Фармакогностическое исследование травы гречихи посевной (fagopyrum sagittatum gilib.)

Анисимова, Мария Михайловна

Диссертации по медицине → Фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фармакогностическое исследование травы гречихи посевной (fagopyrum sagittatum gilib.)

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Анисимова, Мария Михайловна Самара 2011 г.

Ученая степень: кандидата фармацевтических наук

ВАК РФ: 14.04.02

Автореферат диссертации по медицине на тему Фармакогностическое исследование травы гречихи посевной (fagopyrum sagittatum gilib.)

На правах рукописи

Анисимова Мария Михайловна

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ТРАВЫ ГРЕЧИХИ ПОСЕВНОЙ (РАвОРУШМ ЭАСГТТАТиМ вИЛВ.)

14.04.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

1 5 СЕН 2011

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Самара-2011

4852986

Диссертационная работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГБОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразвития России)

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

доктор фармацевтических наук, профессор

Куркин Владимир Александрович

Аввакумова Надежда Петровна Пупыкина Кира Александровна

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится » октября 20 И г. в Лд часов на заседании диссертационного совета Д 208.085.06 при ГБОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразвития России по адресу: 443079, г. Самара, пр. К.Маркса, 165 Б.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразвития России (г. Самара, ул. Арцыбушевская, 171).

Автореферат разослан « О » Си^йфь 201

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат фармацевтических наук, доцент

1 г.

И.К. Петрухина

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. В настоящее время на фармацевтическом рынке РФ имеется целый ряд лекарственных средств, обладающих ангиопротекторной активностью (Киселева Т.Л. и др., 2003). Большинство растительных лекарственных препаратов, рекомендованных для лечения заболеваний, сопровождающихся повышением проницаемости сосудов, продолжают поступать из-за рубежа (Германия, Польша, Украина и другие страны).

В медицине успешно применяются лекарственные растения, содержащие фла-воноиды. Ярким представителем из них является рутин, обладающий не только ангиопротекторной, капилляроукрепляющей активностью, но и антиоксидантным действием (Самылина И.А., Северцев В.А. и др., 2003). Так, рутин является универсальным органопротектором и применяется в качестве лекарственного средства, причем чаще всего в сочетании с аскорбиновой кислотой («Аскорутин», «Профи-лактин С», поливитаминные препараты).

На сегодняшний день основным источником получения рутина в фармацевтической промышленности являются бутоны софоры японской, однако промышленная сырьевая база указанного растения в РФ отсутствует. Потребность в данном препарате удовлетворяется за счёт импорта (Бразилия, Германия, Китай), что не выгодно с экономической точки зрения. На наш взгляд, перспективным отечественным источником рутина и других флавоноидов может являться трава гречихи посевной (Та^оругит ¡а^ШаЫт вШЬ.), широко культивируемая как ценная пищевая культура в РФ, в том числе и в Самарской области.

В цветущих побегах гречихи в качестве основного компонента содержится до 3-5 % рутина, а также сопутствующие ему другие флавоноиды, в частности, кверце-тин и изокверцитрин, однако данное сырье не используется как источник лекарственных препаратов.

Создание новых отечественных лекарственных средств на основе рутина затруднительно по причине отсутствия унифицированного подхода к стандартизации субстанции и препаратов данного вещества и отсутствия отечественного государственного стандартного образца (ГСО) рутина.

воноидных отечественных средств иа основе комплексного использования данного растения.

Цели и задачи исследования. Фармакогностическое исследование по обоснованию целесообразности использования травы гречихи посевной как потенциального сырьевого источника флавоноидных отечественных лекарственных препаратов.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Исследование анатомо-морфологических признаков травы гречихи посевной.

2. Изучение химического состава травы гречихи посевной.

3. Разработка методик качественного анализа травы гречихи посевной.

4. Разработка методик количественного определения рутина и суммы флавонои-дов в траве гречихи посевной.

5. Изучение динамики накопления рутина и суммы флавоноидов в траве гречихи посевной.

6. Разработка метода получения рутина из травы гречихи посевной и очистки данной субстанции.

7. Разработка методик анализа на субстанцию «Рутин».

8. Изучение показателей качества рутина как стандартного образца.

9. Обоснование возможности использования ГСО рутина в методиках качественного и количественного анализа сырья и препаратов, содержащих рутин.

10. Изучение показателей качества нового вида лекарственного растительного сырья «Гречихи посевной трава» и лекарственных препаратов на основе данного растения «Гречихи экстракт жидкий», «Гречихи экстракт густой».

11. Разработка проектов ФС «Гречихи посевной трава», ФСП «Гречихи экстракт жидкий», «Гречихи экстракт густой».

12. Обоснование целесообразности создания флавоноидных лекарственных препаратов на основе травы гречихи посевной.

водилось с использованием УФ-, 'Н-ЯМР-спектроскопии в сочетании с различными химическими превращениями (кислотный и ферментативный гидролиз). Впервые изучен флавоноидный состав травы гречихи посевной с использованием обра-щенно-фазовой ВЭЖХ.

Обоснована необходимость использования ГСО рутина в методиках качественного и количественного анализа травы гречихи посевной и препаратов на основе рутина.

Изучена динамика накопления флавоноидов, в том числе рутина, в траве гречихи посевной на протяжении всего периода вегетации. Установлено, что наиболее оптимальным временем сбора сырья данного растения является период массового цветения - начала плодоношения (содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин варьирует от 4,90 до 6,10 % в зависимости от места культивирования и года сбора).

С использованием цифровой микроскопии впервые проведены анатомо-гисто-логические исследования травы гречихи посевной, при этом выявлены диагностические признаки сырья, заключающиеся в наличии сосочковидных выростов по краю и по жилкам листа, аналогичных выростов на поверхности околоцветника, уголковая колленхима в ребрах стебля, особенностях строения гинецея, пыльцевых зерен.

Изучены показатели качества травы гречихи посевной и новых лекарственных препаратов «Гречихи экстракт жидкий», «Гречихи экстракт густой», которые нашли свое отражение в соответствующих проектах ФСП.

Обоснована целесообразность использования в медицинской практике нового вида лекарственного растительного сырья «Гречихи посевной трава». Установлено, что жидкий экстракт гречихи обладает выраженным гепатопротекторным и ноо-тропным действием.

Обоснован способ получения рутина из травы гречихи посевной.

Практическая значимость. Разработаны методики качественного и количественного анализа травы гречихи посевной. Проверка на подлинность данного сырья основывается на определении рутина методами тонкослойной хроматографии (ТСХ), спектрофотометрии и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Методики количественного анализа ЛРС гречихи посевной базируются на определении содержания суммы флавоноидов в пересчете на рутин методом спектрофотометрии и рутина методом хроматоспектрофотометрии и ВЭЖХ.

Изучена динамика накопления флавоноидов в траве гречихи посевной. При этом отмечено в отходах травы гречихи посевной после обмолота высокое содержание действующих веществ (2,5 ± 0,10%), что служит доказательством возможности безотходного использования данного растения.

Унифицированы методики качественного и количественного анализа сырья гречихи посевной и ЛС на основе рутина с использованием ТСХ-анализа, спектро-фотометрии и ВЭЖХ. С использованием методик анализа обоснованы способы получения рутина и новых лекарственных препаратов из сырья гречихи посевной.

Разработаны показатели качества ЛРС «Гречихи посевной трава», ЛП «Гречихи экстракт жидкий», «Гречихи экстракт густой».

Разработаны новые унифицированные методики качественного и количественного анализа сырья «Гречихи посевной трава», «Гречихи экстракт жидкий», «Гречихи экстракт густой» с использованием ГСО рутина.

В проект ФС «Гречихи посевной трава» включены разделы «Внешние признаки», «Микроскопия», в которых нашли отражение иллюстрации микропрепаратов сырья гречихи, изготовленных в процессе микроскопического исследования.

Оформлены проекты ФС «Гречихи посевной трава», ФСП на лекарственные препараты «Гречихи экстракт жидкий», «Гречихи экстракт густой», направленные на экспертизу в ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского назначения» Минздравсоцразвития РФ (входящий № 07а - ЦФМС от 19.01.11).

Результаты исследований используются в учебном процессе на кафедре фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии и кафедре химии фармацевтического факультета ГБОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразвития России, в ГУЗ «Центр контроля качества лекарственных средств Самарской области», ЗАО «Самаралектравы» (акты внедрения от 22.04.2011 г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Результаты анатомо-морфологического исследования травы гречихи посевной.

2. Результаты изучения химического состава травы гречихи посевной.

3. Результаты исследований по разработке подходов к стандартизации ЛРС гречихи посевной и ЛП на основе рутина.

4. Методики качественного анализа ЛРС «Гречихи посевной трава» и ЛП «Гречихи экстракт жидкий», «Гречихи экстракт густой» с использованием ГСО рутина, ТСХ, спектрофотометрии и ВЭЖХ.

5. Методики количественного определения рутина и суммы флавоноидов ЛРС «Гречихи посевной трава» и ЛП «Гречихи экстракт жидкий», «Гречихи экстракт густой» с использованием ГСО рутина, ТСХ, спектрофотометрии и ВЭЖХ.

6. Результаты исследований по обоснованию показателей качества травы гречихи посевной, а также лекарственных препаратов «Гречихи экстракт жидкий», «Гречихи экстракт густой».

7. Способ получения рутина из травы гречихи посевной.

Связь задач исследования с планами научных работ. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (№ Государственной регистрации 01200105332) и Республиканских программ:

1. «Совершенствование лекарственного обеспечения населения и лечебно-профилактических учреждений в рыночных условиях» по теме: «Создание лекарственных средств природного происхождения антимикробного, адаптогенного и гепатопро-текторного действия» (№ Государственной регистрации 01990005277).

2. «Разработка методик качественного и количественного анализа сырья и препаратов лекарственных растений, содержащих фенилпропаноиды и флавоноиды» (№ Государственной регистрации 01990007536).

Апробация работы. Материалы работы доложены и обсуждены на конференции дипломированных специалистов «Молодые ученые - медицине» «Аспирантские чтения-2009»; на конкурсе программы «Участник Молодежного Научно-Инновационного Конкурса» («УМНИК» 2009 г.); на VII Международном симпозиуме по фе-нольным соединениям: фундаментальные и прикладные аспекты (2009 г.); на X, XIII, XV Всероссийских конгрессах «Экология и здоровье человека» (Самара, 2006, 2008, 2009 гт.); на инновационной смене Всероссийского Форума «Селигер-2010» по программе «У.М.Н.И.К. на СТАРТ» (2010 г.); II Российском фитотерапевтиче-ском съезде (г. Москва, 2010 г.).

Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 25 научных работах, из них 7 статей в журналах, рекомендуемых ВАК РФ.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 158 страницах машинописного текста, содержит 19 таблицы, 66 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, 4-х глав, отражающих результаты собственных экспериментальных исследований и их обсуждение, общих выводов, приложения и списка литературы, включающего 156 источников, из которых 38 - на иностранных языках.

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, отмечена новизна и практическая значимость полученных результатов, а также изложены положения, выносимые на защиту.

Глава 1 содержит аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы по современному состоянию исследований гречихи посевной, в котором обобщены и систематизированы сведения по изучению химического состава растения, фармакологической активности, применению в медицинской практике.

В главе 2 представлена характеристика объектов и методов исследования. Приведены методики анатомо-морфологического, химического и физико-химического изучения лекарственного сырья, индивидуальных веществ и препаратов, а также контроля качества ЛП на основе сырья гречихи посевной.

В главах 3-6 экспериментальной части приводятся результаты собственных исследований по изучению химического состава травы гречихи посевной, совершенствованию методик стандартизации данного сырья и ЛП на его основе, разработке новых препаратов, оценке их качества и обоснованию целесообразности внедрения в медицинскую практику в качестве ангиопротекторных ЛС.

В Приложения включены: результаты микроскопического анализа, материалы по разработке НД, акты внедрения.

Результаты, полученные при проведении исследований, обработаны статистически и представлены в таблицах, формулах, на рисунках, которые приведены в тексте диссертации.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Морфолого-анатомический анализ травы гречихи посевной

Исследования морфолого-анатомического строения изучаемого сырья гречихи (лист, стебель, цветок, плод) и его порошка проводили с использованием цифрового микроскопа Motic DM111 (с кратностью увеличения 4x10; 10x10; 40x10; 100x10) и

цифрового стереоскопического микроскопа Мойс БМ-39С-Ы900-А (возможность увеличения: х 20; х 40). Приготовление микропрепаратов проводили в соответствии с ГФ СССР XI издания.

А <дг/00)

I ,;

9.Х

: .у

I* **

да

, (Х4Ш1)

Рис. 1. Результаты анатомо-гистологических исследований

Обозначения: А - Край листа с сосочковидними выростами; Б - Гинецей цветка; В -Уголковая колленхима стебля; Г - Пыльники; Д - эпидермис стебля; Е -поверхность околоцветника; Ж - Порошок травы с диагностическими признаками; 3 - Железка на эпидермисе стебля.

Микроскопический анализ травы гречихи позволил выявить диагностические признаки сырья, заключающиеся в наличии сосочковидных выростов по краю и по жилкам листа (рис. 1А), аналогичных выростов на поверхности околоцветника (рис. 1Е), уголковая колленхима в ребрах стебля (рис. 1В), особенностях строения гинецея (рис. 1Б), пыльников и пыльцевых зерен (рис. 1Г). Результаты проведенного исследования подтверждаются соответствующими микрофотографиями (рис. 1).

(.х400)

Б 1x40)

2. Фитохимическое исследование лекарственного растительного сырья гречихи посевной. В результате изучения химического состава травы гречихи посевной {Fagopyrum sagittatum ОШЬ.), культивируемой в Самарской области, выделены и идентифицированы 5 индивидуальных соединений, относящихся к флаво-ноидам (рутин, кверцетин, изокверцитрин) и фенилпропаноидам (хлорогеновая, кофейная кислоты) (табл. 1).

Для установления структуры выделенных веществ использованы данные ТСХ-анализа, УФ-, 'Н-ЯМР-спектров, результаты химических превращений, а также непосредственное сравнение с достоверными образцами веществ. Отсутствие примесей в получаемых соединениях контролировали методом ТСХ в нескольких системах растворителей и с использованием различных способов детекции.

Таблица 1

Физико-химические характеристики

4. Хлорогеновая кислота: с16н18о9 24гг° н° уЧн /чшх (ЕЮН) 243, 300 (пл), 330 нм Т. пл. 203-205° (вода).

5. Кофейная кислота: СрНзО,) ноп нс/ч^х\соон X™ (ЕЮН) 243, 299 (пл), 328 нм Т. пл. 182-184° (вода).

Рутин (1) желтое с зеленоватым оттенком кристаллическое вещество состава С27Нз0О16; УФ-спектр: А™,, 257, 267пл, 362 нм. 'Н-ЯМР-спектр (200 МГц), 5, м.д.: 7,66 (д, 9 Гц, Н-21), 7,58 (д, 9 Гц, Н-61), 6,91 (д, 9 Гц, Н-51), 6,44 (д, 2,5 Гц, Н-8), 6,21 (д, 2,5 Гц, Н-6), 5,07 (д, 7 Гц, Н-1 "-глюкозы), 4,56 (д, 2 Гц, Н-1ш-рамнозы), 4,4 - 3,2 (м, бН-глюкозы + 4Н рамнозы) (рис. 2).

Мм

"Л !: 1»

А_О.

Рис. 2. 'И-ЯМР-спектр рутина в смеси дейтероацетона и 02()

3. Исследование по стандартизации травы гречихи посевной 3.1. Качественный анализ сырья гречихи посевной

Для определения подлинности травы гречихи посевной разработана методика тонкослойной хроматографии (ТСХ).

3.1.1. Тонкослойная хроматография

В задачу исследования входил подбор системы растворителей и способа детектирования зон адсорбции на хроматограмме, позволяющих идентифицировать

флавоноиды. Разделение флавоноидов было оптимальным в системе растворителей: хлороформ - метанол - вода (26:14:3) («БИиМ ЦУ 254») или н-бутанол - уксусная кислота - вода (4:1:2) («Сорбфил ПТСХ-П-А-УФ», «Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ»), В данных условиях четко разделяются флавоноидные и фенилпропаноидные соединения. Для обнаружения веществ на хроматограмме использовали детекцию в УФ-свете (254 нм и 366 нм).

Рис. 3. Схема ТСХ водно-спиртовых извлечений из травы гречихи посевной

Обозначения: 1 - водно-спиртовое извлечение из травы гречихи посевной (70% спирт этиловый); 2 - рутин; 3 - никотифлорин; 4 - изокверцитрин; 5 - кверцетин.

На хроматограмме обнаруживается доминирующее пятно с величиной около 0,4 (рутин), а также проявляются другие пятна, в частности, пятно фиолетового цвета с величиной Кг - 0,2 (хлорогеновая кислота), с - 0,45 (никотифлорин), - 0,8 (кверцетин) и с - 0,6 (изокверцитрин) (рис. 3), идентифицируемые с помощью достоверно известных образцов указанных веществ.

При проявлении хроматограммы щелочным раствором диазобензолсульфокистоты (ДСК) также обнаруживается доминирующее пятно с величиной К(~0,4 (на уровне аналогичного пятна ГСО рутина). Наличие доминирующего пятна рутина является аналитическим эффектом метода, позволяющим применять его в разделе «Качественные реакции».

3.1.2. Спектрофотометрия

Электронные спектры флавоноидных соединений и суммарных извлечений из ЛРС, содержащих флавонолы, характеризуются, как правило, 2 максимумами по-

глощения. УФ-спектр раствора Б (рис. 4) должен иметь максимум поглощения при длине волны X ™ = 256 ±2 нм и 362 нм ±2 нм (флавоноиды).

Следовательно, характер кривой поглощения раствора водно-спиртовых извлечений из травы гречихи посевной практически соответствуют таковому электронного спектра раствора рутина.

3.2. Количественный анализ сырья гречихи посевной

3.2.1. Количественное определение суммы флавоноидов в траве гречихи посевной

С учетом того, что трава гречихи посевной является перспективным источником не только рутина, но и суммарных препаратов, нами предлагается анализировать сумму флавоноидов, содержащихся в сырье изучаемого растения.

Для оценки количественного содержания суммы флавоноидов, содержащихся в траве гречихи посевной, был предложен метод дифференциальной спектрофотомет-рии с комплексообразователем А)С1з, при этом обоснована целесообразность использования ГСО рутина (рис. 4).

Рис. 4. Электронные спектры водно-спиртовых извлечений травы гречихи посевной

Обозначения: 1 - водно-спиртовое извлечение из травы гречихи посевной;

2 - водно-спиртовое извлечение из травы гречихи посевной с добавлением А1С13;

3 - дифференциальный спектр.

Расчет содержания суммы флавоноидов в гречихе посевной проводится при длине волны X = 362 нм. Содержание суммы флавоноидов в пересчете на ГСО рутин и абсолютно сухое сырье в процентах (А) вычисляют по формуле:

_ Д »у40 25 100 100 ' П0-т-5-50-(Ю0-ИО'ГДе

О - оптическая плотность испытуемого раствора; Д, - оптическая плотность раствора ГСО рутина; т - масса сырья, г; т„ - масса ГСО рутина, г; IV- потеря в массе при высушивании в процентах.

Содержание суммы флавоноидов в гречихе посевной варьирует от 5,30 до 6,10 % в зависимости от места культивирования и года сбора.

Таблица 2

Метрологические характеристики спектрофотометрической методики количественного определения суммы флавоноидов в траве гречихи посевной

/ X £ Р, % ((Р.!) ЛХ Е, %

10 5,41 0,10067 95 2,23 0,225 ±4,15

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин в траве гречихи методом дифференциальной спектрофотометрии представлены в таблице 2. Результаты статистической обработки проведенных опытов свидетельствуют о том, что ошибка единичного определения рутина в траве гречихи посевной с доверительной вероятностью 95% составляет ± 4,15%.

Для количественного изучения динамики накопления флавоноидов определяли спектрофотометрическую зависимость концентрации флавоноидов в сырье от фазы вегетации гречихи посевной.

Таблица 3

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин в зависимости от фазы вегетации

Время сбора № образца Фаза вегетации Содержание флавоноидов, %

21 июня 1 начало вегетации 4,86 + 0,02

28 июня 2 Вегетация 5,01+0,03

06 июля 3 начало цветения 5,10 + 0,02

18 июля 4 Цветение 5,19 + 0,03

29 июля 5 Цветение 5,27 + 0,04

09 августа 6 массовое цветение 5,41 + 0,03

17 августа 7 массовое цветение - начало плодоношения 5,67 ± 0,04

28 августа 8 начало плодоношения 5,59 + 0,04

12 сентября 9 трава после обмолота 2,51 +0,04

Проведенные исследования образцов, собранных в разные фазы вегетации, свидетельствуют о том, что по мере роста гречихи концентрация БАС в вегетатив-

ной массе вначале возрастает, достигая максимума во время полного (массового) цветения - начала плодоношения (в возрасте 30-40 дней), а далее постепенно уменьшается во время завязывания плодов (табл. 3).

Наибольшее содержание флавоноидов выявлено в образцах, собранных в фазу массового цветения - начала плодоношения, при этом трава гречихи после обмолота представляет собой не менее интересное сырье в качестве источника флавоноидов (2,51 ±0,04%).

