Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фармакогностическая характеристика альфредии поникшей (Alfredia cernua (L.) Cass.) и разработка на ее основе лекарственного средства



'I v 00460464

На правах рукописи

КУВАЧЕВА НАТАЛЬЯ ВАЛЕРЬЕВНА

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АЛЬФРЕДИИ ПОНИКШЕЙ (ALFREDIA CERNUA (L.) CASS.) И РАЗРАБОТКА НА ЕЕ ОСНОВЕ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА

Специальность 14.04.02-фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

- 3 ИЮН 2010

Улан-Удэ - 2010

004604645

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации».

Научный руководитель: кандидат фармацевтических наук

Шилова Инесса Владимировна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Анцупова Татьяна Петровна

кандидат фармацевтических наук Николаева Ирина Геннадьевна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Самарский государственный

медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится «3» июня 2010 года в 1400 часов на заседании Диссертационного совета ДМ 003.028.02 при Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН по адресу: 670047, г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Бурятского научного центра СО РАН.

Автореферат разослан (ЗСк 2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, ^/ф" -___

кандидат биологических наук / У В.Б. Хобракова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В структуре современного фармацевтического рынка неуклонно растет доля средств на основе лекарственного растительного сырья. По данным Всемирной организации здравоохранения, около 80 % населения используют фитопрепараты для лечения и профилактики различных заболеваний. Широкий спектр их действия объясняется многокомпонентностью химического состава и мягким комплексным воздействием на организм (Theodoratou, 2007; Tin, 2007; Wang, 2007; Лекарственные растения ..., 2008; Fang, 2008; Mariani, 2008; Tiwari, 2008; Yimin, 2008).

Терапевтическая широта ноотропных препаратов, поступающих в Россию или производящихся внутри страны, недостаточна, их эффективность оставляет желать лучшего. Ограниченный ассортимент ноотропных лекарственных средств синтетического происхождения, вызываемые ими побочные эффекты и широкое распространение невротических расстройств, диктует необходимость создания фитопрепаратов ноотропного действия из растений флоры России.

Альфредия поникшая (сем. Asteraceae) - многолетнее травянистое растение, произрастающее на территории Кузнецкого Алатау, Республики Горный Алтай и Алтайского края. Данное растение успешно культивируется на экспериментальной базе Сибирского ботанического сада Томского государственного университета. В народной медицине надземную часть альфредии используют в качестве противосудорожного и болеутоляющего средства, в сборах - при энурезе, неврастении, шизофрении.

Учитывая широкое применение растения народами Сибири при неврологических патологиях и малую степень его изученности, определен выбор объекта и цель наших исследований.

Цель работы. Фитохимическая характеристика надземной части альфредии поникшей и разработка на ее основе фитопрепарата, рекомендуемого в качестве ноотропного средства.

Для достижения поставленной цели исследования необходимо решить следующие задачи:

1. Определить основные группы биологически активных веществ надземной части дикорастущей и культивируемой альфредии поникшей.

2. Разработать рациональный способ получения экстракта альфредии поникшей, изучив влияние основных факторов экстракции на выход биологически активных веществ.

3. Изучить химический состав фармакологически активного экстракта и его фракций, установить строение выделенных индивидуальных соединений.

4. Разработать методики анализа для оценки критериев подлинности и количественного содержания действующих веществ в траве и жидком экстракте.

5. Разработать нормативную документацию на лекарственное растительное сырье и жидкий экстракт альфредии поникшей.

Научная новизна. Впервые определен химический состав биологически активных веществ, макро- и микроэлементов надземной части альфредии поникшей.

Разработан рациональный способ получения экстракта надземной части растения на 95 % этаноле, рекомендуемого в качестве ноотропного средства.

Впервые установлен химический состав фармакологически активного экстракта альфредии поникшей, выделены из активного экстракта флавоноиды (кверцетин, изокверцитрин, рутин), сумма тритерпеновых спиртов (а- и /3-амирин, моретенол, лупеол), лигнан (арктиин) и органические кислоты (коричная, ванилиновая, хлорогеновая).

Установлены микроскопические диагностические признаки травы альфредии поникшей, заключающиеся в наличии различных типов волосков на эпидермисе листа, цветка и стебля.

Разработаны методики качественного обнаружения хроматографией в тонком слое силикагеля и количественного определения методом дифференциальной спектрофотометрии флавоноидов (изокверцитрин), положенные в основу стандартизации травы и жидкого экстракта альфредии поникшей.

Практическая значимость. На основании данных фитохимического, фармакологического, морфолого-анатомического и товароведческого анализа разработаны проекты ФС «Альфредии поникшей трава» и «Альфредии поникшей экстракт жидкий». Разработаны методы определения подлинности и количественного содержания флавоноидов в траве и жидком экстракте альфредии поникшей.

Полученные результаты внедрены в учебный процесс кафедры биологической химии с курсами медицинской, фармацевтической и токсикологической химии, кафедры биологии с экологией и курсом фармакогнозии Красноярского государственного медицинского университета им. проф. В. Ф. Войно-Ясенецкого, кафедры фармации Омской государственной медицинской академии, кафедры геоэкологии и геохимии Национального исследовательского Томского политехнического университета.

Положения, выносимые на защиту:

1. Химический состав надземной части дикорастущей и культивируемой альфредии поникшей представлен простыми фенолами, флавоноидами, кумаринами, органическими кислотами, лигнанами, стеринами, тритерпеновыми соединениями, каротиноидами, полисахаридами, аминокислотами, макро- и микроэлементами.

2. Рациональный способ получения экстракта альфредии поникшей на 95 % этаноле, из которого выделены лигнаны (арктиин), флавоноиды (кверцетин, изокверцитрин, рутин), органические

кислоты (коричная, ванилиновая и хлорогеновая) и тритерпеновые спирты (а-амирин, /3-амирин, моретенол, лупеол).

3. Микроскопические диагностические признаки сырья альфредии поникшей, заключаются в наличии различных типов волосков на эпидермисе листа, стебля и цветка.

4. Методики качественного обнаружения флавоноидов (изокверцитрина) в траве и жидком экстракте растения методом хроматографии в тонком слое силикагеля и количественного определения методом дифференциальной спектрофотометрии по реакции с алюминия хлоридом в видимой области спектра.

