Кроветворение в длительной культуре костного мозга мышей, дефицитных по фактору некроза опухоли

Нифонтова, Ирина Николаевна

Диссертации по медицине → Гематология и переливание крови

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Кроветворение в длительной культуре костного мозга мышей, дефицитных по фактору некроза опухоли

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Нифонтова, Ирина Николаевна Москва 2005 г.

Ученая степень: кандидата биологических наук

ВАК РФ: 14.00.29

Автореферат диссертации по медицине на тему Кроветворение в длительной культуре костного мозга мышей, дефицитных по фактору некроза опухоли

На правах рукописи

Нифонтова Ирина Николаевна

Кроветворение в длительной культуре костного мозга мышей, дефицитных по фактору некроза опухоли.

14.00.29 - гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2005

Работа выполнена в Государственном учреждении Гематологический Научный центр Российской Академии Медицинских Наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук Нина Иосифовна Дризе.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Иван Андреевич Воробьев; кандидат биологических наук Мария Андреевна Лагарькова.

Ведущее научное учреждение:

Государственное Учреждение Российский Онкологический Научный центр им. Н.Н. Блохина Российской Академии Медицинских Наук

Защита состоится « УУ » _2005 г. в часов

на заседании диссертационного Совета Д 001.045.02 при Государственном учреждении Гематологический Научный центр Российской Академии Медицинских Наук

по адресу: 125167 Москва, Новозыковский проезд, д. 4а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного учреждения Гематологический Научный центр Российской Академии Медицинских Наук.

Автореферат разослан «■// » иАЛ^Л_2005 года

Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат медицинских наук

Е.Е.Зыбунова

¿¿>06-У

шп

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Регуляции в кроветворной системе осуществляются системой ростовых факторов и цитокинов, каждый из которых, как правило, способен стимулировать к пролиферации или апоптозу несколько различных типов предшественников. Некоторые цитокины способны действовать и на зрелые клетки, ингибируя или стимулируя в них апоптоз.

Одним из таких многофункциональных факторов, влияющих на кроветворные клетки различной степени зрелости, является фактор некроза опухоли (ФНО). В зависимости от степени зрелости клеточной популяции и состава других участвующих цитокинов он способен как ингибировать, так и стимулировать пролиферацию. Напрямую ФНО воздействует на зрелые клетки-предшественники в костном мозге только как ингибитор, а его стимуляторные эффекты, как правило, непрямые, и реализуются через индукцию продукции других цитокинов. ФНО является мощным регулятором их образования, а также может модулировать экспрессию поверхностных рецепторов к многочисленным цитокинам. Наиболее известна роль ФНО как индуктора программируемой клеточной гибели, однако, как и в случае регуляции пролиферации, участие ФНО в индукции апоптоза зависит от присутствующих цитокинов. Имеются данные о влиянии ФНО на дифференцировку стромальных клеток костного мозга.

разнообразные нарушения иммунного ответа. Также были получены свидетельства того, что у мышей, нокаутных по ФНО, нарушены взаимодействия кроветворных клеток со своим микроокружением. Кроме того, известно, что в длительной культуре костного мозга мышей ФНО-/-наблюдается повышение суммарной клеточной продукции, а также количества КОЕ-ГМ. Исследование кроветворной системы дефицитных по ФНО мышей может прояснить роль этого многофункционального цитокина в гемопоэзе. Однако большинство имеющихся в настоящее время данных было получено in vivo, где, как известно, существует значительная избыточность и взаимозаменяемость цитокинов. Т.о., нельзя исключить вероятность того, что функции отсутствующего изначально ФНО взяли на себя какие-то другие факторы.

В связи с этим необходимо изучение изменений в кроветворной системе мышей, дефицитных по фактору некроза опухоли, методами, позволяющими снять воздействия других цитокинов. Удобной моделью для этого представляется длительная культура костного мозга.

Цель работы:

Целью настоящей работы было изучение роли фактора некроза опухоли в кроветворной системе на модели мышей, дефицигаых по этому гену, методами in vitro.

В условиях культуры сильно снижено количество различных факторов роста и цитокинов, что дает возможность заметить изменения в кроветворении, вызванные отсутствием ФНО. Таким образом, эта модель открывает новые возможности для выявления роли ФНО в регуляции кроветворения.

Задачи:

1. Сравнить основные характеристики кроветворения в ДККМ мышей ДТ и ФНО-V.

2. Изучить возрастные изменения кроветворения и роль ФНО в этом процессе.

3. Проанализировать влияние ФНО на стромальные клетки.

4. Попытаться получить стромальные клеточные линии от дефицитных по ФНО животных для модельных экспериментов по выявлению роли этого цитокина в формировании кроветворного микроокружения.

Научная новизна:

В данной работе впервые было показано, что продолжительное поддержание кроветворения в длительной культуре костного мозга мышей, дефицитных по фактору некроза опухоли, сопровождается повышением количества кроветворных предшественников всех исследованных уровней дифференцировки, уровня их пролиферации и апоптоза. Впервые показано участие ФНО в регуляции пролиферативного потенциала стромальных клеток-предшественников. Доказано, что наблюдаемые в длительной культуре изменения не являются следствием опухолевой трансформации. Полученные в работе данные выявили важную, ранее не описанную, роль ФНО в регуляции кроветворения. Этот цитокин модулирует количество стволовых кроветворных клеток, участвует во взаимодействии кроветворных клеток со стромальным микроокружением и важен для развития и поддержания стромы кроветворных органов. Детальное выяснение функции этого цитокина позволит более полно охарактеризовать систему регуляции процессов кроветворения.

Научно-практическое значение работы:

Результаты исследований могут быть использованы в экспериментальной гематологии и работах по экспансии СКК. Полученные стромальные линии открывают широкие возможности экспериментального изучения отдельных элементов стромального микроокружения, роли экспрессии факторов, важных для самоподдержания и выживания СКК, а так же актуальной возможности адаптации мезенхимальных клеток для экспансии СКК ex vivo. Результаты

работы демонстрируют значение ФНО для формирования регулярной структуры кроветворного микроокружения.

Положения, выносимые на защиту:

• Экспрессия ФНО кроветворными клетками приводит к ограничению их пролиферативного потенциала.

• Экспрессия ФНО стромальными клетками способствует выживанию кроветворных клеток-предшественников с высоким пролиферативным потенциалом.

• ФНО играет существенную роль в предотвращении возникновения возрастных изменений кроветворной системы.

ФНО оказывает ингибирующее действие на способность стволовых стромальных клеток к пролиферации.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ.

Апробация работы

Диссертационная работа апробирована 19 октября 2005 года на заседании проблемной комиссии «Гемопоэз, молекулярная биология, биотехнология, иммуногематология; гемобластозы и депрессии кроветворения» ГУ ГНЦ РАМН.

Материалы работы были представлены на следующих конференциях и симпозиумах:

1. «Поддержание кроветворения в длительной культуре костного мозга у мышей, дефицитных по гену ФНО». XXII Международная Гематологическая Школа «Лейкозы и лимфомы. Терапия и фундаментальные исследования». Москва, 26-28 июня 2002.

2. "Dynamic of CAFC frequency in long-term bone marrow culture of TNF deficient mice." 31st Annual Meeting of the International Society for Experimental Hematology. Montreal, Canada, July, 5-9, 2002.

3. "Hematopoietic supportive stromal cell line was established from suspension fraction of long-term bone marrow culture." 31st Annual Meeting of the International Society for Experimental Hematology. Montreal, Canada, July, 5-9, 2002.

4. Neoplastic transformation is not the course of extremely long (more than 100 weeks) hematopoiesis maintenance of long-term bone marrow culture from TNF deficient mice." 7th Meeting of the European Hematology Assotiation. Florence, Italy, June, 6-9,2002.