3.2.2. Количественное определение рутина в траве гречихи посевной

В связи с тем, что спектрофотометрическая методика не позволяет избирательно определить целевое вещество (рутин) в смеси флавоноидных соединений, изучена возможность определения данного флавоноида методом хроматоспектрофо-тометрии.

Для оценки количественного содержания рутина в траве гречихи посевной был предложен метод хроматоспектрофотометрии с использованием ГСО рутина.

Хроматографическое разделение водно-спиртового извлечения из травы гречихи посевной проводили в системе растворителей: хлороформ - метанол - вода (26:14:3) на пластинках «Силуфол УФ 254» или «Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ». Пятно соответствующее ГСО рутину со значением Яг около 0,4 вырезали и десорбировали в этиловый спирт.

Оптическую плотность полученных элюатов измеряли на спектрофотометре «Бресогё 40» в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 362 нм на фоне элюата контрольного опыта.

Содержание рутина в траве гречихи посевной в процентах (X) на абсолютно сухое сырье вычисляли по формуле:

Р-т0 -40-5 1 0,01 100 ~ £>о-'"-О,ОЗ-5О-25-5-(1ОО-0')'ГДе

О - оптическая плотность испытуемого раствора; О0 - оптическая плотность раствора ГСО рутина; т - масса сырья, г; т0 - масса ГСО рутина, г; IV - потеря в массе при высушивании в процентах.

Содержание рутина в траве гречихе посевной, культивируемой в Самарской области, находится в диапазоне 2,50-3,70 %.

Метрологические характеристики методики количественного определения рутина в траве гречихи методом хроматоспектрофотометрии представлены в таблице 4. Результаты статистической обработки проведенных опытов свидетельствуют о том, что ошибка единичного определения рутина в траве гречихи посевной с доверительной вероятностью 95% составляет ± 4,90 %.

Таблица 4

Метрологические характеристики хроматоспектрофотометрической методики количественного определения рутина в траве гречихи посевной

/ X S Р, % t(PJ) АХ Е, %

10 3,05 0,06702 95 2,23 0,149 ±4,90

3.3. Исследование возможности использования метода ВЭЖХ для

стандартизации сырья гречихи посевной

В целях совершенствования стандартизации JIPC гречихи посевной проведены исследования по изучению возможности использования метода ВЭЖХ, который одновременно может сочетать качественное и количественное определение флаво-ноидов.

Анализ водно-спиртовых извлечений из травы гречихи посевной проводили методом обращенно-фазовой ВЭЖХ на хроматографе «Милихром-5» в изократи-ческом режиме (колонка КАХ 6-80-4 № 6 25.01.99, стационарная фаза - «Separon Cig», подвижная фаза - смесь ацетонитрила и воды в соотношении 30:70 с добавлением 1% ледяной уксусной кислоты, скорость потока - 0,1 мл/мин). Детекцию флавоноидов проводили при аналитической длине волны ?ч,1ах 360 нм, а также при других длинах волн: 254, 270, 290, 330 нм.

На хроматограмме испытуемого раствора (рис. 5А) пик № 3 соответствует по времени удерживания пику ГСО рутина, анализ которого проводился в тех же условиях, что и проба водно-спиртового извлечения травы гречихи посевной (рис. 5Б).

В экспериментально подобранных условиях при температуре окружающей среды 20 °С, доминирующий пик (№2), соответствующий ГСО рутина, имеет время удерживания 2,4 мин (рис. 5).

А Б

Рис. 5. Хроматограмма анализа травы гречихи посевной: А - проба водно-спиртового извлечения травы гречихи посевной, Б - проба ГСО рутина

Особенностью данной методики является её универсальность и возможность приложения в анализе других препаратов, в составе которых имеются флавоноиды гречихи посевной.

Метрологические характеристики методики количественного определения рутина в траве гречихи методом ВЭЖХ представлены в таблице 5. Результаты статистической обработки проведенных опытов свидетельствуют о том, что ошибка единичного определения рутина в траве гречихи посевной с доверительной вероятностью 95% составляет ± 4,65 %.

Таблица 5

Метрологические характеристики методики ВЭЖХ-анализа количественного определения рутина в траве гречихи посевной

/ X 5 Р, % ДХ Е, %

10 3,10 0,0646 95 2,23 0,144 ±4,65

4. Исследования по разработке и стандартизации лекарственных препаратов на основе гречихи посевной

На основании результатов настоящих исследований химического состава травы гречихи посевной, а именно высокого содержания БАС флавоноидной природы (рутин), было проведено исследование по разработке способа получения новых флавоноидных препаратов «Гречихи экстракт жидкий» и «Гречихи экстракт густой».

4.1. Стандартизация препаратов на основе травы гречихи посевной

При разработке методик качественного анализа и количественного определения содержания флавоноидов в препаратах травы гречихи посевной мы придерживались принципа унификации методов анализа в ряду лекарственное растительное сырье - фитосубстанция - лекарственная форма (Самылина И.А. и др., 1994). За основу взяты подходы к стандартизации, рекомендованные нами при разработке методик качественного и количественного анализа травы гречихи посевной с использованием ГСО рутина. Коррекции подвергались лишь размеры проб (навески) анализируемых объектов. Определение проводили в 11-ти повторениях, результаты анализа подвергали статистической обработке.

Для качественной оценки препаратов нами предложено использовать комплексный подход, заключающийся в одновременном применении ТСХ-анализа (рис. 7) и спектрофотометрии.

Количественное содержание флавоноидов в препаратах гречихи посевной, как и в отношении сырья, определяли методом дифференциальной спектрофотометрии (рис. 8) с использованием ГСО рутина, что нашло отражение в проектах ФСП на жидкий и густой экстракты гречихи.

Содержание суммы флавоноидов в жидком и густом экстрактах гречихи посевной варьирует от 2,4 до 3,10 % и от 23,41 до 24,10 % соответственно в зависимости от места культивирования и года сбора исходного сырья.

Таблица 6

Метрологические характеристики спектрофотометрической методики количественного определения суммы флавоноидов в препаратах «Гречихи экстракт жидкий» и «Гречихи экстракт густой»

Наименование лекарственного препарата / X б1 Р, % ЮС Е, %

Гречихи экстракт жидкий 10 2,51 0,0425 95 2,23 0,095 ±3,78

Гречихи экстракт густой 10 23,90 0,5005 95 2,23 1,116 ±4,87

Помимо метода дифференциальной спектрофотометрии нами разработаны методики количественного анализа рутина в препаратах гречихи методом ВЭЖХ.

При ВЭЖХ-анализе ЛП «Гречихи экстракта жидкого» и «Гречихи экстракта густого» считаем рациональным использовать раствор А из метода спектрофото-метрического анализа исследуемого препарата.

Таблица 7

Метрологические характеристики методики ВЭЖХ-анализа количественного определения рутина в препаратах «Гречихи экстракт жидкий» и «Гречихи экстракт густой»

Наименование лекарственного препарата / X S Р, % t(P.J) Л* Е, %

Гречихи экстракт жидкий 10 1,84 0,0355 95 2,23 0,070 ±4,30

Гречихи экстракт густой 10 7,73 0,1716 95 2,23 0,383 ±4,95

Содержание рутина в препаратах «Гречихи экстракт жидкий» и «Гречихи экстракт густой» находится в диапазоне 1,50-2,10 % и 7,10-8,20 % соответственно.

Метрологические характеристики методики количественного определения рутина в жидком и густом экстракте гречихи посевной представлены в таблице 7.

4.2. Обоснование способа получения субстанции «Рутин» из травы гречихи посевной

Как указывалось выше, рутин является одним из ценнейших антиоксидантов, применяемых в медицине. В мировой практике его получают из сырья софоры японской, промышленная сырьевая база которого отсутствует в РФ. По этой причине до настоящего момента рутин поступает на отечественный фармацевтический рынок из-за рубежа.

Ранее был описан способ получения рутина из гречихи посевной, однако он имел низкий выход готового продукта и не нашел применения в промышленности.

В настоящей работе приведены результаты исследований по разработке технологии получения субстанции «Рутин» из травы гречихи посевной. Способ получения рутина был разделён на несколько этапов: первый этап - получение технического рутина; второй этап - очистка целевого продукта путем перекристаллизации. При этом получили субстанцию рутина с высокой степенью очистки. Выход рутина составил 1,5-2,0 % от массы воздушно-сухого сырья. Качество очистки рутина оценивают с помощью ТСХ, спектрофотометрии и ВЭЖХ.

Результаты сравнительных исследований показали, что образец рутина, полученный из травы гречихи посевной, не уступает по показателям качества образцу рутина импортного производителя (Merck). Для получения стандартного образца рутина использовал рехроматографию на полиамиде с последующей перекристаллизацией.

5. Обоснование целесообразности использования в медицинской практике нового вида лекарственного растительного сырья «Гречихи посевной трава» и лекарственных препаратов на основе данного сырья.

В результате проведенных исследований травы гречихи посевной выявлено высокое содержание флавоноидов (до 6,50 %) и доминирующего флавоноида - рутина (до 3,10%). Данное сырье может быть использовано как в качестве источника для получения импортозамещающих флавоноидных препаратов, так и в качестве отечественного источника рутина. В рамках обоснования целесообразности создания лекарственных препаратов на основе травы гречихи посевной нами были разработаны проекты ФСП на препараты «Гречихи экстракт жидкий» и «Гречихи экстракт густой».

Исследования по выявлению фармакологической активности полученного образца гречихи экстракта жидкого проводили на кафедре фармакологии им. заслуженного деятеля науки РФ проф. A.A. Лебедева ГБОУ ВПО СамГМУ Минздравсоц-развития России под руководством профессора A.B. Дубищева и профессора O.JL Кулагина, при этом было выявлено гепатопротекторное действие и нейротропная активность.

Изучение гепатопротекторного действия жидкого экстракта гречихи, содержащего флавоноиды, проводили при токсическом поражении печени при применении парацетамола (опыт 1) и изониазида (опыт 2) в опытах in vivo. В процессе исследования (опыт 1) было установлено, что в крови животных 2 группы в обоих опытах наблюдалось уменьшение уровня общего билирубина и AJIAT, в гомогенате печени - увеличение активности каталазы и уменьшение количества малонового диальде-гида. В результате проведенных исследований нами были разработаны возможные пути преодоления гепатотоксического действия изониазида и парацетамола в опытах in vivo с применением экстракта гречихи жидкого.