Апробация работы и публикации: Основные положения работы доложены и обсуждены на IV Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (Сыктывкар, 2006), Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора J1.H. Березнеговской (Томск, 2006), III и IV Всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2007, 2009), VIII Международном конгрессе молодых ученых «Науки о человеке» (Томск, 2007), VI Всероссийского научного семинара с молодежной научной школой «Химия и медицина» (Уфа, 2007), II Международной научной конференции «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений» (Алматы, Казахстан, 2007), V Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2008), ежегодной конференции «Фармация и общественное здоровье» (Екатеринбург, 2009), конференции «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2009).

Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 18 научных работах, из них 4 - в периодических изданиях, рекомендованных ВАК МО и науки РФ, 3 патента РФ на изобретение.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 127 страницах машинописного текста, содержит 37 таблиц, 18 рисунков.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, 3 глав, отражающих результаты собственных экспериментальных исследований и их обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 203 источника, из которых 50 - зарубежные, и приложения.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объект и методы исследования

Объектом исследования явилась надземная часть альфредии поникшей, собранная в 2001 - 2007 г.г. в фазы вегетации, бутонизации, цветения и плодоношения в Ширинском районе Республики Хакасия, в Усть-Канском, Онгудайском и Шебалинском районе Республики Горный Алтай, в Солонешенском районе Алтайского края и на экспериментальной базе Сибирского ботанического сада Томского государственного университета.

Определение макро- и микроскопических диагностических признаков сырья проводили в соответствии со статьями «Методы анализа лекарственного растительного сырья», «Техника микроскопического и микрохимического исследования лекарственного растительного сырья» ГФ XI.

Качественный состав и количественное содержание биологически активных веществ (БАВ) исследовали с помощью современных методов и приемов фотохимического анализа. Для получения экстрактов использовали воду, этанол различной концентрации, метанол и хлороформ. Обнаружение и количественное определение БАВ проводили с применением качественных реакций, хроматографии в тонком слое сорбента и на бумаге, спектрофотометрии в УФ-, видимой и ИК-областях. Исследование аминокислотного состава осуществляли на аминокислотном анализаторе A0326V2 (Knauer, Германия).

Элементный состав изучали эмиссионным спектральным методом на кварцевом спектрографе ИСП-28 с микрофотометром МФ-2, а также масс-спектрометрией с индуктивно-связанной плазмой X Series И (Thermo Fisher Scientific, США) с системой микроволнового разложения Mars 5 (Berghoff, США).

Для разделения сложных смесей веществ и выделения индивидуальных соединений (тритерпеновых спиртов, флавоноидов, лигнанов, органических кислот) использовали методы избирательной жидкостной экстракции, адсорбционной колоночной и флэш-хроматографии на полиамиде и силикагеле, хроматографии на бумаге и в тонком слое сорбента, дробной кристаллизации, хроматомасс-спектрометрии.

Выделенные вещества идентифицировали, используя методы УФ-спектроскопии (СФ-2000 (Россия), "UVIKON 943 Dable Beam UV/VIS" (Италия)), ИК- (Nicolet 5700 (FT-IR) (США)), ЯМР 'Н, 13С спектроскопии («Bruker DRX-400» и «Bruker DRX-500»), хроматомасс-спектрометрии (ГХ/МС) (Trace DSQ (Thermoelectron corp.) с программным обеспечением Xcalibur 1.4).

Температуру плавления определяли в блоке Кофлера. Оптическое вращение измеряли при 580 нм на поляриметре «Polamat А».

Стандартизацию травы альфредии поникшей, жидкого экстракта и разработку ФС проводили в соответствии с требованиями ОСТ 91500.05.00100 и ГФ XI.

Фитохимическая характеристика основных групп биологически активных веществ и элементный состав надземной части альфредии

поникшей

В надземной части альфредии поникшей выявлены следующие группы БАВ (табл. 1): простые фенолы, лигнаны, флавоноиды, органические кислоты, кумарины, дубильные вещества, тритерпеновые соединения, стерины, каротиноиды, полисахариды, азотсодержащие соединения (в т.ч. аминокислоты).

Исследование аминокислотного состава альфредии поникшей, с применением анализатора, показало наличие 15 аминокислот, семь из которых являются незаменимыми (лизин, треонин, валин, изолейцин, лейцин, фенилаланин, гистидин).

В ходе исследования установлено, что качественный состав надземной части дикорастущей и культивируемой альфредии поникшей идентичны. Количественное содержание основных групп БАВ (флавоноидов,

фенолкарбоновых кислот) в надземной части культивируемого растения также сопоставимо с содержанием их в дикорастущем растении. Так, количество флавоноидов в надземной части культивируемого растения составляет 0,83 ±0,09 %, фенолкарбоновых кислот - 2,57±0,25 %. Альфредия поникшая, выращенная в условиях открытого участка СибБС ТГУ, накапливает больше БАВ. Напр., в условиях открытого участка определяется 5,00±0,84 % фенолокислот и 1,53±0,24 % флавоноидов, в то же время, в полутени их содержание снижается до 1,58±0,27 % и 0,48±0,09 % соответственно.

Таблица 1 - Биологически активные вещества

надземной части альфредии поникшей

Группы БАВ Состав Количественное содержание, %

Простые фенолы + #

Лигнаны Арктиин #

Флавоноиды Кверцетин, кемпферол, таксифолин, апигенин, лютеолин, изоквериитрин, лютеолин-7-глкжозид, рутин 0,81±0,08

Кумарины Эскулетин #

Органические кислоты Бензойная, салициловая, ванилиновая, коричная, кофейная, хлорогеновая, хинная 3,33±0,49

Дубильные вещества Гидролизуемые и конденсированные Следовые количества

Тритерпеновые соединения а- и /3-амирин #

Стерины /3-ситостерин #

Каротиноиды + #

Полисахариды водорастворимые D-r.no коза, Э-галактоза, 1.-арабиноза, Э-глюкуроновая кислота 2,27±0,33

Азотсодержащие соединения + 13,75±2,45

Аминокислоты Аспарагиновая и глутаминовая кислоты, серии, пролин, глицин, аланин, цистеин, изолейцин, лейцин, тирозин, фенилапанин, валин, гистидин, метионин, лизин, треонин, триптофан 2,98±0,13

Примечание: знаком (+) отмечено наличие группы биологически

активных веществ, знаком (#) - определение не проводилось.

