видов рода Энотера. -■ ~ _ _ ~

В результате проведения дисперсионного анализа сырья энотеры двулетней в проекте ФС «Энотеры двулетней семена» предлагается установить норму для показателя «частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 0,5 мм» не более 2%.

Макроскопический анализ сырья смородины красной. Изучаемые виды сырья из дв}^ мест культивирования смородины красной не имеют отличий и соответствуют данным литературы. Микроскопический анализ сырья смородины красной. Изучение анатомического строения показало, что сочный плод смородины красной состоит из 3 слоев. Экзокарп представлен полигональными клетками с четковидными утолщениями, в основании плода на нём встречаются устьица (рис. 7). Клетки мезокарпа тонкостенные, у свежего плода в них содержится клеточный сок, при обезвоживании плода клетки мезокарпа спадаются и их стенки становятся плохо различимыми. Эндокарп представлен слоем сильно вытянутых клеток, их стенки утолщены (рис. В) и пронизаны порами.

Рисунок -5. Фрагмент поверхности семени энотеры двулетней, культивируемой в Подмосковье

Рисунок -6. Фрагмент поперечного среза семени энотеры двулетней, культивируемой в Подмосковье

На поперечном срезе семени видно, что экзотеста представлена крупными тонкостенными палисадными клетками, в не высушенном семени в них также содержится сок, Мезотеста состоит из 2-3 рядов радиапьно сплющенных тонкостенных клеток. Эндотеста представлена одним рядом 1]-образных клеток, внешняя стенка у их тонкая, а остальные значительно утолщены, все стенки имеют коричневую окраску, а в их полости содержится по одному кристаллу оксалата кальция. Тегмен состоит их ряда радиально уплощенных коричневатых клеток, несколько вытянутых вдоль семени. Перисперм представлен гиалиновым слоем, довольно толстым, бесструктурным (рис. 10). Эндосперм мощный, состоит из толстостенных клеток, полигональной формы, вытянутых поперек оси семени, в них содержатся крахмальные зерна и капли жирного масла. Зародыш мелкий (рис. 9), в его клетках содержатся капли жирного масла и крахмальные зерна.

ЯШ

; „ Л т , -л'-'- %■>.

' и;. V

-Л);

■ с ! : .

4 ?

Рисунок -7. Фрагмент клеток экзокарпа у основания плода смородины красной

Рисунок - 8. Фрагмент эндокарпа околоплодника смородины красной

1-устьичный аппарат;

2-семенная кожура;

3-зародыш,

4-эндосперм;

5-мезотеста;

6-эндотеста;

7-тегмен;

8-перисперм;

5 9-эндосперм.

6

Рисунок - 9. Поперечный срез семени смородины красной

Рисунок - 10. Фрагмент поперечного среза семени смородины красной

Изучение особенностей микроархитектуры плодов и семян смородины красной с помощью СЭМ. Установлено, что наружная поверхность клеток экзокарпа настолько гладкая, что очертания клеток трудно различимы даже при больших (больше 2000х) увеличениях. При изучении внутренней поверхности экзокарпа видны толстые стенки клеток. Мезотеста представлена толстостенными мелкими клетками различной формы. На поперечном срезе семени хорошо видны все ткани, за исключением слоя тегмена и перисперма, которые практически неразличимы.

Дисперсионный анализ сырья смородины красной. Жом плодов смородины красной, высушенный после получения сока, на 40% состоит из семян и на 60% из тканей околоплодника и плодоножек. Разработан способ выделения семян из высушенного жома для получения жирного масла из их. Для внесения в проект НД на сырье «Семена смородины красной» предлагается установить следующие нормы: «частиц, не проходящих сквозь сито с

отверстиями диаметром 2мм» не более 5%; «частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром I мм» не более 5%.

Технология выделения семян из сухого жома сводится к следующему: жом измельчают в мельнице в течение одной минуты, при этом мягкие высушенные ткани перикарпа и мезокарпа, а также плодоножки, измельчаются. Семена смородины остаются цельными. Семена и измельченные части плода разделяют на ситах с отверстиями размером 2 и 1 мм. Просев через сито с диаметром отверстий 1 мм отбрасывают, непросев через сито с диаметром отверстий 2мм повторно измельчают. На сите с диаметром отверстий 1мм остаются только семена. Макроскопический анализ сырья гранатника. Жом плодов гранатника сорта Гюловша представляет собой части околоплодника с семенами. Исследованы семена, полученные из плодов гранатника других сортов, после удаления сока из саркотесты (сочная, мясистая часть семенной кожуры!. Обнаружено, что семена гранатника горького вкуса из Ливана, мельче по размерам семян остальных изученных сортов.

