Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Фактор некроза опухолей-альфа как радиопротектор кроветворных клеток-предшественников

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СССР

^УЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОЮ ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ ИМЕНИ ПОЧЕТНОГО АКАДЕМИКА Н.Ф.ГАМАЛЕИ

На правах рукгпигг УДК 616-006-02:615.849.015,25 [-092.9-07

НРИВЕННО Светлана Ивановна

»АКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ-о£ £АК РАДИОПРОТЕКТОР КРОВЕТВОР-1ЫХ КЛЕТОК-ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ

Ii.00.36 - ИММУНОЛОГИЯ И АЛЛЕРГОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОСКВА 1992

(

Работа выполнена в Научно-исследовательском института гематологии и переливания крови ИЗ Республики Беларусь и Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии вмени Почетного академика Н.Ф.Гамалеи Российской АМН

Научнке руководители:

доктор биологических наук А.В.Санин кандидат медицинских наук Л.В.Карканща

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук И.В.Мирошниченко доктор биологических наук А.В.Пронин

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Габричевского

Защита состоится " %Л1^С.глс 1992г. в 14. часов на заседании Специализированного Совета в Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи Российской АМН (123098, Москва, ул.Гамалеи, 18).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи Российской АМН.

Автореферат разослан в^гЛ^аи^ 1992г.

Ученый секретарь Специализированного Совета, доктор медицинских наук

Е.И.К01ГГЕЛ0ВА

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОМ

Актуальность проблемы. Проблема влияния радиации на организм является в настодоре время одной из наиболее актуальных и активно изучаемых (Г.Баррон, 1955; А.Г.Коноплянников,1984; А.А.Яршмн, I98S), Облучение вызывает нарушение функций практически всех органов и систем (Г.Баррон, 1955; Е.А.Кербин и др., 1989; Д.М.Зубаиров и др., 1970). Наиболее» серьезнее изменения возникают в ¡'.лотках лимфогемспоэтическсй системы (ЛГС) (A.M.Поверенный, 1986). Доказано, что именно состояние ЛГС, 'в частности кроветворных предшественников, является определяем фактором выживания opraHiisMá после облучения в дозах, вызывающих поражение костного мозга (А.Е.Пероверзев, I9S6). В связи с этим важное значение приобретают исследования по защите ЛГС и в особен- . ности кроветворных предшественнике:) от поврээдающвго действия радиации.

В Настоящее время имеется достаточно шгрокйй выбор ра-диозацитянх средств (В.Г.Владимиров.и др., 1969), но поиск и разработка новых рецептур постоянно продолжается. В последнее врэмй внимание многих исследователей привлекают медиаторы*иммунитета как вероятные радиопротекторы. Описано защшюэ действие интер-лейкина-! ( a.Nota о.я., 1986), интерлейхина-2 (Т.Н.Семенец и др., 1989), фактора некроза опухолей-^ /кахектина (®0) ( a,seta е.а. 1997 )»' ^-интерферона ( л. Не ta, 198З ), а также взаимное усиление эффектов цитокинов при использовании в непротектив-нше дозах ( íi.lista, 19Q0 ). Механизмы радиопротективного дей-втвйя цитокинов да сих пор обсуждаются в литературе и единого ЧНВНИЯ HEL Stoi счет нет ( H.llcta, 1988j D.J.Tíaxren е.а., 1990 Выдвигаются различные гипотезы, но »i одна из них не получила по-:ta достаточного подтверждения. Учитывая важное значение клеток 1ГС для вшивания организма после облучения, некоторые авторы /называют на возможную связь радиопротективного действий медиа-торой иммунитета ú их влиянием на систему кроветворения ( x.slor-dal 19391 R.Urbaschek e.a.j 1S07).

С этой точки зрения большой интерес представляет ШО-аС. Зтот цитогатн обладает хорошим защитным эффе1сгом на облученный в ют&льннх или сублетальных дозах организм ( л.Neta, 1988 ). При ¡ублегальнмх дозах облучения ЗШ эффективен также и при введении ¡го экспериментальным животикм после облучения ( n.Neta е.а,1907).

Кроме того, №0 является важным регулятором ЛГС, существенно пяияющш на пролиферацию и дифференцировку кроветворных предшественников СЛ.В.Карканяца, 1991). На знании агих фактов и основано предположение о возможном защтиом действии данного цито-кша на систему гемопозза при облучении. Однако. радиопротектив-ноа действие ?Н0 непосредственно для кроветворны*, предшественников не изучено, Серьезным ограничением для подобного рода исследований является сложность методик изучения системы гемопоэза, особенно несовершенство. методов морфологической идентификации стволовых кроветворных клэток (СКК) и их потомков (ВЛогок-storb, 1эзе). .

Кроме-того, в большинстве известных работ авторы ис-пользоьат легальные и субяеталвные дозьг облучения, требующие применения чрсззььмайю ёысоккх концентраций ШО (й.Кс-te е.а.,' 1987? Е.Urbaschek е.а., 13Э75 L.Clordal е.ам1939), «ПО сопряжено с риском возникновения ряда осложнений, связанных с токсическим действием данного издиатора иммунитета. Пркчзг* на основании результатов этих исследований можно только установить сам йакт улучшения вшшвания облученнвэс животных без уточнения механизмов ¡¡ЁЮ-опоерэдовагагой раднопрогекцгш.

Вольной научный интерес представляет также изучение за щитных ^фактов ®0 при дозах облучения, близких к Лй длл этих клеток. При таком подходе естественно и уменьшзняэ зф^ексивных ради о пр о 1 з 1;*л 1 б mix доз ШО. Изучение защипок еффектов ШО напое-родственно для кроветворных предиоствегс-шов цвии и человека да-жег позволить установить некоторые б.озшншз пути ршяязгдии ра-диоиротективнего действия медиаторов йадукйтёга в оргяниаш. Бм-' ясненив механизма агого феномена игаат способствовать не только разработке новых способов завдаы организма, но и существенному дополнению объема имеющейся информации Но радйопротбзотийному дей стеки медиаторов иммунитета.

Изучении радйоггротектиьнше эффектов ШО-еС на кроветворные предадмэоннкки ицш и человека и поейя^ана эта работа.. Для цденмфикации биологических аффектов в ней был нсиойьгоаан рекомбинантный ШО (рШО) челоаека к нейтрализующие его актив-; ность енгите^а, что отвечает совреиашьш ®рабованиям к какого рс да исследованиям (и.д.а.Иббгв, 1990 ),

Неля я задачи исследования. Целью работа било изучение радиопрогстиенсгэ действия рзкомбинантиого фактора некроза ойу-

xonel\-<¿ на мышиные и человеческие кроветворные предшественники.