5. "Functional analysis of stromal cell lines derived from non-adherent fraction of long-term bone marrow cultures of TNF knockout mice". Modern trends in human leukemia. XV Wilsede Meeting, June 14-18, 2003.

6. "Характеристика клеточных линий, полученных из длительных культур костного мозга мышей, дефицитных по фактору некроза опухолей". XXIV Международная Гематологическая Школа «Лейкозы и лимфомы. Терапия и фундаментальные исследования». Москва, 25-27 июня 2003.

7. "Comparative study of stromal cell lines derived from non-adherent fraction of long-term bone marrow cultures of TNF knockout mice". 32nd Annual Meeting of the International Society for Experimental Hematology. Paris, France, July, 5-8,2003.

8. "Hematopoietic stem cells and mesenchymal stem cells in long-term bone marrow cultures of TNF knock-out mice" 9th Congress of the European Hematology Association, Geneva, Switzerland, June 10-13, 2004.

9. «Кроветворные и стромальные стволовые клетки в ДККМ мышей, дефицитных по ФНО», XXVI Международная Гематологическая Школа «Лейкозы и лимфомы. Терапия и фундаментальные исследования». Москва, 28-29 июня, 2004.

10. «Кроветворные и мезенхимальные стволовые клетки в длительной культуре костного мозга мышей, дефицитных по фактору некроза опухоли». I съезд физиологов СНГ, Сочи, Дагомыс, 19-23 сентября 2005.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, собственных результатов, обсуждения результатов, выводов, списка литературы и приложения. Материалы диссертации изложены на 188 страницах машинописного текста и включают 48 рисунков, 19 таблиц и список литературы из 268 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Получение длительных культур костного мозга (ДККМ), прикрепленных клеточных линий, их клонирование и функциональные тесты проводились стандартными методами культивирования. Так, длительные культуры костного мозга получали по методу Декстера: в каждый пластиковый флакон с площадью дна 25 см2 стерильно вымывали костный мозг одного бедра мыши в виде фрагментов в 5 мл среды Фишера, затем добавляли еще 5 мл среды и других питательных компонентов в расчете на конечный объем 10 мл. Культуру вели в питательной среде с 80% среды Фишера (ICN), 2мМ глутамина (ICN), Ю^М гидрокортизона (Sigma) и 20% сыворотки (1/3 эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС, HyClone) и 2/3 лошадиной сыворотки (ЛС, GibcoBRL)). В полную питательную среду добавляли антибиотики: 100 ед./мл пенициллина (Ферейн) и 50 мкг/мл стрептомицина (Ферейн). Культуру вели при 33°С и 5% С02 с еженедельной сменой половины среды без возвращения удаляемых клеток. Получение и клонирование стромальных клеточных линий осуществляли в среде для остеогенной дифференцировки: ДМЕМ с 10% ЭТС, xl ITS (инозитол-трансферрин-селенит натрия, Sigma), 10мМ p-глицерофосфат натрия (Sigma), 0,05мМ 2-фосфат

аскорбиновой кислоты (Sigma), ЮОнМ дексаметазон (Sigma), 1мМ пируват натрия (ICN), 2мМ глутамин и антибиотики.

Для анализа состава клеток-предшественников и дифференцированных кроветворных клеток были использованы иммуноцитохимические методы с использованием флуоресцентно меченых моно- и поликлональных антител к специфическим для каждой стадии дифференцировки маркерам (CD45(BD Pharmingen, US Biological), Mac-1 (CD1 lb), Mac-3, Ly-6G (Gr-1), CD34, CD117 (c-kit), CD135 (Flk-2/Flt-3), Ly-6A/E (Sca-1), CD31 (PECAM-1), CD44 (BD Pharmingen), а также кроличьи анти-человеческие антитела против коллагенов I, II и IV типов и фибронектина (Imtek)). Функциональное состояние клеток-предшественников оценивали в различных клональных тестах, таких, как подсчет КОЕ-С(12) в сублетально облученных мышах-реципиентах (по методу Тилла и МакКаллока), подсчет КОЕ-ГМ в полужидкой среде (помещали по 105 клеток в 1 лунку 24-ячеечной платы (по 4 лунки на вариант) в 0,5 мл питательной агаровой среды следующего состава: среда 1 (см. далее) с 0,3% бактоагара (Difco), 30% ЭТС (НуС1опе),1% 2мМ глутамина (ICN),100 ед/мл пенициллина (Ферейн),50 мкг/мл стрептомицина (Ферейн), 0,1% |3-меркаптоэтанола (Serva) и 10% смеси кондиционированных сред от клеток линий WEHI ЗВ и L929 (2:1) в качестве источника ростовых факторов), подсчет клеток, образующих области булыжника, с использованием метода Пломахера. Для этого в 60 ячеек 96-ячеечной платы предварительно были посажены суспендированные клетки костного мозга из двух бедренных костей мыши ДТ в среде для Декстеровской культуры. Платы культивировались при 33°С и 5% С02 во влажной атмосфере. Еженедельно проводилась смена половины среды. Через 3 недели платы облучали и вместе со сменой всей среды имплантировали на полученный подслой тестируемые клетки в 4х последовательных разведениях (как правило, 50, 25, 12,5 и 6,25 тысяч клеток на ячейку, в каждом разведении по 15 ячеек). Анализ ячеек производили каждую неделю под инвертированным микроскопом. Согласно методу Пломахера для определения частоты КООБ использовалось количество

отрицательных (не содержащих КООБ) ячеек.

Интенсивность пролиферации клеток-предшественников оценивали по доле клеток, чувствительных к воздействию цитостатиков (часть клеток из в концентрации 106/мл инкубировали с оксимочевиной (Serva) (концентрация 1мг/мл) в течение 2 часов, либо в течение 1 часа с добавлением арабинозид-цитозина (Pharmacia&Upjohn) (концентрация 2Х10"6 моль/мл) в среде Фишера с 2% ЭТС при температуре 37°С и 5% С02, затем клетки отмывали средой Фишера и использовали для определения количества различных кроветворных предшественников). Уровень апоптоза в длительных культурах определяли с использованием иммунофлуоресцентного метода, основанного на различной проницаемости мембран и степени конденсированное™ хроматина живых и апоптотических клеток. Для этого клетки осаждали на стекло, фиксировали 4% параформальдегидом (на фосфатно-солевом буфере (ФБ), ICN) на 25 мин. После этого стекла промывали в двух сменах ФБ, по 5 мин каждая. Затем клетки обрабатывали 0,2% Triton Х-100 (на ФБ, ICN) в течение 5 мин для пермеабилизации мембран, снова промывали в двух сменах ФБ по 5 мин. DAPI (Ю^мг/мл, Sigma), наносили на стекло и оставляли на 15 мин при комнатной температуре. Стекло споласкивали ФБ и заключали в глицерол.

Морфологию кроветворных клеток различных уровней дифференцировки в ДККМ мышей, дефицитных по ФИО, определяли по данным иммуноцитохимического анализа и по мазкам, приготовленным и обработанным стандартным образом (окрашивание по Паппенгейму).

В ходе экспериментов по проверке возможности возникновения в культуре неопластической трансформации теломеразную активность и кариотип определяли согласно стандартным методикам. Для определения способности клеток из ДККМ мышей, дефицитных по ФИО, образовывать опухоль при попадании в организм, клетки из суспензионной фракции (СФ) такой культуры после 45 недель культивирования вводили внутривенно и внутрибрюшинно 3 интактным мышам и 3 мышам, предварительно облученным для ослабления иммунитета (ЗООсГр). Суммарное количество введенных клеток составило 1,2x106 клеток на мышь. Все мыши были линии

С57В1/6 ДТ, возраст в начале эксперимента 8-14 недель. Каждые 2 месяца у мышей из хвостовой вены брали кровь для подсчета количества лейкоцитов и лейкоцитарной формулы. Из клеток крови также выделяли геномную ДНК для анализа методом ПЦР на наличие в периферической крови клеток с генотипом

Экспрессию интересующих генов определяли методом обратной транскрипции и последующей полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР).