Ноотропное действие экстракта гречихи жидкого изучали путем выработки условного рефлекса активного избегания (УРАИ), помещая животных в камеру с электрифицированным решетчатым полом на расположенную в центре безопасную площадку. В ходе эксперимента было установлено, что время поиска безопасной площадки при повторном воздействии тока сокращалось в 4 раза по сравнению с контролем при введении экстракта гречихи, а количество обученных крыс в иссле-

дуемой группе составило 100% на второй день опыта. Результаты, полученные в ходе эксперимента, свидетельствуют о влиянии препарата на процессы запоминания, а также на концентрацию внимания при избегании электроболевого раздражения, что доказывает ноотропное действие жидкого экстракта гречихи посевной.

ВЫВОДЫ

1. В результате анатомо-морфологического исследования нового вида лекарственного растительного сырья «Гречихи посевной трава» выявлены морфолого-анатомические особенности строения данного сырья, которые положены в основу разделов «Внешние признаки» и «Микроскопия» проекта ФСП «Гречихи посевной трава».

2. В ходе изучения химического состава гречихи посевной, культивируемой в Самарской области, выделены пять индивидуальных веществ: рутин, кверцетин, изокверцитрин (флавоноиды), хлорогеновая и кофейная кислоты (фенилпропаноиды), идентификация которых осуществлялась с помощью УФ-, 'Н-ЯМР-спектроскопии, результатов химических превращений (кислотный и ферментативный гидролиз).

3. Разработаны методики качественного анализа ЛРС «Гречихи посевной трава» и ЛП «Гречихи экстракт жидкий», «Гречихи экстракт густой» с использованием ГСО рутина, ТСХ, спектрофотометрии и ВЭЖХ.

4. Разработаны методики количественного анализа ЛРС «Гречихи посевной трава» по содержанию суммы флавоноидов в пересчете на ГСО рутин методом дифференциальной спектрофотометрии и рутина методом хроматоспектрофотометрии. Содержание суммы флавоноидов в гречихе посевной варьирует от 5,30 до 6,10 % в зависимости от места культивирования и года сбора, содержание рутина находится в диапазоне 2,50-3,70 %.

5. Изучена динамика накопления флавоноидов в траве гречихи, при этом выявлена оптимальная для сбора сырья фаза вегетации данного растения -фаза массового цветения - начала плодоношения.

6. Обоснован способ получения субстанции «Рутин» из травы гречихи посевной, позволяющий получать целевое вещество с выходом 1,5-2,0 % от массы воздушно-сухого сырья.

7. На основе результатов проведенных исследований предложены подходы к

стандартизации сырья гречихи посевной, заключающиеся в использовании таких методов анализа, как тонкослойная хроматография, УФ-спектроскопия, дифференциальная спектрофотометрия, хроматоспектрофотометрия, ВЭЖХ с применением ГСО рутина в методиках анализа.

8. Разработаны методики количественного анализа ЛП «Гречихи экстракт жидкий», «Гречихи экстракт густой» по содержанию суммы флавоноидов в пересчете на ГСО рутин методом дифференциальной спектрофотометрии и рутина методом ВЭЖХ использованием ГСО рутина. Содержание суммы флавоноидов в жидком и густом экстрактах гречихи посевной варьирует от 2,4 до 3,10 % и от 23,41 до 24,10 % соответственно. Содержание рутина в препаратах «Гречихи экстракт жидкий» и «Гречихи экстракт густой» находится в диапазоне 1,50-2,10 % и 7,10-8,20 % соответственно.

9. Изучены показатели качества новых лекарственных препаратов «Гречихи экстракт жидкий», «Гречихи экстракт густой» с использованием ГСО рутина, которые положены в основу соответствующих проектов ФС и на их основе разработаны проекты ФС «Гречихи посевной трава», ФСП «Гречихи экстракт жидкий», «Гречихи экстракт густой».

10. Выявлена гепатопротекторная и ноотропная активность ЛП «Гречихи экстракт жидкий». Обоснована целесообразность внедрения лекарственных препаратов на основе нового вида лекарственного растительного сырья «Гречихи посевной трава».

Список работ, опубликованных по теме диссертации;

1. Анисимова, М.М. Трава гречихи посевной - перспективный сырьевой источник ангиопротекторных препаратов / М.М. Анисимова // Известия Самарского научного центра РАН. - 2008. - T. II. - С. 190-192.

2. Куркин, В.А. Антиоксидантная активность суммарных извлечений травы гречихи посевной / М.М. Анисимова, В.А. Куркин // Известия самарского научного центра РАН. - 2009. - T. II, № 1 (6).-С. 1259-1261.

3. Куркин, В.А. Создание ресурсосберегающих технологий переработки лекарственного растительного сырья / В.А. Куркин, Е.В. Авдеева, В.Б. Браславский, O.E. Правдивцева,

A.B. Куркина, М.В. Егоров, В.В. Стеняева, В.М. Рыжов, Ф.Ш. Сатдарова, Л.Н. Зимина, Д.Г. Буланкин, М.М. Анисимова, J1.P. Сулейманова, Н.Р. Шагалиева, А.И. Хусаинова // Известия Самарского научного центра РАН.-2010. - К» 12,№ I (З).-С. 737-740.

4. Анисимова, М.М. Качественный и количественный анализ флавоноидов травы гречихи посевной / М.М. Анисимова, В.А. Куркин, В.Н. Ежков // Известия Самарского научного центра РАН.- 2010. -№ 12 (33), Ks 1 (8).-С. 2011-2014.

5. Анисимова, М.М. Анатомо-морфологическое исследование травы гречихи посевной (Fagopy-rum sagiltatum Gilib.) / М.М. Анисимова, В.А. Куркин, В.М. Рыжов, Л.В. Тарасенко II Медицинский альманах. - 2010. - № 3 (12).- С. 204-206.

6. Анисимова, М.М. Методические и методологические аспекты стандартизации травы гречихи посевной / М.М. Анисимова // Аспирантский вестник Поволжья. - Самара, 2011. - Т. 1-2. -С. 177-179.

7. Анисимова, М.М. Исследование возможности использования высокоэффективной жидкостной хроматографии для стандартизации сырья гречихи посевной / М.М. Анисимова, В.А. Куркин,

B.М. Рыжов//Известия Самарского научного центра РАН.-2011.-№ 13,№ I (4).-С. 767769.

8. Анисимова, М.М. Трава гречихи посевной - перспективный источник рутина / М.М. Анисимова // Труды X Всероссийского конгресса «Экология и здоровье человека». - Самара, 2005. -

C. 17-18.

9. Анисимова, М.М. Трава гречихи как потенциальный источник рутина / М.М. Анисимова II Аспирантские чтения Поволжья: сб. науч. тр. - Самара, 2007. - С. 184-191.

10. Kurkin, V. A. The new methodological approaches to the standartization of the some medicinal plants containing the flavonouds and phenylpropanoids / E.V. Avdeeva, V.B. Braslavsky, O.E. Pravdivtseva, A.V. Kurkina, M.V. Egorov, V.M. Ryzhov, O.V. Sharova, E.S. Artamonova, F.S. Satdarova,

A.V. Egorova, Mohammed Lamrini, L.N. Zimina, М.М. Anisimova, D.G. Bulankin, A.V. Smirnov // XXIVth International conference on Polyphenols Communications: Vol.1., Salamanca, 2008. -P. 185-186.

11. Анисимова, М.М. Трава гречихи посевной - новый сырьевой источник ангиопротекторных и антиоксидантных лекарственных средств / М.М. Анисимова, В.А. Куркин // VIII Международный симпозиум «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования». М..РУДН, 2009.-С. 9-12.

12. Куркин, В.А. Лекарственные растения как источник импортзамещающих гепатопротекторных, антиоксидантных, иммуномодулирующих и нейротропных лекарственных средств / В.А. Куркин, Е.В. Авдеева, В.Б. Браславский, O.E. Правдивцева, A.B. Куркина, М.В. Егоров, В.В. Стеняева, В.М. Рыжов, Ф.Ш. Сатдарова, Л.Н. Зимина, Д.Г. Буланкин, М.М. Анисимова // VIII Международный симпозиум «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования». М.: РУДН, 2009. - С. 360-363.

13. Анисимова, М.М. Фитохимический анализ травы гречихи посевной / М.М. Анисимова,

B.А. Куркин // VII Международный симпозиум по фенольным соединениям: фундаментальные и прикладные аспекты. Материалы докладов. 19-23 октября 2009 г. - Москва Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, 2009. - С. 18-19.

14. Анисимова, М.М. Трава гречихи посевной - перспективный источник капиллярукрепляющих и антиоксидантных лекарственных средств/ М.М. Анисимова // XV Всероссийская научко-прак-тическая конференция «Молодые ученые в медицине»: тез. докл. - Казань, 2010. - С. 245.

15. Анисимова, М.М. Трава гречихи посевной - новый сырьевой источник ангиопротекторных и антиоксидантных лекарственных средств/ М.М. Анисимова // 4-ая Всероссийская с международным участием научно-методическая конференция «Фармобразование-2010»: Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Поиск новых физиологически активных веществ, ч. II, научные основы создания новых лекарственных средств. - Воронеж, 2010. -С. 34-35.

16. Куркин, В.А. Флавоноиды и фенилпропаноиды - перспективные антиоксиданты лекарственных растений / В.А. Куркин, Е.В. Авдеева, В.Б. Браславский, O.E. Правдивцева, A.B. Куркина, М.В. Егоров, В.В. Стеняева, В.М. Рыжов, Ф.Ш. Сатдарова, Л.Н. Зимина, Д.Г. Буланкин, М.М. Анисимова, JI.P. Сулейманова, Н.Р. Шагалиева, А.И. Хусаинова // Тезисы докладов VIII Международной конференции «Биоантиоксидант». -М., 2010. -С.241-243.

17. Анисимова, М.М. Качественный и количественный анализ флавоноидов травы гречихи посевной / М.М. Анисимова // Материалы докладов Всероссийской конференции «Молодые ученые -медицине» Аспирантские чтения.-Самара, 2010.- С. 219-222.

18. Анисимова, М.М. Анатомо-диагностическое исследование травы гречихи посевной ОFagopyrum sagillalum Gilib.) / М.М. Анисимова, В.А. Куркин, В.М. Рыжов, Л.В. Тарасенко // II Российский фитотерапевтический съезд: сб. науч. тр. - М., 2010. - С. 94-97.

19. Kurkin, V.A. The new metodological approaches to the standartization of the some medical plants containing the flavonoids/ E.V. Avdeeva, V.B. Braslavsky, O.E. Pravdivtseva, A.V. Kurkina, M.V. Egorov, V.M. Ryzhov, D.G. Bulankin, M.M. Anisimova, A.V. Egorova, L.N. Zimina // Polyphenols Communication. - Salamanca, 2010. - P. 548-549.