Для достижения этой пели решались следующие задачи:

1. Изучить раднопрогективное действие p3H0-«¿ человека на кроветворные предшественники мили in vivo , ox vivo , in vitro и о декстеровских культурах. .

2. Научить радиопротективные эффекты р5Ш человека на кроветворные клетки костного мозга .человека in vitro и в де.ксте-ровских культурах. '

' 3. Выяснить возмояшсть связи рад'лопротективиого действия pfflO с его влиянием на пролпфердтивную активность'кроветворных предшественников.

4. Исследовать влияние рекомбинантного интерлейкииа-б (HJ1-6) на занятные эффекты р5Н0.

5. Изучить воздействие ионизирующего излучения на продукцию íHÓ в" культурах мононуклеаров периферической крови (Ш!Ж) и мсноцитоэ/ыакрофагов человека in vitro .

Научная новизна работы. Впервые проведено комплексное изучение радиопротективных свойств SH0 на кроветворные предшественники« Исследование эффектов данного цитошгна для этих клеток' показало, что его радиопротективное действие может бить связано' с защитой геМопоэтической■ системы. Продемонстрировано наличие па--щмтного действия для Низких концентраций рШО. Установлена корреляция мегт,цу ■ радиопротекцкей и дозой цитокина, Проведено сравнение основных закономерностей проявления радиопротективногб действия $Н0 для.различных экспериментальных моделей, различающихся по характеру межклеточного взаимодействия и степени зрелости кроветворных предшественников. Сохранение основных, закономерностей . ЗНО-отюсредованной рациопротекций свидетельствует об универсальности денного. эффекта. Проведен, сравнительны!) анализ раднозащит-ньК (эффектов PÜÍ0 человека. Полученные результаты свидетельствуют ой отсутствий ■ йидоипвцифичности радноирогектишмго действия

человека», Показана также достаточно высокая, аффективное*ь рШО-Л tí качества раднопрйтектввноГо средства при его использований непойредстйенно после воздействия ионизирующего излучения • На кроветворные предшественники» Однако предпочтительным является йрименёнйо данного цитокина до облучения» Продемонстрировано, что радиопротёктийнОб действие 4И0 может быть связано- о изменением пройиферативной активности кроветворных предшественников. ШО выаыв&я дозоэдвисимое снижение численности этих клеток в я -

фазе клеточного цикла, что было противоположно действии облучения. Впервые показано, чго облучение способно значительно стимулировать продукцию Ш0~аС в культурах мононуклеаров периферической крови и моноцитов/макрофагов человека in vitro. Установлено, что рИЛ-6 человека, обладая сам по себе слабым радио-протективкьм действием, может незначительно усиливать защитные эффекты pfflO при сочетанном применении этих двух цитокинов, Показано отсутствие синергизма радиопротективных эффектов этих двух цитокинов при использовании их комбинации.

Практическая ценность. Учитывая важность проблемы воздействия радиации на организм в целом и на систему кроветворения в частности, результаты данного исследования могут оказаться полезными при дальнейшем изучении ра.циопротективного действия цитокинов, Такие исследования представляются важными для изучения механизмов занятного влияния медиаторов иммунитета на организм, а также их роли в восстановлении ЯГО после облучения. Научно-практическую ценность имеют также данные об усилении про цукции ®0 под действие« облучения, что следует учитывать при лучевой терапии онкологических больных. Результаты данного исследования могут оказаться полезными при составлении новых радиозащитных рецептур, а также, учитывая разностороннее действие ШО на гемопоэз, для зацкты кроветворных предиественников ори, радиационно-индуцированнък подавлениях гемопоэза, 1

Основные положения, выносимые на защиту;

1. р8Н0 оказывает радиопротективное действии на кроветворные предшественники мыши и человека.

2. Занятное действие ШО дозозависимо и проявляется ' при использовании цитокина как до облучения, так н посла него. При этом применений р®0 до облучения несколько более &£фектив но.

3. рШО оказывает радиопротективное Действие на кроветворные ПредиесРвеННяки костного мозга взрослых людей, амбра нальной печени человека, цэкстеровских культур человека. Наряд с отсутствием видослецифичности защитного эффекта рШО ■ 8ÏÔ CS детеяьствует об универсальности этого аффекта. ' •

4. рШО йедаайяет пролиферация кройетворньй йредаёст венников» уменьшая число клето« в fi-фаэб клеточного »шла. И гибирующео воздействие pfflO Hâ кроветворные предвзотеенники ый жег ле.«®ть в основб мёканиама Ьпоср&ЦовайноЙ ШО радиопрбтбкци

5, Усиления защитного действия рФНО при его применении в сочетании о рШ1-б не наблюдается.

5. Облучение увеличивает продукцию эндогенного ЕНО в культурах ШПК и моноцитов/макрофагов человека,

Апробация. Основные положения работа доложены и обсуждены на 2 международных, I всесоюзном и I республиканском симпозиумах и конференциях: XX конгрессе международного общества экспериментальной гематологии (Парма, Италия, 1991),'международном симпозиуме "Молекулярная биология гемопоэза" (Инсбрук, Австрия, 1991), всесоюзной научной конференции "Иммунный статус человека и радиация" (Гомель, 1993), I иммунологическом съезде Белоруссии (Минск, 1990)4

Публикаций» Основные результаты работы опубликованы в 5 печатных работах.

• Объем и структура диссертации. Работа написана по Традиционному плану и включает сяацугощие разделы: Введение» Обзор литературы, Собственные исследования <4 глава), Внвода, Список литературы (230 источников, в том числе работы отечественных авторов), 0б!дий объем диссертации - 155 страниц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

• Материалы и ието,ды исследования. В акспериментах был

использован рекомбинантный ®0-«6 человека производства .НПО "Фер-ментас'' (Вильнюс» Литва). Рекомбинантиый интерлейкий-3 человека (рИЛ-3) был предоставлен Ог.У.яаеетаког (Радиобиологический Институт, Райсвийк, Голландия)» РекоМбинантный интэрлейкин-6'человека (рИЛ-б) и мышиные моноклональные антитела к нему были предоставлены йг.Ь.Аагае» Шлстердам, Голландия), В качестве источника КОЗ для клеток мыши использовали супернатант иуйьтур гибридода Ш-1 (Л.В.Каркашца* 1990).

