Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Фармакогностическое изучение и оценка биологической активности травы люцерны посевной (MEDICASO SATIVA L.)

, . ! > > • и 1 Cttí 1999

На правах рукописи

ТРИШИН АЛЕКСАНДР ВЯЧЕСЛАВОВИЧ

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ И ОЦЕНКА БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ТРАВЫ ЛЮЦЕРНЫ ПОСЕВНОЙ (MEDICASO SATIVA L.)

15.00.02 - Фармацевтическая химия и фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Москва - 1999

Работа выполнена в Онкологическом научном центре РАМН им. Е Е Блохина Научные руководители:

доктор медицинских наук М. В. Киселевский, доктор фармацевтических наук профессор К С. Бабаскин

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук профессор Д. А. Муравьева кандидат фармацевтических наук Т. А. Сокольская

Ведущая организация - Научно-исследовательский институт фармации Ю РФ, Москва

Защита состоится "_"_199 г. в _ часов на

заседании диссертационного совета Д. 074.05. Об при Московской ме дицинской академии им. И. М. Сеченова (Москва, Б. Пироговская 2-6

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской ме дицинской академии им. И. М. Сеченова (Москва, Зубовский бульвар 1 Автореферат разослан "_"_199 г.

Ученый секретарь

диссертационного Совета Д. 074. 05. 06 кандидат фармацевтических наук

доцент Е Е Садчиковг

Актуашзосп 1Ш1

Род люцерна (МесИсаго) известен как ценная сельскохозяйс-¡енная кормовая культура с широким ареалом, богатым семенным )ндом многочисленного видового и сортового состава. Содержание змплексов незаменимых аминокислот и витаминов, разнообразный хи-шеский состав объясняют эффективность использования люцерны в »родной медицине при различных заболеваниях.

В траве люцерны содержится значительное количество флавонои-зв, которые обладают различными видами фармакологической актив-)сти, в том числе, оказывают противовоспалительное и ранозажив-зкщэе действие.

Проведенные ранее исследования клевера, относящегося к тому г семейству бобовых, что и люцерна показали, что он оказывает зрмализуювдее влияние на уровень артериального давления у спон-Ешно гипертензивных крыс, усиливает моторику тонкого кишечника роликов, оказывает иммуномодулирующее действие .

Биологическая активность представителей семейства бобовых, яавньгм образом, связывалась с входящими в их состав фяавоноидами. звестно, что люцерна , так же как клевер является источником азличных флавоноидов, белковых и минеральных веществ . Вместе с гм, химический состав люцерны до настоящего времени изучен не-эстаточно, имеющиеся данные весьма противоречивы, что очевидно вязано с использованием растительного сырья, заготовленного на азличных этапах онтогенеза растений, в различные сроки вегетаци-нного периода и с различных мест произрастания. Практически не сследован спектр фармакологической активности биологически ак-ивных веществ , входящих в состав люцерны посевной, хотя извест-о ее применение в народной медицине.

ЦЕДЫО данной работы было изучение химического состава и би логической активности люцерны посевной в онтогенетическом аспеге В задачи исследования входило:

1. Изучение флавоноидов в сырье и лекарственных формах д| церны посевной . Оценка влияния этапа онтогенеза, форм веп тации и условий произрастания на содержание флавоноидов.

2. Анализ минерального состава.

3. Исследование аминокислотного состава .

4. Изучение острой токсичности экстракта люцерны посевной.

5. Оценка влияния экстракта на кардиореспираторные парамет! лабораторных животных.

6. Исследование иммуномодулирующей и противоопухолевой а! тивности люцерны посевной.

7. Решение вопросов стандартизации сырья люцерны посевнс (числовые показатели качества).

8. Определение оптимальных условий сбора травы люцерны пс севной с учетом этапа онтогенеза.

Научная новизна работы В настоящей работе впервые проведе! комплексное исследование химического состава и биологической ш тивности люцерны посевной с учетом онтогенеза. Изучен флавоноад ный, минеральный и аминокислотный составы данного лекарственно: сырья и лекарственных форм на его основе. Определены токсические иммуномодулирующие, противоопухолевые свойства экстрактов тра! люцерны посевной. Впервые установлено , что трава люцерны посе! ной оказывает стимулирующее действие на противоопухолевую цитотс сическую активность лимфоцитов и обладает гипотензивным действу ем. В работе получены новые данные, характеризующие накоплен» флавоноидов в различные возрастные периоды в ходе онтогенезе форм вегетации. Установлено влияние на флавоноидный состав люцег

:ловий произрастания. Разработаны показатели качества травы лю->рны посевной и методика определения количественного содержания ¡авоноидов.