20. Куркин, В.А. Флавоноиды и фенилпропаноиды как биологически активные соединения лекарственных растений / В.А. Куркин, Е.В. Авдеева, В.Б. Браславский, O.E. Правдивцева,

A.B. Куркина, М.В. Егоров, В.В. Стеняева, В.М. Рыжов, Ф.Ш. Сатдарова, Л.Н. Зимина, Д.Г. Буланкин, М.М. Анисимова, Л.Р. Сулейманова, Н.Р. Шагалиева, А.И. Хусаинова // Актуальные проблемы химии природных соединений: сб. тез. конф. - Ташкент, 2010. - С. 8-9.

21. Анисимова, М.М. Перспективы использования травы гречихи посевной как сырьевого источника ангиопротекторных препаратов / М.М. Анисимова, В.А.Куркин // XVIII Российского национального конгресса «Человек и лекарство»: тез. докл. - М., 2011. - С. 499-500.

22. Анисимова, М.М. Разработка новых подходов к стандартизации перспективных лекарственных растений / М.М.Анисимова, Л.Н. Зимина, Л.Р. Сулейманова // «Гаммермановские чтения -2011»: сб. науч. тр. -С.-Пб., 2011.-С. 8-10.

23. Корчагина, Д.В. Исследование нейротропной активности препаратов зверобоя пятнистого и гречихи посевной / Д.В. Корчагина, A.B. Дубищев, М.М. Анисимова, Л.Н. Зимина, М.С. Горемыкина // Всероссийская научно-практическая конференция, посвященная 40-летию фармацевтического факультета Самарского государственного медицинского университета «Современная фармацевтическая наука и практика: традиции, инновации, приоритеты». -Самара, 2011. - С. 403-406.

24. Кулагин, О.Л. Возможные пути преодоления гепатотоксического действия изониазида в опытах in vivo/ О.Л. Кулагин, A.A. Царева, Т.М. Кривошеева, Е.С. Чуманова, М.М. Анисимова// Там же. - Самара, 2011. - С. 406-408.

25. Кулагин, О.Л. Гепатопротекторное действие препаратов растительного происхождения, содержащих флавоноиды, при токсическом поражении печени / О.Л. Кулагин, A.A. Царева,

B.В. Кулаков, И.С. Муллова, М.М. Анисимова// Там же. - Самара, 2011. - С. 417-419.

26. Удостоверение на рационализаторское предложение № 161 ГБОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразвития России от 20.06.2011 «Способ получения жидкого экстракта гречихи посевной» / В.А. Куркин, М.М. Анисимова.

27. Удостоверение на рационализаторское предложение № 162 ГБОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразвития России от 20.06.2011 «Методика количественного определения рутина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)» / М.М. Анисимова, В.А. Куркин, В.М. Рыжов.

Подписано в печать 21.06.2011 г. Формат 60x84/16. Бумага офсетная. Печать оперативная. Объем 1,45 усл. печ. л. Тираж 100 экз. Заказ № 1367.

Отпечатано в типография ООО «Офорт». 443080, г. Самара, ул. Революционная, 70, литера П. Тел.: 372-00-56, 372-00-57.

Оглавление диссертации Анисимова, Мария Михайловна :: 2011 :: Самара

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. Современное состояние исследований травы гречихи посевной (Обзор литературы).

1.1. Историческая справка.

1.2. Ботанико-фармакогностическая характеристика гречихи посевной.

1.3. Ареал и промышленное возделывание гречихи посевной

1.4. Заготовка и переработка травы гречихи посевной.

1.5. Химический состав травы гречихи посевной.

1.6. Проблемы стандартизации травы гречихи посевной и препаратов на ее основе.

1.6.1. Микроскопический анализ семейства Гречишные.

1.6.2. Методы качественного и количественного анализа травы гречихи и препаратов на основе рутина.

1.7. Фармакологические свойства рутина и препаратов на его основе.

1.8. Применение травы гречихи посевной в научной и народной медицине.

1.9. Перспективы создания новых препаратов на основе травы гречихи посевной.

Выводы к главе 1.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Глава 2. Объекты и методы исследования.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Методы морфолого-анатомического исследования.

2.2.2. Химические методы (качественные реакции).

2.2.3. Хроматографические методы.

2.2.4. Физикохимические методы.

2.2.5. Методы, использованные для получения лекарственных средств и определения числовых показателей.

2.2.6. Фармакологические методы.

2.2.7. Статистические методы обработки результатов исследований.

Глава 3. Морфолого-анатомический анализ травы гречихи посевной.

3.1. Изучение морфологических особенностей гречихи посевной.

Анатомо-гистологическое исследование цельного сырья гречихи посевной.

3.2.1. Гистология листа гречихи.

3.2.2. Анатомия и гистология стебля.

3.2.3. Гистология цветка.

3.2.4. Гистология плода.

3.3. Микроскопическое изучение измельченного сырья гречихи посевной.

3.4. Анатомо-морфологическое исследование примесных видов 70 Выводы к главе 3.

Глава 4. Фитохимическое исследование лекарственного растительного сырья гречихи посевной.

4.1. Сравнительное ТСХ-исследование различных органов гречихи посевной.

4.2. Подбор оптимальных условий экстракции.

4.3. Изучение динамики накопления флавоноидов в траве гречихи посевной.

4.4. Изучение химического состава нового вида лекарственного растительного сырья «Гречихи посевной трава».

Выводы к главе 4.

Глава 5. Исследование по стандартизации травы гречихи посевной.

5.1. Разработка методик качественного анализа травы гречихи посевной.

5.1.1. Тонкослойная хроматография.

5.1.2. Спектрофотометрия.

5.2. Разработка методики количественного анализа травы гречихи посевной.

5.2.1. Количественное определение суммы флавоноидов в траве гречихи посевной.

5.2.2. Количественное определение рутина в траве гречихи посевной.

5. 3. Исследование возможности использования метода ВЭЖХ для стандартизации сырья.

Выводы к главе 5.

Глава 6. Исследования по разработке и стандартизации лекарственных препаратов на основе гречихи посевной.

6.1, Исследование по стандартизации экстракта гречихи жидкого.

6.1.1. Обоснование способа получения экстракта гречихи жидкого.

6.1.2. Стандартизация экстракта гречихи посевной жидкого.

6.1.2.1. Разработка методики качественного анализа.

6.1.2.2. Разработка методик количественного определения рутина и суммы флавоноидов густого.

6.1.3. Изучение фармакологической активности экстракта гречихи жидкого.

6.1.3.1. Гепатопротекторное действие.

6.1.3.2. Нейротропная активность.

6.2. Исследование по стандартизации экстракта гречихи густого.I.

6.2.1 Обоснование способа получения экстракта гречихи густого

6.2.2. Стандартизация экстракта гречихи посевной густого.

6.2.2.1. Разработка методики качественного анализа.

6.2.2.2. Разработка методик количественного анализа рутина и суммы флавоноидов в густом экстракте гречихи посевной.

6.3. Обоснование способа получения субстанции «Рутин» из ^д травы гречихи посевной

Выводы к главе 6.

Введение диссертации по теме "Фармацевтическая химия, фармакогнозия", Анисимова, Мария Михайловна, автореферат

В медицине успешно применяются лекарственные растения, содержащие флавоноиды. Ярким представителем из них является рутин, обладающий не только ангиопротекторной, капилляроукрепляющей активностью, но и антиоксидантным действием (Самылина И.А., Северцев В.А. и др., 2003). Так, рутин является универсальным органопротектором и применяется в качестве лекарственного средства, причем чаще всего в сочетании с аскорбиновой кислотой («Аскорутин», «Профилактин С», поливитаминные препараты).

На сегодняшний день основным источником получения рутина в фармацевтической промышленности являются бутоны софоры японской, однако промышленная сырьевая база указанного растения в РФ отсутствует. Потребность в данном препарате удовлетворяется за счёт импорта (Бразилия, Германия, Китай), что не выгодно с экономической точки зрения. На наш взгляд, перспективным отечественным источником рутина и других флавоноидов может являться трава гречихи посевной (Ра%рругит sagШatum вШЬ.), широко культивируемая как ценная пищевая культура в РФ, в том числе и в Самарской области.

В цветущих побегах гречихи в качестве основного компонента содержится до 3-5 % рутина, а также сопутствующие ему другие флавоноиды, в частности, кверцетин и изокверцитрин, однако данное сырье не используется как источник лекарственных препаратов.

Таким образом, представляется актуальным фитохимическое исследование травы гречихи посевной в рамках разработки отечественного стандартного образца и современных подходов к химическому анализу лекарственного растительного сырья (ЛРС), а также создание новых флавоноидных отечественных средств на основе комплексного использования данного растения.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Исследование анатомо-морфологических признаков травы гречихи посевной.

2. Изучение химического состава травы гречихи посевной.

3. Разработка методик качественного анализа травы гречихи посевной.

4. Разработка методик количественного определения рутина и суммы флавоноидов в траве гречихи посевной.

5. Изучение динамики накопления рутина и суммы флавоноидов в траве гречихи посевной.

6. Разработка метода получения рутина из травы гречихи посевной и очистки данной субстанции.

7. Разработка методик анализа на субстанцию «Рутин».

8. Изучение показателей качества рутина как стандартного образца.

11. Разработка проектов ФСП «Гречихи посевной трава», «Гречихи экстракт жидкий», «Гречихи экстракт густой».

Научная новизна. В результате изучения химического состава водно-спиртовых извлечений травы гречихи посевной, культивируемой в Среднем Поволжье, в том числе и в Самарской области, впервые выделены и идентифицированы 5 индивидуальных соединений - рутин (доминирующий компонент исследуемого растения), а также кверцетин, изокверцитрин, хлорогеновая, кофейная кислоты. Установление структуры и изучение физико-химических свойств выделенных веществ проводилось с использованием УФ-, ^-ЯМР-спектроскопии в сочетании с различными химическими превращениями (кислотный и ферментативный гидролиз). Впервые изучен флавоноидный состав травы гречихи посевной с использованием обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

С использованием цифровой микроскопии впервые проведены анатомо-гистологические исследования травы гречихи посевной, при этом выявлены диагностические признаки сырья, заключающиеся в наличии сосочковидных выростов по краю и по жилкам листа, аналогичных выростов на поверхности околоцветника, уголковая колленхима в ребрах стебля, особенностях строения гинецея, пыльцевых зерен.

Обоснован способ получения рутина из травы гречихи посевной.

Практическая значимость. Разработаны методики качественного и количественного анализа травы гречихи посевной. Проверка на подлинность данного сырья основывается на определении рутина методами тонкослойной хроматографии (ТСХ), спектрофотометрии и ВЭЖХ. Методики количественного анализа ЛРС гречихи посевной базируются на определении содержания суммы флавоноидов в пересчете на рутин методом спектрофотометрии и рутина методом хроматоспектрофотометрии и ВЭЖХ.