Элементный состав надземной части альфредии поникшей исследовали методом эмиссионной спектрометрии в зольном остатке после сжигания. Проведенные исследования выявили наличие 28 элементов, шесть из которых

являются макроэлементами, 10 микро- и 13 ультрамикроэлементами. Из обнаруженных элементов 18 относят к эссенциальным или условно эссенциальным. На основании полученных данных составлен ряд предпочтительного накопления элементов: К> Са> Р> Na> Sn> Mg> Al> S¡> Ва> Fe> Sr> Mn> B> Ti> Cu> Zn> Zr> Li> Ni> Pb> V> Cr> Mo> Sc> Y> Ga> Be> Ag, который показывает, что в растении в преобладающей концентрации содержатся макроэлементы: калий, кальций, фосфор, натрий, магний, а также ультрамикроэлемент - олово, которые представляют большую часть зольного остатка.

Способы получения и идентификация биологически активных веществ фармакологически активного экстракта альфредии поникшей и его фракций

В результате экспериментального фармакологического исследования установлена выраженная ноотропная активность экстракта дикорастущей и культивируемой надземной части альфредии поникшей на 95 % этаноле. Рациональный способ получения фармакологически активного экстракта альфредии поникшей разрабатывали, изучая зависимость выхода целевого продукта от соотношения сырье-экстрагент, времени, температуры экстракции и степени измельчения сырья. Исходя из полученных результатов установлено, что экстракцию надземной части альфредии поникшей следует осуществлять 95 % этанолом в соотношении 1:20-1:25 при температуре 80-90°С и степени измельчения сырья - 2 мм в течение 90-120 мин.

Для разработки рациональной технологии экстракта альфредии поникшей на 95 % этаноле применяли также метод противоточной экстракции. Проведенные фармакологические испытания показали, что эффекты, оказываемые экстрактами, полученными разными способами, практически равнозначны. Однако выходы экстрактов по отношению к растительному сырью значительно отличаются и составляют 14,8±0,3 %, при применении метода с использованием нагревания, и 4,0±0,3 %, в

противоположном случае. Время процесса также различно: 10 суток, в случае применения метода противоточной экстракции, и всего 3-4 ч - при получении экстракта с использованием нагревания. Принимая во внимание полученные результаты, следует, что наиболее предпочтительным является способ получения экстракта альфредии поникшей на 95 % этаноле с использованием нагревания.

Для выявления носителей ноотропного эффекта экстракт альфредии поникшей на 95 % этаноле фракционировали рядом растворителей с увеличивающейся полярностью (хлороформом, этилацетатом и бутанолом-1) и исследовали химический состав полученных фракций хроматографическими и спектральными методами.

С помощью хроматографии в тонком слое сорбента и на бумаге в хлороформной фракции в сравнении с достоверными образцами обнаружили пигменты (хлорофилл), стерины (/3-ситостерин), тритерпеновые соединения, гидроксикумарины (эскулетин), ароматические кислоты (бензойная, салициловая, ванилиновая).

Исследования, проведенные с помощью хроматомасс-спектрометрии выявили 35 компонентов, 20 из которых идентифицированы: простые фенолы (стирол, конифериловый спирт, бензиловый спирт), алканы (1-фенил-1-циклогексан, пентакозан), ароматические кислоты и их эфиры (бензойная, салициловая кислоты, этилсалицилат), альдегиды (ванилин, сиреневый альдегид), ациклические дитерпеноиды (фитол), насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты (пальмитиновая, линолевая, а-линоленовая), тритерпеновые соединения (/З-амирин, ацетат олеаноловой кислоты). Значительное содержание в составе хлороформной фракции отмечено для производных фталевой кислоты (диэтилфталат, моно(2-этилгексил) фтагтат), тритерпеновых соединений и пальмитиновой кислоты (рис. 3, табл. 2).

Относит, интенсивность

12.Щ

п 60 бо: «о:

30: го: 10-о-

5,71 I

иР

им

Я.31

50,65

25.99 зг и

fl "«да

«да

70.3В «6.74 ЭЦ34 10281

100 t, Ш1Н

Рисунок 3 - ГЖ-хроматограмма хлороформной фракции экстракта альфредии

поникшей на 95 % этаноле. Таблица 2 - Химический состав хлороформной фракции экстракта альфредии поникшей на 95 % этаноле по данным ГХ/МС

Наименование вещества Время удерживания, мин Содержание, %

Стирол 5,71 0,62

1-фенил-1-циклогексан 7,39 0,02

Бензиловый спирт 7,54 0,05

Бензойная кислота 8,8 0,07

Этилсалицилат 10,15 0,10

Салициловая кислота 10,22 0,46

Ванилин 11,48 0,19

Дигидроактинидиолид (2(4Н)-бензафуранон) 12,86 0,06

Диэтилфталат 12,94 9,59

Сиреневый альдегид 13,65 0,15

4-(( 1 Е)-3-гидрокси-1 -пропенил)-2-метоксифенол 14,31 1,11

(конифериловый спирт)

14,54

Фитол 14,71 14,87 16,47 4,96

Пальмитиновая кислота 15,46 3,59

Линолевая кислота 16,66 1,04

а-линоленовая кислота 16,72 0,94

Моно(2-этилгексил) фталат 20,2 3,56

Пентакозан 22,02 0,37

/?-амирин 50,65 10,9

12-олеанен-З-ил ацетат 56,18 5,50

Выделение индивидуальных веществ из хлороформной фракции осуществляли методами колоночной хроматографии на силикагеле по следующей схеме (рис. 4):

Рисунок 4 - Схема выделения веществ из хлороформной фракции экстракта альфредии поникшей на 95 % этаноле.

Смесь веществ 1-4 - белый мелкокристаллический порошок, т. пл. 160-161°С (этанол), растворим в гексане, хлороформе, не растворим в этаноле, метаноле и воде. УФ-спектр (QHu), X,mx, нм: 210, (220). ИК-спектр (KBr), iw см"1: 1043, 1072, 1085, 1110, 1138 (ОН), 1189, 1217, 1253, 1273, 1298, 1360, 1381, 1454, 1463 (СН3, СН2> СН), 1641 (С=С), 2660, 2725 (ОН), 2872, 2962 (СН3, СН2, СН), 3387, 3614 (ОН).

Разделение указанной смеси явилось сложной экспериментальной задачей, поэтому для исследования применяли метод хромато-масс-спектрометрии (ГХ/МС). В результате во фракции идентифицировали /3-амирин (олеан-12-ен-З-ол, 27,48 %, tr 53,58 мин), а-амирин (ypc-12-ен-З-ол, 27,52 %, tr 57,72 мин), моретенол (гоп-22(29)-ен-3/3-ол, 25,52 %, tr 66,11 мин) и лупеол (луп-22(29)-ен-3/3-ол, 19,48 %, tr 66,96 мин).