Научно-практическая значкмость работы. Полученные в работе шные свидетельствуют о том, что трава люцерны посевной является ■иным растительным сырьем и может служить источником флавоноидов, шеральных веществ и аминокислот. Результаты настоящего исследо-шия могут быть использованы при разработке лекарственных форм с ¡пользованием дешевого и широко распространенного растительного [рья травы люцерны посевной. На основании проведенных исследова-й разработаны и внедрены технические условия ТУ 64-4-1. 21-9? рава люцерны" и разработан проект ВФС "Трава люцерны посевной".

Апробация диссертации состоялась на объединенной конференции Моратории химико-фармацевтического анализа НИИ эксперименталь-й диагностики и терапии опухолей ОЩ РАМН, лаборатории механиз-в регуляции иммунитета НИИ канцерогенеза ОВД РАМН, лаборатории инической биохимии и лаборатории клеточного иммунитета НИИ кли-ческой онкологии ОНЦ РАМН, а также кафедры ботаники Московской дицинской академии им. И. М. Сеченова.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введе-я, обзора литературы, 2 глав собственных исследований, заключе-я, выводов, списка литературы и приложения. Материалы диссерта-и изложены на 119 страницах машинописного текста. Работа содер-т 18 таблиц и 16 рисунков. Библиография содержит 100 источников.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ЯХ ОБСУДДЕННЕ Изучение химического состава травы и лекарственных форм лоцерны посевной.

Основными объектами изучения были сырье и лекарственные фор-

мы (настои, отвары, экстракты) люцерны посевной сортов Марусинс кая 425, Дунавка, Семиреченская, Хивинская. Сырье было получено Институте кормов им. Е Р. Вильямса, в совхозах АО "Эфирлекрасг ром", в совхозе Багаевский Ростовской области и в Башкорстане

В работе использованы 80 линейный мыши С57В1/6 обоего полг весом 20-25 г, в возрасте 3-4 месяцев, полученные из питомниь лабораторных животных РАМН "Столбовая" и 6 беспородных кролике обоего пола, весом 3-3,5 кг. Животные содержались на обычном т

о

щевом рационе в закрытом помещении при 18-20 С.

Разделение суммы флавоноидов осуществляли методами тонкое лойной (ТСХ) и колоночной хроматографии. Идентификацию выделенш флавоноидов проводили на основании данных УФ-спектров, ТСХ с ис пользованием стандартных образцов.

Как следует из данных, полученных при ТСХ в траве люцер! посевной обнаружено 10 различных компонентов. Смешение со ста! дартными образцами позволило установить присутствие кверцитина рутина

Сравнение УФ-спектров стандартных образцов флавоноидов УФ-спектрами экстракта травы люцерны посевной и выделенных фра! ций подтвердило наличие рутина. Идентификация кверцетина бы. затруднена, так как этот флавоновд имел сходные спектральные х рактеристики с лютеолином и лютеолин-7-гликозидом. Однако данн ТСХ в присутсвии стандартных образцов подтвердили наличие кверц тина

Образцы флавоноидов для определения температуры плавлен были получены препаратной ТСХ после хроматографии на сефадек ЬН-20.

Для подтверждения структуры соединений были изучены спектральные характеристики при добавлении ионизирующих и коь

ексообразуккцих реагентов, вызывающих батохромию и гипсохромию линноволновой или коротковолновой полос .