Источником нормальных кроветворных предшественников человека были фрагмента подвздошных костей» полученные в НИИ травматологии И ортопедии 13 БССР (г.Шнек) во время операций по поводу переломов костей таза, В некоторых опытах использовали также трупный коМный мозг, полуденный в лаборатории консервации органов и тканей 4-й Городской клинической больницы (г,Минск). Эмбриональная печень Человека была вццелеНа из эмбрионов, полученных во время аборта от здоровых женщин в абортном отделении 6-й городской клинической больницы (г.Шнек).

- 3 -

В экспериментах использованы линейные мыши cea (II-гк) и 1а1Ъ/с (K-2d) в возрасте 3-16 недель (опнты in vivo ) и в возрасте 12-20 недель (опыты ex vivo и in vitro), полученные из питомников "Столбовая" и "Рапполово".

В работе были использованы нейтрализующие мьгаиные мо-ноклональные антитела против рШЮ человека зс71< , полученные и охарактеризованные ранее в совместной работе с коллективом соавторов (А.В.Панвтич и др., 1933),

Для работы с клетками использовали питательные среды 2МШ, ШШ, тш-шо ("Gibco" , Англия; "Serva" ФРГ).

Внцеленке клеток костного мозга мшей . Костный мозг стерильно вызывали из бедренной кости мышей,-'пропускали несколько раз через иприц с иглой для подкожных инъекций и двазды mwhj валч центрифугированием в среде с эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТО.

Получение мононуклеавных клеток периферической кроьи и -костного мозга человека. Для выделения мононуклеаров периферической крова (МШН) использовали градиент плотности фиколл-верографина (1,077 г/см^) по описанной методике (Н.Н.Войтенок и др., 1337). Веделеше моноцитов проводили центрлфугироианиеи в односауприча-том градиенте- перколла (Д.В.Панвтич и др., 1938), после чего клетки несколько pao отмывали в питательной среде с добавлением сыворотки с помощью центрифугирован л я в -течение 10 минут При 250. g . Содержание макрофагов в полученной фракции определит; по наличия в клетках гранул неспецифической «¿.-нафталацетагэегераоы - цитохимического маркера макрофагов (l.S.Keplow, 1975 )» Мононуклеары костного мозга выделяли в градиенте плотности фиколл-пака (1,077 г/см^), прилипающие клетки 'уделяли адгезией на пластике, а Т-лимфоциты - розеткообразованием с эритроцитам;; б'арана (Я.В.Карканк-ца, 1992).

Жизнеспособность клеток подсчитывали ho исключений три-панового синего. • . !

Определение биологической активности ЗНО. Об активности ÍH0 и p-íHO судили по общепринятому цлтотоксическому Тесту на Мининых опухолевых клетках Ь929 . (А.В.Панотич И др., Í938). .*•"''.

Пульсовая обработка клеток рШО. 20 млн/мл клеток, игжу-бироЕали в бессывороточной среде с разбедениямй pSÍO в течение I часа rtp» 37°G, затем клетки дващцн отмывали от pffiO. Установлено, «то этого било достаточно'для полного удзлйний р9Н0 из культуры^ ,,.

Жизнеспособность' клеток после пульсовой обработки р$Нп была не ниже 9655.

Облучение животных и клеточных культур. ¿Ьигей тоталь-г но облучали лучами на установке "Э1{У-50И (НИИЭ»1 им. Гамалеи АШ СССР, г.Москва): источник Со®®, поле равномерное, мощность дозы 13,8 рад/мин. Клеточныэ культуры облучались Х-лучами на рентгеновской установке "РУМ-17" (НИИГПК МЗ БССР, гЛ.Ьшск):. мощность дозы 0,19 Дж/кг, нагтрякение 160-230 кБ, сила тока 5 мА-, фильтр Си 0,5 №.

Агаровые культуры кроветворных предшественников. Для исследования пролиферации кроветворных предшественников мыши и ' человека использовали, метод клонирования кроветворных Предшественников in vitro в полутвердом агаре о небольшими модификациями-(А.В.Панютяч и др., 1983; Л.З.Каркакнца и др., 3S90). В качестве контрольного образца КО® в мышиных культурах использовали кондиционированную среду культур гибридных клзтск мыши MK-I (Л.В.Кар-каница, IS90). Агаровые культуры человека готовили аналогично, но без меркаптоэтанола; пролиферацию колониеобразующих единиц культура (КОВс) стимулировали с псмоцыо рИЛ-3 человека.

Определение, зкзогетоьге и эндогенных КОЕо. Данная серия экспериментов выполнена совместно с н.с.Сосновской O.D. (КИИЭМ . . им.Гамалеи АШ СССР, г.Москва). Для получения экзогенных колоний . использовали метод кйонирозанйя кроветворных предшественников, предложенный ml и r.fcCulloch (1961). Для мышей-реципиентов использовали дозу.ЛД IQQ/3Ö, что соответствовало 8,3 Гр. В экспериментах эндогенного колониеобразования доза облучения, обеспечивающая образование на поверхности селезенка удобного для подсчета Количества эндогенных очагой гемопоэза была раина 5,5 Гр..

Длительные культуры костного мозга.декстеройского типа получали Так, как это.указывается в общепринятой методике (ИЛ. Чертков и др., 1984).

Продукция Ш0-С& ШИК и моноцитами человека. Бьщелен-нке.монону!(леары"ресуспецд1гровали в питательной среде в концентрации 3 или/кл и добавляла фстогемаггйотишн (№А) ( "sorva'1 , SPD а количестве 10 Мкг/мл. Стимуляций мэноцнтоа/макрофагои проводили' яппополисахарндсм (ЛПС) ("Calbiechetn" , США.)'в дозе 10 мкг/мл при клеточной концентрации I млн/мл. Продукции изучали через 24 и 48 часов культивирования клегок.

Определение ..пролиферация кроветворны« предшественников.