Вещество 5 - белый порошок, 86 °С (газообразные выделения), 250 °С (с разложением), растворим в метаноле, этаноле, ацетоне, хлороформе, не растворим в воде. УФ-спектр, >w, нм: 224, 255, 274, 299. ИК-спектр (КВг), »W, см"1: 1026, 1074, 1140, 1157, 1194 (ОН), 1235, 1264 (=С-0-С), 1332, 1349,

1383, 1421, 1453, 1464 (СН3, СН2, СН), 1515, 1592, 1606 (С=С), 1766 ('v^0), 2598, 2839, 2866 (ОСН3), 2921, 3014, 3419 (ОН). С помощью спектров ЯМР (|3С и 'Н), а также двумерных спектров COSY, HMQC и НМВС установлена структура вещества 5 (рис. 5), представляющего собой 3-(3-MeTOKCH-4-ß-D-глкжопиранозилоксибензил)-4-(3,4-диметоксибензил)-бутиролактон (арктиин).

Рисунок 5 - Формула вещества 5 (арктиин).

Исследование этилацетатной фракции, проведенное с использованием хроматографии на бумаге и в тонком слое сорбента в сравнении с достоверными образцами, выявили наличие простых фенолов, флавоноидов (кверцетин, кемпферол, таксифолин, апигенин, лютеолин, изокверцитрин, лютеолин-7-глюкозид), органических кислот (ванилиновая, коричная, кофейная, хлорогеновая), лигнанов, кумаринов, тритерпеновых соединений, стеринов (/3-ситостерин) и неорганических компонентов.

Выделение индивидуальных веществ из этилацетатной фракции проводили по следующей схеме (рис. 6):

Рисунок б - Схема выделения веществ из этилацетатной фракции экстракта альфредии поникшей на 95 % этаноле.

Вещество 6 - желтые кристаллы, т. пл. 312-313°С (этанол-хлороформ 1:20), растворимы в ацетоне, этаноле и метаноле, не растворимы в гексане, хлороформе и воде. УФ-спектр (С2Н5ОН), >w, нм: 255, (295), (317), 372. ИК-спектр (KBr), fma„ см"1: 1093, 1166, 1201 (ОН), 1513, 1557, 1606 (С6Н6), 1659 (аромат. С=0 7-пиронового цикла), 3280 (ОН). По физическим, спектральным и хроматографическим характеристикам в сравнении с достоверным образцом вещество 6 идентифицировали как кверцетин.

Вещество 7 - белое кристаллическое вещество, т. пл. 282-283°С, растворимое в хлороформе, этаноле, не растворимое в воде. ИК-спектр (КВг), IV*, см'1: 1023, 1074, 1105, 1166, 1197 (ОН), 1266, 1304, 1333, 1367, 1379 (СН3), 1443, 1464 (СН3), 1644, 1669, 2851 (СН2), 2869, 2934, 2969 (СН3), 3396 (ОН). По физическим, спектральным и хроматографическим характеристикам установили, что вещество 7 (условно обозначенное ОВ-2) относится к тритерпеновым соединениям.

Вещество 8 - желтые кристаллы, т. пл. 238-240°С (ацетон), растворимы в этаноле и метаноле, не растворимы в гексане и хлороформе. УФ-спектр (С2Н5ОН), >w, нм: 255, 303, 339. ИК-спектр (KBr), етах, см"1: 1068, 1088,

15

1134, 1157, 1183, 1204 (ОН), 1231, 1296, 1308, 1355, 1376, 1466, 1493, 1524, 1569, 1594, 1602 (С6Н6), 1666 (аромат. С=0 7-пиронового цикла), 2766, 2866, 2924, 2959, 2983, 3111, 3263 (ОН), 3343, 3446, 3582. По физическим, спектральным и хроматографическим характеристикам в сравнении с достоверным образцом вещество 8 идентифицировали как 3-0-/J-D-глюкопиранозид кверцетина (изокверцитрин).

Вещество 9 - бесцветные игольчатые кристаллы со специфическим запахом, т. пл. 121-122°С (ацетон-гексан 1:20), растворимы в ацетоне, этаноле, мало растворимы в хлороформе, не растворимы в гексане и воде. УФ-спектр (С2Н50Н), >w нм: 220, 291. Масс-спектр, m/z, ЭУ, 70 eV: 148 (М+). На основании физических и физико-химических данных в сравнении с достоверным образцом вещество 9 отождествили с коричной кислотой.

Вещество 10 - белый мелкокристаллический порошок, т. пл. 210-212°С (этанол-хлороформ 1:20), растворим в ацетоне, этаноле, метаноле, мало растворим в хлороформе и воде, не растворим в гексане. УФ-спектр (С2Н5ОН), \гах, нм: 220, 260, 290. Масс-спектр, m/z, ЭУ, 70 eV: 168 (М+), 153, 151, 125, 97. 'Н-ЯМР ((/-ацетон),5, м.д.: 7,62 (дд.; 9 и 2 Гц, Н-6), 7,56 (д.; 2 Гц, Н-2), 6,92 (д.; 9 Гц, Н-5), 3,90 (е.; СН30). Таким образом, на основании полученных физических, хроматографических и спектральных данных в сравнении с достоверным образцом вещество 10 идентифицировали как 3-метокси-4-гидроксибензойная кислота (ванилиновая кислота).

С помощью бумажной хроматографии и хроматографии в тонком слое сорбента установили, что бутанольная фракция содержит простые фенолы, флавоноиды (изокверцитрин, лютеолин-7-глюкозид, рутин), органические кислоты (ванилиновая, коричная, кофейная, хлорогеновая), тритерпеновые соединения (следовые количества), аминокислоты и неорганические компоненты.

Выделение индивидуальных веществ из бутанольной фракции экстракта осуществляли, применяя колоночную хроматографию на силикагеле и полиамиде, по следующей схеме (рис. 7):

Рисунок 7 - Схема выделения веществ из бутанольной фракции экстракта альфредии поникшей на 95 % этаноле.