Результаты работы

Наличие кроветворных клеток в суспензионной фракции (СФ) длительных культур костного мозга (ДККМ), полученных от мышей дикого типа (ДТ) и дефицитных по фактору некроза опухоли (ФНО-/-), определяли по наличию либо кроветворных предшественников, либо СБ45+ клеток. Было показано, что в ДККМ ФНО-/- продукция кроветворных клеток продолжается в 5-6 раз дольше, чем в ДККМ ДТ (164,3+ 19,8 недели против 25+ 4,3 недели соответственно) (рис.1).

Рис.1. Количество клеток в СФ ДККМ ДГ и ФНО-/-, усреднение данных по каждым 10 неделям наблюдения.

При этом в рассматриваемых типах культур существенно отличается динамика изменения частот встречаемости как ранних, так и поздних кроветворных клеток-предшественников (КОЕ-ГМ, КООБ-7, КООБ-28) с течением времени культивирования (рис.2А, Б).

ФНО-/-.

500

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 продолжительность наблюдения, недели

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

-»-ДТ

-■—ФНО-/-

продолжительность наблюдении, надели

1000,00

100,00

— а |8

2 Э 11

КМ 29

31 37 68 67 75 82 104 109 возраст культуры, н*дели

Рис.2. А. Концентрация КОЕ-ГМ в ДККМ ДГ и ФНО-/-, на 105 клеток СФ. Б. Динамика встречаемости КООБ-7 и КООБ-28 в костном мозге ДТ и в ДККМ ФНО-/- с течением времени культивирования.

Через 10 недель культивирования не обнаруживается значимой разницы в частоте КОЕ-ГМ между культурами. В дальнейшем в ДККМ ДТ количество КОЕ-ГМ резко снижается и после 30 недель культивирования не детектируется совсем (что коррелирует с истощением клеточной продукции), тогда как в ДККМ ФНО-/- в это же время происходят противоположные события. Уже с 20 недели частота КОЕ-ГМ начинает расти и к 50 неделе превышает прежнее значение практически на порядок. На 50 неделе культивирования частота КОЕ-ГМ была 359 + 22,7 на 105 клеток СФ. Частота КОЕ-ГМ продолжала повышаться на протяжении еще 30 недель, достигая 1130,63 + 539,95 на 105 клеток СФ к 80 неделям культивирования.

Затем этот показатель постепенно снижался, но оставался на уровне, сравнимом с таковым в ДККМ на ранних сроках культивирования, вплоть до окончания культивирования (до 200 недель).

Из сравнения полученных частот видно, что, как минимум с 30 по 80

неделю культивирования, количество поздних (КООБ-7) и особенно ранних

кроветворных предшественников (КООБ-28) находится на довольно высоком

уровне. Так как определить точно частоту КООБ-7 в КМ ДТ не удалось из-за

того, что значения вышли за выбранные нами верхние границы

чувствительности метода и наверняка можно утверждать лишь, что их

количество превышает 120 на 105 клеток КМ, то сложно сказать, насколько

велика разница между частотами этих предшественников в КМ ДТ и в ДККМ

ФНО-/-, культивировавшейся от 30 до 80 недель. Тем не менее,

предшественники этой степени дифференцированности присутствуют в

довольно высоких количествах в проанализированных культурах. С более

ранними кроветворными предшественниками, КООБ-28, ситуация более ясная:

с 30 по 80 неделю культивирования частоты этих предшественников

увеличиваются более, чем на порядок (через 29 и 66 недель - 10,13 и 10 на 105

клеток СФ соответственно против 0,54 на 105 клеток КМ), а иногда и на два

(через 37 и 67 недель - 41,71 и больше 120 на 105 клеток СФ соответственно

против 0,54 на 105 клеток КМ) превышают таковые в КМ. После 80 и до 110

недели культивирования в ДККМ ФНО-/- происходят изменения, приводящие

к значительному снижению, но не к полному исчезновению, как ранних, так и

поздних кроветворных клеток-предшественников. Т.о., кроветворение в

ДККМ ФНО-/- поддерживается гораздо дольше, чем в ДККМ ДТ. В отсутствие

экспрессии ФНО кроветворными клетками в ДККМ не происходит истощения

кроветворения, наблюдаемого в интактных культурах, а наоборот, клеточная

продукция поддерживается на постоянном уровне в течение времени,

сравнимого или превышающего продолжительность жизни мыши. При этом,

тогда как в ДККМ ДТ на протяжении всего времени наблюдения практически

все клетки неприкрепленной фракции - кроветворные, в ДККМ ФНО-/- после

30-40 недель культивирования доля кроветворных падает до 1-10%. Интересно отметить, что это происходит приблизительно в тот момент, когда в культурах ДТ происходит угасание кроветворения. Снижение доли кроветворных клеток в культурах, дефицитных по ФИО, не сопровождается снижением клеточной продукции. В то же самое время в этих культурах резко повышается частота встречаемости практически всех проанализированных кроветворных предшественников.

Показано, что в отсутствие ФНО, участвующего в регуляции процессов пролиферации и программируемой клеточной гибели, к моменту истощения кроветворения в культурах ДТ (сопровождающегося резким повышением доли клеток в апоптозе) в ДККМ ФНО-/- повышается доля пролиферирующих клеток, а приблизительно через 10 недель начинает повышаться и доля клеток в апоптозе (рис. ЗА, Б и В).

О 5 10 15 20 28 30 36 продолжипльность кромтворенкя, неделя

Г'

время культивирования, недели

В.——---

Рис.3. А. Доля пролиферирующих КОЕ-ГМ из СФ ДККМ ДТ и ФНО-/-разного возраста. Б. Доля клеток из СФ ДККМ ДТ и ФНО-/-, вступивших в апоптоз. В. Количество клеток в СФ ДККМ ДТ и ФНО-/- из эксперимента по определению доли клеток в апоптозе, на мл взвеси.

Следовательно, в отсутствие одного индуктора апоптоза его функции на себя берет какой-то другой. Помимо ФНО в кроветворной системе вступление клеток в апоптоз обуславливает еще и взаимодействие Раэ-Рав-Ь, возможно, что и в данном случае именно этот цитокин, который также является членом семейства ФНО, вызывает повышение доли клеток в апоптозе.

Аномальная продолжительность клеточной продукции при повышенном уровне пролиферации и апоптоза, а так же появление морфологически нехарактерных для данной культуры клеток может быть следствием произошедшего неопластического перерождения.

К важнейшим свойствам неопластической клетки относятся: 1) отсутствие репликативного старения, или «иммортализация»; 2) ослабление индукции апоптоза; 3) блокирование клеточной дифференцировки; 4) самодостаточность в пролиферативных сигналах; 5) генетическая нестабильность; 6) нечувствительность к рост-супрессирующим сигналам; 7) изменения цитоскелета / локомоции и 8) стимуляция неоангиогенеза. В ДККМ ФНО-/-после длительного культивирования была обнаружена генетическая нестабильность. Однако клональных изменений выявить не удалось, что указывает на возрастные изменения в культуре, а не на опухолевую

трансформацию. Обнаружение высокой теломеразной активности, которая, как недавно было продемонстрировано, не обязательно предотвращает укорочение теломер также недостаточный признак трансформации. В кроветворных клетках в культуре происходит индукция апоптоза; образуются клетки-предшественники разной степени зрелости, и как минимум, для одной из них (КОЕ-С) показано сохранение способности к всем стандартным дифференцировкам, что не подтверждает наличие неопластического перерождения в ФНО-/- культурах. Жизнеспособность клеток зависит от наличия ростовых факторов в среде; попадая в организм ослабленного или интактного животного, эти клетки не развивают опухоли или гемаТопролиферативные заболевания в течение года. В совокупности представленные данные свидетельствуют о том, что изменения, наблюдаемые в ДККМ ФНО-/- после длительного культивирования, не являются следствием возникшей неопластической трансформации.

