Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Сравнительное фармакогностическое исследование долговегетирующих видов рода Euphrasia L. флоры Пермского края

На правах рукописи

Кроткова Ольга Александровна

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ДОЛГОВЕГЕТИРУЮЩИХ ВИДОВ РОДА EUPHRASIA L. ФЛОРЫ ПЕРМСКОГО КРАЯ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

з О А В Г Ш1

Пермь 2012

005046775

Диссертационная работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Научный руководитель: кандидат фармацевтических наук, доцент

Бомбела Татьяна Владимировна

Официальные доктор фармацевтических наук, профессор

оппоненты: фурса Николай Сергеевич

ГБОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России

кандидат фармацевтических наук, доцент

Калина Милитина Александровна

ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздравсоцразвития России

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Самарский государственный

медицинский университет» Минздравсоцразвития России

Защита состоится «18» сентября 2012 г. в 13.00 часов на заседании Диссертационного совета Д 208.068.01 при ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздравсоцразвития России по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Полевая, д. 2. Тел./факс (342)233-55-01

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке при ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия»

Минздравсоцразвития России по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Крупской, д. 46.

Автореферат разослан « августа 2012 г.

Дата размещения объявления о защите диссертации на сайте Министерства образования и науки РФ http://www.mon.gov.ru «августа 2012 г. и на сайте ГБОУ ВПО ПГФА Минздравсоцразвития России http://www.pfa.ru авгута 2012 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета,

кандидат фармацевтических наук, *

доцент И.А. Липатникова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одной из приоритетных задач здравоохранения является расширение ассортимента отечественных лекарственных средств за счет внедрения в лечебную практику новых лекарственных растений. Как известно, фитопрепараты по эффективности не уступают синтетическим аналогам, они благоприятно действуют иа организм при длительном применении, используются в реабилитационный период у всех возрастных групп.

Перспективными объектами для изучения являются растения рода Очанка, источники высокоактивных природных соединений, издавна используемые в народной медицине для лечения заболеваний глаз, верхних дыхательных путей, желудочно-кишечного тракта. Некоторые виды рода Очанка являются официнальными в Европейских странах. Трава очанки Ростковиуса включена в фармакопею Германии, а очанки лекарственной в Британскую травяную фармакопею. В Польше являются официнальными виды очанка Ростковиуса и очанка прямая. Они отпускаются аптеками под торговым названием «НегЪа ЕирИгахше» и используются в традиционной медицине этих стран как противовоспалительное, вяжущее и антисклеротическое средство.

В результате ранее проведенных в Пермской государственной фармацевтической академии исследований было установлено, что виды рода Очанка (о. коротковолосистая, о. Рейтера, о. мелкоцветная) имеют близкий химический состав продуктов вторичного обмена, обладают гипотензивной, противовоспалительной, антимикробной, противолейкемической активностью, сочетающейся с низкой токсичностью. По итогам исследований разработан проект фармакопейной статьи «Очанки трава»,

Однако исследования химического состава продуктов первичного обмена у представителей рода Очанка носят фрагментарный характер, так как проводились в отношении только некоторых групп биологически активных веществ (БАВ).

Для современного производства фитопрепаратов необходима гарантированная сырьевая база, которую можно обеспечить за счет использования морфологически близких видов рода Очанка, произрастающих совместно. Во флоре Пермского края встречаются 11 представителей, особое внимание заслуживают долговегетирующие (позднецветушие) виды, как широко распространенные, образующие значительные заросли, имеющие максимальный габитус, а соответственно и сырьевую массу.

В связи с этим представляется актуальным комплексное фармакогностическое исследование долговегетирующих видов рода Очанка, произрастающих в Пермском крае, и обоснование возможности их использования в качестве дополнительных производящих растений, а также изучение распределения и накопления продуктов первичного метаболизма и пигментов в растениях рода Очанка.

Цель работы. Целью работы является сравнительное изучение морфолого-анатомического строения и химико-фармакологических свойств

долгавегешрующих видов рода Очанка (Euphrasia L.), встречающихся во флоре Пермского края, н обоснование возможности их использования в медицинской практике.

Задачи исследования. Для достижения поставленной цели предусматривалось решение следующих задач:

изучить морфолого-анатомическое строение перспективных видов рода Очанка (о. лекарственной, о. татарской, о. прямой, о. Мурбека), провести сравнительный анализ с ранее изученными видами (о. Рейтера, о. коротковолосистой и о. мелкоцветной) и выявить диагностические признаки лекарственного расти тельного сырья (ЛРС);

провести сравнительный фитохимический анализ продуктов вторичного метаболизма четырех ранее не изученных видов рода Очанка, установить константные компоненты, которые могут быть использованы в качестве химических маркеров рода, а так же в аналитических целях;

установить нормы числовых показателей ЛРС и обосновать возможность использования в качестве дополнительных производящих растений перспективных видов, разработать изменение к ФС «Очанки трава»:

исследовать качественный состав, количественное содержание и закономерности накопления в растениях рода Очанка продуктов первичного метаболизма (аминокислот, углеводов, липофильных веществ) и пигментов;

разработать методику количественного определения углеводов, позволяющую проводить сравнительную оценку их содержания в растениях рода Очанка;

изучить фармакологические свойства и острую токсичность долговегетирующих видов рода Очанка.

Научная новизна. На основании макро- и микроскопического анализа растений рода Очанка установлен комплекс диагностических признаков морфолого-ai ¡атомического строения, позволяющий проводить дифференциальную диагностику морфологически близких видов. Получены объективные иллюстрации анатомо-диагностических признаков в виде оригинальных микрофотографий.

Проведено сравнительное фитохимическое исследование продуктов вторичного метаболизма очанки лекарственной, о. татарской, о. Мурбека и о. прямой. Выявлены особенности внутри- и межвидовой изменчивости компонентного состава и количественного содержания основных групп БАВ в растениях рода Очанка. Показана необходимость выделения и использования константных, аналитически значимых компонентов при разработке нормативной документации.

Изучен компонентный состав и количественное содержание продуктов первичного обмена и пигментов очанки лекарственной, о. татарской, о. прямой, о. Рейтера, о. Мурбека, о. коротковолосистой и о. мелкоцветной. Показано, что данные виды могут быть использованы в качестве источников углеводов, аминокислот, каротииоидов. хлорофиллов, жирных кислот и других веществ.

Проведен фармакологический скрининг перспективных видов рода Очанка, установлено антикоагулянтиое и антирадикальное действие, сочетающееся с низкой токсичностью.

Практическая значимость. Доказана целесообразность использования очанки лекарственной, о. татарской, о. Мурбска и о. прямей к качестве дополнительных производящих растений. Перспективные ниды включены в проект изменения к «Очанки трава».

Материалы диссертационного исследования но теме «Морфолого-анатомическое строение растений рода Очанка, произрастающих в Пермском крае» использованы при разработке иллюстрированного методического пособия, которое рекомендовано студентам, интернам, аспирантам для учебного процесса, а так же биологам; провизорам и врачам для практической деятельности.

Научно обоснована целесообразность использования растений рода Очанка для получения препаратов, оказывающих антикоагуляитное и антирадикальное действие.

Разработана методика количественного определения углеводов и сырье очанки, позволяющая проводить поэтапное определение содержания низкомолекулярных Сахаров и полисахаридов, а также их суммы из одной навески.

Положения, выносимые на защиту: результаты морфолого-анатомического изучения растений рода Очанка и разработка характеристик подлинности ЛРС; фитохимического изучения продуктов вторичного метаболизма перспективных видов о. лекарственной, о. татарской, о. Мурбека и о. прямой, их распределение и накопление в зависимости от условий произрастания; данные сравнительного изучения продуктов первичного метаболизма и пигментного состава долговегетирующих видов рода Очанка флоры Пермского края; результаты разработки методики количественного определения углеводов в сырье очанки; итоги фармакологических исследований перспективных видов рода Очанка.

Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на: ежегодных научных конференциях студентов и молодых ученых Пермской государственной фармацевтической академии (Пермь. 2006, 2007, 2008. 2009, 2010, 2011, 2012); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблем!»! современной науки и образования» (Уфа, 2010); Российской научно-практической конференции «Создание лекарственных средств на основе продуктов природного происхождения» (Пермь, 2010); Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежная наука и современность» (Курск, 2011); Конкурсе «Молодежная инновационная медицина XXI века», проходившем в рамках конгресса «Здравоохранение Российской Федерации, стран СНГ и Европы» (Москва, 2011); Научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы науки фармацевтических и медицинских вузов: от разработки до коммерциализации» (Пермь, 2011).

Публикации материалов исследования. По результатам исследований опубликовано 30 работ, которые отражают основное содержание диссертации, из них 5 в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК,

Связь задач исследовании с проблемным «лаком фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с- планом научных исследований Пермской государственной фармацевтической академии (номер государственной регистрации 01.9.¡0018875).