Вещество 11 - белый кристаллический порошок, т. пл. 203-204°С (этанол-вода 3:2), растворим в этаноле, метаноле, воде, частично растворим в ацетоне, не растворим в хлороформе. УФ-спектр (С2Н5ОН), Хтах, нм: 243, (299), 326. ИК-спектр (КВг), см"': 1523, 1605 (С6Н6), 1692 (С=0 сл. эф.), 1708 (СООН), 3440, 3476 (ОН). 13С-ЯМР-спектр (ЭМСО-сЦ), о, м.д.: 127,7 (С-1), 115,2 (С-2), 149,7 (С-3), 146,8 (С-4), 116,5 (С-5), 123,2 (С-6), 114,7 (С-7), 148,0 (С-8), 168,3 (С-9), 73,6 (С-Г), 36,4 (С-2'), 70,5 (С-3'), 70,6 (С-4'), 68,3 (С-5'), 37,3 (С-6'), 175,0 (С-7'). Масс-спектр, т/г, ЭУ, 70 еУ: 355 (М+). В продуктах щелочного гидролиза методом хроматографии в тонком слое и на бумаге обнаружили кофейную и Б-хинную кислоты. На основании физических, спектральных и хроматографических данных в сравнении с достоверным образцом полученное вещество 11 является З-кофеил-О-хинной кислотой (хлорогеновой кислотой).

Вещество 12 - желтые кристаллы, т. пл. 192-194°С (вода), растворим в этаноле, метаноле, нерастворим в гексане и хлороформе. УФ-спектр (С2Н5ОН), Хм*, нм: 256, 357. По физическим, спектральным и хроматографическим характеристикам в сравнении с достоверным образцом вещество 12 идентифицировали как рутин.

Водный остаток экстракта альфредии на 95 % этаноле содержит углеводы (32 %, О-глюкоза, О-галактоза, Ь-арабиноза, Э-глюкуроновая кислота), азотсодержащие соединения (10,63 %, амины и аминокислоты), фенольные соединения (следовые количества) и неорганические компоненты. С помощью аминокислотного анализатора во фракции обнаружены 15 аминокислот, общее содержание которых составляет 1,99% (в т.ч. 0,77 % - незаменимые). В преобладающей концентрации присутствуют глутаминовая и аспарагиновая кислоты, пролин, валин, аланин и гистидин. Элементный состав водного остатка, изученный методом плазменной масс-спектрометрии, содержит 43 элемента, 21 из которых являются эссенциальными или условно эссенциальными. На основании полученных данных составлен ряд предпочтительного накопления элементов: К> М§> Ъп> Шэ> Р> Са> Мп> В1> Н§> Т1> Мо> №> А1> В> Ыа> Си> Бт> Ва> и> Ре> Аи> 8п> Ов> Сг> БЬ> Со> У> Бе> С<1> Хх> Сб> Бс> Са> Ав> Се> W> Ьа> У> Ш> Яе> 1п> Эу> и, который показывает, что в водном остатке доминирует калий, в значительных количествах присутствуют магний, цинк, рубидий и фосфор.

Таким образом, установлен состав основных групп БАВ экстракта альфредии поникшей на 95 % этаноле, обладающего выраженной ноотропной активностью, из которого впервые выделены тритерпеновые соединения (а- и )3-амирин, моретенол, лупеол), лигнан (арктиин), флавоноиды (кверцетин, изокверцитрин, рутин) и органические кислоты (ванилиновая, коричная, хлорогеновая).

Разработка нормативной документации на траву и жидкий экстракт альфредии поникшей

Стандартизацию травы альфредии поникшей, жидкого экстракта и разработку ФС проводили в соответствии с ОСТ 91500.05.001-00 и ГФ XI.

Морфологические диагностические признаки травы альфредии поникшей определены формой, цветом и опушением листьев и стеблей, а также строением и окраской корзинок.

В результате изучения анатомического строения травы альфредии поникшей установлено, что диагностическими признаками растения является

наличие различных типов волосков. На эпидермисе листа расположены простые многоклеточные тонкостенные и толстостенные волоски с продольной складчатостью и простые тонкостенные волоски с многоклеточным основанием. Простые многоклеточные тонкостенные и звездчато-лучистые многоклеточные волоски с многоклеточным основанием следует отнести к диагностическим признакам цветка. На эпидермисе стебля встречаются простые многоклеточные волоски с неравномерными утолщениями и простые многоклеточные двухрядные волоски.

Качественное обнаружение и количественное определение действующих веществ в траве и жидком экстракте альфредии поникшей предложено проводить по флавоноиду изокверцитрину - доминирующему веществу, обладающему выраженными ноотропными свойствами.

Для идентификации флавоноидов применяли хроматографию в тонком слое силикагеля - метод, позволяющий разделить сумму БАВ экстракта, характеризующийся чувствительностью и экспрессностью. Обнаружение проводили на пластинках «Сорбфил ПТСХ-П-А» в экспериментально подобранной системе растворителей этилацетат - муравьиная кислота - вода (8:1:1), в которой достигается наилучшее разделение флавоноидов экстракта альфредии поникшей. В качестве детектора использовали фильтрованный УФ-свет с длиной волны 254 нм и 5 % раствор алюминия хлорида на 95 % этаноле. Указанный реактив чувствителен и образует с флавоноидами комплексы характерного желтого цвета.

Для количественного определения флавоноидов использовали метод дифференциальной спектрофотометрии. В связи с отсутствием выраженного максимума поглощения в УФ-спектре и для увеличения избирательности методики, определяли оптическую плотность окрашенных, устойчивых во времени продуктов реакции флавоноидов альфредии поникшей с алюминия хлоридом. Спектры поглощения продуктов реакции изокверцитрина с алюминия хлоридом и флавоноидов альфредии с указанным реактивом совпадают (\тых 410±2 нм), поэтому определяли содержание флавоноидов в пересчете на изокверцитрин.

В ходе эксперимента определяли оптимальные условия реакции

комплексообразования изокверцитрина с алюминия хлоридом. Установлено, что для проведения реакции необходимо использовать 18 мл 10% раствора алюминия хлорида, время реакции - 30 мин.

Используя полученные данные, рассчитывали удельный показатель поглощения изокверцитрина () при данных условиях комплексообразования, величина которого равна 295,0.

Для подбора оптимальных условий экстрагирования флавоноидов из травы устанавливали зависимость их количественного содержания от экстрагента, степени измельчения сырья, соотношения сырье-экстрагент, кратности, времени экстракции и температурного режима. В результате установлено, что оптимальным экстрагентом является 95 % спирт этиловый, наибольший выход флавоноидов наблюдается при соотношении сырье-экстрагент 1:24, степени измельчения травы 2 мм, двукратной экстракции по 30 мин при температуре 80 °С.