Для определения числа пролиферирующих КОЕк использовали метод клеточного самоубийства, основанный на поражении клеток в фазе синтеза Д1К ( s-фаза клеточного цикла) оксимочевиной ("Serva" , ФРГ) по методике л.Калатаги (1982). Для этого I млн/мл клеток

• инкубировали о 200 мкг/мл бксимочевины в бесеывороточной среде Ш в. течение I часа при 37°С.' Клетки трижды отмывали от ок-симочевины и подсчитывали жизнеспособность. Количество КОЕк в . iS -фазе учитывали по колониеобраэованию в культурах кроветворных предшественников in vitro по формуле:

А = х 100, •

где а - число колоний, образованных клетками без обработки оксимочевиной; 0 - с обработкой оксимочевиной.-'

Статистическая обработка. Достоверность различий полученных величин устанавливали, используя Критерий Сгьюдента, В работе был принят уровень еначнмости Р<0.01 й Р<0.05. В рисунках приведены доверительные интервалы, вычисленные при Р <0.05. .

••• РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУдаИБ -

I , -Рациопротективное действие ШО на кроветворные предшественники.мыли. Феномен индуцированной ШО радиопрстекцяи был

• описан рвиое в работах по исследованию радиопротективных аффектов эндотоксина (R.Vrhascheic е.а., 1906). Среди медиаторов'иммунитета ffiO-<¿- является одним их самых. эффективных по радиопр'отекТивному действию при облучении в дозах, вызывающих преимущественное поражение кроветворной системы (L.siordai е.а., 1909 ). Кроме того, <S10-«¿ также является важным регулятором этой системы, обладающим как ингибирующим (s.AMxmd о*а., 19S7 ), Так н стимулирующем "(U.Munlcer oíd, 1SJOG ) действием на клетки ЛГС.УчНтывая это, моя1-но предположить,- что ващитное Действие 'ШО на оргйиизм может быть связано с влиянием данного цнтокина на кроветворные Предшественника. Однако, на'основании результатов .большинства опубликованных работ можно только констатировать' сам факт улучшений выкивання летально и сублетально облученных животных под действием цнтокина без анализа механизмов данного явления ■ (п.Iíéta е.а., 1998} Ihür-badchek е»б», 198?! L.Slordal 6»á»¡ 1909).

В данной работе для решений ётого вопроса использовали различные методические подходы, принятые для изучения.кроветворных предшественников. Это позволило не только установить .

связь между защитным действием р$Н0 и его регуляторныы воздействием на гемопоэз, но и исследовать некоторые закономерности радио-протективного эффекта данного медиатора иммунитета.

Мы исследовали рациопротективные эффекты p®0-<¿ для кроветворных предшественников мыля in vivo , ex vivo , in vitro и в цекстеровских культурах. Во всех ранее опубликованных работах авторы использовали летальные и сублегалыше дозы облучения. Однако, зная о высокой чувствительности кроветворных предшественников к воздействию ионизирующего излучения (J.E.Sill and Е.А.Мо-Cull -3h, 19б1 )> нам представлялось интересным'исследовать радиопротективные эффекты ЗНО при дозах облучения, близких к Д0 для зтих клеток. Именно поэтому мы в своих экспериментах выбрали,, дозу облучения 0,45 и 0,9 Гр (доза облучения 9 Гр использовалабь в качестве контрольной). При таком подходе естественно и снижение защитных концентраций цитокяна: в наших опытах мы использовали концентрации цитскина в 5000-10000 раз ниже общепринятых'для такого " рода исследований (R.Nota е.а., 1388; l.Slordal е.а3989).Это позволяет приблизить защитные дозы' <£Н0 к естественным концентрация!.! этого медиатора, синтезируемым "в организме, и таким-образом избежать осложнений, связанных с токсическими эффектами. ФИО. Сроки введения/внесения цитокина в налей работе согласовывались с общепринятыми для подобного рода Исследований (R.iieta е.а., 1983; L.Slordal- о»а,1989) •' Обработка клеток рШО проводилась как до облучения, так и после него.

С целью исследования радиопротективного действия ШО, мы Изучили его влияний на экзогенное и эндогенное колониербразо-ванио в селезенках облученных мышей. Результаты, экспериментов позволили установить, что pfflO стимулирует образование 'зндоколо-ний у мышей (рис. I). Использовали описанный ранее.метод получений колоний й селезенке (Till and KoCulloch, 1961).. S10 вводали мышам," облученным в дОзе 5,5 Гр, за 20 часов до воздействия радиации либо trac спустя. Радиопротеитивнйй эффект был выралеп- в большей степени, когда рШО вбодили за 20 'часов до облучений.

Увеличившееся в результате стимулирующего воздействия pIííO количество шдсколоний мотет быть как следствием истинного возрастания пула СКК, так и результатом усиленной миграции ство-" ловых элементов из костного мозга в селезенку при неизменном числе выживших стволовых клеток. По литературным данным введение р2Н0 мышам за сутки до облучения в летальной дозе, а также спустя 1-3

Число KOEc 12

9

б

- 0,45 0,9 "Доза облучения,Гр

Рисунок I.Влияние pSHQ на экзогенное колониеобразование в селезенке, мыши облученными кроветворными предшественниками. Концентрации pfflO: Q-0 Ед/;шво?ное, | - 50 Цд/животное, 200 Цц/животное, Ц ~ 400 Вд/живот'ноэ.

часа после обучения в сублзтальной дозе приводит к разному уве- i личению. пострадиационной выживаемости киаотных, а также к более быстрому восстановлению гематологических показателей (R.Heta е.а., 19ÖQ; L.Slordal е.а,1909). По-видимому, ©10 действительно может индуцировать восстановление гемопозза у мышей, тшс как в анало-гпчных экспериментах усилившаяся миграция клеток-из костного мозга в селезенку, при неизменной численности выживших стволовых вле-ментов даже теоретически не обладала .бы столь значительным радйо-протектквиым эффектом (А.Е.Перееерзев, I9B6). Естественно предположить, Что стимуляция еццоколониесбразования и увеличеше поотра- . диационной выживаемости мыыей связаны с.действибМр$ЙО На СКК. , .