Конкретное участие автора в получении научных результатов. После обобщения современных данных литературы, автором осуществлено сравнительное морфологс-анатомическое исследование растений рода Очанка: проведено изучение качественного состава и количественного содержания веществ вторичного (флавоноидов, иридоидов. фенолкарбоновых кислот), первичного (аминокислот, углеводов, липофильных веществ) метаболизма и пигментов; разработана методика количественного определения углеводов в сырье очанки, позволяющая проводить поэтапное определение содержания низкомолекулярных Сахаров и полисахаридов, а также их суммы из одной навески; установлены отдельные фармакологические свойства растений рода Очанка.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 208 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (1 глава), материалов к методов (2 глава), экспериментальной части (4 главы), общих выводов, списка литературы и приложения; иллюстрирована 43 рисунками и 41 таблицами. Список литературы включает 297 источников, из них 31 на иностранных языках.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследовании

Объектами исследования служила надземная часть с корнями дикорастущих, однолетних, травянистых растений семи видов рода Euphrasia: Е. officinalis L. - о, лекарственная; Е. tatarica Fisch, ex. Spreng. - о. татарская; Е. striata D. Wolff ex. J.F. Lehm. - о. прямая; Е. х reuteri Wettst. - о. Рейтера; Е. х murbeckii Wettst. - о. Мурбека; Е. brcvipila Burn, et Gremli -о. коротковолоснстая; Е. parviflora Schag. - о. мелкоцветная. Образцы заготовлены в фазу цветения - начало плодоношения в период с 2003 по 2009 гг. преимущественно в Уральском регионе.

Морфолого-анатомическое строение изучали на свежем и гербарном материале (35 - 50 образцов) по общепринятым методикам (ГФ XI).

Качественный состав и количественное содержание БАВ исследовали с помощью современных методов и приемов фотохимического анализа: избирательная жидкостная экстракция, хроматография на бумаге (БХ.) и в тонком слое (ТСХ), хромато - масс - спектрометрия (ГХ/МС), фотоэлектроколориметрия, спектрофотометрия.

Исследование липофильных веществ проводили в лаборатории Пермского краевого бюро судебно-медицинской экспертизы, с помощью ГЖХ на приборе Hewlett - Packard 5S90/II (США) с квадрупольным масс-спектрометром (MS) (HP MSD 5971), вещества идентифицировали путем

сравнения времени удерживания и полных масс-спектров с соответствующими данными библиотеки Wiley275 и N1ST98.

Для оценки антирадикальной активности использовали реакцию со свободным стабильным радикалом дифенилпикрилгидразилом (ДФПГ). Антикоагулянтную активность исследовали in vitro с помощью коагулометра «Minilab-701». Оценку острой токсичности сухих спиртовых экстрактов определяли на нелинейных белых мышах массой 17-25 г при вн)'трижелудочном введении. Для обработки полученных данных использовали статистический анализ.

Морфолого-анатомические особенности растений рода Euphrasia

Сравнительный анализ морфолого-анатомических признаков долговегетирующих видов рода Очанка показал, что, несмотря на принадлежность к различным подсекциям, изучаемые виды имеют общие признаки строения. Ни один признак не обладает абсолютной таксономической и диагностической ценностью. Для надежного определения вида и диагностики лекарственного растительного сырья необходимо использовать комплекс низковариабильных признаков, имеющих достоверные отличия. Результаты включены в изменение к проекту ФС «Очанки трава».

Диагностическими признаками морфологической структуры являются: для стебля — длина и ветвистость, длина максимального бокового побега, отношение длины стебля к длине максимального бокового побега; для листа -форма и количество зубцов на листовой пластинке, остистость зубцов стеблевых и прицветных листьев; для цветка — длина венчика, длина нижней губы венчика, отношение длины венчика к длине нижней губы, степень рассечения лопастей верхней губы; длина соцветия; для плода - форма, глубина выемки.

Диагностическими признаками анатомической структуры являются: для листа — сочетание типов трихом, толщина столбчатого и губчатого мезофилла; для стебля - диаметр, отношение толщины первичной коры к радиусу, отношение толщины флоэмы, перицикла, камбия к радиусу, отношение толщины ксилемы к радиусу, число рядов клеток ксилемы, отношение диаметра сосудов к радиусу стебля; для корня - диаметр, отношение толщины перидермы к радиусу корня, отношение толщины флоэмы к радиусу, отношение толщины ксилемы к радиусу.

Химический состав и распределение продуктов вторичного метаболизма у представителей рода Euphrasia

На основании результатов хроматографического анализа установлен состав и характер распределения основных групп БАВ по органам растений: флавоноидов, фенолкарбоновых кислот и иридоидов в четырех, ранее не исследованных видах рода Euphrasia: Е. officinalis, Е. latarica, Е. х murbeckii и Е. stricta (табл. 1). С помощью аутентичных образцов доказано наличие цинарозида, хлорогеновой кислоты и аукубина.

Таблица 1

Хроматографическая характерист'нка БАВ растений рода Euphrasia L.

№ вещества Значение Rf Е. ofßcinalis Е. tatarica Е. * murbeckii Е. stricla

КУБ, 4:1: 2 ж о Q О U трава ! J s * S ЛИСТЬЯ 1 цветки | ПЛОДЫ 1 трава | 3 о. о У. | стебли j Г 1 листья j цветки плоды cd s Cd Э" ъ к ю CJ н о 1 ЛИСТЬЯ j Ö и а Г плоды CS и С. | корни ID <u b j ЛИСТЬЯ а н У га Я 1 ПЛОДЫ

Фласоноиды

1 0,21 0,31 + + -f -г + + + + + 4 4 + + + + + + + + + + 4. +

2 0.22 0,74 + 4 + + 4 + 4 + + + + + + + +

3 0,24 0,38 + + + + + 1 + + + + + + + + + + + + + +

4 0,32 0,16 + + + + + + + 4- 4 + 4- + + + + + + + + + + +

5 0,32 0,47 + ■н + + + + 4 4 + + +

6 0,42 0,30 1 + л. + 4- + + + + 4- + + + + + + + + 4.

7 0,43 0,18 + + + + + + + + + 4 4 + + + + + + + +

8 0,53 0,32 + + л. + + + 4 + 4 4 + + + + + -t- + +

9 0,56 0.56 + -t- + + + + + 4 + + + Ч- + + + + + + + + + +

10 0,25 0,69 + + + + 4 + + + + + + +

11 0,74 0,77 + + + + + + +

12 0,32 0,52 + 4- 4

13 0,11 0,45 + + 4 + +

14 0.07 0,08 + +

Фснолкарбоповые кислоты

Г 0,45 0,74 + 1 + + + + 4 + 4 j

2 0,48 0,64 + + т + + + + 4 4 + + _L

3 0,55 0,69 + + + ■i- + + + + 4 4 4- 4 +1 + + + +

4 0,66 0,69 -г + + 4- + + + + 4 + + 4 + 4. + + + + + + + + + +

5 0,7S 0,83 + + + + + + + + + + + +

6 0,23 0,86 I + + +

7 0,58 0.40 1 + + + + + + -г +

8 0,79 Ö.6V 1 1 + + + + + + + + + + +

9 0,78 0,32 1 + + 4-

Ирпдоидм

1 0,13 ___ + + + -ь + + + + 4- 4 4 О. + + + + + + + + + + +

2 0,22 — + + + + 4- 4 + + + + + + + + + + + + + +

3 0,26 — + + 4- + + + + + 4 + 4 4 + + + + + + + + + -h + +

4 0,37 — + + + + + -г 4 4 4 4 + + + +

5 0,41 — + + 4- + + 4- + + 4 + + + + + + + + + + + + + + +

С 0.56 — + + + + 4- + 4. + + + + + + + + + +

7 0,78 + + 4- + + + + 4- 4 4- -г ■f + + + + + +

Примечание: * 15% CHjCOOH используется для анализа флавоноидов, 2% СН3СООН -фвволокислот. Значения Rf PCO цинарозида в системе: БУВ, 4:1:2 - 0,32; СНзСООН, 15% -0,17; значение Rf PCO хлорогеновой кислоты в системе БУВ, 4:1:2 - 0,65; СН3СООН, 2% -0,68; значение Rf PCO аукубина в системе БУВ, 4:1:2 — 0,41.

Сравнительный фитохимический анализ изученных видов показал, что флавсноидный состав является близким и представлен 14 веществами. Типичными для данного рода являются девять веществ, в том числе цинарозид. Наиболее разнообразный состав флавоноидов (13 веществ) отмечен у

E. latarica, несколько беднее у Е. х murbeckii и Е. slricta (11 веществ), минимальное количество найдено в траве Е. officinalis (9 веществ).

У изученных видов обнаружено 9 фенолкарбоновых кислот. Сравнительный хроматографический анализ показал, что компонентный состав исследуемых видов варьирует от четырех до шести веществ. Близкий химический состав установлен для Е. officinalis и Е. latarica, а так же для Е. х murbeckii и Е. stricta. Данные пары видов характеризуются наличием четырех совпадающих веществ. Постоянным компонентом рода Euphrasia является хлорогеновая кислота.