Содержание флавоноидов в траве альфредии поникшей в пересчете на изокверцитрин в процентах (X) на абсолютно сухую массу вычисляют по формуле:

д = Q1QO-25IOO D 141,24

295 m-6-(\QQ-W)~ m (\00-W)' ГД6

D - оптическая плотность исследуемого раствора;

295 -удельный показатель поглощения изокверцитрина по реакции с алюминия хлоридом при длине волны 410±2 нм;

m - точная навеска сырья, г;

W - потеря в массе при высушивании, %;

6 - апи квота, мл;

25, 100 - разведение, мл.

Методика валидирована согласно рекомендациям ICH по показателям: линейность (у=0,631 Зх+0,0065, R2=0,9998), прецизионность (RSD=0,962%), точность (RSD=0,461 %).

В результате исследования установлено, что количественное содержание флавоноидов в траве дикорастущей и культивируемой альфредии поникшей составляет от 0,58 % до 1 %.

Определены товароведческие показатели сырья: содержание флавоноидов не менее 0,5 %; экстрактивных веществ не менее 14%; влажность не более 13 %; зола общая и зола, нерастворимая в хлористоводородной кислоте не более 13 % и не более I % соответственно; стеблей диаметром более 20 мм не более 10 %; органической и минеральной примеси не более 1,5 и 1 % соответственно; частиц, не проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 7 мм не более 10 %; частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 0,25 мм не более 10 %.

Проведен контроль указанных показателей в пробах от семи партий сырья через каждые полгода в течение 2,5 лет. Данные проведенных исследований показали пригодность травы альфредии поникшей для получения экстракта, обладающего ноотропной активностью в течение 2,5 лет (время наблюдения).

Жидкий экстракт альфредии поникшей получали методом противоточной экстракции (реперколяция в модификации по Н. А. Чулкову) в батарее из пяти перколяторов в соотношении растительное сырье - экстракт 1:1с использованием 95 % спирта этилового в качестве экстрагента. Выбор экстрагента обусловлен проявлением наиболее выраженной ноотропной активности.

Жидкий экстракт альфредии поникший представляет собой жидкость темно-коричневого цвета с зеленоватым оттенком со специфическим запахом горько-кислого вкуса.

При разработке методик качественного обнаружения и количественного определения действующих веществ в жидком экстракте альфредии поникшей учитывали принцип унификации методик в ряду: сырье-лекарственная форма, поэтому объем жидкого экстракта для анализа составляет 1 мл, что соответствует 1 г травы альфредии поникшей. Обнаружение флавоноидов (изокверцитрин) в жидком экстракте альфредии проводили методом хроматографии в тонком слое силикагеля, количественное определение осуществляли методом дифференциальной спектрофотометрии по реакции образования комплекса с алюминия хлоридом. Разработанная методика валидирована согласно рекомендациям ICH по показателям: линейность

(у=0,7197х+0,0097, Я2=0,9987), прецизионность (1« 0=0,9 5 О %), точность (ЯБО=0,65 %).

В результате проведенных исследований определены нормы показателей качества экстракта, положенные в основу разработанного проекта ФС «Альфредии поникшей экстракт жидкий»: содержание флавоноидов (в пересчете на изокверцитрин) не менее 0,5 %, сприта не менее 82 %, сухого остатка не менее 6 % и тяжелых металлов не более 0,01 %. Контроль указанных показателей в пробах от трех серий в течение 3 лет показал пригодность жидкого экстракта, обладающего ноотропной активностью в течение 3 лет (время наблюдения).

ВЫВОДЫ

1. Установлен химический состав надземной части альфредии поникшей, представленный простыми фенолами, флавоноидами, лигнанами, фенолкарбоновыми кислотами, гидроксикумаринами, дубильными веществами, стеринами, тритерпеновыми соединениями, полисахаридами, аминокислотами, каротиноидами, макро- и микроэлементами. Выявлено, что надземные части дикорастущей и культивируемой альфредии поникшей имеют идентичный химический состав.

2. Разработан рациональный способ получения экстракта альфредии поникшей на 95 % этаноле, рекомендуемого в качестве ноотропного средства, определена зависимость выхода биологически активных веществ от ряда факторов (характера растворителя, способа получения экстракта, соотношения сырье-экстрагент и температуры экстракции).

3. Из экстракта альфредии поникшей на 95 % этаноле, обладающего выраженной ноотропной активностью, впервые выделены тритерпеновые спирты (а- и /З-амирин, моретенол, лупеол), лигнан (арктиин), флавоноиды (кверцетин, изокверцитрин, рутин), органические кислоты (ванилиновая, коричная, хлорогеновая), а также установлен состав аминокислот, макро- и микроэлементов.

4. Определены морфологические и микроскопические

диагностические признаки травы альфредии поникшей. Диагностическое значение для цельного сырья имеет форма, окраска и опушение листьев и стеблей, а также строение корзинок. Микроскопические диагностические признаки заключаются в наличии различных типов волосков на эпидермисе листа, стебля и цветка.

5. Разработаны методики качественного обнаружения флавоноидов (изокверцитрин) в траве и жидком экстракте альфредии поникшей методом хроматографии в тонком слое силикагеля и количественного определения методом дифференциальной спектрофотометрии по реакции с алюминия хлоридом в видимой области спектра. Составлены проекты ФС на лекарственное сырье «Альфредии поникшей трава» и лекарственное средство «Альфредии поникшей экстракт жидкий».

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Анатомическое строение надземной части альфредии поникшей / Н. В. Кувачева, И. В. Шилова, В. П. Амельченко, Н. Э. Коломиец, А. И. Пяк // Фармация. - 2006.-№ 6. - С. 10-12.

2. Химический состав и антиоксидантные свойства растений рода лабазник и альфредия / И. В. Шилова, Е. А. Краснов, Е. Ю. Авдеева, Н. В. Кувачева, О. П. Слепушкина, Е. И. Короткова, А. Н. Лукина // Химия и технология растительных веществ: Тезисы докладов IV Всероссийской научной конференции. - Сыктывкар, 2006. - С. 217.

3. Биологически активные вещества Alfredia cernua Cass, и Alfredia nivea Kar. et Kir. / И. В. Шилова, Н. В. Кувачева, Е. А. Краснов, О. В. Никитина, Е. И. Короткова, А. Н. Лукина, Т. П. Новожеева // Новые достижения в создании лекарственных средств растительного происхождения: Материалы Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения проф. Л. Н. Березнеговской. - Томск, 2006. - С. 372-374.

4. Средство, обладающее антиоксидантной активностью / И. В. Шилова, Е. А.

Краснов, Н. В. Кувачева, Т. П. Новожеева. Патент РФ на изобретение № 2292214, опубликован 27.01.2007, бюл. №3.