Так , батохромный сдвиг максимума ( А - 256 нм) после добав-ения ацетата натрия указывает на наличие свободной гидроксильной руппы в положении С-7 , батохромное смещение максимума (А -360 , 70 нм) на 10-30 нм при добавлении ацетата натрия и борной кисло-ы свидетельствует о наличии незамещенных гидроксильных групп в сложении С-3' и С-4'. Батохромное смещение максимума Д =- 360, 70 нм на 45-65 нм со значительным повышением интенсивности мак-имума поглащения после добавления этилата натрия свидетельствует наличии свободной гидроксильной группы в положении С-4'. Флаво-оиды содержащие свободные ОН-группы в положении С-3' и С-4', с ллюминия хлоридом образуют комплекс , который разрушается после обавления разбавленной соляной кислоты. Батохромный сдвиг макси-ума (А-360,370 нм) на 35-65 нм, вызываемый добавлением аллюминия лорида указывает на наличие сводной гидроксильной группы в поло-ении С-5, об этом же свидетельствует батохромное смещение макси-ума (Л -256 нм) после добавления аллюминия хлорида и разбавленной □ляной кислоты (таблица 1).

В результате исследований было достоверно установлено нали-ие основных флавоноидов кверцетина и рутина в траве люцерны по-евной.

Для проведения сравнительной оценки количественного содержа-ия флавоноидов в сырье различных сортов люцерны посевной была заработана методика с применением спектрофотометрического мето-а. В основе методики лежит реакция комплексообразования флавоно-цов с аллюминия хлоридом. Определение содержания флавоноидов в арье люцерны проводили в пересчете на рутин.

При изучении оптимальных условий экстракции флавоноидов из

Спектральные характеристики флавоноидов, выделенных из травы лкм посевной.

Таблица 1

Флавоноид МеОН +C2H50Na +А1С13 А1С13+НС1 +CH3C00Na CH3C00Na+H:

/}тах ^№x Л Л max /max Дшах йХ /Imax А

370 420 ±50 430 +60 400 ¿30 386 ±16 384 ±14

Кверцетин

256 274 ±18 273 ±17 266 ±10 270 ±14 257 ±1

Рутин 360 405 ±45 415 ±55 384 +24 382 +22 387 ±27

256 270 ±14 272 ¿16 266 ±10 269 +13 265 ±9

травы люцерны было установлено, что наиболее полное извлечение флавоноидов достигается при трехкратном экстрагировании 50-70% этанолом, при соотношении сырья и экстрагента 1:30 и времени экстракции - по 30 минут каждое экстрагирование, при измельченности сырья - до 1 мм. Метрологические характеристики методики представлены в таблице 2. Относительная ошибка методики не превышала ±3%.

Таблица 2.

Метрологические характеристики методики количественного определения флавоноидов в траве люцерны.

* хД Б* Б РД А X ЕД

) 0,74 0,00078 0,0279 95 0,02 2,70

Для определения точности методики был использован метод до-' 1вок рутина Излученные результаты свидетельствовали об отсутс-зии систематических ошибок.

При использовании разработанной методики было установлено, го содержание флавоноидов в траве дикорастущих растений выше, ?м особей в культуре, (табл.3). Достоверных различий в содержа-1И флавоноидов в сырье различных сортов люцерны посевной, нахо-

х -

¡щихея в близких эколого-фитоценотических условиях, не обнаруже-

Исследования содержания флавоноидов по этапам онтогенеза пошали, что наибольшее количество флавоноидов имели в прегенера-1вном периоде имматурное растение, а в генеративном периоде -зедневозрастные особи (табл.3).

фи определении содержания флавоноидов по фазам вегетации ¡тановлено, что максимальное количество флавоноидов в траве эедневозрастных генеративных растений люцерны посевной обнаружатся в фазах бутонизации и начала цветения. (рисЛа). Таким об-13ом, для рационального и эффективного использования посевов лю-;рны следует заготавливать на сырье средневозрастные генератив-растения, характеризующиеся максимальной биомассой, в фазах

Таблица 3.

Содержание флавоноидов в сырье травы люцерны посевной с учетом этапа онтогенеза.

Вид, сорт растений Метрологические характеристики, Содержали

и этап онтогенеза Р=95%, п=5 флвоноидов,

на абс. сух.