Компонентный состав иридоидов четырех видов очанок представлен 7 веществами. По качественным реакциям на хроматограммах эти соединения разделены по окраске пятен на две группы. Вещества группы А (1 -4) проявляются только реактивом Бэкона — Эдельмана, что указывает на их принадлежность к иридоидным соединениям подгруппы каталпола. Вещества группы Б (5 - 7) проявляются как реактивом Бэкона - Эдельмана, так и другими реактивами, что подтверждает их принадлежность к подгруппе аукубина. Сравнительный фитохимический анализ четырех видев Очанок показал, что их иридоидиый состав имеет близкое значение. Постоянными компонентами данного рода являются четыре вещества, в том числе аукубин. Наиболее разнообразный состав (6 веществ) обнаружен у Е. officinalis и Е. stricta. Компонентный состав Е. latarica и Е. х murbeckii представлен шестью иридоидными веществами.

Исследовано количественное содержание флавоноидов, окисляемых веществ и иридоидов (рис. 1). Установлено, что наибольшее количество накапливается в траве и органах Е. *murbeckii, а наименьшее в Е. officinalis и Е. stricta. Среднее содержание БАВ (флазоноиды — 6,11%; иридоиды — 0,33%; окисляемые вещества - 7,81%), установленное для рода, характерно для Е. tatarica.

Сравнительный анализ компонентного состава БАВ показал, что исследованные виды характеризуются незначительной вариабельностью флавоноидного и иридоидного пула внутри рода Euphrasia. Константными компонентами являются девять флавоноидных и пять иридоидных веществ, в том числе цинарозид и аукубин. Накопление фенолкарбоновых кислот сильно варьирует внутри рода, типичным компонентом является хлорогеновая кислота. Идентифицированные вещества являются химическими маркерами рода Euphrasia, значение коэффициентов их распределения можно использовать в аналитических целях.

Сравнительный анализ внутривидовой изменчивости четырех видов рода Euphrasia проведен на образцах, собранных в Уральском регионе. Установлено, что на компонентный состав флавоноидов, фенолкарбоновых кислот и иридоидов не оказывает влияние местообитание растения. Сходство, вероятнее всего, обусловлено онтогенетическими факторами, а незначительные различия в количественном содержании влиянием экологических условий произрастания.

£

n 6

a 1 3.1

v

C,.B <■

i pctbti корни с;е6ли листья цоежи плоды Е. officinalis

.1 г i.12

п

Г, ¿J

"в

^ CL 53 1.1 Л

гг .10

8

6 ^

2 0

11.2 И 7

jjv г

_ it® rlifes L

I ров-j корпи Стебли ЛНС1Ы1 цветки плоды

Е. tatarica

Э 15

Щ «

я я й а.

а,-«

о О

10

jO.f'li

1u.5j

1н.7г, ' 12.27

Ш

трава корпи стебли листья цветки плоды я. х murbecku

10 i -

'1 »3

r \

\ L

0 : t

гч «./•>

).8Ь УЗ

я,52 i-°*na<>.«

7,05 7,68

•i.27 3.5%

Wfe

37 I

to

23

трава корни стебли лиоьн цветки плоды Е. stricta

□ флавононды; ¡ЕД окисляемые вещества; Щ иридоиды

Рис. 1. Содержание БАВ в траве и органах растений рода Euphrasia L.

Характер накопления БАВ в органах исследуемых видов имеет общие тенденции. Содержание флавоноидов и окисляемых веществ максимально в листьях и генеративных органах (цветках, плодах). .Минимальное количество содержится в корнях и стеблях. Наибольшее количественное содержание иридоидов установлено для плодов, стеблей и корней.

В ходе стандартизации образцов сырья Е. officinalis, Е. tatarica, Е. х murbeckii и Е. stricta установлены числовые показатели, которые регламентируют доброкачественность цельного и измельченного ЛРС. Рекомендуемые нормы включены в проект изменения к ФС «Очанки трава»: флавоноидов в пересчете на цинарозид не менее 2%; экстрактивных веществ, извлекаемых <40% спиртом, не менее 20%; влажность не более 10%; золы общей не более 10%; золы, не растворимой в 10% растворе кислоты хлористоводородной, не более 10%; органической примеси не более 3%; минеральной примеси не более 1%.

Химический состав и распределение продуктов первичного метаболизма и пигментов долговегетирумнцих видов рода Euphrasia

Компонентный состав свободных аминокислот исследованных видов представлен двенадцатью веществами, из них идентифицированы: орнитин, пролин, глутаминовая кислота, аланин, аспарагин, серин и три незаменимые

аминокислоты - вални, изолейцин, аргинин. Наиболее разнообразный состав аминокислот (двенадцать веществ) отмечен у Е. brevipila и Е. officinalis, а наименьший (восемь веществ) в траве Е. х reuteri (табл. 2).

Таблица 2

Хроматографическаи характеристика свободных аминокислот

растений рода Euphrasia L.

я а ь Щ а а £Й Значение R¡ Вид Стандартные образцы

lift i о ь Я ® 5 & g. i * с ™ « § я. о ' 3 и N ё &I 1°: в gs 1§ хлороформ -этанол - уксусная кислота - вода (24,5:13,5 4,0:2.2) Е. brevipila s i £ с а, fei S ■a Iii a ■ü ■3 fei ■S3 "a .g o ^ o> fei ■8 и ■o 1 4 fej g o S fei 1 я а, о 5 i и 6 1 о g- глутаминовая ¡ i кислота i i S § 8 а к fe & с. о cct к & ID о к § es изолейцин

i ÖTÖS 0,04 + + + + + + + + - - - - - - - -

2 0,05 0,07 + + + + + + -i - - - - - - -

3 0,14 0,26 + + - + t

4 0,17 0,24 - + + + - - -

Г 5 0,20 0,22 + + + + + + + - - +

6 0,21 0,16 + + + + + + + - - +

7 0,24 0,20 + + + + + + a. - - - + - - - -

8 0,37 0,13 + + - + + - + - - - - - + - - -

9 0,48 0,16 + + + + + + + +

30 "1 0,50 0,39 + + + + + + +

11 0,55 0,46 + + + + + + + +

12 0,63 0,20 + + - + + + + - -

Количественное содержание свободных аминокислот в траве семи исследованных видов находится в пределах 0,82 - 1,64% (рис. 2). По органам аминокислоты распределены неравномерно, их максимальное количество установлено в генеративных органах (цветках, плодах) и листьях, а минимальное - в корнях и стеблях.

о

3 2

ч

с

О

1.8 - 1,64

1.6 -1.4 - 1 -v.-...

1.2 ■ щ

т. .....

0.S - щ

0.6 - г

0.4 ■ ijuyh

0,2 - '.'f-í 1ЫШ

0 - ¡Hfc

1,17

1

¡S

! ш i

0,82 i —--Чда-—-- И Plis В 1

Щ i íffiSS I

1.14

и^редмse значение

Е brevipila E.parviflora Е. reuteri Е tatarica Е. officinalis Е. ¡mirbeckii Е. strick!

Вид

Рис. 2. Содержание свободных Euphrasia L.

аминокислот в растениях рода

1Z -

Компонентный состав углеводов долговегетирующих представителей рода Euphrasia представлен шестью веществами, при этом глюкоза, галактоза, ксилоза, арабиноза и рамноза присутствуют как в свободном, так и в связанном состоянии.

Из травы Е. brevipila выделены фракции водорастворимых полисахаридов (ВРПС), выход составил 4,1%; пектиновых веществ (ПВ) - 2,7%; гемицеллюлозы А (ГЦ А) - 1,4%; гемицеллюлозы Б (ГЦ Б) - 2,3% и установлен их компонентный состав (табл. 3).

Таблица 3

Содержание и состав полисахаридных фракций травы Е. brevipila

Фракция Характеристика Мономерный состав

о 3 СЗ о X а

ВРПС темно-коричневый аморфный порошок, без запаха и вкуса + - + -

ПВ светло-серый аморфный порошок, без запаха и вкуса + - - -

ГЦ А бежевый аморфный порошок, без запаха и вкуса - + + -

ГЦ Б темно-серый аморфный порошок, без запаха и вкуса - 4- + +

Мономерами водорастворимых полисахаридов являются глюкоза и ксилоза. В комплексе пектиновых веществ обнаружена только глюкоза. Обязательные компоненты пектиновых веществ — уроновые кислоты не найдены, что вероятно связано с ферментативным или химическим восстановлением карбоксильных групп в процессе экстракции и гидролиза. Гемицеллюлоза А — это природный галактоксилан, а гемицеллюлоза Б — галактоксилоарабан.

РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММЫ УГЛЕВОДОВ В РАСТЕНИЯХ РОДА EUPHRASIA

Разработана методика количественного определения углеводов, спектрофотометрическим методом, с использованием антронсерного реактива, в пересчете на глюкозу, как постоянного и доминирующего компонента в растениях рода Очанка.

В ходе последовательного анализа (три этапа) возможно параллельное определение полисахаридов и низкомолекулярных Сахаров, а также их суммы из одной навески. С антронсерным реактивом будут взаимодействовать свободные и связанные, полимерные углеводы, а также и углеводные компоненты гетерозидов (рис. 3).

Метрологическая характеристика разработанной методики показала, что относительная ошибка определения суммы полисахаридов и низкомолекулярных Сахаров составляет ± 4,7%, а полисахаридов ± 6,5%, при доверительной вероятности 95%.

С целью сравнительной оценки количественного содержания углеводов в долговегетирующих видах была использована разработанная методика. Установлено, что содержание углеводов находится в пределах от 3,91% до

8,65% (рис. 4). Максимальное количество от общей суммы приходится на низкомолекулярные сахара, тогда как полисахариды от общей суммы составляют 10%. Наибольшее количество углеводов накапливается в траве Е. officinalis, наименьшее — в траве Е. х reuteri. По органам углеводы распределены неравномерно, их максимальное количество установлено в цветках, плодах и листьях, а минимальное- в корнях и стеблях.

i этап - сШрЕДЮййШ содкМйний CVS«mbi ннжбмолею. лягаых сд.чАй'ит

полнсахаи1дов (Еимсчпс) Ч

в водаом щвдагешт без лредаарщенького оеетдетщ поцисахаридок •

учитывается оптическая плотности продуктов реакции низкомолекуллрных ¡моно-, ди-) Сахаров и

полисахаридов сантроном в присутствии концентрированной серной кислоты

"]..... ...........

)

II этап - определение содержания полисахаридов (¿„с)" после предварительно! о осаждения полисахаридов'95Н спиртом этиловым. в отношении! й учитывается оптическая плотность продуктов реакции только осажденных полисахаридов с антроном в присутствии концентрированной серной кислоты

г..... г......

:4 ; '

ш ?тагх -'расчет содержаний шнкомп ттктляптык cas.a-pob istwc)

^ НМС — нмс+пс" —' ПС' где, 2' „„( - содержание низкомолекулярных Сахаров, .„„ - сумма полисахаридов и низкомолекулярных Сахаров (i этап), хж - содержание полисахаридов (и этап).

Рис. 3. Схема количественного определения углеводов в растениях рода EuDhmsia Ь.

ю

! 3 I

; з

I

S 6 ;

с

ь *

г,

а

I 1

s,

I " i г1 i

£=5,-14

-Я

•195

0 : -

5>3.91

3,64

-0.02

5,0')

£«5,49

5,1 г

1С! Я

=8,65

8,09

1 полисахариды О нпшомолекулярные сахара £ - сумма углеводов

Е. hreripih Б v renter) Е fm-rijlorn Е. х mwhecUit Е. tatarica Е officinalis Е shlcta

Вид

Рис.4. Содержание суммы углеводов в траве растений рода Euphrasia L.

Качественный состав пигментов семи видов рода Euphrasia незначительно отличается и представлен основными фотосинтетическими пигментами высших растений. Обнаружено 11 веществ, в сравнении с аутентичными образцами идентифицированы (по значению Rf и УФ-спектрам элюатов с хроматограмм) Д-каротии и хлорофилл а. В стандартных условиях в сравнении с литературными данными (по УФ-спектрам элюатов с хроматограмм) - хлорофилл Ъ. Девять веществ по окраске отнесены к производным каротина и ксантофилла (табл. 4, рис. 5).

Таблица 4

Качественный состав пигментов растений рода Euphrasia L.

Окраска Виды

№ вещества § g Значение Rf ПЭ : ДЭ (1:10) * в видимом свете в УФ свете после детектирования ** 1 J3 § S*. о hi 1 X <ч II CJ ta «с X g 1, fc « ft, hi Та 5 hi С! 8 (4 а к hi

1 - 0,05 - - синяя + + + + + + +

о - 0,09 - - синяя J. + + + + +

3 - 0,18 - - синяя + -Г 4- "Г 4- + +

4 - 0,22 - - синяя + + + + т + +

5 - 0,26 бледно-желтая зеленая - + + + + + + +

6 - 0,32 желтая зеленая - + + + + + +

7 459,645 0,43 зеленая красная - + .1. + + + + +

8 - 0,46 - - синяя + "Г + + + +

о 432,666 0,53 темно-зеленая красная - + + + + + + +

10 - 0.63 - - синяя + + + - + - +

11 424. 45?. 480 0,70 - - синяя + + —I. + + + т

Стандартные образцы

/.'-каротин 430. 453. 480 0,69 ярко-желтая зеленая синяя + + + + + + +

хлорофилл а 430, 666 0,52 темно-зеленая красная - + + + + + + +

хлорофилл Ь 453. 642'" * - - - - -Ь + + + + + +

Примечание: * - петродейный эфир - диэтиловый эфир (1:10); ** - 10% спиртовым раствором фосфорно-молибденовой кислоты; *** - литературные данные.

А

0,6

0,4

424

452

. вещество ] I

А 0,6

0,4 -L

А

400

432

459

V Г

500

вещество 7 * вещество 9

600

X. им

666

/5Л

/А \

/ / \ \ У-'" \ \ ••• \ V.

400

500

453

430 ч 4S0

/Т" -Л .

600

Д-каротнн

_ хлорофилл о

X, им

400

500

600

X, нм

Рис. 5. Спектральные характеристики веществ 7, 9 и 11, элюированных с хроматограмм и стандартных веществ: /?-каротина и хлорофилла а.

Суммарное содержание зеленых пигментов и продуктов их разрушения в исследованных видах рода Euphrasia в среднем составляет 5,01 мг/г (табл. 5). Содержание феофетинов преобладает над содержанием хлорофиллов. Доминирующими являются феофетин а (его содержание у исследованных видов колеблется от 2,20 до 3,20 мг/г) и хлорофилл а (от 1,20 до 1,70 мг/г). Максимальное количество хлорофиллов и феофетинов обнаружено в Е. striata.

Содержание каротиноидов в растениях рода Euphrasia варьирует от 0,26 до 0,40 мг/г (табл. 6). Наибольшее их количество обнаружено в Е. parviflora, а наименьшее - в траве Е. х reuteri и Е. tatarica. Установлено, что на накопление пигментов влияют функциональные особенности органов растений. Максимальное количество обнаружено в листьях, активно участвующих в фотосинтезе, а минимальное в корнях, у которых отсутствует светособирающая функция.

Фотосинтетический аппарат растений рода Euphrasia, характеризующихся полупаразитическим типом питания, является сформированным и прошел успешную адаптацию к природным условиям, о чем свидетельствуют стабильные показатели отношений хлорофилла а (С а) к

хлорофнллу !> (С Ь) - 2,5; суммы хлорофиллов к каротиноидам (С а+Ы Саг) -6,2 и их совпадение со значениями данных отношений, установленными для автотрофных растений (табл. 6).

Таблица 5

Содержание хлорофиллов и феофетинов в растениях рода Euphrasia L.

№ п/п Вид Содержание, мг/г

хлорофшшы феофетнны

а Г ь а+Ь а b а+Ь

1 Е. brevipila 1,37±0,21 0,47±0,1 1 !,85±0,09 2,48±0,24 0,42±0,02 2,92±0,21

2 Е. х reuteri 1,22±0,13 0,61 ±0,06 1,83±0,21 2,20±0,09 0,66±0,02 2,86±0,!3

3 Е. х murbeckii 1,20±0,22 0,53±0,03 1,46±0,16 2,22±0,08 0,50±0,03 2,29±0,17

4 Е. parviflora 1,54±0,16 j 0,52±0,03 2,15±0,22 3,05±0,09 0,32±0,07 3,14±0,09

5 Е. officinalis 1,54+0,05 0,65±0,07 2,19±0,24 2,81±0,12 0,57±0,04 3,38±0,22

6 Е. tatarica 1,22*0,08 0,51+0,10 1,73±0,03 2,20±0,05 0,41 ±0,03 2,61 ±0,08

7 Е. striata !,70±0.11 0,61±0,04 2,58±0,13 3,20±0,21 0,41±0,06 4,П±0,15

Таблица 6

Содержание пигментов и их отношение в растениях рода Euphrasia L.