Унифицированы методики качественного и количественного анализа сырья гречихи посевной и ЛС на основе рутина с использованием ТСХ-анализа, спектрофотометрии и ВЭЖХ. С использованием методик анализа обоснованы способы получения рутина и новых лекарственных препаратов из сырья гречихи посевной.

В проект ФСП «Гречихи посевной трава» включены разделы «Внешние признаки», «Микроскопия», в которых нашли отражение иллюстрации микропрепаратов сырья гречихи, изготовленных в процессе микроскопического исследования.

Оформлены проекты ФСП «Гречихи посевной трава», на лекарственные препараты «Гречихи экстракт жидкий», «Гречихи экстракт густой», направленные на экспертизу в ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского назначения» Минздравсоцразвития РФ (входящий № 07а -ЦФМС от 19.01.11).

Результаты исследований используются в учебном процессе на кафедре фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии и кафедре химии фармацевтического факультета ГБОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразвития России (акт внедрения от 25.04.2011 г.), в ГУЗ «Центр контроля качества лекарственных средств Самарской области», ЗАО «Самаралектравы» (акт внедрения от 11.04.2011 г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Результаты анатомо-морфологического исследования травы гречихи посевной.

2. Результаты изучения химического состава травы гречихи посевной.

5. Методики количественного определения рутина и суммы флавоноидов ЛРС «Гречихи посевной трава» и ЛП «Гречихи экстракт жидкий»,

Гречихи экстракт густой» с использованием ГСО рутина, ТСХ, спектрофотометрии и ВЭЖХ.

7. Способ получения рутина из травы гречихи посевной.

1. «Совершенствование лекарственного обеспечения населения и лечебно-профилактических учреждений в рыночных условиях» по теме: «Создание лекарственных средств природного происхождения антимикробного, адаптогенного и гепатопротекторного действия» (№ Государственной регистрации 01990005277).

Апробация работы. Материалы работы доложены и обсуждены на конференции дипломированных специалистов «Молодые ученые - медицине» «Аспирантские чтения-2009»; на конкурсе программы «Участник Молодежного Научно-Инновационного Конкурса» («УМНИК!» 2009 г.); на VII Международном симпозиуме по фенольным соединениям: фундаментальные и прикладные аспекты (2009 г.); на X, XIII, XV Всероссийских конгрессах «Экология и здоровье человека» (Самара, 2006, 2008, 2009 гг.); на инновационной смене Всероссийского Форума «Селигер-2010» по программе «У.М.Н.И.К. на СТАРТ» (2010 г.); II Российском фитотерапевтическом съезде (Москва, 2010 г.).

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 158 страницах машинописного текста, содержит 19 таблиц, 66 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, 4-х глав, отражающих результаты собственных экспериментальных исследований и их обсуждение, общих выводов, приложения и списка литературы, включающего 156 источников, из которых 38 - на иностранных языках.

Заключение диссертационного исследования на тему "Фармакогностическое исследование травы гречихи посевной (fagopyrum sagittatum gilib.)"

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

5. Изучена динамика накопления флавоноидов в траве гречихи, при этом выявлена оптимальная для сбора сырья фаза вегетации данного растения - фаза массового цветения - начала плодоношения.

7. На основе результатов проведенных исследований предложены подходы к стандартизации сырья гречихи посевной, заключающиеся в использовании таких методов анализа, как тонкослойная хроматография, УФ-спектроскопия, дифференциальная спектрофотометрия, хроматоспектрофотометрия, ВЭЖХ с применением ГСО рутина в методиках анализа.

8. Разработаны методики количественного анализа ЛП «Гречихи экстракт жидкий», «Гречихи экстракт густой» по содержанию суммы флавоноидов в пересчете на ГСО рутин методом дифференциальной спектрофотометрии и рутина методом ВЭЖХ использованием ГСО рутина. Содержание суммы флавоноидов в жидком и густом экстрактах гречихи посевной варьирует от 2,40 до 3,10 % и от 23,41 до 24,10 % соответственно. Содержание рутина в препаратах «Гречихи экстракт жидкий» и «Гречихи экстракт густой» находится в диапазоне 1,50-2,10 % и 7,10-8,20 % соответственно.

9. Изучены показатели качества нового вида лекарственного растительного сырья «Гречихи посевной трава» и новых лекарственных препаратов на основе данного сырья «Гречихи экстракт жидкий», «Гречихи экстракт густой» с использованием ГСО рутина, которые положены в основу соответствующих проектов ФС и на их основе разработаны проекты ФСП «Гречихи посевной трава», «Гречихи экстракт жидкий», «Гречихи экстракт густой».

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2011 года, Анисимова, Мария Михайловна

1. Арзамасцев, А.П. Валидация аналитических методов / А.П. Арзамасцев, Н.П, Садчикова, Ю.Я. Харитонов // Фармация. 2006. -Т. 54. - № 4. - С.8-12.

2. Арзамасцев, А.П. Государственные стандартные образцы лекарственных веществ (проект общей фармакопейной статьи) /

3. A.П. Арзамасцев, B.JI. Дорофеев, Н.П. Садчикова // Ведомости научного центра экспертизы и государственного контроля лекарственных средств. МЗ РФ, 2000. - № 3. - С. 24-26.

4. Арзамасцев, А.П. Основные аспекты совершенствования фармакопейного анализа / А.П. Арзамасцев, B.JI. Багирова, Н.П. Садчикова // Хим.- фармац. журн. 2000. - Т. 34, № 5. - С.47-48.

5. Арзамасцев, А.П. Стратегия в области совершенствования фармакопейного анализа лекарственных средств / А.П. Арзамасцев,

6. B.JI. Багирова, Н.П. Садчикова // Человек и лекарство: тез. докл. VII Рос. нац. конгр. 10-14 апр. 2000 г. М., 2000. - С. 599.

7. Атлас ареалов и ресурсов лекарственных растений СССР / под ред. П.С. Чикова. М., 1980. - 340 с.

8. Ахрем, A.A. Тонкослойная хроматография / A.A. Ахрем, А.И. Кузнецова. М.: Наука, 1964. - 153 с.

9. Багирова, B.JI. О стандартизации лекарственных средств на современном этапе / В. JI. Багирова, Е. JI. Ковалева, Н. П. Садчикова // Хим. фармац. журн. - 2001. - Т. 34, № 11. - С. 46-47.

10. Барабой, В.А. Биологическое действие растительных фенольных соединений / В.А. Барабой. Киев: Наукова Думка, 1976. - С. 69.

11. Беленький, Б.Г. Тонкослойная хроматография. В кн.: Успехи хроматографии. К 100-летию со дня рождения М.С. Цвета. / Под ред. К.В. Чмутова и К.И. Сакодынского. М.: Наука, 1972. - С. 134162.

12. Беликов, В.В. Реакции комплексообразования в анализе флавоноидов /В.В. Беликов, Точкова Т.В. // Фенольные соединения и их физиологические свойства. Алма-Ата, 1973. - С. 168-172.

13. Беляков, К.В. Методические подходы к определению биологически активных веществ в лекарственном растительном сырье спектрофотометрическим методом. -М., 2004. 186 с.

14. Березовская, Т.П. Методы микроскопического анализа ботанических объектов / Т.П. Березовская, Н.В. Дощинская, Е.А. Серых. Томск, 1978. - 113 с.

15. Биологически активные вещества растительного происхождения / Головкин Б.Н., Руденская Р.Н., Трофимова И.А. и др.: в трех томах. М.: Наука, 2001. - 764 с.

16. Богачев, В.Ю. Современная фармакотерапия хронической венозной недостаточности нижних конечностей / В.Ю. Богачев // Фармацевтический вестник. 2002. - №12. - С. 24-25.

17. Ботанико-фармакогностический словарь / под ред. К.Ф. Блиновой, Г.П. Яковлева. -М.: Высш. шк., 1990. 272 с.

18. Брунори, А. Современное понимание перспектив возделывания и использования гречихи в Центральной и Южной Италии / А. Брунори, Г. Бавиелло, М. Колонна, М. Рисси, Г. Иззи, М. Тотх, Г. Вегвари // Вестник ОрелГАУ. 2010. - № 4 (25). - С. 23- 30.

19. Бурмистров, А.Н. Медоносные растения и их пыльца. / А.Н. Бурмистров, В.А. Никитина. -М.: Росагропромиздат, 1990. 192 с.

20. Васильев, В.П. Аналитическая химия. В 2-х ч. Ч II. Физико-химические методы анализа. Учеб. для химико-технол. спец. вузов. /В.П. Васильев. -М.: Высш. шк., 1989.-384 с.

21. Витамин Р его свойства и применение. Сборник статей. Отв. ред.

22. B. Н. Бунин и М.Н. Запрометов. М., Изд-во АН СССР. - 1959. - С. 45-50.

23. Воронина, Т. А. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Т.А. Воронина, С.Б. Середенин. М., 2000. - С. 122-136.

24. Воронина, Т. А. Травы восточной медицины / Т. А. Воронина, A.B. Воронина,-М.; СПб., 1991.-320 с.

25. Выделение и анализ природных биологически активных веществ / Под ред. Сироткиной Е.Е. Томск.: Изд. Томского университета, 1987.- 184 с.

26. Гаммерман, А.Ф. Лекарственные растения / А.Ф. Гаммерман, Г.Н. Кадаев, А.Н. Яценко-Хмелевский. М.: Высшая школа, 1983. - 400 с.

27. Геккелер, К. Аналитические и препаративные лабораторные методы / К. Геккелер, X. Экштайн. М.: Химия, 1994. - 409 с.

28. Георгиевский, В.П. Биологически активные вещества лекарственных растений / В.П. Георгиевский, Н.Ф. Комиссаренко,

29. C.Е. Дмитрук. Новосибирск: Наука, Сиб. отд., 1990. - 330 с.

30. Георгиевский, В.П. Применение хроматографии в тонком слое для идентификации и количественного определения биологически активных веществ растительного происхождения. М.: Наука, 1978. -68 с.

31. Георгиевский, В.П. 50 лет тонкослойной хроматографии / В.П. Георгиевский, Ю.В. Шостенко // Фармация. 1989. - Т. 38, № 3. -С. 86-87.

32. Гомеопатия и фитотерапия в лечении сердечно сосудистых болезней / Под. ред. Киселевой Т.Л. и Карпеева А. А. М.: Мосгорпечать. - 1997. - т. 1. - С. 279, т. 2. - С. 967.

33. ГОСТ 17768-80. Средства лекарственные. Упаковка, маркировка, транспортировка и хранение.

34. ГОСТ 19092-92: Гречиха. Требования при заготовках и поставках

35. Государственная фармакопея КНР (на китайском языке). Пекин, 2000.-Т. 1.-668 с.