Очевидно, что в отсутствие ФНО серьезно нарушается система регуляции ранних кроветворных предшественников. Возможно, в данном случае имеет значение повышение уровня экспрессии большого числа генов, участвующих в регуляции СКК и стромальных клеток (интегрина ßl, фактора стволовых клеток (SCF) и его рецептора c-kit, а также хемокинового рецептора CXCR4, ВМР4, остеомодулина, остеопонтина, кадгерина 2 типа (костная дифференцировка), COMP (хрящевая дифференцировка), РЕСАМ1 и FVIII (эндотелий), FGF1 (фибробласты)) в клетках стромального подслоя ДККМ ФНО-/- с течением времени культивирования. Кроме того, необходимо отметить несколько важных моментов. Прежде всего, так как первые 20-30 недель культивирования ДККМ ФНО-/- практически ничем не отличается от ДККМ ДТ, то, вероятно, в регуляции нормального стабильного кроветворения ФНО участия не принимает или его роль могут взять на себя другие цитокины. Однако, он необходим для осуществления процессов, приводящих к истощению кроветворения в культуре. Так как существует, скорее всего, неслучайное совпадение по времени истощения кроветворения в ДККМ ДТ и

резкого повышения частот всех проанализированных предшественников в ДККМ ФНО-/-, то можно предположить, что именно в это время наступает некая контрольная точка (биологические часы), в которой ФНО запускает каскады, элиминирующие кроветворные предшественники. Т.о., при снижающейся в процессе культивирования функции контроля пролиферации и отсутствии апоптотического эффекта ФНО в культуре и наблюдается существенное повышение частот всех проанализированных типов предшественников. При этом важно отсутствие только аутокринного ФНО: наличие экспрессии этого цитокина клетками подслоя при кокультивировании клеток КМ ФНО-/- с подслоем ДТ, продуцирующим ФНО, не только не приводит к исчезновению феномена, а наоборот, изменения становятся гораздо более выраженными.

При анализе частоты кроветворных клеток-предшественников разной степени зрелости в ДККМ ФНО-/-, установленных на подслое ДТ, были выявлены значительные отличия от ДККМ ФНО-/-. Данные по изменению частоты КОЕ-ГМ с течением времени культивирования приведены на рис.4.

■ «HO-f-

ВФЖМ- на подслое ДТ

во 100 110 120 130 140 190 100 190 200 время культивирования, недели

Рис.4. Изменение частоты КОЕ-ГМ в СФ ДККМ ФНО-/-, установленных на подслое ДТ, на поздних сроках культивирования.

Частота КОЕ-ГМ в ФНО-/- ДККМ на поздних сроках культивирования фактически на два порядка ниже, чем в то же время в ДККМ ФНО-/-, исходно установленной на подслое ДТ. В СФ ДККМ ФНО-/- на подслое ДТ как

минимум в период с 90 по 120 неделю культивирования частота встречаемости предшественников этого типа составляет от 1 на 10 до 1 на 100 клеток.

Существенные отличия были выявлены и среди менее дифференцированных клеток-предшественников - КОЕ-С. Данные приведены на рис.5.

ь юо

¡ИФНО-/-

□ ФНО-/ на лсдслое ДТ

90 100 110

время культивирования недели

Рис.5. Изменение частоты КОЕ-С в СФ ДККМ ФНО-/-, установленных на подслое ДТ, на поздних сроках культивирования.

Частоты КОЕ-С в ДККМ на подслое ДТ даже спустя 90 недель культивирования более, чем на порядок превышают таковые в ФНО-/- ДККМ. Концентрация КОЕ-С в таких культурах при этом существенно превышает стандартную концентрацию этих клеток в костном мозге, которая составляет 20-30 на 105 клеток.

Вероятным объяснением может быть, что на ранних стадиях реорганизации СКК ФНО-/-В кроветворном микроокружении ДТ, продуцирующем ФНО, последний каким-то образом способствует селекции и преимущественному выживанию кроветворных предшественников с высоким пролиферативным потенциалом.

О том, что ФНО принимает участие в сохранении пролиферативного

потенциала, свидетельствуют и данные, полученные при анализе отличий в

характере изменений между культурами, полученными от молодых и старых

мышей. Тогда как в присутствии ФНО (в культуре ДТ) продолжительность

продукции кроветворных клеток не зависит от возраста донора (рис.бА) и,

таким образом, подтверждает, что в норме пролиферативный потенциал

кроветворных клеток-предшественников велик и с возрастом снижается незначительно, в культурах, в которых ФНО отсутствует, продолжительность кроветворения снижается с увеличением возраста донора (рис.бБ), что указывает на роль ФНО в сохранении пролиферативного потенциала СКК. Возрастные изменения в динамике изменения частот кроветворных предшественников в культурах ФНО-/- (рис.7А и Б), а также снижение уровня экспрессии практически всех проанализированных генов с увеличением возраста донора с очевидностью указывают на участие ФНО в возрастных изменениях регуляции кроветворных предшественников и более дифференцированных клеток.

О 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 продолжительность культивирования, недели

Рис.6 .А. Количество клеток в СФ ДККМ ДТ, полученных от молодых и старых животных, усреднение данных по каждым 10 неделям наблюдения. Б.

Количество клеток в СФ ДККМ ФИО-/-, полученных от молодых и старых животных, усреднение данных по каждым 10 неделям наблюдения.

Рис.7. А. Изменение частоты встречаемости КОЕ-ГМ в СФ ДККМ ДТ, полученных от молодых и старых мышей, усреднение данных по каждым 10 неделям наблюдения. Б. Изменение частоты встречаемости КОЕ-ГМ в СФ ДККМ ДТ, полученных от молодых и старых мышей, усреднение данных по каждым 10 неделям наблюдения.

Итак, при анализе динамики изменений в отделе ранних и поздних клеток-предшественников было показано значительное повышение частоты встречаемости кроветворных предшественников всех проанализированных уровней дифференцировки в период с 30 по 80 неделю культивирования. Эти

показатели оставались на высоком уровне вплоть до 70-80 недели культивирования, когда в СФ ДККМ ФНО-/- начали появляться клетки стромальной природы. Выводы о природе клеток, составляющих на поздних сроках культивирования большую часть клеток СФ, были сделаны на основании иммуноцитохимических характеристик - начиная с 50 недели общий лейкоцитарный маркер СБ45 несет около 10% клеток (рис.8); результатов морфологических и гистохимических окрашиваний (клетки при окрашивании по Паппенгейму проявляют типичную для стромальных клеток морфологию, кроме того, окрашиваются положительно на щелочную фосфатазу и неспецифическую эстеразу в присутствии фторида натрия); результатов по экспрессии генов (в клетках СФ на поздних сроках культивирования экспрессируются такие маркеры стромальных дифференцировок, как ВМР4, остеопонтин и кадгерин 2 типа, при этом другие маркеры той же линии дифференцировки (остеомодулин, остеокальцин и ШБР) в этих клетках не экспрессируются); а также функциональных тестов при использовании среды для остеогенной дифференцировки из клеток СФ, культивировавшихся более 70 недель были получены прикрепленные стромальные линии с эффективностью от 24 до 99,9%.

100

£ 10

1--

0,1

■ ФНО-/-ПДТ

ГГ-Г

О 2 30 40 50 60 110 120 130 140 150 160 170 возраст культуры, недели

Рис.8. Изменение доли СБ45+ клеток по мере культивирования в ДККМ ДТ и ФНО-/-.