№ п/п Вид Содержание, мг/г Отношение

Са СЬ Саг Сумма пигментов Са/СЬ С а+Ь/Саг

1 Е. brevipila 1,37 0,47 0,28 2,12 2,9 6,6

1.1 корни 0,14 0,1 0,05 0,29 1,4 4,8

1.2 стебли 0,99 0,55 0.21 1,75 1,8 7,3

1.3 листья 7.21 2,87 1,71 11,79 2,5 5,9

1.4 цветки 2,55 1,17 0.61 4,33 2,2 6,1

1.5 плоды 1,87 1,08 0,49 3,44 1,7 6,0

2 Е. х reuteri 1,22 0,61 0,26 2,09 2,0 7,0

3 Е. х murbeckii 1,20 0,53 0,30 2,03 2,3 5,8

4 Е. parviflora 1,54 0,52 0,40 2,46 2,9 5,2

5 Е. officinalis 1,54 0,65 0,35 2,54 2,4 6,3

6 Е. tatarica 1,22 0,51 0,27 2,0 2,4 6,4

7 Е. stricla 1,70 0,61 0,39 2,7 2.8 5,9

В гексановых извлечениях, полученных из травы исследуемых видов рода Euphrasia, обнаружено 16 липофильных компонентов, доминирующими являются: высшие алканы (сктадекан, нонадекан, гексакозан, октакозан, нонахозан, эйкозан), а так же фитостерин (у - ситостерол) и его предшественник (сквален). Содержание жирных кислот и их альдегидов незначительно (табл. 7).

Таблица 7

Состав гексановых извлечений из растений рода Euphrasia L.

Соединение Количественное содержание, %* Степень совпадения с библиотечным масс-спектром. %

"3 .с о м Е. tatarica J g и С £ о С X bj о ^ Е к '■4 Е. brevipila в 1 ? S а. ьз

Неофитадиен ___** — — — — 0,60 ... 99

Октадекан — ... — 9.45 ... 1,11 ... 95

Нонадекан 9,82 ... 4,01 — 7,78 6,S9 7,34 90

Эйкозан — 6,62 ... ... ... 6,71 3,10 98

Гексакозан 6,68 — 20,90 — 38,49 ... 27,69 91

Гептакозан — ... — 9,79 ... 7,08 ... 99

Октакозан 33,62 ... 6,28 ... 7,19 2,85 7,50 83

Нонакозан — 14,24 ... 21,47 ... 35,38 ... 97

2-Нонакозанон — — 0,56 — — ... ... 94

Сквален 1,96 1,48 — 2,97 — ... ... 92

у - Ситостерол 1,56 — 28,161 2,67 10.87 21,32 15,03 93

Додекановый (лауриновый) альдегид 2,05 ... — ... 0,59 ... ... 91

Тетрадекановый (мирнстиновый) альдегид 1,86 ... — ... 0,42 ... ... 95

Гексадекановая (пальмитиновая) кислота 2,81 ... 7,75 1,59 5,32 ... 10,05 93

Октадекаиовая (стеариновая) кислота — .... 1,91 ... ... ... ... 91

9,12-октадекадиеновая (линолевая) кислота ... ... ... ... ... ... 1,91 99

9,12,15- Октадекатриеновая (линоленовая) кислота ... ... 15,92 ... 6,04 6,93 93

9-Октадеценовая (олеиновая) кислота ... ... ... ... ... ... 2,91 86

Тиомочевина 4,22 ... ... ... ... ... ... 80

6,10,14-триметил-2-пеигадеканон (гексагидрофарпезил-ацетон) ... ... 0,27 ... ... 0,48 ... 97

1,2-Бензолдикарбоновая (фталевая) кислота ... ... ... ... 0,66 ... 97

Фитол ... ... ... ... ... 1,24 ... 91

Примечание: * - содержание компонентов в нормировочных процентах от суммы площадей всех зарегистрированных пиков; ** - содержание соединения относительно суммы всех пиков менее 0,005% или его отсутствие.

Сравнительный анализ долговегетирующих видов показал, что компонентный состав липофильных веществ варьирует от трех (Е. talarica) до одиннадцати (Е. brevipila) веществ, у Е. officinalis, Е. stricta и Е. parviflora представлен девятью веществами.

Суммарное содержание идентифицированных липофильных компонентов в растениях рода Euphrasia убывает в ряду Е. stricta > Е. brevipila > Е. х murbeckii > Е. parviflora > Е. officinalis > Е. х reuteri > Е. tatarica.

Фармакологические свойства растений рода Euphrasia

Проведена сравнительная оценка антикоагулянтной активности сухих водных и спиртовых экстрактов из долговегетирующих растений рода Euphrasia флоры Пермского края.

Наиболее высокая антикоагулянтная активность отмечена у спиртовых экстрактов из травы Е. х reuteri (22,5%) и Е. stricta (21,3%), водного из Е. х murbeckii (23,5%), а так же водного и спиртового из Е. parviflora (22,5 и 22,0% соответственно). Остальные экстракты проявляют активность в пределах от 15,3 до 19,1% (табл. 8).

Таблица 8

Антикоагулянтная активность сухих экстрактов из растений рода Euphrasia L.

№ п/п Вид Экстрагент Время свертывания, с Изменение свертываемости, % Р

контроль опыт

1 Е. brevipila вода 30,5±0,63 34,5±0,79 --16,6 < 0,002

спирт- 29,9±0,53 34,4±1,20 -15,3 <0,01

2 Е. * reuteri вода 29,7±1,26 35,1±1,75 -18,3 <0,02

спирт 28,2±1,16 34,5±1,44 -22,5 <0,002

3 Е. parvifora вода 26,6±1,24 32,6±1,73 -22,5 <0,02

спирт 26,4± 1,13 32,2±1,35 -22,0 <0,02

4 Е. officinalis вода 28,2±0,58 33,4±1,27 -18,5 < 0,002

спирт 20,9±1,07 24,9±0,93 -19,1 <0,01

5 Е. tatarica вода 20,5±0,89 24,1±1,43 -17,7 <0,05

спирт 35,3±1,49 41,2±1,84 -16,7 <0,05

6 Е. х murbeckii вода 22,6±1,21 27,9±0,94 -23,5 <0,01

спирт 22,7±1,17 2б,8±0,15 -18,1 < 0,02

7 Е. stricta вода 14,6±0,62 17,4±0,72 -18,8 <0,02

спирт 18,6±0,б4 22,6±0,42 -21,3 < 0,001

8 Гепарин — 29,9±0,48 36,6±1,82 -22,4 <0,01

Установлена антирадикальная активность (АРА) у исследуемых видов рода Euphrasia. Время полураспада стабильного радикала ДФПГ изменяется в пределах 0,5 - 27 мин. Наиболее высокую активность показали извлечения из Е. Y-murbeckii, Е. brevipila, Е. tatarica, Е. stricta (0,5 - 6 мин). Низкая

антирадикальная активность обнаружена у извлечений из Е. х reuteri, Е. officinalis и Е. parviflora (18 - 27 мин). Степень выраженности антирадикальной активности изученных видов зависит от содержания в них фенольных соединений и иридоидов (рис. 6). Коэффициент корреляции составляет - 0,841 и - 0,681, соответственно.

I

20 I

§ I

2 15

с ' н 10

о I

я. 5

JJ.4

/ /

/ /

У

й;___А о.зб

А4

..6.2.

—»-■-

-о-

0.35

-.11

O.i"

~ov

Е. brevipila Е. * reuteri 11. parvifora Е. officinalis Е. tatanca Е. х murbeckii Е. stricia

10

1.У 5

,3.85. 4 3

1 о

п

> и

д окисляемые вещества;

флавоновды; нридонды;

АРА, мин.

Рис. 6. Зависимость между АРА (т ¡п) и количественным содержанием БАВ в растениях рода Euphrasia. L.

Наибольшей антирадикальной активностью обладают извлечения из генеративных органов - цветков и плодов (не более 0,5 мин). Низкую активность показали извлечения из корней и стеблей (45 мин). Антирадикальная активность травы составила 2 минуты, что объясняется большим удельным весом в массе растения листьев, цветков и плодов.

Сухие спиртовые экстракты всех исследуемых видов рода Euphrasia малотоксичны, ЛД50 при введении в желудок - более 5000 мг/кг.

Анализ результатов биологических испытаний подтверждает целесообразность использования растений рода Euphrasia в научной медицине и позволяет рекомендовать их для разработки фитопрепаратов с антикоагулянтной и антирадикальной активностью.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Изучено морфолого-анатомическое строение четырех перспективных видов рода Euphrasia, произрастающих в Пермском крае: Е. officinalis, Е. tatarica, Е. х murbeckii и Е. stricia. Методом сравнительного анализа с морфологически близкими ранее изученными видами (Е. reuteri, Е. brevipila, Е. parviflora), определен комплекс низковариабельных признаков для диагностики цельного и измельченного сырья, включенный в проект изменения к ФС «Очанки трава».

2. Установлено, что исследованные виды рода Euphrasia имеют близкий химический состав продуктов вторичного метаболизма, представленный флавоноидами, ирндоидами и фснолкарбоновыми кислотами. С помощью аутентичных образцов доказано наличие цинарозида, хлорогеновой кислоты и аукубина. Данные вещества являются константными для рода Euphrasia и могут использоваться в фармацевтическом и хемосистематическом анализе.