X Ь ъ А* ЕХ

Люцерна посевная,

дикорастущая 0,85 0,00022 0,02 2,35 0,85+0,02

Люцерна посевная,

Марусинская 425 0,56 0,00013 0,01 1,79 0,56+0,01

Люцерна посевная,

Дунавка 0,62 0,00012 0,01 1,61 0,62+0,01

Люцерна посевная,

Семиреченская 0,51 0,00010 0,01 1,96 0,51+0,01

Люцерна посевная,

Хивинская:

прегенеративный период:

ювенильные 0,45 0,00010 ' 0,01 2,22 0,45+0,01

имматурные 0,67 0,00027 0,02 2,98 0,67+0,0*

виргинильные 0,52 0,00018 0,02 3,89 0,52+0,05

генеративный период:

молодые 0,64 0.00025 0,02 3,12 0,64+0,05

средневозрастные 0,78 0,00021 0,02 2,56 0,78+0,02

старые . 0,60 0,00017 0,02 3,33 0,60Ю,02

сенильный период: 0,33 0,00022 0,02 6,06 о,зз+о,о;

утонизации и начала цветения.

Было проведено исследование содержания флавоноидов в различ-ых органах люцерны посевной, в фазе начала цветения: листьях, лодах, стеблях, цветках.

Экспериментальные данные показали, что максимальное коли-ество флавоноидов содержится в цветках (рис. 16), но на их долю риходится лишь до 10£ биомассы, поэтому оптимальным сырьем для аготовок является трава.

При изучении содержания флавоноидов в зависимости от условий роиэрастания было установлено, что наибольшее количество флаво-оидов содержится в партии 2 (п. Горный Вашкорстан) (рис.1в).

До настоящего времени люцерна посевная в научной медицине не рименялась, поэтому одной из задач работы было определение со-ержания флавоноидов в лекарственных формах: настое, отваре, нас-ойке и жидком экстракте с целью создания в дальнейшем рациональ-ой лекарственной формы. В результате проведенных экспериментов ыло установлено, что наибольшее количество флавоноидов содержит-я в жидком экстракте.

Изучение минерального состава травы люцерны посевной провопили на вакуумном рентгеновском спектроанализаторе У!?А-30,(Карл-;ейс, Германия), оснащенном трубкой с V-анодом и плоскими кристал-:ами анализаторами.

Результаты анализа минерального состава травы средневозраст-ых генеративных растений люцерны посевной представлены в табли-1е 4.

* Сод»р*Атм

81№ КИ Пята СП Пмчлн ИИ О««« СРП Пата

11||| У'пс+ашоЛл п Г"гти1. нот*арт I 1 пУерлатачн

Рис. 1. Сравнительная оценка содержания флавоноидов в траве средне-возрастных генеративных растений люцерны посевной: а) по фазам вегетации,б) по органам растений, в) по условиям произрастания.

Таблица 4.

Содержание основных минеральных компонентов в траве люцерны евной (мг/кг абс. массы).

Элементы

—I—I-1-1—1-1-1-1-1-1—I—I-1-1-1-

l|Ti| All Fe|Mn| Mïl Са I К I Р I S |Cu|Zn| Ni I Co | Pb |C1

-+Ч-I-l-H-1-!-1-1-1—I—I-1-1-1-

0110|200|280144140011300011800012000134001101141 2,00|0,10 | 2,00|650 51±31±231±211±51±511 ±100|il00 |±100|±40 |*2|*4|±0,10|±0,20|±0,08|±20

_i_I_I I_I_I_i_I_i_I_I_I_I_I_

Как следует из представленных в таблице 4 данных трава лю-ны посевной богата биологически активными макро- и микроэле-гами. Наибольшее содержание отмечается магния, калия и каль-, кроме того большой интерес может представлять наличие в тра-люцерны в значимых количествах железа, меди и цинка

Аминокислоты являются исходным материалом для биосинтеза ря-Эиологически активных веществ в растениях том числе: фермен-, алкалоидов, флавоноидов и др. Определение аминокислотного гава травы люцерны проводили после кислотного гидролиза 5,7 н яной кислотой, упаривания. Аминокислотный анализ осуществляли аминокислотном анализаторе Biotronik LC 5001 (Германия) с ис-ьзованием внутреннего стандарта. Исследование аминокислотного гава травы люцерны посевной ( свободные и связанные аминокис-j) показало, что люцерна богата аминокислотами. В ней содержит-ia6op из 14 аминокислот, среди которых б незаменимых. В наибо-îm количестве в исследуемом сырье содержится аспарагиновая кис-

лота - 3,6%, на долю остальных аминокислот приходится от 0,70 д 0,04%.