Микроскопический анализ сырья гранатника. Семена гранатника изучались после предварительного замачивания и нагревания в растворе хлоралгидрата. Поперечные срезы делались поперек оси семени в средней части. При изучении поперечных срезов семян гранатника разных сортов установлено, что к диагностическим признакам можно отнести: крупные, толстостенные пористые клетки мезотесты, которые уменьшаются и уплотняются ближе к центру семени. Эндотеста представлена темно-коричневым слоем плохо различимых клеток. Тегмен состоит из слоя продольно вытянутых тонкостенных клеток. Эндосперм в семенах гранатника отсутствует. Зародыш крупный, состоит их нескольких зародышевых листков, содержит многочисленные капли жирного масла.

Клетки саркотесты в плане - полигональные с прямыми стенками. На срезе свежего семени клетки саркотесты вытянутые, верхняя стенка клеток утолщена, боковые стенки практически не различимы.

Изучение особенностей микроархитектуры семян гранатника с помощью СЭМ. Были изучены семена и околоплодник гранатника сорта Гюловша, семена гранатника «горького» из Ливана и семена плодов гранатника из торговой сети. При изучении клеток мезотесты при большом увеличении видны поры размерами от 0,5 до 2 мкм. Стенки клеток мезотесты семян гранатника сорта Гюловша слоистые (рис. 11) в отличие от стенок клеток мезотесты семян плодов гранатников из Ливана (рис.12) и торговой сети (рис. 13). Стенки клеток мезотесты семян последних не имеют заметных слоев.

Рисунок - I/. Клетка Рисунок - 12. Клетка Рисунок-] 3. Клетка

мезотесты семени мезотесты семени мезотесты семени

гранатника сорта Гюловша гранатника «горького» гранатника из торговой сети

Дисперсионным анализ сырья гранатника. При ситовом анализе семян было установлено, что количество частиц, не прошедших сквозь сито 5мм, а также частиц, прошедших сквозь сито Змм не превышает 3%. На основании полученных результатов ситового анализа в проект ФС для контроля измельченности сырья «Жом плодов гранатника» предлагается установить норму для показателя «частиц, не проходящих сквозь сито с отверстиями размером 10 мм» не более 7%; «частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 1 мм» не более 5%.

3. Выделение II изучение липофильных фракции семян энотеры двулетней, смородины красной и гранатника.

В ходе исследований выделены и изучены жирные масла семян энотеры двулетней, смородины красной и гранатника разных сортов. Изучение этих масел проводилось с помощью современных инструментальных методов анализа. Часть использованных нами методов относятся к неразрушающим и экспрессным. Введение этих методов в НД на жирные масла может существенно сократить время и трудозатраты на анализ.

Разработка технологии выделения липофильных фракций жирномасличного сырья в лабораторных условиях. Наиболее приемлемым в лабораторных условиях является метод экстракции органическими растворителями. Данный метод достаточно прост и быстр. За основу разрабатываемой методики был взят уже существующий метод определения масличности, описанный в ГОСТ 10857-64. Предлагается внести в гравиметрический метод определения содержания жирного масла в новых видах сырья с помощью аппарата Сокслета следующие дополнения: навеска сырья, указываемая в НД на конкретное сырье, должна обеспечивать получение такой навески липидной фракции, чтобы минимизировать ошибку гравиметрического определения и, чтобы полученного масла хватило для подтверждения качества этого масла в сырье. При этом, содержание целевых веществ предлагается рассчитывать не по разнице в массе навески J1PC до и после обезжиривания, а по массе жирного масла после удаления растворителя. Методика должна гарантировать получение определенной массы жирного масла для контроля его качества, в зависимости от уровня содержания липофильной фракции в каждом виде сырья.

Определение параметров экстракции. Основными параметрами экстракции являются: время экстракции и степень измельченности сырья. Остальные показатели были константны: масса навески сырья - 10 г, объем растворителя 150 мл, объем экстрактора аппарата Сокслета 100 мл. При необходимости использовать другой объем аппарата Сокслета данные параметры легко масштабируются. Скорость прохождения одного цикла экстракции составляла 1 слив в 20 минут. Экстрагент н-гексан. Данный экстрагент был выбран, благодаря его низкой токсичности, низкой температуре кипения и хорошей растворяющей способности липофильных фракций. Установлено, что для максимального выхода липофильной фракции из сырья, необходимо проводить экстракцию 3-4 часа. Размер частиц для более полной экстракции сырья энотеры двулетней не должен быть более 0,5 мм; смородины красной не более 0,5 мм и гранатника не более 2 мм. Более тонкое измельчение сырья не ведет к значительному увеличению выхода масла, но удлиняет и усложняет технологический процесс. Результаты изучения содержания жирных масел в образцах новых видов сырья представлены в таблице 1. Выход масла из жомов значительно ниже выхода масла из семян Именно по этой причине нами была разработана технология очистки семян от остатков околоплодника (ТП 4 технологической схемы рис. 14).

Таблица /.