36. Государственная фармакопея Российской Федерации. 12 изд. - М.: Научный центр экспертизы средств медицинского применения, 2008.-4.1.-704 с.

37. Государственная фармакопея СССР. Десятое издание. - М.: Медицина, 1986.- 1078 с.

38. Государственная фармакопея СССР. Общие методы анализа / МЗ СССР. 11 изд. -М.: Медицина, 1987. - Вып. 1.-336 с.

39. Государственная фармакопея СССР. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье / МЗ СССР. 11 изд. - М.: Медицина, 1990. - Вып. 2. - 398 с.

40. Государственный реестр лекарственных средств. Офиц. изд. (Данные по состоянию на 1 апр. 2008 г.). - М.: Ремедиум, 2008. -1208 с.

41. Гречиха как источник флавоноидов /Под ред. В.К. Шумного. -Новосибирск: «Наука», 1985.-243 с.

42. Дерффель, К. Статистика в аналитической химии / К. Дерффель. -М.: Мир., 1994.-С. 248.

43. Долгова, A.A. Руководство к практическим занятиям по фармакогнозии / A.A. Долгова, Е.Я. Ладыгина. М.: Медицина. -1977.-с. 215.

44. Долгова, A.A. Морфолого-анатомическое исследование лекарственного растительного сырья: практикум по фармакогнозии / A.A. Долгова, Е.Я. Ладыгина. -М.: Медицина, 1977. С. 227-228.

45. Ефименко, Д.Я., Гречиха / Д.Я. Ефименко, Р.И. Барабаш. М.: Мир, 1990.-6 с.

46. Жидкостная колоночная хроматография / Под ред. 3. Дейла, К. Мацека, Я. Янака (пер. с англ.). М.: Мир, 1978. - 428 с.

47. Зайцев, В.М., Прикладная медицинская статистика / Лифляндский В.Г., Маринкин В.И. С.-Пб. Фолиант, 2003. - 432 с.

48. Жизнь растений. Т.5. Цветковые растения. - М.: Просвещение, 1980.-С. 382-385.

49. Зенкевич, И.Г. Обзор физико-химических методов стандартизации настоек, экстрактов и эликсиров в ведущих странах Европы и Америки // И.Г. Зенкевич, В.Л. Багирова., Т.А. Сокольская, Е.Б. Нечаева // М., Фармация. 2002.- № 1. - С. 43-45.

50. Зенкевич, И.Г. Методы количественного хроматографического анализа лекарственных веществ. Пособие для фармацевтических работников / И.Г. Зенкевич, В.М. Косман. С.-Пб.: СПХФА, 1999. -81 с.

51. Зотиков, В.И. Современное состояние и перспективы развития производства гречихи в России / В.И. Зотиков, Т.С. Наумкина, B.C. Сидоренко // Вестник ОрелГАУ. 2010. - № 4 (25). - С. 18-23.

52. Иванов, В.И. Лекарственные растения в народной медицине / В.И. Иванов. -М.: Военное изд-во, 1992. -442 с.

53. Инг, В. Состотяние процесса производства и разработки стратегий в отношении продуктов из гречихи в Китае / В. Инг, Ч. Дзя, Ф. Ибаили // Вестник ОрелГАУ. 2010. - № 4 (25). - С. 9-15.

54. Кадырова, Л. Р. Морфология вегетативных и репродуктивных органов растений Fagopyrum esculentum Moench ssp. vulgare Stolet: автореф. дис. .канд. биол. наук: 03.00.05. / Кадырова Луиза Равилевна. Казань, 2004. - 24 с.

55. Кирхнер, Ю. Тонкослойная хроматография. В 2-х томах. / Пер. с англ. Под ред. д.х.н., проф. В.Г. Березкина. М.: Мир, 1981. - 1139 с.

56. Киселева, Т.Л. Фитопрепараты в терапии хронической венозной недостаточности / Т.Д. Киселева, A.B. Майнсков // «Российские аптеки». 2007. №7. - С. 23-25.

57. Киселева, Т.Л. Лечебные свойства круп / Т.Л. Киселева, A.A. Карпеев, Ю.А. Смирнова, В.П. Сафонов, Е.В. Цветаева, Л.И. Коган И.Л. Блинков, М.А. Дронова // Традиционная медицина. 2009. - № 4 (9).-С. 24-31.

58. Кияшко, В.А. Консервативное лечение хронической венозной недостаточности / В.А. Кияшко // РМЖ. 2002. - т. 10. - №26.

59. Ковалева, Н.Г. Лечение растениями. Очерки по фитотерапии / Н.Г. Ковалева-М.: Медицина, 1971. С.278.

60. Колесникова, В.Г. Лекарственные растения: мифы и реальность / В.Г. Колесникова, В.А. Марченко, Н.В. Сыровежко С.-Пб.: СПХФА, 1998.-261 с.

61. Крефт, И. Разработка функционально новых продуктов питания на основе гречихи обыкновенной и татарской / И. Крефт, К. Икеда, С. Икеда, Б. Вомбергар // Вестник ОрелГАУ. 2010. - № 4 (25). - С. 15-18.

62. Кузнецова, М.А. Сказания о лекарственных растениях / М.А. Кузнецова, A.C. Резникова. М.: Высшая школа, 1992. - С. 133-135.

63. Куркин, В.А. Актуальные аспекты стандартизации лекарственного растительного сырья, содержащего флавоноиды / В.А Куркин // Человек и лекарство: тез. докл. XIV Рос. нац. конгр. М., 2007. С. 839.

64. Куркин, В.А. Фармакогнозия: Учебник для студентов фармацевтических вузов / В.А. Куркин. 2-е изд., перераб. и доп. -Самара: Офорт; СамГМУ, 2007. - 1239 с.

65. Куркин, В.А. Основы фитотерапии: учебное пособие: Самара: ООО «Офорт», ГОУ ВПО «СамГМУ Росздрава», 2009. - 963 с.

66. Куркин, В.А. Программа по фармакогнозии с основами фитотерапии (для студентов медицинских и фармацевтических вузов, врачей и фармацевтических работников) / В.А. Куркин. М.; Самара, 2001.-28 с.

67. Куркин, В.А. Современные аспекты химической классификации биологически активных соединений лекарственных растений / В.А. Куркин // Фармация. 2002. - Т. 50. - № 2. - С. 8-16.

68. Курс органической химии / П. Каррер; Пер с немец. В.Э. Вассерберга, Э.М. Левиной, Л.Д. Родионовой; Под ред. М.Н. Колосова. С-Пб.: Гос. Научно-техническое издат. хим. Литературы, 1962. - 1216 с.

69. Лавренов, В.К. Энциклопедия лекарственных растений народной медицины / В.К. Лавренов, Г.В. Лавренова С.-Пб.: Издательский дом «Нева», 2003. - 272 с.

70. Лазарева, Т.Н. Полиморфизм белков семян у видов и сортов гречихи Fagopyrum Mill.: автореф. дис. .канд. биол. наук: 03.00.12 / Лазарева Татьяна Николаевна. СПб, 2007. - 20 с.

71. Лекарственные растения / Гринкевич Н.И., Баландина И.А., Самылина И.А., Ермакова В.А. и др.; Под ред. Гринкевича Н.И. -М.: Высшая школа, 1991.- 398 с.

72. Лечение растениями: основы фитотерапии: Учеб. пособие / В.М. Баева. М.: ООО «Издательство Астрель», 2004. - 202 с.

73. Майников, A.B. Лекарственные средства растительного прорисхождения в терапии хронической венозной недостаточности / Майнсков A.B., Киселева Т.Л., Колхир В.К., Черных Д.С., Быков В.А. М.: Изд-во МОКБ «Марс», 1999. - 42 с.

74. Машковский, М.Д. Лекарственные средства: Практ.пособие. В.2 т. Т.2. 14 изд., перераб., исправ. и доп. - М.: Новая волна, 2000. - 608 с.

75. Муравьева Д.А. Фармакогнозия: Учебник / Д.А. Муравьева. М.: Медицина, 1991. - С. 512-513.

76. Муравьева, Д.А. Фармакогнозия: учеб. / Д.А. Муравьева, И.А. Самылина, Г.П. Яковлев. 4-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 2002.-656 с.

77. Настойки, экстракты, эликсиры и их стандартизация / под ред. В.Л. Багировой, В.А. Северцева. СПб.: СпецЛит, 2001. - 223 с.

78. Орлов, В.И. Жидкостная хроматография: теоретические основы / В.И. Орлов, A.A. Аратсков. Дзержинск, 1997. - 82 с.

79. ОСТ «Стандарты качества лекарственных средств». Основные положения 91500.05.001 00 (ОСТ).

80. Пастушенков, Л. В. Фармакотерапия с основами фитотерапии / Л.В. Пастушенков, Е.Е. Лесиовская. СПб.: СПХФИ, 1995. - Ч. I, II.

81. Паламарчук, И.А. Изучение растительной клетки / И.А. Паламарчук, Т.Д. Веселова. -М.: Просвещение, 1969. 143 с.

82. Палов, М. Энциклопедия лекарственных растений / М. Палов. Пер. с немец.- М.: Мир, 1989. 467 с.

83. Парахин, H.B. Гречихи: биологические возможности и пути их реализации / Н.В. Парахин // Вестник ОрелГАУ. 2010. - № 4 (25). - С. 4-9.

84. Племенков, В.В. Введение в химию природных соединений / В.В. Племенков. Казань, 2001.-376 с.

85. Правила сбора и сушки лекарственных растений / под ред. А.И Шретера. М.: Медицина, 1985. - 328 с.

86. Растения для нас: Справочное издание / Под ред. Г.П. Яковлева и К.Ф. Блиновой. С.-Пб.: Учебная книга, 1996. 654 с.

87. Растительные ресурсы СССР. Цветковые растения, их химический состав, использование. Семейства Magnoliaceae Limoniaceae / Под. ред. A.A. Федорова. - JL: Наука, 1984. - 464 с.

88. Регистр лекарственных средств России / под ред. Г.Л. Вышковского. -М.: РЛС-2007, 2006. 1312 с.

89. Рейхарт, Д.В. Проблемы экспертизы и утверждения фармакопейных статей предприятий на лекарственные средства / Д.В. Рейхарт, В.Л. Багирова, Е.Л. Ковалева // Хим.- фармац. журн. 2002. - Т. 36. -№ 1.-С. 42-43.

90. Романенко, Г.А. 30 лет Международной ассоциации исследователей гречихи (IBRA) вехи и тенденции / Г.А. Романенко // Вестник ОрелГАУ. - 2010. - № 4 (25). - С. 2-4.

91. Самылина, И. А. Основные направления исследований лекарственных растений на современном этапе / И.А. Самылина, И.С. Грицаенко, Н.К. Горчакова // Современные аспекты изучения лекарственных растений: науч. тр. М., 1995. - Т. XXXIV. - С. 3-6.