Оценка биологической активности лкцериы посевной.

Острая токсичность определялась в опытах на белых мышах пр внутривенном введении испытуемого раствора, полученного при высу шивании жидкого экстракта в термостате и последующим разведении физиологическом растворе, в хвостовую вену. Тестировались следук щие уровни воздействующих доз: 10,25,50,100,250 и 500 мг/кг. Ча тичная гибель животных наблюдалась при введении испытуемого раст вора в дозе 100 мг/кг. Доза 250 мг/кг вызывала гибель 50% живот ных. Введение дозы 500 мг/кг вызывала 100% гибель мышей. Среднее мертельная доза LD(50) расчитывалась по компьютерной програмк "BI0STAT" по методу Литчфилда-Уилкоксона и составила 204, (122,2-337,1) мг/кг.

Изучение влияния люцерны посевной на гемодинамику и дыхат исследовалось на кроликах. В данном разделе работы исследовалис три уровня воздействующих доз. 1,0 и 10,0 мг/кг не оказывали cj щественного влияния, за исключением транзиторной гипотензм Внутривенное введение в дозе 100 мг/кг вызывали выраженное сниже ние АД в течение нескольких минут, сопровождаемое отрицательш хронотропным влиянием (брадикардией). Нормализация параметров г< модинамики в этих условиях наступала в течение 10-15 мин. След< вательно, жидкий экстракт оказывает умеренное и полностью обрат! мое гипотензивное действие и снижает частоту пульса.

Научение цитотоксической активности

Прямая цитотоксическая активность жидкого экстракта исследи валась на перевиваемой опухолевой линии аденокарциномы легко: (АКЛ). Опухолевые клетки-мишени вносили по 2*10 кл/лунку . контрольной серии экспериментов клеткам-мишеням добавляли 10 м

зиологического раствора, а в опытных сериях по 10 мкл раствора

цкого экстракта люцерны посевной. Клетки-мишени и эффекторы ин-

0

Эировали в 18-часовом цитотоксическом тесте при 37 С в СО^инку-горе. По окончанию теста, в каждую лунку 96-луночной плоскодон-3 микропланшеты вносили по 10 мкл стерильного раствора красите-МТТ. По истечении 4-х часов, необходимых для образования крие-плов формазана в митохондриях супернатант удаляли. Кристаллы эмазана растворялись в диметилсульфоксиде. (DMS0).

Оптическую плотность измеряли сразу же после полного раство-яия кристаллов формазана или спустя 30 минут после добавления 30 на спектрофотометре ( Titertek Multiscan КСС 340 Labsystens, :üand) при длине волны 540 нм.

На основании данных оптической плотности в контрольных и эггных лунках расчитывали процент погибших клеток-мишеней после *убации с активным веществом, т. е. цитотоксическую активность следуемых образцов.

В серии экспериментов по изучению цитотоксичности жидкого зтракта люцерны посевной было показано, что добавление к мише-м исследуемого раствора в концентрации 5 мг/мл приводило почти полной гибели опухолевых клеток (83%). Уменьшение действующей нцентрации в 2 раза (2,5 мг/мл) вызывала лизис 29% клеток AKJL более низких концентрациях от 0,5 до 0,005 мг/мл цитотоксич-сть клеток составляла 9-11 что достоверно не отличалось от нных контрольной серии (табл. 5).

Таблица 5. Цитотоксическая активность при испытании на клетках АКЛ

концентрация раствора мг/мл

контроль

0,005

0,050

0,500

2,500

5.000

* - достоверные различия при р < 0,05

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о ток что исследуемый раствор люцерны посевной оказывал прямое противоопухолевое цитотоксическое действие на клетки АКЛ. При это достоверный цитолитический эффект наблюдался в концентрации н ниже 2,5 мг/мл.

Меньшие концентрации не влияют на клетки АКЛ и получении цифры в этих экспериментах соответствуют спонтанной гибели клето в контрольной серии экспериментов.

Учитывая вышеизложенное, для дальнейших исследований модули рующего влияния исследуемого раствора на киллерную активность мо нонуклеаров (МНК) крови были использованы концентрации, не ока-

Z цитотоксичности

8+2 9+4 11+5 10+3 29+3* 83+5*

- 17 -

лвающие прямого цитотоксического действия на клетки АКЛ.