Сырье Выход масла, %, в пересчете на абсолютно-сухое сырье

Семена энотеры двулетней 23,2 ±3,9

Жом смородины красной 9,9 ± 0,7

Семена смородины красной 21,9 ± 0,5

Жом гранатника 13,2 ± 1,1

Семена гранатника 22,4 ± 6,7

Технологическая схема получения масла из семян энотеры двулетней отличается наличием только одной стадии измельчения сырья. Процесс выделения липофилыюй фракции из сырья смородины красной и гранатника представлен на рисунке 14.

ВР 1.1. Подготовка воздуха

ВР 1.2. Подготовка дезинфицирующих растворов

ВР 1.3. Подготовка помещений и оборудования

ВР 1.4. Подготовка технической одежды

ВР 1.5. Подготовка персонала

ВР 2.1. Подготовка сырья (прием, анализї

ВР 2.2. Подготовка первичной упаковки (флаконов)

ВР 1. Санитарная

подготовка

производства

Отходы

ВР 2. Подготовка сырья и упаковки

Потери

ВР 3. Подготовка экстрагента

Потери 4--

ТП 4. Измельчение и просеивание сырья (отделение околоплодника) Кт.

Отходы

Потери

ТП 5. Измельчение и просеивание сырья (семян) Кт.

ТП 6.1. Экстракция

Потери

ТП 6.2. Отгон экстрагента

ТП 6. Экстракция и регенерация экстоагента Кт.

Экстрагент

Шрот

УМО 7.1. Фасовка экстракта

УМО 7.2. Упаковка, маркировка

УМО 7. Упаковка и маркировка -т-

Потери

Потери

Кт - контроль технологический Контроль качества

Рисунок 14. - Технологическая схема получения жирного масла смородины красной и

гранатника

Изучение жирных масел не разрушающими физико-химическими методами.

Выделенные масла были изучены такими не разрушающими методами, как ЯМР спектроскопия (табл.2 рис.: 15,17,19), спектроскопия средней ИК области (рис.16,18,20) и рефрактометрия (табл.3)

Таблица 2.

Числовые показатели качества жирных масел семян энотеры двулетней, смородины

красной и гранатника, вычисленные по Н' ЯМР спектру

Растение, из сырья которого выделено жирное масло Название показателя

«Эквивалент йодного числа» Сод. ненасыщ. кислот в триацилгли церинах, % Сод. насыщ. кислот в триацилгли церинах, % Отнош. интегральн. интенсивн. сигналов в области 4,0 - 4,5м.д. и в области 2,2 -2,4м.д.

энотера двулетняя, выращенная в Подмосковье 185,5 93,8 6,2 4:6,4

смородина красная урожая 2006г 184 95 5 4:6

смородина красная урожая июля 2009 191,59 89 11 4:6,3

смородина красная урожая сентября 2009 191,11 95,5 4,5 4:6,1

гранатник из торговой сети 249,3 98,0 2,0 4:6,5

гранатник сорта Гюловша 246,0 88,44 11,55 4:6,9

гранатник сорта Мелес 244,42 91,91 8,08 4:6,3

гранатник «сладкий», Ливан 242,32 93,9 6,09 4:6,22

гранатник «горький», Ливан 219,81 94,0 6,0 4:6,1

В результате расчетов, проведенных по интегральным интенсивностям сигналов протонов, установлено, что содержание ненасыщенных кислот в триацилглицеринах жирного масла семян смородины красной, собранных в июле и в сентябре, имеют различия. Масло из семян, собранных в более поздние сроки содержит на 6,5% больше ненасыщенных кислот в триацилглицеринах.

При изучении спектров среднего ИК диапазона всех полученных липофильных фракций видны характерные для жирных масел полосы. Установлено, что в спектре масла гранатника имеются две полосы, характерные для конъюгированной двойной связи -С=С-С=С-. По этим полосам на 937-938 см'1 и 988 см"' можно отличить спектры масла гранатника от спектров масел энотеры двулетней и смородины красной. Спектры масел энотеры двулетней и смородины красной могут быть идентифицированы по сдвигам полос.

Рисунок -15. //' ЯМР спектр жирного масла из семян энотеры двулетней, выращенной в Подмосковье

Рисунок -16. Спектр средней ПК области жирного масла семян энотеры двулетней, выращенной в Подмосковье

И і

.1:ІО;

Рисунок-17. н' ЯМР спектр жирного масла из семян смородины красной урожая июля 2009г

Рисунок - 18. Спектр средней ИК области жирного масла из семян смородины красной урожая июля 2009г

І і >І і і I і і І пі І

: I 1 , 1 . - "

! І. Л .„і И І "" і.....- Г '

Ь Гї |ґ , . і]

..........яіь—т..............Ж________митМ-кА*____ І (

Рисунок -19. Н1 ЯМР спектр жирного Рисунок - 20. Спектр средней ИК области

масла из семян гранатника сорта Гюловіиа жирного масла гранатника сорта Гюловша Разработка метода идентификации жирных масел путем создания базы спектров БИК.