92. Самылина, И.А. Пути использования лекарственного растительного сырья и его стандартизация / И.А. Самылина, И.А. Баландина // Фармация. —2004. №2. - С. 39-41.

93. Самылина, И.А. Лекарственные растения Государственной фармакопеи. / И.А.Самылина, В.А. Северцева, ч.1, 2. М., 2003. 534 с.

94. Смирнова, Е.Б. Гречиха как источник рутина ценного лекарственного сырья / Е.Б. Смирнова, В.А. Кузьминов // Вестник Саратовского госагроуниверситета им. Н.И. Вавилова. - 2010. - № 8. -С. 35-38.

95. Советы пчеловоду / М.Ф. Шеметков, В.И. Головнев, М.М. Кочевой. 3-е изд., перераб. И доп. - Мн.: Ураджай, 1991. - 399 с.

96. Соколов, С.Я. Справочник по лекарственным растениям (фитотерапия) / С. Я.Соколов, И. П. Замотаев. М.: Металлургия, 1989.-428 с.

97. Справочник по лекарственным растениям (фитотерапия): Справ. / Сост.: С.Я. Соколов, И.П. Замотаев. -М.: Медицина, 1988.-463 с.

98. Стоник, В.А., Г.А. Толстиков Природные соединения и создание отечественных лекарственных препаратов // Вестник Российской академии наук. 2008. - Т. 78. - № 8 - С. 675-687.

99. Тайны народной медицины. Полная энциклопедия / Сост. А.В.Маркова. М., 2003. - 637 с.

100. Технология лекарственных форм / Под ред. Ивановой Л.А.: М. -Медицина. 1991. - Т. 2. - С. 420.

101. Фармакогнозия. Атлас. Учеб. пособие для студентов фармацевт, ин-тов и фармацевт, фак-тов мед. ин-тов / Е.Я. Ладыгина, Н.И. Гринкевич, И.А. Самылина и др.; Под ред. Н.И. Гринкевич., Е.Я. Ладыгиной. М.: Медицина, 1989. - 511 с.

102. Фармакопея США, USP 29. Национальный формуляр, NF 24. в 2 т.: (пер. с англ.). -М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. - Т. 1. - 1720 с.

103. Фенилпропаноиды лекарственных растений / В.А. Куркин, Г.Г. Запесочная, Е.В. Авдеева, В.Н. Ежков. Самара: Офорт; СамГМУ, 2005.- 128 с.

104. Фесенко, А.Н. Новые методы селекции гречихи (Fagopyrum esculentum Moench.): автореф. дис. .докт. биол. наук: 06.01.05 / Фесенко Алексей Николаевич. СПб, 2009. — 44 с.

105. Фесенко Н.В. От Дикуши к Дикулго. Селекция гречихи в 20-м столетии (исторический обзор) // Вопросы физиологии, селекции и технологии возделывания сельскохозяйственных культур. — Орел: Орелиздат, 2001. С. 89-93.

106. Флора СССР: в 2 т. М.; Л.: Изд-во АН СССР, 1954. - Т.2. - 720 с.

107. Хржановский, В.Г. Практикум по курсу общей ботаники: Учеб. пособие / В.Г. Хржановский, С.Ф. Пономаренко. М.: Высш. школа, 1979.-422 с.

108. Хроматография в тонких слоях / Под ред. Э. Шталя. М.: Мир, 1965.- 508 с.

109. Хроматография: Практическое применение метода: в 2-х ч.: пер. с англ./ Ш. Чарме и др., под ред. Э. Хефтмана. М.: Мир, 1986. -422 с.

110. Шаршунова, М. Тонкослойная хроматография в фармации и клинической биохимии / М. Шаршунова, В. Шварц, Ч. Михалец. -М.: Мир, 1980.-Т. 1,2.

111. Энциклопедия лекарственных растений. Пер. с немец. / Предисл. И.А. Губанова. -М., Мир, 1998. С. 209-210.

112. Afanas'ev, I. В. Different antioxidant activies of bioflavonoids rutin in normal and iron overloading rats / I. B. Afanas'ev, E.A. Natalia, G. K. Ludmila // Biochem. Pharmacol. - 1995. - vol. - 50. - P. 627-735.

113. Autery, A. Pharmacodynamics and pharmacocinetics ofVeliten (rutine, alfa-tocopherol and ascorbic acid) in patients with chronic venous insufficienc / A. Autery et al. // Int.J.CHn.Pharmacol.Res. 1994. - № 14(3).-P. 95-100.

114. British Herbal Compendium / Ed. P.R.Bradly. Bournemouth, 1992.

115. British Herbal Pharmacopoeia. Vol. 1. - Bournemouth, 1990.

116. British Pharmacopoeia. Vol. 1-2. - London, 1993.

117. British Pharmacopoeia. Appendix III, 2001. - Vol. 11.

118. Cheatle, T.R. Drug treatment of chronic venous insufficiency and venous ulceration: a review / T.R. Cheatle, J.H. Scurr, P.D. Colerige Smith//J.R. Soc. Med. 1991.-№ 84 (6).-P. 354-358.

119. Chen, Q.F. A study of resources of Fagopyrum (Polygonaceae) native to china. / Q.F. Chen//Bot. Y. Linn. Soc. 1999: 130. P. 53-64.

120. Gross, H. Beitrage zur Kenntnis der Polygonaceae / H. Gross // Bot. Jahrbucher fur Systematik, Pflanzengeschichte und Pflanzengeographie. 1913. - B. 49. H. 2. - P. 234-339.

121. European Pharmacopoeia. 2004. - Vol. 6, No. 20.4.

122. Ernst E. Konservative Therapie der chronisch venösen Insuffizienz / E. Ernst, T. Saradeth //Wien.Med.Wochenschr. 1992. V.I42. No 1. p. 1622.

123. Carpentier, P. Epidemiologie de L'lnsuffisance Veineuse hronique / P. Carpentier, P. Priollett // Presse Med. 1994. - No 5. - P. 197-205.

124. Jovanotic, S. V. Flavonoids as antioxidants / S.V. Jovanotic, S. Steenken, M. Tosic, B. Marjanovic, M.G. Simic // J. Am. Chem. Soc. 1994. - Vol. 116. -P.4846 -4851.

125. Mabry, T.J. The Systematic Identification of Flavonoids / TJ. Mabry, K.R. Markham, M.B. Thomas // Springer Verlag, Berlin-Heidelberg-New York, 1970.-354 p.

126. Mac Lennan, W.J. Hydroxyethylrutosides in elderly patients with chronic venous insufficiency: its efficacy and tolerability / W.J. Mac Lennan, J. Wilson // Gerontology. 1994. - No 40(1). - P. 45-52.

127. Mahony K.L. Morphological and cytological studies on Fagopyrum esculentum / K.L. Mahony // Amer. Y. Bot. 1935. - Vol. 22, No 4. - P. 460-475.

128. Mahony, K.L. Morphological and cytological studies on Fagopyrum esculentum II. Embryogeny / K.L. Mahony // Amer. Y. Bot. 1936. -Vol. 23, No 2.-P. 129-133.

129. Martens, S Biochemical properties of dioxygenases involved in flavonoid biosyntesis in parsley: an evolutionary aspect / S Martens and al. // XII Internatioal Conference on Polyphenols. Helsinki, 2004. - P. 31-32.

130. Neuman, H.A. A comparative clinical trial of graduted compression and 0-(beta-hydroxyethyl)-rutosides (HR) in the treatment of patients with chronic venous insufficiency / Neuman H.A. et al. //Z.Lymphol. -1995.19(1). P. 8-11.

131. Ohnishi, O. Cultivated buckwheat species and their relatives in the Himalaya and Southern China 10. Ohnishi // Proc. 4th Int. Symp. on Buckwheat. Orel, USSR, 1989. - P. 562-571.

132. Ohnishi, O. Discovery of new Fagopyrum species and its implication for the studies of evolution of buckwheat / O. Ohnishi // Proc. 6th Int. Symp. on Buckwheat. Yapan, 1995,- P. 175-190.

133. Ohnishi O. Recent Progress of the Study on Wild Fagopyrum Species / O. Ohnishi // Proc. 8th Int. Symp. on Buckwheat. Korea, 2001. - P. 218-224.

134. Ohnishi O. Search for the wild ancestor of buckwheat III. The wild ancestor of cultivated common buckwheat, and of Tatary buckwheat / O. Ohnishi // Econ. Bot. 1998. Vol. 52, No 2. - P. 123-133.

135. Pedersen, P.M. Effect of O-(beta-hydroxyethyl) rutosides (venoruton) on symptomatic venous insufficiency in the lower limbs / Pedersen P.M. et al. // Ugeskr. Laeger. 1992. - Vol. 154, No 38. - P. 25612563.

136. Kurkina, A.V Pharmacological activity of flavonoid-containing plants / A.V. Kurkina, O.E. Pravdivtseva, V.A. Kurkin, A.V. Dubishchev // International medizinischer Kongress. Hannover, 2006. - P. 37-38.

137. Rehn, D. Investigation of the therapeutic equivalence of different galenical preparations of O (beta-hydroxyethyl)-rutosides following multiple dose peroral administration / D. Rehn, H. Brunnauer, W.

138. Diebschlag, W. Lehmacher //Arzneim.-Forsch. Drug.Res. 1996. - Vol. 46, No 1.-P. 488-492.

139. Tetenyi, P. Infraspecific chemical taxa of medicinal plants. Budapest: Academiai Kiado, 1970. 225 p.

140. U.S. Pharmacopeia. The official Compendia of Standards. The USP 30 NF 25. - Official May 1, 2007.

141. Validation of compendial methods. General Chapter 1225: United States Pharmacopoeia XXIII. National Formulary, XVIII, Rockville, MD -The United States Pharmacopeial Convention, 1995. - P. 1710 - 1712.

142. U.S. Pharmacopeia. The official Compendia of Standards. The USP 30 NF 25. - Official May 1, 2007.

143. Wadwordt, A.N. Hydroxyethylrutosides. A review of its pharmacology and therapeutic efficacy in venous insufficiency and related disorders / A.N. Wadwordt // Drugs. 1992. - Vol. 44, No 6. - P. 1013-1032.

144. Wagner, H. Plant Drug Analysis. A Thin Layer Chromatography Atlas. / H. Wagner, S. Bladt // Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-New-York. -1995.-384 p.

145. Wagner, H. Pharmazeutische Biologie / H. Wagner. Stuttgart-New York, 1993.-522 p.

146. Zeller F.Y. Buckweizen (F. esculentum Moench): Nutzung, Genetik, Züchtung//Bodenkultur. 2001. Vol. 52. No 3. - S. 259-276.