МНК выделяли из эритролимфомассы донорской крови, получений с пункта переливания крови ОВД РАМЕ В качестве клеток-мише-?й использовали перевиваемую опухолевую линию клеток АКЛ. Соот->шение клеток-мишеней и эффекторов составляло 1:5.

В контрольной серии эксперимента в каждую лунку добавлялось ) 10 мкл физиологического раствора. В опытных сериях добавляли > 10 мкл исследуемого раствора. При этом конечные концентрации ютавляли 0,5 мг/мл; 0,05 мг/мл; 0,001 мг/мл соответственно. >емя инкубации равнялось 18 ч.

Результаты данного эксперимента приведены в таблице 6.

Таблица б.

Иэдулмружпре влияние на спонтанную цитотокстность ШЯ дари$ертеской крови здоровых доноров.

концентрация % цитотоксичности

раствора

мг/мл

контроль 30±5

0,001 31 ¿4

0,050 57±3*

0,500 2б±4

*- достоверные различия по сравнению со спонтанной активностью при р < 0,05. Согласно полученным данным инкубация исследуемого раствора в шазоне концентраций от 0,5 до 0,001 мг/мл оказывали достовер-

ное стимулирующее влияние на противоопухолевую цитотоксическ активность МНК только в дозе 0,05 мг/мл (57%). Повышение воздей твующих концентраций до 0,5 мг/мл не приводило к усилению спонт ной активности МНК, а дальнейшее увеличение дозы, как показано предыдущем разделе может оказывать прямое токсическое действие опухолевые клетки.

Полученные данные соответствуют действию других извести иммуномодуляторов таких как интерлейкин 1, интерлейкин 2, факт активации тромбоцитов и т. д., для которых не характерен дозо-з висимый эффект, а отмечается оптимальная зона действующих ко центраций. Учитывая наличие прямого цитотоксического иммуномод жирующего действия при испытании на клетках АКЛ (in vitro) пред тавлялось целесообразным исследовать противоопухолевый эффект условиях целостного организма на мышах с привитыми опухолями.

Исследование противоопухолевого действия.

Противоопухолевое действие исследуемого раствора люцерны п севной изучалось на мышах линии C57BL/6 с привитой опухолью мел / номы В-16. Опытные и контрольные группы состояли из 6 животны которым подкожно вводили клетки меланомы В-16 в дозе 750 тыс. мышь. Исследуемый раствор вводили внутримышечно в дозе 20 мг/ (1/10 ЛД 50) через 1, 5, 7, 9, 12 суток после перевивки опухол В контрольной и опытных группах, пальпируемые опухолевые узл отмечались фактически одновременно на 5 - 7 сутки после подкожн трансплантации опухолевых клеток. Динамика роста опухолевых узл у животных, подвергавшихся воздействию тестируемого раствора л церны и контрольных особей достоверно не различались. Первые сл чаи гибели животных опухоленосителей, как в контрольной, так и опытной группе наблюдались на 21-е сутки.

На 27-е сутки эксперимента в опытной группе из 6-ти животн

"ибло Z особи, в то время, как в контроле отмечался летальный [>ект в 3-х случаях из 6. На 30-е сутки регистрировалась 100% 5ель не леченных мышей, в то время, как в опытной группе из б зотных выжила 1 мышь.

Таким образом, тестируемый раствор люцерны посевной в иссле-гмой дозе не оказывает противоопухолевого действия, однако от-1ается некоторая тенденция к увеличению длительности жизни житных, подвергавшихся воздействию люцерны.

Злияние биологически активны* веществ , соде ленных из лэдерны ta щгготоксичиость тромбоцитов

Участие тромбоцитов в иммунологических реакциях организма, ^ширяющее наши прежние представления об ограниченной их роли, а энно, в тромбообразовании, исследовано в ряде работ, посвящен-( цитотоксическим свойствам тромбоцитов. Тромбоциты убивают лижи Schistosoma mansoni, с помощью IgE и комплемент-зависимым зсобом, лизируют эритроциты, связанные с антителами, а также (долевые клетки.

Вовлечение тромбоцитов в противоопухолевый иммунитет предс-эляет интерес, как один из возможных факторов иммунологического цзора, предотвращающего развитие неоплазм.