5. Alfredia cernua Cass. - перспективный источник биологически активных веществ, обладающих антиоксидантными свойствами / Н. В. Кувачева, И. В. Шилова, Е. А. Краснов, В. П. Амельченко, Е. И. Короткова, А. Н. Лукина, О. А. Аврамчик, А. И. Пяк // Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья: Материалы III Всероссийской конференции. - Барнаул, 2007. - С. 332-333.

6. Изучение антиоксидантных свойств и химического состава дикорастущей и культивируемой альфредии поникшей / Н. В. Кувачева, И. В. Шилова, А. Н. Лукина, О. А. Аврамчик // Науки о человеке: Материалы VIII конгресса молодых ученых и специалистов. - Томск, 2007. - С. 226-227.

7. Исследование альфредии поникшей, культивируемой в Сибирском ботаническом саду / Н. В. Кувачева, И. В. Шилова, В. П. Амельченко, Е. И. Короткова, Е. А. Краснов, А. Н. Лукина, О. А. Аврамчик, А. И. Пяк // Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений: Материалы II Международной научной конференции. - Алматы, Казахстан, 2007.-С. 190.

8. К вопросу стандартизации травы альфредии поникшей как перспективного источника фитопрепарата / Н. В. Кувачева, И. В. Шилова, В. П. Амельченко, Е. И. Короткова, Е. А. Краснов, А. Н. Лукина, А. И. Пяк // Химия и медицина: Тезисы докладов VI Всероссийского научного семинара с молодежной научной школой. - Уфа, 2007. - С. 178.

9. Антиоксидантные свойства биологически активных веществ Alfredia cernua и A. nivea (Asteraceae) / И. В. Шилова, Н. В. Кувачева, Е. И. Короткова, Е. А. Краснов, О. В. Никитина, А. Н. Лукина, Н. А. Некратова, А. И. Пяк // Растительные ресурсы. - 2008.-Т. 44, вып. 1.-С. 114-121.

10. Антиоксидантные и церебропротекторные свойства дикорастущей и культивируемой альфредии поникшей / Н. В. Кувачева, И. В. Шилова, Н. И. Суслов, Р. Н. Мустафин, Е. И. Короткова, А. Н. Вторушина, В. П. Амельченко // Молекулярная медицина и биобезопасность: Тезисы V Международной конференции. - Москва, 2008. - С. 61-62.

11. Кувачева, Н. В. Исследование аминокислотного состава альфредии поникшей / Н. В. Кувачева, И. В. Шилова, А. А. Колмакова // Фармация и

общественное здоровье: Материалы конференции. - Екатеринбург, 2009. -С. 108.

12. Средство, обладающее ноотропным действием / И. В. Шилова, Н. И. Суслов, В. А. Хазанов, Р. Н. Мустафин, Н. В. Кувачева. Патент РФ на изобретение № 2347580, опубликован 27.02.2009, бюл. №6.

13. Элементный состав фракции апьфредии поникшей, обладающей ноотропной активностью / Н. В. Кувачева, И. В. Шилова, Е. В. Буйко, В. Н. Лосев // Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья: Материалы IV Всероссийской конференции. -Барнаул, 2009. - С. 108.

14. Средство, обладающее анксиолитическим действием / Н. И. Суслов, В. А. Хазанов, И. В. Шилова, Р. Н. Мустафин, Н. В. Кувачева. Патент РФ на изобретение № 2354397, опубликован 10.05.2009, бюл. № 13.

15. Амельченко, В. П. Особенности развития и компонентный состав Alfredia cemua (Asteraceae) в условиях интродукции (г. Томск) / В. П. Амельченко, И. В. Шилова, Н. В. Кувачева // Растительные ресурсы. - 2009. - Т. 45, вып. 2-С. 23-31.

16. Шилова, И. В. Химическое исследование экстракта альфредии поникшей, обладающего ноотропными свойствами / И. В. Шилова, Н. В. Кувачева // Медицина в Кузбассе. - 2009. - Вып. № 3. - С. 118.

17. Шилова, И. В. Химическое исследование фракций альфредии поникшей, обладающей ноотропной активностью / И. В. Шилова, Н. В. Кувачева И Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: Сборник научных трудов. - Пятигорск, 2009. - Вып. 64. - С. 126-127.

18. Влияние экстрактов альфредии поникшей на поведение, память и работоспособность в эксперименте / Р. Н. Мустафин, Н. И. Суслов, И. В. Шилова, Н. В. Кувачева // Экспериментальная и клиническая фармакология.-2010.-Т. 73,№ 1.-С. 16-18.

Благодарности

Автор выражает искреннюю признательность и благодарность д. х. н, профессору Иркутского технического университета Семенову А. А., д. м. н., профессору НИИ фармакологии СО РАМН Суслову Н. И. за помощь в организации аналитических исследований и обсуждении полученных результатов. За предоставленные для исследования образцы растения выражаю благодарность д. б. н., проф. Томского государственного университета Пяку А. И., к. б. н., с. н. с. Сибирского ботанического сада Томского государственного университета Амельченко В. П.

Лицензия ПЛД№ 40-12 от 17.12.1999 г. Сдано в печать 29.04.10 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная №1. Печать офсетная. Объём 1.5 физ. печ. л. Заказ № 404 Тираж 100 экз.

660049, г. Красноярск, ул. Вейнбаума, 26. ККМИАЦ ОИиПД

Актуальность темы. В структуре современного фармацевтического рынка неуклонно растет доля средств, разработанных на основе лекарственного растительного сырья. По данным Всемирной организации здравоохранения, около 80 % населения используют фитопрепараты для лечения и профилактики различных заболеваний. Широкий спектр их действия объясняется многокомпонентностью химического состава и мягким комплексным воздействием на организм (Лекарственные растения ., 2008; Theodoratou, 2007; Tin, 2007; Wang, 2007; Fang, 2008; Mariani, 2008; Tiwari, 2008; Yimin, 2008).

Ограниченный ассортимент ноотропных лекарственных средств синтетического происхождения, вызываемые ими побочные эффекты и широкое распространение невротических расстройств, диктует необходимость создания фитопрепаратов ноотропного действия из растений флоры России.

Альфредия поникшая (сем. Asteraceae) - многолетнее травянистое растение, произрастающее на территории Кузнецкого Алатау, Республики Горный Алтай и Алтайского края. Данное растение успешно культивируется на экспериментальной базе Сибирского ботанического сада Томского государственного университета. В народной медицине надземную часть альфредии используют в качестве противосудорожного и болеутоляющего средства, в сборах - при энурезе, неврастении, шизофрении.