Как известно, в прикрепленных клетках в случае нарушения адгезионных взаимодействий или открепления от субстрата начинается апоптоз. Однако, наблюдаемые нами стромальные клетки не только не погибают в неприкрепленном состоянии, но и сохраняют способность прикрепляться и пролиферировать, оказавшись в благоприятных для этого условиях. Имеются данные, что, как минимум в клетках рака простаты, адгезия к молекулам внеклеточного матрикса защищает эти клетки от апоптоза, индуцируемого ФНО. Вероятно, в стромальных клетках костного мозга апоптоз, вызываемый нарушениями клеточной адгезии, также опосредуется ФНО. В его отсутствие эти клетки, открепившись, не погибают. Более того, в условиях, благоприятных для дифференцировки клеток костной ткани, эти неприкрепленные стромальные клетки не только прикрепляются, но и обнаруживают довольно высокий, хотя и ограниченный, пролиферативный потенциал. Следовательно, и в отделе стромальных клеток ФНО участвует в регуляции пролиферативного потенциала. Клетки полученных стромальных линий клонируются и отличаются между собой и по функциональным характеристикам, и по профилю экспрессии различных генов.

Экспрессия некоторых генов клетками прикрепленных стромальных клеточных линий.

линии,

СПК ФНО-/- линии, полученные из ДККМот молодых мышей, на подслое ДТ полученные из ДККМот молодых мышей

проанализированные гены возраст культуры при получении, недели

28 141 94 141

(3-актин ++ + + +

интегрин Р1 +++ ++ + +

ВМР4 +++ + -/+ -

СОМР ++ + -/+ +

остеомодулин + +/- +/- -

РЕСАМ1 + - ++ ++

десмин + - - -

тубулин рЗ + +/- + -

8ПР1 ++ + + ++

СХСЯ4 ++ - - -

БСР ++ ++ + +

с-кй ++ - - -

ит - - - -

Ш-Л - -/+ -/+ -

УБвР - + +/- ++

РвР! + +/- + ++

+++ - ген экспрессирован во всех протестированных субклонах на очень высоком уровне, ++ - ген экспрессирован во всех протестированных субклонах на высоком уровне, + - ген экспрессирован во всех протестированных субклонах, +/- - ген экспрессирован более, чем в 50% протестированных субклонов, -/+ - ген экспрессирован менее, чем в 50% протестированных субклонов, - - экспрессия гена не обнаружена ни в одном из протестированных субклонов.

Это, опять же, свидетельствует о том, что наблюдаемый эффект не является следствием единичного случая трансформации. Более того, тот факт, что клетки линий одновременно экспрессируют маркеры различных линий дифференцирвки говорит о недифференцированности полученных клеток.

Кроме того, при посадке на уже сформированный подслой ДТ суспензии клеток КМ ФНО-/- через какое-то время стромальные клетки ФНО-/-полностью вытесняют аналогичные клетки ДТ (рис.9).

ко нт иго тт тя» »«мо

Рис.9. ПЦР анализ генотипа подслоя ДККМ через 80 недель культивирования клеток КМ от ФНО-/- мышей на подслое ДТ.

ко - КМ мышей дефицитных по ФНО; АУТ - костный мозг мышей ДТ; WT/ko -костный мозг радиационных химер ДТ, восстановленных клетками КМ ФНО-/- животных; ехр.30 - подслой ДККМ.

Следовательно, отсутствие аутокринной экспрессии ФНО существенно повышав! конкурентоспособность клеток стромы, возможно, за счет повышения пролиферативного потенциала. Так как в ДККМ ФНО-/-, изначально установленных на подслое ДТ, продуцирующем ФНО, стромальные клеточные линии получались с эффективностью, существенно меньшей, чем в культурах с полным отсутствием ФНО, то, видимо, воздействие этого фактора на стромальные клетки в течение некоторого времени необратимо ограничивает пролиферативный потенциал этих клеток.

Подводя итоги, на модели длительной культуры костного мозга мышей, дефицитных по фактору некроза опухоли, были выявлены следующие функции этого цитокина:

• аутокринная экспрессия ФНО важна для сохранения пролиферативного потенциала кроветворных клеток-предшественников (либо для избирательного выживания СКК с высоким пролиферативным потенциалом) в процессе старения организма. Однако, при культивировании клеток костного мозга аутокринная экспрессия ФНО приводит к снижению пролиферативного потенциала как кроветворных, так и стромальных клеток-предшественников;

• наличие экзокринной экспрессии ФНО во время культивирования способствует сохранению кроветворных клеток-предшественников с высоким пролиферативным потенциалом, но необратимо ограничивает таковой у стромальных предшественников.

Ввиду того, что в организме наблюдается значительная функциональная

избыточность цитокинов, то, вероятно, у мышей, дефицитных по ФНО, его

функции по регуляции кроветворения практически полностью замещаются другими факторами. Поэтому при анализе кроветворения у мышей, дефицитных по ФИО , in vivo существенных отличий в кроветворной системе выявлено не было. Однако нам удалось показать роль ФНО в процессах, предотвращающих возникновение возрастных изменений кроветворной системы. Кроме того, наши исследования были проведены ex vivo, и этим было снято воздействие множества ростовых факторов, гормонов и цитокинов. Стало очевидно, что факторы, секретируемые самими миелоидными и стромалъными клетками костного мозга не могут в полной мере скомпенсировать отсутствие ФНО в процессах регуляции кроветворных и стромальных стволовых клеток.

ВЫВОДЫ

1. Количество клеток-предшественников в разных отделах стволовых кроветворных клеток регулируется фактором некроза опухоли. В его отсутствие в длительной культуре костного мозга в 5-6 раз увеличивается продолжительность кроветворения с дифференцировкой до зрелых форм. По мере культивирования пролиферация клеток-предшественников интенсифицируется, в 10 - 100 раз повышается концентрация кроветворных клеток-предшественников. Доля клеток в апоптозе нарастает с течением времени культивирования.

2. Все изменения кроветворения сохраняются при культивировании клеток костного мозга мышей, дефицитных по фактору некроза опухоли на подслое клеток, продуцирующих этот цитокин. Следовательно, для увеличения продолжительности кроветворения важно отсутствие экспрессии фактора некроза опухоли кроветворными клетками.

3. Кроветворение в культурах, полученных от нормальных мышей, не ухудшается с повышением возраста донора костного мозга. В культурах от старых мышей повышена продукция КОЕ-ГМ, а кроветворение продолжается на 10 недель дольше, чем в культурах от молодых животных.

4. В культурах, полученных от старых животных, дефицитных по фактору некроза опухоли, в отличие от молодых мышей того же генотипа, снижаются: продолжительность кроветворения, интенсивность клеточной продукции и частота всех кроветворных клеток-предшественников.

5. Фактор некроза опухоли участвует в регуляции структуры стромального микроокружения. Стромальные клетки, дефицитные по этому цитокину, полностью вытесняют аналогичные контрольные клетки при совместном культивировании. Начиная с 70 недели культивирования во фракции неприкрепленных клеток длительных культур костного мозга от молодых и старых животных, дефицитных по фактору некроза опухоли, появляются стромальные клетки-предшественники, образующие прикрепленные, клонирующиеся клеточные линии, находящиеся в недифференцированном состоянии. Полученные линии способны длительное время поддерживать кроветворение и рост эмбриональных стволовых клеток без дифференцировки.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. И.Н.Нифонтова, М.А.Эршлер, Н.И.Дризе, 2002. Аномалии, выявляемые в длительной культуре костного мозга мышей, дефицитных по фактору некроза опухоли: индукция а по птоза и клеточная пролиферация. Бюлл Эксп Биол Мед, Том 133, №4.

2. М.А.Эршлер, И.Н.Нифонтова, Ю.В.Ольшанская, Т.В.Тодрия, И.ЛЧертков, Н.И.Дризе, 2002 Длительное самоподдержание кроветворных предшественников в культуре костного мозга мышей, дефицитных по фактору некроза опухоли, не является следствием неопластической трансформации. Бюлл Эксп Биол Мед, Том 133, №5,537-540.