В настоящем разделе работы было проведено исследование цито-ксической активности мышинных тромбоцитов против перевиваемых винных опухолевых клеток: EL-4 (тимома), В-16 (меланома), Rag ак почек), эмбриональной тератокарциномы Т-20. Исследования проводились на линейных мышах C57BL/6, BaLb/c и , обоего пола, весом 20-25 г в возрасте 3-4 месяцев, полученных питомника "Столбовая" и вивария ОНЦ РАМН, обоего пола.

В опытах in vivo мышам вводили подкожно по 0.5 мл суспензии

опухолевых клеток в среде 199 с 40 мкг/мл гентамицина, по 750ть клеток / мышь.

Пальпирумые опухоли определялись через 5-7 дней после пер вивки, а асцит на 8-10 сутки. Массовая гибель мышей наблюдала на 18-21 день.

Эффекторы - мьпшнные тромбоциты - выделяли из периферическ крови мышей. Для предотвращения быстрого свертывания кровь бра из ретроорбитального синуса стерильной гепаринизированной паст ровской пипеткой в стерильную стеклянную пробирку с 0,5 мл геп ринизированной 199 среды

Мишенями служили как аутологичные опухолевые клетки, вьщ ленные непосредственно перед опытом из асцита, так и клетки поддерживаемых долгосрочных культур. Для сравнения цитотоксиче кой активности тромбоцитов здоровых мышей и мышей с перевить опухолями, тромбоциты выделяли из крови интактных и опухолеЕ мышей и тестировали как против аутологичных, так и аллогени опухолевых клеток.

Контрольня группа включала 26, а опытная 51 мышь. Цитотс сичность тромбоцитов оценивали после 18-часовой инкубации с кле ками-мишеням в МГТ-тесте.

В контрольной группе цитотоксическая активность тромбоцит здоровых мышей колебалась от 1-77 %. Средние значения цитотокс ческой активности мышиных тромбоцитов контрольной группы на ра них линиях опухолевых клеток представлены в таблице 7.

Таблица 7.

Рлияние экстракта люцерны на цнтотоксичность тромбоцитов мышей с привитыми опухолями.

---1------------------------------------

ЦитотоксичностьГX)

Линия клеток

7------

н

Контроль

Игнат

1613

В-16 | ЕЬ-4

I

36*11 |39±12

Т 20 | Тимома

I

13±8 |4.7±1

- достоверные изменения по сравнению с контролем при р' 0. 05 Как следует из данных таблицы тромбоциты мышей обладают спон-нной цитотоксической активностью по отношению к аутологичным ухолевым клеткам. При этом наиболее чусвтительными к действию омбоцитов оказались клетки меланомы В-16 и лейкоза мышей Е1-4. кубация в течение 18 часов тромбоцитов этих мышей с экстрактом церны в максимально не цитотоксичной концентрации 2,5 мг/кг иводила к достоверному увеличению килленых свойств тромбоцитов отив клеток меланомы В-16, Е1-4.

Стандартизация сырья травы лсцерны посевной.

С целью стандартизации травы люцерны разработаны показатели .честна сырья с учетом результатов товароведческих и химических ¡ализов проб тестируемых партий сырья, заготовленных в 1995 1997 >дах.

Для цельного и измельченного сырья установлены влажност: не более 13,0%; золы общей - не более 6,0% золы, нерастворимо; 10% растворе хлористоводородной кислоты - не более 1,0%.

Предложены норма содержания органической примеси - не бо, 1,0%; минеральной - не более 0,5%. Для люцерны введен допол; тельный показатель - содержание стеблей. Установлена норма -более 50%.

Определение количественного содержания флавоноидов провод) по разработанным нами методикам. Полученные результаты позвол) установить норму содержания флавоноидов - не менее 0,5%.

С целью установления сроков годности лекарственного рас: тельного сырья проводили исследования стабильности потребите, ских свойств и качества травы люцерны в процессе хранения. Ана. зы проводили согласно ОСТ 42-3-84. Результаты исследования по! зали, что содержание флавоноидов незначительно изменяется в те< ние 2-2,5 лет. Это дало возможность рекомендовать срок хране1 сырья 2 года.