Изучено количественное содержание основных групп БАВ, наибольшее количество накапливается в траве и органах E.x-murbeckii, а наименьшее в Е. officinalis и Е. slricta. Среднее содержание БАВ, установленное для рода составляет: флавоноидов - 6,11%; иридоидов - 0,33%; окисляемые вещества -7,81% и сопоставимо с результатами, полученными ранее.

3. Разработаны и включены в проект изменения к ФС «Очанки трава» числовые показатели, регламентирующие доброкачественность цельного и измельченного сырья (флавоноидов в пересчете на цинарозид не менее 2%; экстрактивных веществ, извлекаемых 40% спиртом, не менее 20%; и др.), с учетом дополнительных производящих растений: Е. officinalis, Е. tatarica, Е. х murbeckii, Е. stricia.

4. Изучен качественный состав и количественное содержание продуктов первичного метаболизма и пигментов в траве и органах семи видов рода Euphrasia: Е. officinalis, Е. tatarica, Е. х murbeckii, Е. stricta, Е. reuteri, Е. brevipila и Е. parviflora.

Установлено наличие 12 аминокислот, в том числе 3-х незаменимых. Из них идентифицированы: орнитин, аргинин, пролин, глутаминовая кислота, аланин, аспарагин, серин, валин, изолейцин. Количественное содержание свободных аминокислот в траве находится в пределах 0,82 - 1,64%.

Компонентный состав углеводов представлен шестью веществами, при этом глюкоза, галактоза, ксилоза, арабиноза и рамноза присутствуют как в свободном, так и в связанном состоянии. Содержание углеводов в траве находится в пределах от 3,91% до 8,65%, максимальное количество от общей суммы приходится на низкомолекулярные сахара.

Пигменты исследуемого рода представлены 11 веществами, три из которых идентифицированы как /?-каротин, хлорофилл а и Ъ, девять веществ отнесены к производным каротина и ксантофилла. Суммарное содержание зеленых пигментов и продуктов их разрушения в траве в среднем составляет 5,01 мг/г. Содержание каротиноидов варьирует от 0,26 до 0.40 мг/г.

По органам исследуемые вещества распределены неравномерно, их максимальное количество установлено в генеративных органах (аминокислоты и углеводы) и листьях (пигменты), а минимальное - в корнях и стеблях.

В гексаиовых извлечениях обнаружено 16 липофильных компонентов, доминирующими являются: высшие алканы (октадекан, нонадекан, гексакозан, октакозан, нонакозан, эйкозан), а так же фитостерин (у - ситостерол) и его предшественник (сквален). Содержание жирных кислот и их альдегидов незначительно.

5. Разработана методика количественного определения углеводов в сырье очанки, позволяющая проводить поэтапное определение содержания

низкомолекулярных Сахаров и полисахаридов, а также их сумм!,; из одной навески. Относительная ошибка метода определения суммы полисахаридов и низкомолекулярных Сахаров составляет:). 4,7%, п полисахаридов J 6,5%.

6. Установлено, что растения рода Euphrasia перспективны для разработки фитопрепаратов с антикоагулянтной и аптирадикальной активностью. В результате определения острой токсичности сухис спиртовые экстракты из исследуемых растений отнесены по общепринятой классификации к группе малоопасных.

Список опубликованных работ

1. Абдуллипа, Е. С. Сравнительный морфологический анализ Euphrasia hirtella и Euphrasia lalarica (Scrophulariaceae) // Е. С. Абдуллипа. О. А. Кроткова // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии. - 2006. - №1. -С. 92.

2. Кроткова, О. А, Сравнительный анализ анатомического строения Euphrasia tatarica Fisch. и Euphrasia fennica Kihlm. (Scrophulariaceae) / О. Л. Кроткова, E. С. Абдуллипа // Там же. -- С. 244 - 246.

3. Кроткова, О. А. Сравнительное исследование флапоноилов Euphrasia tatarica (Scrophulariaceae), произрастающей в Уральском регионе/ О. А. Кроткова, Т. В. Сухинина /У Актуальные вопросы судсбмо-химическич, химико-токсикологических исследований и фармацевтического анализа: Материалы Российской научно-практической конференции с международным участием, 28 сентября - 3 октября 2009 г., Пермь, ГОУ ВПО ПГ'ФА Росздрава, 2009. - С. 153 -156.

4. Петриченко, В. М. Биологические и химические свойства растений семейства норичниковые / В. М. Петриченко, ... О. А. Кроткова и др. // Региональный конкурс РФФИ - Урал. Результаты научных исследований, полученные за 2007-2009 гг. Сб. статей. Ч. 2. Пермь: ПМЦ УрО РАН, 2010. -С. 113- I 17.

5. Кроткова, О. А. Фенольные соединения Euphrasia officinalis / О. А. Кроткова, Т. В. Сухинина, В. М. Петриченко // Актуальные проблемы современной науки и образования. Биологические науки: Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участие?.!. Т. II. - Уфа: РИЦ БашГУ, 2010. - С. 418 - 422.

6. Кроткова, О. А. Компонентный состав иридоидов некоторых видов рода очанка флоры Пермского края / О. А. Кроткова, Е. А. Булгакова, li. А. Мальцева, Е. П. Смирнова // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии.-2010.-№6.-С. 211 - 213.

7. Кроткова, О. А. Влияние места произрастания на содержание биологически активных веществ в очанке лекарственной / О. А. Кроткова, М. В. Мельник, Е. С. Солодникова, В. А. Захарова // Там же. - С, 213 - 216.

8. Бомбела, Т. В. Подлинность и количественное определение действующих компонентов настойки очанки коротковолосистой / Т. В. Бомбела,

О. А. Кроткова и др. /7 Вестник Пермской государственной фармацевтической академии. -2010. - №7. -С. 28 - 31.

9. Бомбсла, Т. В. Иридоиды Euphrasia tatarica (Scrophulariaceae)! Т. В. Бомбела, О. А. Кроткова, В. М. Петриченко //Там же. - С. 23 - 26.

10. Бомбела, Т. В. Состав полисахаридов травы Euphrasia brevipila (Scrophulariaceae) / Т. В. Бомбела, О. А. Кроткова, В. М. Петриченко// Там же. -С. 26 - 28.

11. Кроткова, О. А. Исследование компонентного состава фенольных соединений Euphrasia х murbeckii / О. А. Кроткова, Е. В. Смирнова // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии. - 2011. - №8. - С. 169 -171.

12. Кроткова, О. А. Морфологические признаки стеблевого и прицветиого листа Euphrasia х murbeckii Wettst. и Euphrasia stricta D. Wolf et J.F. Lehm // О. А. Кроткова, О. П. Копылова, Jl. Ф. Нигамаева // Там же. - С. 167 - 169.

13. Кроткова, О. А. Содержание биологически активных веществ в экстракционных препаратах растений рода Euphrasia L. / О. А. Кроткова,

A. А. Бажин /'/ Там же. - С. 165 - 167.

14. Бомбела, Т. В. Микроскопическое исследование травы очанки лекарственной /' Т. В. Бомбела, О. А. Кроткова, В. М. Петриченко // Фармация, 2011.- №4. -С. 21 -23.

15. Бомбела, Т. В. Оценка антимикробной активности растений рода Euphrasia L. / Т. В. Бомбела, О. А. Кроткова, В. М. Петриченко, Т. Ф. Одегова // Актуальные вопросы фармацевтической науки и образования: мат-лы науч. конф. с междун. участием, поев. 70-летию фарм. фак. СГМУ, Томск, 7-8 сентября 2011 г. -Томск, 2011.-С. 27-30.

16. Кроткова, О. А. Полисахариды Euphrasia brevipila (Scrophulariaceae) / О. А. Кроткова, Т. В. Бомбела, В. М. Петриченко // Вестник уральской медицинской академической науки, 20П. -№ 3/1.- С. 64-65.

17. Бомбела, Т. В. Выделение и идентификация пигментов травы очанки коротковолосистой / Т. В. Бомбела, О. А. Кроткова, М. А. Секерина,

B. М. Петриченко // Актуальные проблемы науки фармацевтических и медицинских вузов: от разработки до коммерциализации / Материалы научно-практической конференции с международным участием, посвященной 75-летию Пермской государственной фармацевтической академии (7-9 декабря 2011 года, г. Пермь). - Пермь, ПГФА, 2011.- С. 191 -193.

18. Кроткова, О. А. Компонентный состав биологически активных веществ Euphrasia stricta (Scrophulariaceae) / О. А. Кроткова, Т. В. Бомбела, Е. П. Смирнова, В. М. Петриченко // Там же. - С. 224 - 227.

19. Бомбела, Т. В. Влияние экологических и онтогенетических факторов на содержание окисляемых веществ Е. tatarica, Е. х murbeckii и Е. stricta // Т. В. Бомбела, О. А. Кроткова, В. М. Петриченко // Там же. - С. 188 - 190.