При изучении сгволйвого потенциала мышей; пояучаашй/С.■ рйЮ до или непооредзтвенно после облучении, оказалось, что численность КОЕс, выявляемых методом экзогенного койониёобрйзованЦя(, существенно увеличивается пб результатам учета на 8-е сутки ; (рис. 2). ШО вводили мышам до или нопосредствейид йоолё облучения в дозах 0,45, 0,9 и 9 Гр, а затем донорский костный Maat1 ■трансплантировали летально обдучбнным реципиента.',и Можно tip'e,qrti»- ! ловить еле,дующие механизма опосредованной ФИО радиопротекции трансплантированных.кроветворны*■ клетокt I). рИЮ мбг.ёт избира- ' тельнс способствовать, отбору наиболее' радиаЦибШю-устойчиЕЬпе'. .. : • пулов с Максимальный иролиферативнш Потенциалом поейб трансплантации; "2) рйЮ может повклать тропноЬтЬ '¿ранеялантируемьи iäi,eTök ' к-селезенке, в ййлу чего,выявлялась, Ьозмолзю; завышенное имело.-;*' , колоний. Наконец, усиленное колойиеоёрадЬЫиШв бить след— '-, ствиом,пролиферации .под действием р®0 (который способен вызывать,, синтез крогегтдат рос'тойых факторов) öojtsa дифферёнцироййнйьтх i

Число КОЕо 12

-СЫыео-

5,5 7,5 Доза облучения.Р^

Рисунок 2. Влипниэ рШО на эндогенное колониеобразова-ние в селезёнка шли. Концентрации pfflO: Q - 0 Ед/живо-:'ноо, Ц -50 Ед/живогное, '. | - 200 Ед/живбтноо, | - 400 Дц/животНов!

клеток, чем плюрипбтентная СКК. Последнее предположение основывается на том, что колоний в селезенкб могут развиваться нё обязательно на СКК. Предполагай!*, что до 60% селезеночных колоний развивается из коммитнрованных предшественников, сохранивших достаточно высокий стволовой потенциал (Й.Л.Чертков и др., 1904), Далее мы сделали попытку проследить, будут ли изменяться основные закономерности, выявленные в экспериментах in vivo, при удалении акцйОйорнь« и стромальнйх клеток - продуцентов вторичных факторов, которые могут бпосре4оЬа*ь радиопротсктивное дсйствиО р5Н0. Для síoro ш провели серию ¡экспериментов es v'ivo, р'ЗНО йводнли группам ыьвзей 3á 20 Часой до или спустя час после тотального облуйёния ¿'-лугами, а через 24 Чйса клетки костного мог-' rá йзолировакт, Очицали и оценивали их способности образовывать колонии ¿фоветворных предшественников в йойуШрднх агаровьй культурах iio сравнения с оариаяТаг»:Г{ без Ця'Фокнна, Параллельно проводили сразимте С вариантами, йсФда рШ0 нйхсциЛсл В организме только послз облу^еняя. Йри такой постановке эксперимента рНО могет ен--MBáíi в оргайксмэ цёпь рйэйй^их реакций (например, синтез циго-Кйнов, таких КйК ИЛ-1 (C.A.Díriarsllo é.a. ¡ 1986 } , КСФ (S.N.Vocel

j 10S7),. но ó механизме рацяопротошШ ике'от значение ять Té проЦёйсм,' который полностью реализуются а <гечйк«е 44 часов с ноМбнта ввепёйий рФНО (24 tfacsá для варйантй введения иитокииз ¡Носяе облучения)i Так как йойЛэ ofofo нарушаются естественные ■ связи кровётво{>Ных п^едиюствекНИкоб с Клеркам»! Млкроокрукения 'Дпй усл&вййл теста колрнПйобразоЬаНий й егаро). Йо.^рсинке результаты быМ весьма схоцня с результатами. эксПсряйентог in Wvov. ;

' ^становдеч'о;- что р$Н0, обя?дал-"догтокерН!'м рядспроте;спнз»

6

ным эффектом как при введении его до облучения, так и поело воздействия радиации. Однако, При введении цитокина после облучения эффект был снижен.

Кроме того, мы изучили влияние облучения на клетки костного мозга в присутствии р$Н0 in vitro . Для этого очищенные от прилипающих клеток кроветворные предшественники костного мозга мьши инкубировали в течение I часа при 37°С с рШО в соответствующих концентрациях до (в этом случае облучение проводили в при- • сугствии цитокина) или непосредственно после облучения Х-лучами. Протективное действие цитокина характеризовали по способности облученных КОЕк образовывать колонии в полутвердых агаровых культурах . Избранный метод клонирования кроветворных предшественников (А.В.Панютич и др., 1988) позволяет количественно оценить изменение пролиферативной активности.КОЕк под действием различных; внешних воздействий (например, облучения). При этом во многом устраняется влияние кроветворного минроокружения. В результате проведанного исследования установлено, что pffiO обладал радиопро-тективным действием на облученные КОЕк маши.

Во всех наших опытах (независимо от условий постановки эксперимента) радиопротективнее действие СНО может быть связано . как с прямым влиянием данного цитокина. на 1сровотворные предшественники, так и с его опосредованным воздействием на клетки кроветворного микроокружения. В силу сложной -организации- ЯГС исследовать механизм радиопротективиого действия медиаторов иммунитета чрезвычайно трудно. Б принципе, результаты, работ R.Urbaschei о.а» (1987) и L.Slordal с.в* (1989), а такгг.о наши данные подтверада-ют, что <Ш0 обладает защитным действием на систему кроветворения» Однако, на основании .этих результатов нельзя судить о механизмах данного эффекта. В экспериментах R.Ueta «¡.а. (1988) установлено, что максимальное ваттное действие pfflO наблюдается при введении его за 20 часов до облучения» Учитывая, что Продолжительность существования рЕЮ и организме ограничивается, возможно, минутами (B.B.AggamvaX, 1985 ), оба оти факта скорее свидетельствуют в пользу опосредованного механизма радиопротективиого действия ШО. Возможно, данный датокШ "запускает цепь реакций (например, индуцирует продукцию ИЛ-1 и К® в клетках кроветворного микроокрухо-ния и н акцессорных клетках и таким образов оказывает защитное действие).

Как уже отмечалось, восстановление, системы кроветворе-

иия после облучения определяется в первую очередь количеством сохранившихся СКК. Это позволяет Предположить, что радиопротёк-тивное дейстпие ЭЮ опосредуется на уровне. СКК. В таном случае защитные эффекты этого цитокина могут быть связаны с продукцией фактора роста стволовых клеток, который стимулирует их пролиферацию и лифференцнровку (я.щШйлв е.о, ,1991 ). В зтой связи интересно отметить, что при введении летально облученным мышам фактор роста стволовых клеток сам по себе улучшает пострадиационную выживаемость экспериментальных жлпотных (1.МсШ.есо е.а., 1991).