Проведен кластерный анализ БИК спектров с Фурье-преобразованием для определения возможности использования снятых спектров при последующей идентификации жирных масел. Анализ подтвердил такую возможность. Для пополнения базы данных, помимо спектров масел, выделенных из семян, изученных в работе растений, были исследованы спектры ещё 12 масел, имеющихся на отечественном фармацевтическом рынке. Как видно из дсндрограммы (рис.21), масла гранатника из семян разного происхождения достаточно гомогенны по спектральному расстоянию. Аналогичный вывод можно сделать и о маслах энотеры двулетней и смородины красной. Полученные данные позволяют говорить о возможности идентификации медицинских жирных масел с помощью БИК спектроскопии. Однако, следует отработать методики

15

идентификации для каждого конкретного вида жирного масла. При создании обширной базы БИК спектров масел необходимо будет учесть особенности каждого масла и их сходства.

Масло гранатника И Ї горговой сети

Масло гранатника сладкого Ливан

Масло гранатника сорт ї ю.ювша

Масло шотреры двулетней

Масло смородины красной сбор июль

Масло смородины красной сбор сентябрь

Рисунок - 21. Дендрогралшы кластерного анализа БИК спектров масел.

Был подготовлен валидационный отчет, из которого следует, что в подобранных условиях можно идентифицировать 18 масел, спектры которых были отсняты для эксперимента. Базу данных, к созданию которой мы приступили, можно использовать при экспресс - установлении подлинности жирных масел из семян изученных нами растений. Для анализа, не разрушающего пробу масла, требуется навеска около 2,0 г, а его продолжительность составляет не более 1 минуты.

В результате определения показателя преломления (табл.3) установлено, что масло энотеры двулетней и масло смородины красной имеют близкие значения показателя преломления, а жирное масло семян гранатника обладает наибольшим показателем преломления.

Таблица 3.

Результаты определения показателя преломления_

Образец Величина показателя преломления

Масло из семян энотеры двулетней, выращенной в Подмосковье 1,4783 ±0,0003

Масло из семян смородины красной урожай июль 2009г 1,4798 ±0,0002

Масло из семян гранатника сорта Гюловша 1,5138 ±0,0005

I ■ I 1 І І I

Ч £

= г

г і

10 гранатника сорт Г го кедр» Дивееео

,— цвело лыяиое нэрафинированное изг ООО Она

ІМІЖІ:

1

і пр Биокэр серия С6.0.

- («¿лу ;«мки ^лл-в-ш»

- масло касторозоз серия 0-1940 ФГУП изжбольн иасло кедровое нммерсиснюе партия 11 дата 7 ■ скипидар

!—[—11(1—I—I Г"

По полученным данным масла энотеры двулетней п смородины красной можно отнести к иолувысыхающпм жирным маслам, а масло гранатника к высыхающим. Изучение жирных масел разрушающими Физико-химическими методами.

Выделенные масла были изучены классическими разрушающими методами, такими как: ГХ-МС (табл.4), ТСХ, определение йодного числа (табл.5).

Таблица 4.

Жирнокислотный состав масел семян энотеры двулетней, смородины красной и гранатника

Жирнокислотный состав, содержание, %'

Масло семян Масло семян Масло семян гранатника сорта Гюловша

№ п/п Название кислоты энотеры двулетней, смородины красной,

выращенной в Подмосковье урожая июля 2009г

1 Лауриновая (С 12:0) - 0,33

2 Миристиновая (С14:0) - 0,64 »

3 Пальмитиновая (С16:0) 4.54 18,57 7,34

4 Пальмитолеиновая (С 16:1) - 0.20 .