20. Кроткова, О. А. Особенности микроструктуры прицветиого листа двух видов рода Euphrasia L. / О. А. Кроткова, Т. В. Бомбела, В. М. Петриченко // Там же.-С. 228 -231.

21. Бомбела, Т. В. Фенольные соединения некоторых видов рода очанка (.Euphrasia L.) флоры Пермского края /' Т. В. Бомбела, В.М.Петриченко, О. А. Кроткова // Химия растительного сырья, 2011. - №4. — С. 177-180.

22. Бомбела, Т. В. Изменчивость морфолого-анатомических признаков стеблевого и прицветиого листа двух видов рода Euphrasia L. / Т. В. Бомбела,

О. А. Кроткова, В. М. Петриченко // Разработка, исследование я маркетинг поной фармацевтической продукции: сб. науч. тр. / под. ред. М. В. I 'аврилшш. Пятигорск: I (ятягорская ГФА, 2011. - Вып. 66. - С. 23 - 27.

23. Кроткова. О. Л. Влияние условии произрастания на содержание флаионоидов в траве и органах Euphrasia х murbeckii / О. А. Кроткова, Т. В. Бомбела, Е. П. Смирнова // Материалы 76-й всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых: Молодежная паука и современность. 19-20 апреля 2011 ¡ода. В 3-х частях. Часть 11 - Курск: ГОУ BIIÜ КГМУ, 2011. -С. 247.

24. Бомбела, Т. В. Изменчивость химических параметров травы очанки коротковолосистой в условиях интродукции / Т. В. Бомбела, О. А. Кроткова И Материали за 7-а международна научна практична конференция, ".Achievement of high school», - 20П. Т. 25. Биологии. Бкология. География и геологии. София: сБял ГРАД-БГ» ООД, 2011. - С. 3 - 7.

2.5. Бомбела, Т. В. Проявлясмость анатомо-диагиостических признаков травы очанки лекарственной при измельчении / Т. В. Бомбела, О. А. Кроткова, В. М. Петриченко // Фармация, 2012. - №!. - С. 12- 16.

26. Бомбела, Т. В. Инновационный подход к созданию .лекарственных препаратов для лечения социально значимых заболеваний / Т. В. Бомбела, ... O.A. Кроткова и др. // Менеджмент качества в сфере здравоохранения и социального развития, 2012. - №1 (11).-С.97- 100.

27. Бомбела, Т. В. Фармакогносгическое изучение Euphrasia tatarica Fisch, ex Spreng. (Scrophuiariaceae) / Т. В. Бомбела, О. А. Кроткова, В. М. Петриченко, В. Д. Белоногова // Медицинский альманах, 2012. - №2 (21). - С. 230 - 233.

28. Даминова, Э. Ф. Лекарственные растении, применяемые для лечения болезней глаз / Э. Ф. Дамииова, О. А. Кроткова /7 Вестник Пермской государственной фармацевтической академии, 2012. — № 9. - С. 16! - 163.

29. Кроткова, О. А. Исследование состава фелолкарбоновых кислот в траве и органах очанки татарской, произрастающей в Уральском регионе / О. А. Кроткова, Е. Г1. Смирнова // Там же. - С. 187 - 190.

30. Тимофеева, К. А. Перспективы использования растений рода Очанка в медицине / К. А. Тимофеева, О. А. Кроткова // Там же. — О. 2'! 7 - 219.

Благодарность. Автор выражает благодарность заведующему кафедрой физиологии ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздравсоцразвития России, д.м.н., профессору Сыропятову Б.Я. за помощь в изучении антикоагулянтной активности, лаборанту кафедры физиологии Ковалёвой М. Ю. за установление острой токсичности, Пермскому краевому бюро судебно - медицинской экспертизы в лице Гаранина В. П. за помощь в исследовании липофильных веществ.

Кроткова Ольга Александровна (Россия)

Сравнительное фармагсогностическое исследование

долговегетирующнх' видов рода Euphrasia L. флоры Пермского края

На основании проведенного комплексного фармакогностического исследования обоснована возможность использования долговегетирующих видов рода Очанка флоры Пермского края в качестве лекарственного растительного сырья, разработан проект изменения к ФС «Очанки трава». Установлен комплекс диагностических признаков морфолого-анзтомического строения, позволяющий проводить дифференциальную диагностику близкородственных видов. С использованием хроматографии (БХ, ТСХ, Г'Х-МС), спектрофотометрии и других методов осуществлен анализ фенольных соединений, иридоидов, углеводов, аминокислот, пигментов и липофильных веществ у растений рода Очанка и отмечена возможность применения результатов исследования в аналитических целях и для хемосистематики. Установлено, что экстракционные формы растений рода Очанка малотоксичны и перспективны для разработки фитопрепаратов с антикоагулянтной и анти ради кал ьн ой акти вн остью.

Krotkova Oiga (Russia)

Comparative phannacognostic research of late-flowering species of the genus Euphrasia L. flora of Perm Krai

On the basis of a comprehensive pharmacognostic study, the availability of late-flowering species of the genus Euphrasia L. flora of Perm Krai, as a medicinal plant raw material, has been proved. The Pharmacopoeia article «Euphrasiae Herba» draft change has been developed. Complex of diagnostic morphological and anatomical characteristics for differential diagnostics of closely-related species has been established. Analysis of phenolic compounds, iridoids, carbohydrates, amino acids, pigments and lipophilic compounds of plants of the genus Euphrasia has been carried out by chromatography (PC, TLC, GC-MS), spectrophotometry and other methods. The possibility of application of research results for analytical and chemosystematic purposes has been noted. It was found that the extraction forms of plants of the genus Euphrasia have low toxicity and they are perspective for the development of plant-based medicinal preparations with anticoagulant and antiradical activity.

Подписано в печать 09.07.2012 Формат 60*84/16. Набор компьютерный. Бумага ВХИ. Тираж 100 экз. Усл. печ. л 1,65 Заказ № 80/2012.

Отпечатано на ризографе в типографии ГБОУ ВПО ПГФА 614070, г. Пермь, ул. Крупской, 46, тел. (342) 282-57-92

Актуальность темы. Одной из приоритетных задач здравоохранения является расширение ассортимента отечественных лекарственных средств за счет внедрения в лечебную практику новых лекарственных растений. Как известно, фитопрепараты по эффективности не уступают синтетическим, благоприятно действуют на организм при длительном применении, используются в реабилитационный период у всех возрастных групп.

Перспективными объектами для изучения являются растения рода Очанка, источники высокоактивных природных соединений, издавна используемые в народной медицине для лечения заболеваний глаз, верхних дыхательных путей, желудочно-кишечного тракта. Некоторые виды рода Очанка являются официнальными в Европейских странах. Трава о. Ростковиуса включена в фармакопею Германии, а о. лекарственной в Британскую травяную фармакопею. В Польше являются официнальными виды о. Ростковиуса и о. прямая. Они отпускаются аптеками под торговым названием «Herba Euphrasiae» и используются в традиционной медицине этих стран как противовоспалительное, вяжущее и антисклеротическое средство.

В результате ранее проведенных в Пермской государственной фармацевтической академии исследований было установлено, что виды рода Очанка (о. коротковолосистая, о. Рейтера, о. мелкоцветная) имеют близкий химический состав продуктов вторичного обмена, обладают гипотензивной, противовоспалительной, антимикробной, противолейкемической активностью, сочетающейся с низкой токсичностью. Исходя из полученных данных, разработан проект фармакопейной статьи «Очанки трава».

Однако исследования химического состава продуктов первичного обмена у представителей рода Очанка носят фрагментарный характер, так как проводились в отношении только некоторых групп биологически активных веществ (БАВ).

Для современного производства фитопрепаратов необходима гарантированная сырьевая база, которую можно обеспечить за счет использования других широко распространенных видов рода Очанка, произрастающих совместно.

В связи с этим представляется актуальным комплексное фармакогностическое исследование морфологически близких видов рода Очанка и обоснование возможности их включения в проект нормативной документации в качестве дополнительных производящих растений, а также изучение распределения и накопления продуктов первичного метаболизма в растениях рода Очанка.

Целью настоящих исследований является сравнительное изучение морфолого-анатомического строения и химико-фармакологических свойств долговегетирующих видов рода Очанка {Euphrasia L.), встречающихся во флоре Пермского края, и обоснование возможности их использования в медицинской практике.