Для понимания механизмов радиопрОтективного действия ЙЮ необходимо четкое представление о роли й месте данного цитокина" в регуляции кроветворения. Ранее, в исследованиях других авторов было установлено'сильное подавление пролиферации КОЕк в присутствии рйЮ (Н.Вгохтэуег е.а., 1985; З.АЪЪоиД е.а., 1987 ). Этот ингибирувщиП аффект ЕГО является скорее всего результатом прямого воздействия £Н0 на КОЕк (к.ВагЬег е.а<, 198? ). Однако, установлено и опосредованное ингибирующзе действие данного цитокина (Л.В.Кзрканица, 1991).

В качестве вторичных посредников, имеющих вакное значение для проявления опосредованного ингибнрувщего действия ФНО, "следует отметить индукцию макрофагальных факторов воспаления. (Кар), которые'могут блокировать рецепторы к ИЛ-3 и ГМ-КСИ-кроветворных предшественников (м.Р1еп-,ь , 1991). Механизм опосредованного ингйбируклцего действия нож.ет Играть существенную роль, особенно если учесть, что некоторые из вторичных ингибиторов (Например, гой'ерфёроны илН простаглаИ.циии) сам» оказывает некоторое радибпротективное действие (Р|А.1л/отаку ё.п», 1977; Напаоп апА ТЬошай» 1963 ). В то гее Время, опосредованно - через индукция КСФ - в Клёцках макроойружения - ШО может отполировать пролиферацию НОЙ (К.Миикег е.ц. | 1986 ). Учитывая, что данные эффекты прйТИвой'йлОКШ,-вахз!0 обсудить, 1сак же ОНИ бооФносятся в организме? . , '

Было высказано предположение, что они разделены' во времени И пространстве (Л.В.Карпаница,,1991). В первое время после Облучения определяющим'мокет быть ийгйбирую'цее действие (прямое или опосредованное). Его цель - резко ограничить миграцию и пролиферация кроветворных предшественников,. И тем самым снизить вероятность их повреждения. В последующем более существенна может

быть стимулирующий оффект - через продукцию К® - способствующий более быстрому восстановлению кроветворения. Косвенным подтверждением возможности такого разделения во времени является динамика продукции ®Ю и КС» в культурах мснонуклеаров ».ериферической "крови (Л.В.Карканица, 1991).

Таким образом, с этой точки зрения нет.Противоречий в объяснении существования нескольких путей реализации радиопротективиого действия ШО. 05а эти эффекта при обучении носят выражен- • ный защитный характер и соответствуют рога И0 как возможного универсального фактора естественной резистентности.

В большинстве ранее опубликованных работ ÍR.Eeta o.a., 1988; x.siordal o.a., 1989 ) для достижения радиопротективиого эффекта используются чрезвычайно высокие концентраций цитокина (0,1-10 мкг), что сопряжено с возникновением ряда тялялых осложнении. Это в равной степени справедливо и для ИД-I, и для ®0. Поэтому в настоящее время многие Исследователи Пытаются добиться уменьшения доз препаратов, используя сочетания нескольких цитокй-нов (R.Neta s.a.,19S6íR«Heta,1938), Особую актуальность этой проблеме придает тот факт, что описано взаимное усиление радиопротективиого эффекта цитокинов при их использовании в непрстективных дозах (R.He-ta е.а.» 193а). Подобным действием обладают не только цитокины с собственным- выраженным ¡защитным йректом (например, ИЛ-I и ФИО), но и К®, в отношении радйопротехтивных свойств которых имеются противоречивые сведения (R.Hete е.а. ,1938; K.G.r/ad-dick е.а., 1991). Mu В Наших исследованиях Остановились на ИЛ-6.

Результаты, позволяйте составить представление о ра-диопротектиьных возможностях ИЯ--5, были получены нами на очищенных ,кроветворных предшественниках костного мозга мыши*. На основании работ других авторов нами была выбрана доза ИЛ-б - 50 Ед » которая йызкшет ойльныо Изменения в системе кроветворения (D.Ren-nick е.а*, 1969). Установлено¡ Wo КЛ-6 сам по себе практически не обладал рздиопротёКтивИьш, действием. При обработке кДеток ИЛ-6 в комбинация с рШО синергизма действий не наблюдалось. ШО, кроме '. того вызывал существенную ингибицию йолониеобразосания 8. агаре, которая практически Полностью отменялась р51Л-6. Однако, суцестзён-ного улучшения выживаемости кроветворных предшественников при'использовании рЙ5Н0 в сочетании с ИЛ-6 не наблюдалось. Таким образом, в нашей случае рШ1-б (при его использований и Данной концентрации)_ вряд ли мокст представлять интерес как самостоятельный радиопротек-

тор, а такие как вещество , усиливающее защитное действие р5Н0.

Заключительным отапом исследования радиопротективинх эффектов рИЮ для кроветворных предшественников мыши било изучение действия данного цитокина в длительных культурах костного мозга декстсроаского типа СИ.JI.Чертков и др,1984). Декстеровские культуры - ото многокомпонентные тканевые системы, п которнх сохранены связи кроветворных предшественников с клетками ликроокру-жения, обеспечивающие полную клеточную диффзренцировку и подцерп-ние популяции прояиферирушск клеток. Фактически такие культуры позволяют наблюдать гемопоэз in vitro. Морфологически они характеризуются тем, что в них идет преимущественно гранулоцитопоэз и кроветворение сдвтгуто' в сторону.более зрелых клеток (II.Л.Чертков и др., 1984). Гемопоэз в декстеровокях культурах весьма чувстзи-. телен к экзогенным факторам различной природы (С.А.Кузнецов и др., 1984). Это позволяет не только исследовать влияние облучения на кроветворные предшественники, но и изучать эффекта радиозащтшх средств, так как в дёкотеровских культурах, как и в опытах с очищенными изолированными клетками возиоша пульсовая обработка р£Н0 С последующей нейтрализацией последнего.

Результаты оценивали по изменении колониеоб-

разования В агаре кроветворными прйдюестзенниками ив'облученных декстероаских культур. Декстеровскиэ культуры костного мозга получали по.описанной методике (И.Д.Чертков и др., 1984). Наши результат позволяют заклачить, что рйЮ обладает достоверным радио-, дроте кти'внш действием на гзмопозгичеокие клетки длительных куль-¿гур декогеровского типа. При этом полностью сохраняются все закономерности данного феномена, описанные нами В опытах in vivo ,<;:с VlVo и in vitro.