5 Пуниковая (С 18:3, 9cis, 1 ltrans, 13cis) - - 39,87

6 а-Элеостеариновая (С 18:3,9cis, 1 ltrans, 13trans) - - 7,68

7 ß- Элеостеариновая (C18:3, 9trans, I ltrans, 13trans) - - 6,65

8 Каталповая (C18:3, 9trans, 1 ltrans, 13cis) - - 5,98

9 а-Линоленовая (CI8.3 гаЗ, eis) 6,21 _

10 у- Линоленовая (С 18:3 иб, eis) 8,81 6,44 _

И Линолевая (С 18:2 об, eis) 77,76 45,91 8,76

12 Линолеидиновая (С 18:2 шб, trans) - - 0,61

13 Олеиновая (С18.Т ш9, eis) 5,22 3,85 12,04

14 Транс-вакценовая (С 18:1) 0,2 _

15 Стеариновая (С18:0) 0,87 13,11 5,73

16 Эйкозатриеновая (С20.3) 2,01 . „

17 Эйкозеновая (С20:1 ш9, eis) 0,16 0,85 1,98

18 Арахиновая (С20:0) 0,12 1,44 3,13

19 Бегеновая (С22.0) - 0,61 -

20 Лигноцериновая (С24:0) - 1,10 0,23

21 С26:0 - 0,74 -

Средний результат 5 измерении

В результате проведенного анализа, в масле семян энотеры двулетней идентифицировано 9 жирных кислот. Основным компонентом триацилглицеринов является линолевая кислота 77,76%. Содержание у-линоленовой кислоты - 8,81%. Основным компонентом триацилглицеринов масла семян смородины красной из 14 идентифицированных кислот является линолевая кислота - почти 46%. у- Линоленовой кислоты содержится более 6%. При проведении метилирования масла семян гранатника в кислой среде отмечено протекание реакции изомеризации основного компонента масла - пуниковой кислоты (9cis, 1 ltrans, I3cis) в конъюгированные линоленовые кислоты с другим геометрическим положением двойных связей (катапповая - 9trans, 1 ltrans, 13cis, а-элеостеариновая - 9cis, 1 ltrans, 13trans, ß-элеостеариновая - 9trans, 1 ltrans, 13trans). Из приведенной таблицы видно, что основной компонент триацилглицеринов масла семян гранатника - пуниковая кислота, которая

составляет почти 40% от всех жирных кислот трнацилглицерннов. Более 60% жирных кислот масла семян гранатника - коныогированные. Тонкослойная хроматография (ТСХ).

Для хроматографии в тонком слое сорбента была подобрана система растворителей хлороформ : гептан (7:3). В этой системе масло семян энотеры двулетней разделяется на 11 компонентов, масло семян смородины красной на 7 компонентов, а масло семян гранатника на 8 компонентов. На хроматограмме каждого масла видно крупное пятно с И! около 0,6 принадлежащее сумме триацилглицеринов. Хроматограммы, снятые в подобранных условиях, позволяют идентифицировать изученные жирные масла. Определение йодного числа.

Определение йодного числа и расчеты проводились по методу, описанному в ГФ XI вып. 1. Данные представлены в таблице 5.

Таблица 5.

Результаты расчета йодного числа _

Образец Величина йодного числа

Масло из семян энотеры двулетней, выращенной в Подмосковье 105,35

Масло из семян смородины красной урожай июль 2009г 108,86

Масло из семян гранатника сорта Гюловша 137,99

Масло из семян гранатника обладает наибольшим йодным числом, а масло из семян энотеры двулетней - наименьшим. Данные йодометрического титрования коррелируют с результатами расчета «эквивалента йодного числа» по Н1 ЯМР спектрам, что говорит о возможности замены трудоемкого титрования на экспрессный метод ЯМР в качестве метода контроля качества жирного масла.

4. Фитохимическое изучение обезжиренных видов сырья. Разработка технологии получения экстрактов семян, изученных видов растений.

В работе предложен путь решения проблемы комплексного изучения и использования исследуемого сырья, в частности задачи утилизации обезжиренных семян. Для этого проведены качественные реакций на группы БАВ, а также определено содержание экстрактивных веществ после выделения из семян липидного комплекса. Получены несколько извлечений с помощью последовательной экстракции обезжиренных семян.

В результате проведения качественных реакций установлено: спиртовое извлечение из обезжиренных измельченных семян энотеры двулетней содержит значительные количества фенольных соединений; водное извлечение из этого вида сырья содержит незначительные количества фенольных соединений и полисахариды. Спиртовое извлечение из обезжиренных измельченных семян смородины красной содержит цианидины, а водное извлечение -полисахариды, фенольные соединения и цианидины. Извлечения из обезжиренных измельченных семян гранатника наиболее богаты на БАВ. Спиртовое извлечение дает положительные реакции на фенольные соединения и цианидины, а водное - на полисахариды, фенольные соединения, цианидины и сапонины.

Разработка технологии получения фармацевтической субстанции «Энотеры двулетнем семян экстракт сухой» и экстрактов из обезжиренных семян смородины красной и гранатника.

Для выделения суммы фенольных соединений из обезжиренных измельченных семян энотеры двулетней проводилась экстракция 95% спиртом. При экстракции спиртами более слабой концентрации на выходе получались вязкие патокообразные массы, и только при экстракции 95% спиртом экстракт затвердевал. Экстракция проводилась двумя методами, при нагревании и без нагревания. В первом из них сырье помещали в колбу, заливали растворителем, подсоединяли обратный холодильник и нагревали при перемешивании. Сырье нагревалось до температуры не более 50'С для предотвращения возможного разложения полифенольных соединений. Одна и та же порция сырья экстрагировалась 5 раз. В методе без нагревания сырье помещали в перколятор и промывали растворителем в течение 2-3 часов. В обоих методах после отгона растворителя в колбе остается патокообразная масса, которая превращается за 2 дня в стандартных условиях (при комнатной температуре и влажности менее 50%), в твердое вещество с выходом около 26% от массы обезжиренных измельченных семян.

Результаты получения сухого экстракта из обезжиренных измельченных семян энотеры двулетней представлены в таблице 6.