На основании полученных результатов были разработаны и : вервдены ТУ64-4-1.21-97 "Трава люцерны"; разработан проект 1 "Трава люцерны посевной".

ВЖ02Ы.

1. Результаты проведенных комплексных исследований химическс состава и биологической активности люцерны посевной показг перспективность использования травы люцерны в качестве источш получения новых лекарственных растительных средств, содержат флавоноиды, аминокислоты и биологически активные макро- и микрс лементы.

2. Показана возможность использования онтогенетического подходг обоснованию оптимальных условий заготовки сырья на примере трг

дерны посевной.

Изучен флавоноидный состав сырья травы и лекарственных форм астоя, отвара, настойки, жидкого экстракта) люцерны посевной, делены и индентифицированы основные флавоноиды: рутин и кверце-1. Проведен сравнительный анализ содержания флавоноидов в разных сортах люцерны посевной; показано влияние возрастного сос-шия, форм вегетации на накопление флавоноидов.

Разработана методика количественного определения флавоноидов в 1ве люцерны. Относительная ошибка методики не превышала +3%.

Изучен минеральный состав травы люцерны посевной. Установлено юкое содержание железа, меди, цинка, марганца, калия и кальция.

Определен аминокислотный состав травы люцерны посевной. Уста-злено наличие 14 аминокислот, среди которых 6 незаменимых; пре-иадающей является аспаригиновая кислота.

Установлено, что люцерна посевная по параметрам острой токсич-:ти относится к 4 классу нетоксичных веществ. Среднесмертельная за (ЛД50) при испытании на мышах составила 204,5 мг/кг.

Установлено, что сумма флавоноидов, выделенных из люцерны ока-зает прямое противоопухолевое цитотоксическое действие на пере-заемой линии опухолевых клеток аденокарциномы легких человека в щентрациях превышающих 2,5 мг/мл.

Жидкий экстракт травы люцерны посевной вызывает достоверное вышение спонтанной цитотоксичности мононуклеаров периферической эви здоровых доноров и онкологических больных против опухолевых эток концентрации 0,05 мг/мл.

. Сумма флавоноидов люцерны посевной существенно не влияет на живаемость мышей с имплантированной опухолью меланомы В-16 .

Экстракт травы люцерны повышает цитотоксическую активность омбоцитов мышей-опухоленосителей против аутологичных опухолевых

клеток.

12. Жидкий экстракт травы люцерны посевной вызывает достоверн снижение уровня АД у кроликов в дозе 100 мг/кг.

13. Сцелью стандартизации травы люцерны посевной предложены числ вые показатели качества сырья. Изучена стабильность сырья в пр цессе хранения. На основании проведенных исследований разработа и утверждены ТУ на траву люцерны и разработан проект ВК "Тра люцерны посевной".

Список работ опуОлззтованиьк по теме дехсертацин.

1. А. Р. Тугуз, А. ЕТришин, Т. С. Го лубе ва, М. Е Киселевский. Ци-гоксическая активность тромбоцитов мышей. Бюл. экспер. биол. мед. 997. 9. -с. 183-185.

2. Л. И. Бабаскина, О. А. Матвеева, А. В. Тришин, В. С. Бабаскин. ксичность, иммуномодулирующая и противоопухолевая активность стракта травы люцерны. Мат. Науч. Конференции. Лимфокинин - новый ечественный иммуномодулятор. Москва. 1996. - с.30-31.

3. Л И. Бабаскина, И. А. Самылина А. В. Тришин. Разработка пока-телей качества сырья травы люцерны посевной. // В сб.: Лекарс-енные растения ботанического сада. М., 1996.- с. 39-40.

4. А. В. Тришин, Л. И. Бабаскина, И. А. Смалина, М. В. Киселевский, следование аминокислотного состава сырья и экстракта люцерны севной. // В сб.: Фармацевтическая наука и практика в новых со-ально-экономических условиях /Науч. тр. НИИ фармации. М. 1997. -XXXVI. -4.2. - с. 219-223.

5. Л. И. Бабаскина, И. А. Смалина, А. В. Тришин и др. Трава люцер-. ТУ 64-4-1. 21-97.

Участок множительной техники ОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН

одп. к печати 19,"^ 9 Заказ ^^

Тираж 100 экз.