3. Nifontova I.N., Ershler М.А, Drize N.I., 2002. Dynamic of CAFC frequency in long-term bone marrow culture of TNF deficient mice. Experimental Hematology, v.30, N6, supp.l, 17.

4. Nifontova I.N., Ershler M.A., Olshanskaya Y.V., Chertkov JJL., Drize N.J., 2002. Hematopoietic supportive stromal cell line was established from suspension fraction of long-term bone marrow culture. Experimental Hematology, v.30, N 6, supp.l, 68.

5. Ershler M.A., Nifontova I.N., Olshanskaya Y.V, Todria T.V., Chertkov J.L., Dri7e N.J., 2002. Neoplastic transformation is not the course of extremely long (more than 100 weeks) hematopoiesis maintenance of long-term bone marrow culture from INF deficient mice. The hematology journal, v3, suppl.l, 418.

6. Nifontova I.N., Drize N.J., 2003, Comparative study of stromal cell lines derived from non-adherent fraction of long-term bone marrow cultures of TNF knockout mice, Experimental Hematology, N7, suppl. 1, p.179-180.

7. Ershler Maxim.A., Nifontova Irina.N., Olshanskaya Yulia.V., Todria Tamara.V., Chertkov Joseph.L., Drize Nina.J.,2003, Neoplastic transformation is not the course of extremely long (more than 100 weeks) hematopoiesis maintenance of long-term bone marrow culture from TNF deficient mice, The Hematology Journal, v4, N1,74-77.

8. Нифонтова И.Н., Эршлер M.A., Дризе Н.И., 2003, Динамика состава клеток-предшественников в культуре костного мозга мышей, дефицитных по фактору некроза опухоли, Бюлл.экспер.биол.мед., 2003, том 135, №3, с.330-333.

9. Нифонтова И.Н., Ольшанская Ю.В., Дризе Н.И.. Характеристика стромальных клеточных линий, полученных из суспензионной фракции культур костного мозга мышей, дефицитных по фактору некроза опухоли. Бюлл.экспер.биол.мед., 2004, т.138, №9, с.284-289.

10. Nifontova I.N. Drize NJ. 2004, "Hematopoietic stem cells and mesenchymal stem cells in long-term bone marrow cultures of TNF knock-out mice." The Hematology Journal, vol. 5: Supplement 3, S70.

11. Nifontova I.N., Drize N.J, Effect of wild type stromal cells on hematopoiesis in long-term bone marrow cultures repopulated with bone marrow of TNF knockout mice Exp.Hematol., 2005, v.33, N7, supplement 1, p. 125.

12. Нифонтова И.Н., Дризе Н.И. Кроветворные и мезенхимальные стволовые клетки в длительной культуре костного мозга мышей, дефицитных по фактору некроза опухоли. Научные труды I съезда физиологов СНГ, том 1,стр.213, тезис №587.

М2196?

РНБ Русский фонд

2006-4 20811

Принято к исполнению 10/11/2005 Заказ № 1215

Исполнено 11/11/2005 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш., 36 (095)975-78-56 (095) 747-64-70 www.autoreferat.ru

Оглавление диссертации Нифонтова, Ирина Николаевна :: 2005 :: Москва

Оглавление.

Основные использованные обозначения и сокращения.

Введение.

1 Актуальность проблемы.

2 Цель работы.

3 Основные задачи.

4 Научная новизна и практическое значение работы.

5 Материалы и методы исследования.

6 Основные положения, выносимые на защиту.

7 Содержание работы по

главам.

8 Благодарности.

Глава 1. Обзор литературы.

1 Клеточные основы кроветворной системы.

1.1 Схема кроветворения.

1.2 Методы изучения состава кроветворных предшественников.

1.3 Регуляция самоподдержания и дифференцировки пСКК.

2 Мезенхимальная стволовая клетка.

3 Цитокины, влияющие на кроветворные клетки-предшественники.

3.1 Общая характеристика влияния различных цитокинов на гемопоэз.

3.2 Роль ФНО в гемопоэзе.

3.3 Роль ФНО в регуляции клеток стромы.

4 Рецепторы ФНО.

5 Методика получения нокаутов.

6 Общие характеристики мышей ФНО-/-.

7 Характеристика кроветворения в ДККМ ФНО-/-.

Глава 2. Материалы и методы.

1 Животные и их содержание.

2 Условия облучения животных и культур клеток.

3 Длительные культуры костного мозга Декстеровского типа (46).

4 Определение количества КООБ.

5 Получение и анализ КОЕ-С.

6 Определение количества КОЕ-ГМ (агаровая культура клеток из суспензионной фракции ДККМ).

7 Определение интенсивности пролиферации предшественников разной степени зрелости из СФ ДККМ.

8 Определение доли клеток, находящихся в апоптозе.

9 Получение прикрепленных клеточных линий из неприкрепленных клеток СФ ДККМ ФНО-/-.

9.1 Получение фидера из перитонеальных макрофагов.

9.2 Получение прикрепленных клеточных линий.

9.3 Клонирование полученных клеточных линий.

10 Пассирование клеток полученных линий, а также линий, использовавшихся для сравнения.

11 Получение кондиционированных сред от полученных стромальных линий.

12 Проверка способности клеток полученных стромальных линий поддерживать кроветворение.

13 Проверка способности клеток полученных стромальных линий поддерживать рост КОЕ-ГМ в полужидкой среде.

14 Проверка способности клеток полученных стромальных линий поддерживать рост эмбриональных стволовых клеток.

14.1 Получение эмбриональных фибробластов.

14.2 Культивирование ЭСК.

14.3 Проверка способности клеток полученных стромальных линий поддерживать рост ЭСК.

15 Подсчет клеток.

16 Покрытие стекол поли-лизином.

17 Гистохимия.

17.1 Окрашивание кроветворных клеток по Паппенгейму.

17.2 Окрашивание срезов селезеночных колоний, образованных КОЕ-С.

17.3 Окрашивание клеток СФ на щелочную фосфатазу (5).

17.4 Окрашивание клеток СФ на неспецифическую эстеразу (5).

18 Иммунофлуоресцентное окрашивание.

18.1 Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток для последующего их анализа и счета с использованием флуоресцентного микроскопа.

18.2 Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток для последующего их анализа и счета с использованием проточного цитофлуориметра.

18.3 Антитела, использованные для иммунофлуоресцентного окрашивания.

18.4 Флуоресцентное окрашивание клеток прикрепленных клеточных линий на актиновые микрофиламенты.

19 Проверка клеток СФ на опухолеродность.

19.1 Проверка факторной зависимости клеток СФ.

19.2 Проверка способности клеток СФ образовывать опухоль при попадании в организм.

19.3 Кариотипирование клеток СФ и полученных стромальных линий.

19.3.1 Задержка митоза в анализируемых клетках.

19.3.2 Фиксация хромосом.

19.3.3 Приготовление препаратов хромосом.

19.3.4 Метод G-дифференциальной окраски хромосом по методике (224), с модификациями.

19.3.5 Анализ хромосомных перестроек.

19.4 Определение теломеразной активности в клетках СФ ДККМ ФНО-/- (8).

19.4.1 Приготовление клеточных экстрактов.

19.4.2 Определение активности теломеразы.

20 Выделение геномной ДНК.

20.1 Выделение геномной ДНК из клеток крови.

20.2 Выделение геномной ДНК из клеток подслоя ДККМ ФНО-/-, изначально установленной на подслое ДТ.

21 Выделение РНК из анализируемых клеток.

21.1 Выделение РНК.

21.2 Определение количества и чистоты полученной РНК.

22 Анализ принадлежности геномной ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

23 Анализ экспрессии различных генов методом обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР).

23.1 Построение первых цепей ДНК на РНК.