Таблица 6.

Результаты получения сухого экстракта из обезжиренных семян энотеры двулетней

Способ получения Выход сухого экстракта, %

Экстракция в колбе при нагревании и перемешивании 26,8 ± 1,3

Проточная экстракция в перколяторе без нагревания 26,6 ± 1,5

Количество сухого экстракта, полученного разными методами сопоставимо. Метод экстракции в колбе при нагревании и перемешивании занимает меньше времени и не требует постоянного контроля над уровнем растворителя.

Внешние признаки сухого экстракта семян энотеры двулетней.

Сухой экстракт представляет собой аморфный порошок красно-коричневого цвета. При изучении этой субстанции с помощью СЭМ хорошо видна аморфная структура и слоистость частиц (рис.25).

Рисунок - 25. Микрофотография сухого экстракта семян энотеры двулетней, сделанная с помощью СЭМ

С целью характеристики сухого экстракта энотеры двулетней, изучены его технологические свойства: влажность 5%, насыпная масса при свободном падении 0,65 г/см3, насыпная масса при уплотнении 0,87 г/см3, сыпучесть - 1,92 г/с, угол естественного откоса 39°.

Для сухого экстракта был проведен тест «Растворимость» по ОФС 42-0049-07. В результате установлено, что экстракт очень легко растворим в спирте 95% и практически не растворим в воде, ацетоне и хлороформе.

Сухой экстракт из измельченных обезжиренных семян энотеры двулетней был изучен такими физико-химическими методами, как ТСХ (рис.26) и УФ - спектрометрия (рис.27).

В качестве свидетелей при ТСХ использовались стандарты (+) катехина и галловой кислоты. По полученной после проявления 1% спиртовым раствором ИеС1з хроматограмме, сделан вывод о наличии (+) катехина в сухом экстракте энотеры двулетней, исходя из одинаковых значений КГоколо 0,52.

--фронт

черно-"челснос окрашивание

1.0-, о.з 0.6-< 0.4 0.2

ЗОО 400

№ау«ІепдАі (пт)

(+> катехин

Экстракт 1 алловая нітерм кислота двулетней

Рисунок -27. УФ - спектр спиртового экстракта из обезжиренных семян энотеры двулетней

Рисунок - 26. ТСХхроматограмма спиртового экстракта из обезжиренных

семян энотеры двулетней.

На УФ - спектре спиртового экстракта семян энотеры двулетней присутствует единственный максимум на 280 им, характерный для полифенольных соединений, в частности, (+) катехина.

На рисунке 28 представлена технологическая схема получения «Энотеры двулетней семян сухого экстракта».

Спиртовые экстракты из обезжиренных семян смородины красной и гранатника получали путем экстракции сырья в плоскодонной колбе с обратным холодильником при нагревании и перемешивании. Экстракт обезжиренных семян смородины красной представляет собой патокообразную массу красного цвета с характерным запахом смородины красной. При добавлении воды экстракт мутнеет, образуя опапесцирующий раствор белого цвета с розоватым оттенком. Выход экстракта составляет около 10% от массы обезжиренного сырья. Экстракт обезжиренных семян гранатника представляет собой патокообразную массу фиолетового цвета, растворимую в воде и не растворимую в ацетоне. Выход около 15% от массы обезжиренного сырья.

На УФ - спектре спиртового экстракта обезжиренных семян смородины красной 2 максимума: на 215 нм и 268 им. На УФ - спектре спиртового экстракта обезжиренных семян гранатника так же 2 максимума: на 210 нм и 272 нм.

ВР 1.1. Подготовка воздуха

ВР 1.2. Подготовка дезинфицирующих растворов для сашггарной обработки

ВР 1.3. Подготовка помещений и оборудования

ВР 1.4. Подготовка технической одежды

ВР 1.5. Подготовка персонала

ВР 2.1. Прием и анализ сырья обезжиренных и измельченных семян

ВР 2.2. Подготовка первичной упаковки (флаконов)

ТП 4.1. Экстракция

ТП 4.2. Фильтрация экстракта

ТП 4.3. Отгон экстрагента

ТП 4.4. Сушка экстракта

ВР 1. Санитарная подготовка

производства

Отходы

Потери

Потери

ВР 2. Подготовка сырья и упаковки

ВР 3. Подготовка

ТП4.5. Измельчение экстракта

УМО 5.1. Фасовка экстракта

УМО 5.2. Упаковка маркировка

ТП 4. Получение готового продукта Кт.

Отходы

Потери

УМО 5. Упаковка и маркировка

Кт - контроль технологический

т

Потери

На склад готовой продукции

Рисунок - 28. Технологическая схема производства сухого экстракта энотеры двулетней

Полученным экстракт семян энотеры двулетнеП был изучен методом масс-снектрометрнн. На масс-спектре (рис. 29) видны пики, соответствующие молекулам веществ, представленных в таблице 7.