Учитывая широкое применение растения народами Сибири при неврологических патологиях и малую степень его изученности, определены выбор объекта и цель наших исследований.

Цель работы. Фармакогностическая характеристика надземной части альфредии поникшей и разработка на ее основе экстракта, обладающего ноотропной активностью.

Для достижения поставленной цели исследования необходимо было решить следующие задачи:

1) определить основные группы биологически активных веществ надземной части дикорастущей и культивируемой альфредии поникшей;

2) разработать рациональный способ получения экстракта альфредии поникшей, изучив влияние основных факторов экстракции на выход биологически активных веществ;

3) изучить химический состав фармакологически активного экстракта и его фракций, установить строение выделенных индивидуальных соединений;

4) определить морфолого-анатомические диагностические признаки травы и разработать методики анализа для оценки критериев подлинности и количественного содержания действующих веществ в траве и жидком экстракте;

5) разработать нормативную документацию на лекарственное растительное сырье и жидкий экстракт альфредии поникшей. Научная новизна. Установлены микроскопические диагностические признаки травы альфредии поникшей, заключающиеся в наличии простых многоклеточных тонкостенных и толстостенных, звезчато-лучистых и двухрядных волосков на эпидермисе листа, цветка и стебля.

Впервые определен химический состав биологически активных веществ, макро- и микроэлементов надземной части альфредии поникшей.

Разработан рациональный способ получения экстракта надземной части растения на этаноле, рекомендуемого в качестве ноотропного средства.

Впервые установлен химический состав фармакологически активного экстракта альфредии поникшей, выделены из активного экстракта флавоноиды (кверцетин, изокверцитрин, рутин), сумма тритерпеновых спиртов (а- и p-амирин, моретенол, лупеол), лигнан (арктиин) и органические кислоты (коричная, ванилиновая, хлорогеновая).

Разработаны методики качественного обнаружения хроматографией в тонком слое силикагеля и количественного определения методом дифференциальной спектрофотометрии флавоноидов (изокверцитрин), положенные в основу стандартизации травы и жидкого экстракта альфредии поникшей.

Практическая значимость. На основании данных фитохимического, фармакологического и товароведческого анализа разработаны проекты ФС «Альфредии поникшей трава» и «Альфредии поникшей экстракт жидкий». Разработаны методики определения подлинности и количественного содержания действующих веществ в траве и жидком экстракте альфредии поникшей.

Полученные результаты внедрены в учебный процесс кафедры биологической химии с курсами медицинской, фармацевтической и токсикологической химии, кафедры биологии с экологией и курсом фармакогнозии Красноярского государственного медицинского университета им. проф. В. Ф. Войно-Ясенецкого, кафедры фармации Омской государственной медицинской академии, кафедры геоэкологии и геохимии Национального исследовательского Томского политехнического университета.

Положения, выносимые на защиту:

1. Химический состав надземной части дикорастущей и культивируемой альфредии поникшей представлен простыми фенолами, флавоноидами, кумаринами, органическими кислотами, лигнанами, стеринами, тритерпеновыми соединениями, каротиноидами, полисахаридами, аминокислотами, макро- и микроэлементами.

2. Рациональный способ получения экстракта альфредии поникшей на 70 % этаноле, из которого выделены лигнаны (арктиин), флавоноиды (кверцетин, изокверцитрин, рутин), органические кислоты (коричная, ванилиновая и хлорогеновая) и тритерпеновые спирты (а-амирин, Р-амирин, моретенол, лупеол).

3. Микроскопические диагностические признаки сырья альфредии поникшей, заключаются в наличии различных типов волосков на эпидермисе листа, стебля и цветка.

4. Методики качественного обнаружения флавоноидов (изокверцитрина) в траве и жидком экстракте растения методом хроматографии в тонком слое силикагеля и количественного определения методом дифференциальной спектрофотометрии по реакции с алюминия хлоридом в видимой области спектра.

Апробация работы и публикации: Основные положения работы доложены и обсуждены на IV Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (Сыктывкар, 2006), Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора JI.H. Березнеговской (Томск, 2006), III и IV Всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2007, 2009), VIII Международном конгрессе молодых ученых «Науки о человеке» (Томск, 2007), VI Всероссийском научном семинаре с молодежной научной школой «Химия и медицина» (Уфа, 2007), II Международной научной конференции «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений» (Алматы, Казахстан, 2007), V Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2008), ежегодной конференции «Фармация и общественное здоровье» (Екатеринбург, 2009), конференции «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2009).

Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 18 научных работах, из них 4 - в периодических изданиях, рекомендованных ВАК МО и науки РФ, 3 патента РФ на изобретение.

Выводы

1. Определены морфологические и микроскопические диагностические признаки травы альфредии поникшей. Диагностическое значение для цельного сырья имеет форма, окраска и опушение листьев и стеблей, а также строение корзинок. Микроскопические диагностические признаки заключаются в наличии различных типов волосков на эпидермисе листа, стебля и цветка.

2. Установлен химический состав надземной части альфредии поникшей, представленный простыми фенолами, флавоноидами, лигнанами, фенолкарбоновыми кислотами, гидроксикумаринами, дубильными веществами, стеринами, тритерпеновыми соединениями, полисахаридами, аминокислотами, каротиноидами, макро- и микроэлементами; выявлено, что надземные части дикорастущей и культивируемой альфредии поникшей имеют сопоставимый по содержанию химический состав.

3. Разработан рациональный способ получения экстракта альфредии поникшей на 70 % этаноле, рекомендуемого в качестве ноотропного средства, заключающийся в использовании соотношения сырье-экстрагент 1:20-1:25, температуры 80 °С и степени измельчения сырья - 2 мм в течение 90 мин.

4. В экстракте альфредии поникшей на 70 % этаноле установлено наличие тритерпеновых спиртов (а- и p-амирин, моретенол, лупеол), лигнанов (арктиин), флавоноидов (кверцетин, изокверцитрин, рутин), органических кислот (ванилиновая, коричная, хлорогеновая), а также аминокислот, макро- и микроэлементов.

5. Разработаны методики качественного обнаружения флавоноидов (изокверцитрин) в траве и жидком экстракте альфредии поникшей методом хроматографии в тонком слое силикагеля и количественного определения методом дифференциальной спектрофотометрии по реакции с алюминия хлоридом в видимой области спектра; составлены проекты ФС на лекарственное сырье «Альфредии поникшей трава» и лекарственное средство «Альфредии поникшей экстракт жидкий».