23.2 Анализ полученной кДНК методом ПЦР.

24 Методы статистической обработки данных.

Глава 3. Результаты.

1 Характеристики длительной культуры костного мозга мышей дикого типа и ФНО-/-.

1.1 Клеточная продукция в ДККМ ДТ и ФНО-/- и продолжительность кроветворения.

1.2 Анализ морфологии клеток СФ.

1.2.1 Морфологический анализ клеток СФ в длительной культуре костного мозга мышей дикого типа и ФНО-/-.

1.2.2 Функциональный анализ способности клеток из СФ ФНО-/- к нормальной дифференцировке после длительного культивирования.

1.2.3 Анализ изменения доли CD45+ клеток в длительной культуре костного мозга мышей дикого типа и ФНО-/-.

1.3 Анализ количества КОЕ-ГМ в длительной культуре костного мозга мышей дикого типа и ФНО-/-.

1.4 Анализ количества КОЕ-С в длительной культуре костного мозга мышей дикого типа и ФНО-/-.

1.5 Анализ спектра кроветворных предшественников разного уровня зрелости методом КООБ.

1.5.1 Сравнение профилей кроветворных предшественников на разных сроках культивирования ДККМ.

1.5.2 Изменение количества КООБ-7 и КООБ-28 в ДККМ ДТ и ФНО-/- с течением времени культивирования.

1.5.3 Анализ экспрессии генов в ДККМ ФНО-/-.

1.5.3.1 Анализ экспрессии генов в слоях прилипающих клеток из ДККМ ДТ и ФНО-/-.

1.5.3.2 Анализ экспрессии генов в клетках СФ из ДККМ ФНО-/-.

1.6 Изменение характеристик кроветворных клеток-предшественников в ДККМ ФНО-/-, полученных от старых мышей.

1.6.1 Продолжительность кроветворения в ДККМ ФНО-/-, полученных от старых мышей.

1.6.2 Анализ доли CD45+ клеток в ДККМ ФНО-/-, полученных от старых мышей.

1.6.3 Анализ состава кроветворных клеток-предшественников в ДККМ ФНО-/-, полученных от старых мышей.

1.6.3.1 Анализ изменения частоты КОЕ-ГМ в ДККМ ФНО-/-, полученных от старых мышей, с течением времени культивирования.

1.6.3.2 Анализ изменения частоты КОЕ-С в ДККМ ФНО-/-, полученных от старых мышей, с течением времени культивирования.

1.6.3.3 Анализ изменения частоты КООБ в ДККМ ФНО-/-, полученных от старых мышей, с течением времени культивирования.

1.6.3.3.1 Изменение профилей КООБ с течением времени культивирования.

1.6.3.3.2 Изменение частот КООБ-7 и КООБ-28 с течением времени культивирования.

1.6.4 Анализ экспрессии генов в клетках СФ из ДККМ ФНО-/-, полученных от старых мышей.

1.7 Появление среди ДККМ, инициированных от старых мышей, культур с аномальными характеристиками.

1.7.1 ДККМ ДТ с аномальными характеристиками.

1.7.2 ДККМ ФНО-/- с аномальными характеристиками.

1.8 Сравнение данных по ДККМ ФНО-/-, полученных от молодых и старых мышей.

1.8.1 Продолжительность кроветворения.

1.8.2 Изменение частоты кроветворных клеток-предшественников в течение времени культивирования.

1.8.2.1 Изменение частоты КОЕ-ГМ.

1.8.2.2 Изменение частоты КОЕ-С.

1.8.2.3 Изменение частот КООБ-7 и КООБ-28.

1.8.3 Изменение уровня экспрессии генов с течением времени культивирования.

1.8.4 Возможность объединения данных по ДККМ ФНО-/-, полученных от молодых и старых мышей.

2 Определение возможности возникновения неопластической трансформации в клетках СФ ДККМ ФНО-/-.

2.1 Определение чувствительности к пролиферативным сигналам у клеток ДККМ на поздних сроках культивирования.

2.1.1 Определение факторной зависимости клеток из ДККМ ФНО-/-, предварительно культивировавшихся длительное время.

2.1.2 Определение чувствительности к пролиферативным сигналам клеток подслоя ДККМ ФНО-/-.

2.2 Определение кариотипа клеток из суспензионной фракции и слоя прикрепленных стромальных клеток из ДККМ ФНО-/-, культивировавшихся длительное время.

2.3 Определение теломеразной активности в клетках СФ ДККМ ФНО-/-.

2.4 Проверка способности клеток из ДККМ ФНО-/-, предварительно культивировавшихся длительное время, образовывать опухоль в организме мыши.

3 Характеристики некроветворных клеток, появляющихся в СФ ДККМ ФНО-/- после 70 недель культивирования.

3.1 Динамика экспрессии поверхностного маркера Sca-1 в процессе продолжительного культивирования ДККМ ФНО-/-.

3.2 Появление в СФ ДККМ ФНО-/- неприкрепленных клеток, способных образовывать прикрепленные клеточные линии.

3.3 Анализ экспрессии различных генов клетками прикрепленных клеточных линий.

3.3.1 Определение структуры актинового цитоскелета.

3.3.2 Анализ экспрессии поверхностных маркеров и белков внеклеточного матрикса.

3.3.3 Анализ экспрессии некоторых генов клетками прикрепленных стромальных клеточных линий.

3.4 Функциональные характеристики полученных линий.

3.4.1 Определение продукции цитокинов и факторов роста клетками стромальных линий.

3.4.2 Поддержание кроветворения клетками полученных стромальных линий.

3.4.3 Поддержание роста эмбриональных стволовых клеток на полученных стромальных линиях.

3.4.4 Сравнение экспрессии различных генов в клетках СФ на момент получения прикрепленных клеточных линий и в клетках полученных линий.

4 Определение возможных механизмов изменений, приводящих к длительному поддержанию кроветворения и появлению неприкрепленных недифференцированных стромальных клеток в ДККМ ФНО-/- с течением времени культивирования.

4.1 Пролиферация кроветворных предшественников в длительной культуре костного мозга мышей дикого типа и ФНО-/-.

4.1.1 Действие различных цитостатиков на популяцию КОЕ-ГМ ДТ и ФНО-/-.

4.1.2 Уровень пролиферации КОЕ-ГМ.

4.1.3 Интенсивность пролиферации КООБ-7 и КООБ-28.

4.2 Уровень апоптоза в длительной культуре костного мозга мышей дикого типа и ФНО-/-.

4.3 Определение роли стромальных клеток в возникновении описанных изменений в ДККМ ФНО-/-.

4.3.1 Продолжительность кроветворения в ДККМ ФНО-/- на подслое ДТ.

4.3.2 Изменение экспрессии CD45 и Sca-1 на поверхности клеток СФ из ДККМ ФНО-/- на подслое ДТ.

4.3.3 Анализ изменения частот кроветворных клеток-предшественников различной степени дифференцировки в ДККМ ФНО-/- на подслое ДТ.

4.3.3.1 Анализ изменения частоты КОЕ-ГМ в ДККМ ФНО-/- на подслое ДТ.

4.3.3.2 Анализ изменения частоты КОЕ-С в ДККМ ФНО-/- на подслое ДТ.

4.3.3.3 Анализ изменения частоты КООБ-7 и КООБ-28 в ДККМ ФНО-/- на подслое ДТ.

4.3.4 Анализ генотипа подслоя ДККМ ФНО-/-, изначально образованной на подслое ДТ, после продолжительного культивирования.

4.3.5 Экспрессия некоторых генов клетками СФ ДККМ ФНО-/- на подслое ДТ после продолжительного культивирования.

4.3.6 Характеристики неприкрепленных стромальных клеток, появляющихся в СФ ДККМ ФНО-/- на подслое ДТ после продолжительного культивирования.