Таблица 7.

Отнесение пиков масс спектра спиртового экстракта семян энотеры двулетней

№ п/п Пик т/г Вещество

1 279 С,6Н2204 -бутилфталат или С,,Н,802 изопропилбифенил

2 289 а С^НпОб-дигидрокемпферол (Гт"0" он о

3 291 он С^НнОб-катехин г^Ч'011 11 1 • ЙЬО он

4 303 он СиНюСЬ-кверцетин (^У" - О ■ -- ТХ^о" ОН О

5 305 ОН С15н,207- 1он дигидрокверцетин Т ]Г он О

6 395 С^Н4с,Оз

7 439 СзоН4(;02 - 2,2-этиледенбис(4,6-дитретбутилфенол)

гея» Р«)

Рисунок - 29. Масс - спектр сухого экстракта семян энотеры двулетней

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Проанализированы литературные данные о методах контроля качества жирных масел и лекарственных форм на их основе. Анализ данных современной номенклатуры лекарственных средств на основе жирных масел и жирных кислот показал, что они составляют не менее 0,5% всех лекарственных средств, зарегистрированных в Российской Федерации.

2. Изучены морфолого-анатомические особенности и выявлены диагностические признаки: семян энотеры двулетнем; замороженных плодов, жома плодов и семена смородины красной; жома плодов и семена гранатника. Методом СЭМ впервые изучена микроархитектура поверхности и поперечных срезов семян энотеры 3-х видов и различного происхождения в сравнительном аспекте. Впервые изучены микроархитектуры поверхностей плодов и семян смородины красной, культивируемой в условиях Подмосковья и поверхностей семян гранатника различного происхождения.

3. Разработаны разделы «Внешние признаки», «Микроскопия» для проектов НД на новые виды сырья. Предложены нормы для регламентирования качества сырья по содержанию жирного масла, влажности, примесей, измельченности.

4. Установлено содержание жирного масла в образцах новых видов сырья и рекомендованы массы навесок, степень измельченное™ сырья и время экстракции. Липидный фрагмент метаболома в семенах энотеры двулетней составляет (21-23)%, в семенах смородины красной -(21-22)% и в семенах гранатника-(15-28)%.

5. Разработаны лабораторные технологические методики получения жирного масла энотеры двулетней, смородины красной и гранатника, в аппарате Сокслета (экстрагент н-гексан), предполагающие гравиметрический контроль над содержанием жирного масла в сырье по массе выделенного масла. Разработаны методики концентрирования семян из жомов, позволяющие повысить выход конечного продукта. Основные показатели качества жирных масел изучены не разрушающими (ЯМР, спектроскопия средней ИК области, измерение показателей преломления) и разрушающими методами (ГХ-МС, ТСХ, определение йодного числа). Установлено: в липидном комплексе семян энотеры двулетней, выращенной в Подмосковье около 8% у-линоленовой кислоты, ненасыщенных жирных кислот почти 94%; в липидном комплексе семян смородины красной более 6% у-линоленовой кислоты, ненасыщенных жирных кислот около 90%; в липидном комплексе семян гранатника почти 40% пуниковой кислоты, более 60% всех жирных кислот - конъюгнрованные, а всего ненасыщенных жирных кислот около 90%.

6. Впервые разработана и валидирована экспресс-методика установления подлинности 3-х жирных масел с помощью ЕИК - спектроскопии. Создана база БИК - спектров для идентификации 18-ти субстанций, являющихся маслами.

7. Проведен фотохимический анализ обезжиренных семян энотеры двулетней, смородины красной и гранатника на основные группы БАВ. Установлено: обезжиренные семена энотеры двулетней содержат полифенольные соединения; обезжиренные семена смородины красной содержат полисахариды, полифенолы и цианидины; обезжиренные семена гранатника содержат полисахариды, полифенолы, сапонины и цианидины.

8. Разработан, оформленный в виде лабораторного регламента, способ получения «Энотеры двулетней семян экстракта сухого» с выходом 26% от массы обезжиренного измельченного сырья. Установлено наличие катехина, кверцетина, дигидрокверцетина, дигидрокемпферола в

сухом экстракте. Определены значения параметров для стандартизации качества этой субстанции.

СППСОК РАПОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Хомик A.C. Фармакогностическое изучение семян энотеры двулетней, как источника жирного масла / A.C. Хомик // Тез. Итоговой конференция студенческого научного общества медицинского факультета Российского университета дружбы народов «Клинические и теоретические аспекты современной медицины». М: РУДН. 2007. С. 83-84.

2. Пономарева С.Ю. Семена Púnica Granatum L. - источник биологически активных веществ. / С.Ю. Пономарева, A.C. Хомик, С.Н. Суслина, В.В. Вандышев // Материалы IV Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов». М.: РАЕН, 2007. С. 102103.