Интересный представйялооь изучение ¡вопроса о видоспеця-фичности радиоПротективного эффекта pffiO. Ранее было установлено, что №0 невидоспецифичен, хотя имеются Некоторые различия в аминокислотной после,ц&ватёЛ1Н0сТи Для разных вицое, а также некоторые количественный отлйчия в проявлении биологической активности (B.B.Agg&rwal е.а., 198$), Показано, например, что plHO человека Подавляет пролиферации кроветворных предшестёенников костного . мозга ¡мыши ( ы»Murphy е.ей» I9fis). В наших экспэриментах'также устаноьяе'но' отсутствие видовой епбцифичнооти-радноиротем-тивного Дейстййй pSHO человека,для указании* клеток*

2, Рациопротекгивное действие р?Ш0 на кроветворные ' предшественники человека. В качестве источника кроветворных предшественников человека мы использовали костный мозг взрослого донора и эмбриональную Печень. Как и для аналогичных клеток мыши, рЗШ обладал радиопротективным действием На кроветворные предшественники человека (рио. 3). При этом отличий в эакономер-Число КОЕк бо

45

30

15

0,45 0,9 Доза облучения,Гр

•Рисунок 3. Радиопротектйвное действие pSHO человека На кроветворные предшественники костного мозга Человека in vitro. Концентрации рИО: Q - 0 Щд/мл, g - 50 Ед/Мл, |- 200 Ед/мл, | - 400 £д/мл. ■ ■•

ностях проявления данного эффекта для Кроветворных предшественников человека (взрослый костный мозг и эмбриональная печень) и .мыши (костный мозг) ' не выявлено. Наши опыты по изучению радиопротекгивмого действия рйГО для кроветворных предшественников костного мозга взрослых людей , эмбриональной печени человека, а также .декстеровских культур подтверждают универсальность данного эффекта. Основные оакономерности* йыявленные на мышиной модели, сохранялись. ®0 обладал дозозависимым радиопротективным действием на кроветворные предшественники человека при обработке клеток цитокином как до, так а поело облучения.

Анализ радиопротективным эффектов цитвкинов.Невозможен . без- знания их роли в патогенезе лучевого поражения ЛГС» Известно, что под действием облучения монет изменяться продукция некоторых медиаторов иммунитета (ИЛ-1\ ИЛ-2) (А.А.Ярилин,. 1988). Не исключена такая воёмояюсть и для ШО. В то .жо время, учитывая тот факт, что для эффективной заветы организма of высоких доз радиации требуются очень болыцие концентрации данного цитокина, допустимо предположить, что под действием облучений может Подавляться продукция эндогенного СНО. Раднопротективиый эффект его рекомбинант--нога аналога в данном случае Может' быть связан С заместительной

■терапией.

С целью проверки справедливости данного предположения мы изучили изменение продукции SHO в культурах ШГ1К и моноцитов/ макрофагов человека in vitro , Оказалось, что облучение не только не подавляло продукции ЙЮ, Но даже значительно усиливало, (табл, I), Уровень продукции цитокина прямо зависел от дозы об-

Таблица I. Влияние облучения на продукцию ШО-vC макрофагами периферической крови человека.

Активность $НО-<й , Ец/мл

Доза облуче-

24 часа 48 часов

нин» Гр, нестимули- стимулирован- нестимули- стимулиро-рованные ные ЛПС мак—. рованные ванные ЛГЮ макрофаги рофаги макрофаги макрофаги

0 8,0 9,2 4,6 6,1

0,45 12,1 10,4 . 8,0 10,6

0,9 10,6 24,3 27,9 52,0

9,0 27,9 27,9 21,1 119,4

0,05, so всех остальных случаях - Р < 0.05.

•лучения. Таким образом, наши данные свидетельствуют о тоу, что дащйтноб действие (ВНО не связано о дефицитом данного цитокика, возникающим я организме при воздействии рацнацип. Наши результаты согласуются о бцубликованнши ранее работами a.ii.schivart.4 е.а. в,et» (1981) о повышения функциональной активности иакрофаго§ под действием облучения, а также о данными D.B.Hailahan (1909) о накоплении мШК МО в облученных опухолевых клетках.

Это явление иожег иметь как положитёльное, так и отрицательное значение для облученного организма. С одной стороны, уёийеНЯв продукции эндогенного' ФНО мокег оказывать заветное деП-СТВНё на еистейу кроветворения. С другой стороны, сверхпродукцня SHÖ посла облучения ыокет бить причиной развития лихорадки и ка-хбК'ЧМвсйого состояния) что Может значительно замедлить течение восстановительных процессов в организме и в целом уху^иигь 'прогибе выздоровления.

3. Изучение влияния рШО на прохождение крдветво[>||14ми Предшественниками фазы синтеза ДЩ ( s-^азы) клеточного №1кг.ц._ Помимо выяснения тйгр« как - Л^лмо или опосредованно - цейитвуе! $М0 на облучённые-кроветворный предшественники, вл.тно усганошт.,

какими изменениями о клетках ЛГС (особенно СКК и кроветворных, предшественников) сопровождаются ^¡адиопротективные эффекты данного цитокина? Большой интерес представляет вопрос о взаимосвя-' зи радиочувствительности кроветворных Предшественников с их' нахождением в различных фазах клеточного цикла. Б работах некоторых исследователей отмечается реш&ощзо значение ингибируюцого действия ШО на клеточный цикл кроветворных предшественников для проявления его радиопротек-хивных эффектов, Так К.а.Вайсиск: е.а. (1990), исследуя радиопротекгквное действие ЙГО и ИЛ-1 ¡:а эндогенное колониеобразование в селезенке'мыли, пришли к выводу, что. возможно, механизмы эффектов этих двух цитокинйв различны, и -действие ©10 скорее всего связано с- ингибицией 'охорбети прохождения КОЕс фаэ клеточного цикла.

Учитывая то,- что 8-фаза, вероятно, является одной из важнейших точек приложения регулпторных сигналов, за-

ьтигное действие СИО на облученные кроветворные предшественники может' сопровождаться изменением численности последних В.данной фазе. Например, известно» что окзбгеНные колонии В селезенке образуются преимущественно из КОЕс .трансплантата, находящихся в момент переноса в фазе <50 клеточного цикла,' Выход клеток в 2-фазу приводит к Частичной утрате трансплантатом колоние-■ образующей способности; что было продемонстрировано, О.Ю.Игнатьевой и соавт. (1934) в работе по изучению механизма действия фактора ингибицни стволобих клеток» . ' .