Для достижения поставленной цели предусматривалось решение следующих задач: изучить морфолого-анатомическое строение перспективных видов рода Очанка (о. лекарственной, о. татарской, о. прямой, о. Мурбека), провести сравнительный анализ с ранее изученными видами (о. Рейтера, о. коротковолосистой и о. мелкоцветной) и установить диагностические признаки лекарственного растительного сырья (JIPC); провести сравнительный фитохимический анализ продуктов вторичного метаболизма четырех ранее не изученных видов рода Очанка, установить константные компоненты, которые могут быть использованы в качестве химических маркеров рода, а так же в аналитических целях; установить нормы числовых показателей JIPC и обосновать возможность использования в качестве дополнительных производящих растений перспективных видов, разработать изменение к ФС «Очанки трава»; исследовать качественный состав, количественное содержание и закономерности накопления в растениях рода Очанка продуктов первичного метаболизма (аминокислот, углеводов, липофильных веществ) и пигментов; разработать методику количественного определения углеводов, позволяющую проводить сравнительную оценку их содержания в растениях рода Очанка; изучить фармакологические свойства и острую токсичность долговегетирующих видов рода Очанка.

Научная новизна работы.

1. На основании макро- и микроскопического анализа растений рода Очанка установлен комплекс диагностических признаков морфолого-анатомического строения, позволяющий проводить дифференциальную диагностику близкородственных видов. Получены объективные иллюстрации анатомо-диагностических признаков в виде оригинальных микрофотографий.

2. Проведено сравнительное фитохимическое исследование продуктов вторичного метаболизма очанки лекарственной, о. татарской, о. Мурбека и о. прямой.

3. Выявлены особенности внутри- и межвидовой изменчивости компонентного состава и количественного содержания основных групп БАВ в растениях рода Очанка. Показана необходимость выделения и использования константных, аналитически значимых компонентов при разработке нормативной документации.

4. Изучен компонентный состав и количественное содержание продуктов первичного обмена и пигментов очанки лекарственной, о. татарской, о. прямой, о. Рейтера, о. Мурбека, о. коротковолосистой и о. мелкоцветной. Показано, что данные виды могут быть использованы в качестве источников углеводов, аминокислот, каротиноидов, хлорофиллов, жирных кислот и других веществ.

5. Проведен фармакологический скрининг перспективных видов рода Очанка, установлено антикоагулянтное и антирадикальное действие, сочетающееся с низкой токсичностью.

Практическая значимость работы. Доказана целесообразность использования очанки лекарственной, о. татарской, о. Мурбека и о. прямой в качестве дополнительных производящих растений. Перспективные виды включены в проект изменения к ФС «Очанки трава».

Материалы диссертационного исследования по теме «Морфолого-анатомическое строение растений рода Очанка, произрастающих в Пермском крае» использованы при разработке иллюстрированного методического пособия, которое рекомендовано студентам, интернам, аспирантам для учебного процесса, а так же биологам, провизорам и врачам для практической деятельности.

Научно обоснована целесообразность использования растений рода Очанка для получения препаратов, оказывающих антикоагулянтное и антирадикальное действие.

Разработана методика количественного определения углеводов в сырье очанки, позволяющая проводить поэтапное определение содержания низкомолекулярных Сахаров и полисахаридов, а также их суммы из одной навески.

Положения, выдвигаемые на защиту: результаты морфолого-анатомического изучения растений рода Очанка и разработка характеристик подлинности ЛРС; результаты фитохимического изучения продуктов вторичного метаболизма перспективных видов о. лекарственной, о. татарской, о. Мурбека и о. прямой, их распределение и накопление в зависимости от условий произрастания; результаты сравнительного изучения продуктов первичного метаболизма долговегетирующих видов рода Очанка, встречающихся во флоре Пермского края; результаты разработки методики количественного определения углеводов в сырье очанки; результаты фармакологических исследований перспективных видов рода Очанка.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований Пермской государственной фармацевтической академии (номер государственной регистрации 01.9.10018875).

Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на: ежегодных научных конференциях студентов и молодых ученых Пермской государственной фармацевтической академии (Пермь, 2006, 2007, 2008, 2009, 2010, 2011); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы современной науки и образования» (Уфа, 2010); Российской научно-практической конференции «Создание лекарственных средств на основе продуктов природного происхождения» (Пермь, 2010); Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежная наука и современность» (Курск, 2011); Конкурсе «Молодежная инновационная медицина XXI века», проходившем в рамках конгресса «Здравоохранение Российской Федерации, стран СНГ и Европы» (Москва, 2011); Научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы науки фармацевтических и медицинских вузов: от разработки до коммерциализации» (Пермь, 2011).

Личный вклад автора. После обобщения современных данных литературы, автором осуществлено сравнительное морфолого-анатомическое исследование растений рода Очанка; проведено изучение качественного состава и количественного содержания веществ вторичного (флавоноидов, иридоидов, фенолкарбоновых кислот), первичного (аминокислот, углеводов, липофильных веществ) метаболизма и пигментов; установлены отдельные фармакологические свойства растений рода Очанка.

Публикации материалов исследования. По результатам исследований опубликовано 30 работ, которые отражают основное содержание диссертации, из них 5 в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 208 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (1 глава), материалов и методов (2 глава), экспериментальной части (4 главы), общих выводов, списка литературы и приложения; иллюстрирована 43 рисунками и 41 таблицами. Список литературы включает 297 источников, из них 31 на иностранных языках.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Изучено морфолого-анатомическое строение четырех перспективных видов рода Euphrasia, произрастающих в Пермском крае: Е. officinalis, Е. tatarica, Е. х murbeckii и Е. stricta. Методом сравнительного анализа с морфологически близкими ранее изученными видами (Е. reuteri, Е. brevipila, Е. parviflora), определен комплекс низковариабельных признаков для диагностики цельного и измельченного сырья, включенный в проект изменения к ФС «Очанки трава».

2. Установлено, что исследованные виды рода Euphrasia имеют близкий химический состав продуктов вторичного метаболизма, представленный флавоноидами, иридоидами и фенолкарбоновыми кислотами. С помощью аутентичных образцов доказано наличие цинарозида, хлорогеновой кислоты и аукубина. Данные вещества являются константными для рода Euphrasia и могут использоваться в фармацевтическом и хемосистематическом анализе.

Изучено количественное содержание основных групп БАВ, наибольшее количество накапливается в траве и органах Е. хmurbeckii, а наименьшее в Е. officinalis и Е. stricta. Среднее содержание БАВ, установленное для рода составляет: флавоноидов - 6,11%; иридоидов - 0,33%; окисляемые вещества -7,81% и сопоставимо с результатами полученными ранее.

3. Разработаны и включены в проект изменения к ФС «Очанки трава» числовые показатели, регламентирующие доброкачественность цельного и измельченного сырья (флавоноидов в пересчете на цинарозид не менее 2%; экстрактивных веществ, извлекаемых 40% спиртом, не менее 20%; и др.), с учетом дополнительных производящих растений: Е. officinalis, Е. tatarica, Е. х murbeckii, Е. stricta.

4. Изучен качественный состав и количественное содержание продуктов первичного метаболизма и пигментов в траве и органах семи видов рода Euphrasia: Е. officinalis, Е. tatarica, Е. х murbeckii, Е. stricta, Е. reuteri, Е. brevipila и Е. parviflora.

Установлено наличие 12 аминокислот, в том числе 3-х незаменимых. Из них идентифицированы: орнитин, аргинин, пролин, глутаминовая кислота, аланин, аспарагин, серин, валин, изолейцин. Количественное содержание свободных аминокислот в траве находится в пределах 0,82 - 1,64%.

Компонентный состав углеводов представлен шестью веществами, при этом глюкоза, галактоза, ксилоза, арабиноза и рамноза присутствуют как в свободном, так и в связанном состоянии. Содержание углеводов в траве находится в пределах от 3,91% до 8,65%, максимальное количество от общей суммы приходится на низкомолекулярные сахара.

Пигменты исследуемого рода представлены 11 веществами, три из которых идентифицированы как /?-каротин, хлорофилл а и Ь, девять веществ отнесены к производным каротина и ксантофилла. Суммарное содержание зеленых пигментов и продуктов их разрушения в траве в среднем составляет 5,01 мг/г. Содержание каротиноидов варьирует от 0,26 до 0,40 мг/г.

По органам исследуемые вещества распределены неравномерно, их максимальное количество установлено в генеративных органах (аминокислоты и углеводы) и листьях (пигменты), а минимальное - в корнях и стеблях.

В гексановых извлечениях обнаружено 16 липофильных компонентов, доминирующими являются: высшие алканы (октадекан, нонадекан, гексакозан, октакозан, нонакозан, эйкозан), а так же фитостерин (у - ситостерол) и его предшественник (сквален). Содержание жирных кислот и их альдегидов незначительно.

5. Разработана методика количественного определения углеводов в сырье очанки, позволяющая проводить поэтапное определение содержания низкомолекулярных Сахаров и полисахаридов, а также их суммы из одной навески. Относительная ошибка метода определения суммы полисахаридов и низкомолекулярных Сахаров составляет ± 4,7%, а полисахаридов - ± 6,5%.

6. Установлено, что растения рода Euphrasia перспективны для разработки фитопрепаратов с антикоагулянтной и антирадикальной активностью. В результате определения острой токсичности сухие спиртовые экстракты из исследуемых растений отнесены по общепринятой классификации к группе малоопасных.