3. Хомик A.C. Фармакогностическое изучение обезжиренных семян энотеры двулетней как перспективного сырья для получения биологически активных веществ полифенольной природы / A.C. Хомик, В.В. Вандышев, Г.И. Климахин // Материалы научной программы 15-той специализированной выставки «Аптека 2008». М.: 2008. С. 82-83.

4. Хомик A.C. Фармакогностическое изучение отходов производства жирных масел из семян растений, накапливающих эссенциальную жирную кислоту типа ю-6 / A.C. Хомик, В.В. Вандышев, С.Н. Суслина // Тез. IX Международного конгесса «Здоровье и образование в XXI веке» РУДН. М.: 2008. С. 558-559.

5. Хомик A.C. Разработка методик приготовления микропрепаратов для установления подлинности свежего лекарственного растительного сырья / A.C. Хомик, В.В. Вандышев, С.Н. Суслина// Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии. №1. М.: 2009. С. 27-32

6. Хомик A.C. Фармакогностическое изучение семян Púnica Granatum L., в качестве источника биологически активных веществ / A.C. Хомик, В.В. Вандышев, С.Ю. Пономарева, С.Н. Суслина, В.И. Шейченко, В.В. Семикин // XVI Конгресс «Человек и лекарство», тез. докл. М.: 2009. С. 760.

7. Хомик A.C. Фармакогностическое изучение обезжиренных плодов Ribes rubrum L. / A.C. Хомик, B.B. Вандышев, С.Н. Суслина // XVI Конгресс «Человек и лекарство», тез. докл. М.:

2009. С. 760.

8. Khomik A.S Photochemical and pharmacognostical study of Oenotherae biennis L., grown in Moscow area / A.S. Khomik, V.V. Vandishev, G.I. Klimakhin, S.N. Suslina // The 13lh International Congress «PhytoPharm 2009» in Bonn, Germany. 29-30 July 2009. P. 58.

9. Хомик A.C., Сравнительное изучение внешних признаков и архитектуры поверхности семян Oenotherae biennis L. разного происхождения / A.C. Хомик, В.В. Вандышев, Г.И. Климахин // Тез. II Международной студенческой научной конференции "Клинические и теоретические аспекты современной медицины» с участием молодых ученых РУДН. М.:

2010. С.218.

10. Хомик A.C. Назначение и роль микроскопического анализа при установлении подлинности лекарственного растительного сырья / A.C. Хомик, В.В. Вандышев, Е.А. Мирошникова // Фармацевтическая промышленность. М.: 2010. №3. С. 54-56.

11. Хомик A.C., Изучение гидрофильного фрагмента метаболома семян Энотеры двулетней методом масс-спектрометрии / A.C. Хомик, В.В. Вандышев, М.В. Овчаров, Н.С. Хучуа, P.A. Абрамович, С.Н. Суслина // Тез. Четвертой Всероссийской конференции-школы «Фундаменальные вопросы масс-спектрометрии и её аналитические применения». Звенигород.: 2010. С. 113-114.

12. Хомик A.C. Морфолого-анатомическое изучение семян энотеры двулетней / A.C. Хомик, В.В. Вандышев, С.Н. Суслина // Фармация. М.: 2011. №3. С. 10-13

13. Быков 13.Л. Исследования коллектива кафедры общем фармацевтическом и биомедицпнскон технологии в области бионнженернн растительных продуцентов биологически активных веществ / В.А.Быков, С.Н. Суслина, Т.Е. Саматадзе, O.A. Ссмкпна, A.C. Хомик, MB. Волжапова, Д.А. Сливкин // Вестник Российского университета дружбы народов Серия: Медицина. № 3. М.: 2011. С. 149-152

14. Хомик A.C. Изучение состава липидной фракции метаболома плодов Ribes rubrum L. и разработка технологии получения жирного масла / A.C. Хомик, O.A. Семкина, С.Н. Суслина, В.А. Быков // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. №9. М.: 2011. С. 8-13

15. Горяинов C.B. Жирнокислотный состав семян Púnica granatum L. из отходов от получения гранатового сока//C.B. Горяинов, A.C. Хомпк, Г. А. Калабин, В.В. Вандышев, P.A. Абрамович // Вестник РУДН. Серия экология и безопасность жизнедеятельности. Nal. M.: 2012. C l 1-18

Список сокращений

БАВ - биологически-активные вещества

БИК - ближняя инфракрасная (область спектра)

ГХ-СМ - газовая хроматография с масс селективным детектором

ГФ - Государственная фармакопея

ИК - инфракрасный

ЛРС - лекарственное растительное сырье

НД- нормативный документ

ОФС - общая фармакопейная статья

СЭМ - сканирующая электронная микроскопия

ТСХ - тонкослойная хроматография

УФ - ультрафиолетовый

ФС - фармакопейная статья

ЯМР - ядерно-магнитный резонанс

Подписано в печать:

08.02.2012

Заказ № 6662 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www. autoreferat. ru