. Кроветворные предшественники -..обработанные, раю и Облученные -. инкубировали с оксимочеаиной - цнтостатиком, селективно подавляющим клетки в З-фазе Сс.Иесаа, 1976; ¿.Пио-ЬЪоуея е.а., 1978 ) • В наших экспериментах при действии и облучения и рЗНО наблюдаемся Изменение количества клеток 8 Б-фазй. Выявлена интересная закономерность! при воздействии облучения процент клеток в з-фазе увеличивается, а после пульсовой обработки рЙК в -большинстве случаев значительно уменьшается. При этом оба эффекта находятся в прямой зависимости от дозы облучеМя-ИйН кон- . центрации цитокина (табл. 2). Выявленные (закономерности проявлялись практически во мех опытах как на клетках мышИ,: так и на клетках человека. ,

Однако, в одном иэ случаев (кроветворные предаествеи-■ пики эмбриональной печени человека) радйоиротекТивное действие ФИО сопровождалось не уменьшением , а, наоборот, увеличением

Таблица 2, Изменение пролиферативной активности кроветворных предшественников костного мозга мной при облучении в присутствии р5НО. Эксперимент ex vivo ■(,% клеток в S -фазе).

Доза облучеиия, Концентрация р®0, Ед/жипо' гное

Гр 0 50 200 400

0 25,8 ■ 22,0^ 4,2 ■2,7

0,45 55,2 43,8 31,0 20, Г

0,9 57,7 34', 4 21,8 18,0

*Р>0.05, во всех остальных случаях - Р < 0.05. численности КОЕк в s -фазе клеточного цикла. Это может быть связано с особенностями регуляции кроветворения в эмбриогенезе,. что требует дальнейших исследований. Кроме того; этот факт может, свидетельствовать о том, что', возможно, не всегда радиопротек-тивное действие ЙЮ связано с ингибицкей'прохождения'фаз клеточного цикла кроветворными предшественниками. Следует отметить, что полученные а наших опытах результаты касаются только s -фазь' и никоим образом не отрицают других" возможностей. Не .исключено . .также одновременное существование и прямого и- опосредованного

, путей защитного действия fliO.__

Таблица 3. Влияние облучения и преиккубации с рЗНО на пролиферативную активность Кроветворных предшественников эмбриональной печени "человека tri vitro {% клеток й s-фазе).

Доза облучения, . Концентрация рШО, Вд/мл

. ,... .,. ... О ;• ...so_" 200 _ 409

О 35,2 34,7§ 21,9 - 28,3

<" ' 0,45 16,5 35,7 31,6 38,2

0,9 - . 45,6 -49,2 55,7 52,2

^Р>0*05, во всех остальных случая:* - Р <0.05.

вывода: " :

1. Рекомбинантнкй фактор некроза опухолей-^/кахектин (рЙЮ- £ ) оказнвае? радиолротёктивное действие на кроеетвярные предшественники мышиного (in vivo ,ех vivo ,m vitro , в денст?-роеских культурах) а человеческого (ta vitro « в дек.стеройскмх «ультуразс) происхождения.

2. Защитное действие рЙЮ дозо'зависимо й при использованных й опытах дозах облучения проявляется независимо от о'прэд-

ности воздействия цитокина и радиации. При обработке кдеток рФНО после облучения его радиопротективное действие сравнимо или несколько ниже, чем в случае введения/внесения р®0 до облучения.

3. Радиопротективное действие р®Ю, по-видимому, универсально: оно наблюдается для кроветворных предшественников костного мозга взрослых люцей, эмбриональной печени человека, декстеровских культур человек^ , а также для кроветворных предшественников ыыш. Последнее свидетельствует также об отсутствия видовой специфичности рациопротективного действия рШО человека,

4. рВДО влияет на Цролифератявную активность кроветворных предшественников, в большинстве случаев уменьшая количество клеток в s-фазе клеточного цикла, с чем может быть связано защитное действие этого цитокина при облучений.

5. рИЛ-6 при его применении в использованной нами концентрации сам по себе обладает очень слабым радиопрртектйвнда действием на кроветворные предшественники Мыши in vitro. Усиления защитного эффекта р£Н0 при применении комбинация этих двух цятокинов не наблюдается.

6. Облучение дозозависшо увеличивает проекцию эндогенного ШО в культурах моноцитов/макрофагов и мононуклеароп пе^-риферической крови человека in vitro , что, возможно, является Ьдним из путей самозащиты организма от повреждающего действия ионизирующего излучения.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации: Í. С.И.Кривенко, Л.В.Карканица. Радяозацитное действие фактора некроза опухолей-«С на кроветворные предшественники эмбрио-• нальной печени человека//Тез.докл. 1 иммунологического-съезда Белоруссии. Минск, 1990«-С.70-71.

2. Л.В.Карканица, С,И.Кривенко. Радиопротективное действие фактора некроза опухолей->£ человека на кроветворные предшественники в длительных культурах костного мозга человека декстеров-ского типа//Тез.докл.2-го международного симпозиума "Молекулярная биология гемопоэза". Иннсбрук, Австрия, I99I.-C.36S.

3. Л.В.Карканица, G.H.Кривенко. Выживаемость КОЕс из облученных Х-лучами длительных культур костного мозга мши, обработанных рекомбинантнкм фактором некроза опухолей/кахектином (ШО) человека/Дез, докл. 20-го ежегодного съезда международного общества экспериментальной гематологии. Парма, Италия, 1991

-С.520.

4. С.И.Кривенко, С.И.Дрык. М.В.Комаровская, Л.В.Нарканица. Увеличение продукции фактора некроза опухолей под действием облучения в культурах мононуклеаров периферической крови и моноцитов/макрофагов человека/Дез.докл.Всесоозной научной конференции "Иммунный статус человека и радиация".Гомель, 1991.--С.43.

6. С.И.Кривенко, Л.В.Нарканица, О.Ю.Сосновская, А.В.Санин. Изучение радиопротективных эффектов рекомбинантного фактора некроза опухолей (р£Й0) для кроввтворннх предшественников мши// Иммунология. 1991.-№ 5.-С.32-35.