4.3.6.1 Способность неприкрепленных стромальных клеток из СФ ДККМ ФНО-/- на подслое ДТ к самоподдержанию.

4.3.6.2 Получение прикрепленных стромальных клеточных линий.

4.3.6.3 Экспрессия некоторых генов клетками полученных стромальных линий.

4.3.6.4 Сравнение экспрессии генов в стромальных линиях и в СФ культур в момент получения линий.

5 Обсуждение результатов.

Введение диссертации по теме "Гематология и переливание крови", Нифонтова, Ирина Николаевна, автореферат

1 Актуальность проблемы.

Для того чтобы исследовать множественные функции ФНО, несколькими группами исследователей были получены мыши, дефицитные либо по генам его рецепторов, либо собственно по гену фактора некроза опухоли. Мыши, нокаутные по гену ФНО (ФНО-/-), развиваются нормально. Основные показатели периферической крови таких мышей также не изменены, что, видимо, свидетельствует об отсутствии нарушений в развитии кроветворной системы. Однако были отмечены существенные нарушения в развитии нормальной стромы селезенки, образования и созревания В-клеток, и, в целом, разнообразные нарушения иммунного ответа. Также были получены свидетельства того, что у мышей, нокаутных по ФНО, нарушены взаимодействия кроветворных клеток со своим микроокружением. Кроме того, известно, что в длительной культуре костного мозга мышей ФНО-/- наблюдается повышение суммарной клеточной продукции, а также количества КОЕ-ГМ. Исследование кроветворной системы дефицитных по ФНО мышей может прояснить роль этого многофункционального цитокина в гемопоэзе. Однако большинство имеющихся в настоящее время данных было получено in vivo, где, как известно, существует значительная избыточность и взаимозаменяемость цитокинов. Т.о., нельзя исключить вероятность того, что функции отсутствующего изначально ФНО взяли на себя какие-то другие факторы.

2 Цель работы.

Целью настоящей работы было изучение роли фактора некроза опухоли в кроветворной системе на модели мышей, дефицитных по этому гену, методами in vitro. В этих условиях сильно снижено количество различных факторов роста и цитокинов, что дает возможность заметить изменения в кроветворении, вызванные отсутствием ФНО. Таким образом, эта модель открывает новые возможности для выявления роли ФНО в регуляции кроветворения. Данная работа является продолжением исследований, ведущихся в лаборатории физиологии кроветворения ГНЦ РАМН на протяжении последних лет.

3 Основные задачи.

1. Сравнить основные характеристики кроветворения в длительных культурах костного мозга мышей дикого типа и дефицитных по ФНО.

2. Изучить возрастные изменения кроветворения и роль ФНО в этом процессе.

3. Проанализировать влияние ФНО на стромальные клетки.

4 Научная новизна и практическое значение работы.

Было обнаружено, что продолжительное поддержание кроветворения в длительной культуре костного мозга мышей, дефицитных по фактору некроза опухоли, сопровождается повышением количества кроветворных предшественников всех исследованных уровней дифференцировки, уровня их пролиферации и апоптоза. Кроме того, ФНО участвует в регуляции пролиферативного потенциала стромальных клеток-предшественников, Показано, что наблюдаемые в длительной культуре изменения не являются следствием опухолевой трансформации. Полученные в работе данные выявили важную роль ФНО в регуляции кроветворения. Этот цитокин модулирует количество стволовых кроветворных клеток, участвует во взаимодействии кроветворных клеток со стромальным микроокружением и важен для развития и поддержания стромы кроветворных органов. Более детальное выяснение функции ФНО позволит более полно охарактеризовать систему регуляции процессов кроветворения.

5 Материалы и методы исследования.

Получение длительных культур костного мозга, прикрепленных клеточных линий, их клонирование и функциональные тесты проводились стандартными методами культивирования.

Состав клеток-предшественников и дифференцированных кроветворных клеток анализировали методом непрямой флуоресценции с использованием моно- и поликлональных антител к специфическим для каждой стадии дифференцировки маркерам. Функциональное состояние клеток-предшественников оценивали в различных клональных тестах, таких, как подсчет КОЕ-С(12) в сублетально облученных мышах-реципиентах, подсчет КОЕ-ГМ в полужидкой среде, подсчет клеток, образующих области булыжника, с использованием метода Пломахера.

Интенсивность пролиферации клеток-предшественников оценивали по доле клеток, чувствительных к воздействию цитостатиков. Уровень апоптоза в длительных культурах определяли с использованием низких концентраций флуоресцентного красителя (DAPI), способного связываться с конденсированным хроматином апоптотических клеток.

Принадлежность к той или иной линии дифференцировки кроветворных клеток в длительной культуре костного мозга мышей, дефицитных по ФНО, определяли по данным иммунофлуоресцентного анализа и по мазкам, приготовленным и обработанным стандартным образом.

6 Основные положения, выносимые на защиту.

• Экспрессия фактора некроза опухоли кроветворными клетками приводит к ограничению их пролиферативного потенциала.

• Экспрессия фактора некроза опухоли стромальными клетками способствует выживанию кроветворных клеток-предшественников с высоким пролиферативным потенциалом.

• ФНО играет существенную роль в предотвращении возникновения возрастных изменений кроветворной системы.

• Фактор некроза опухоли оказьюает ингибирующее действие на способность стволовых стромальных клеток к пролиферации.

7 Содержание работы по главам.

Оглавление;

Основные обозначения и сокращения; Введение;

Заключение диссертационного исследования на тему "Кроветворение в длительной культуре костного мозга мышей, дефицитных по фактору некроза опухоли"

Заключение 1 Выводы

2 Печатные работы

По теме диссертации опубликованы следующие печатные работы:

1. И.Н.Нифонтова, М.А.Эршлер, Н.И.Дризе, 2002. Аномалии, выявляемые в длительной культуре костного мозга мышей, дефицитных по фактору некроза опухоли: индукция апоптоза и клеточная пролиферация. Бюлл Эксп Биол Мед, Том 133, №4.

2. М.А.Эршлер, И.Н.Нифонтова, Ю.В.Ольшанская, Т.В.Тодрия, И.Л,Чертков, Н.И.Дризе, 2002. Длительное самоподдержание кроветворных предшественников в культуре костного мозга мышей, дефицитных по фактору некроза опухоли, не является следствием неопластической трансформации. Бюлл Эксп Биол Мед, Том 133, №5,537-540.

3. Nifontova I.N., Ershler М.А, Drize N.I., 2002. Dynamic of CAFC frequency in long-term bone marrow culture of TNF deficient mice. Experimental Hematology, v.30, N 6, supp.l, 17.

4. Nifontova I.N., Ershler M.A., Olshanskaya Y.V., Chertkov J.L., Drize N.J., 2002. Hematopoietic supportive stromal cell line was established from suspension fraction of long-term bone marrow culture. Experimental Hematology, v.30, N 6, supp. 1,68.

5. Ershler M.A., Nifontova I.N., Olshanskaya Y.V, Todria T.V., Chertkov J.L., Drize N.J., 2002. Neoplastic transformation is not the course of extremely long (more than 100 weeks) hematopoiesis maintenance of long-term bone marrow culture from TNF deficient mice. The hematology journal, v3, suppl.l, 418.

7. Ershler Maxim.A., Nifontova Irina.N., Olshanskaya Yulia.VM Todria Tamara.V., Chertkov Joseph.L., Drize Nina.J.,2003, Neoplastic transformation is not the course of extremely long (more than 100 weeks) hematopoiesis maintenance of long-term bone marrow culture from TNF deficient mice, The Hematology Journal, v4, N1, 74-77.

8. Нифонтова И.Н., Эршлер М.А., Дризе Н.И., 2003, Динамика состава клеток-предшественников в культуре костного мозга мышей, дефицитных по фактору некроза опухоли, Бюлл.экспер.биол.мед., 2003, том 135, №3, с.330-333.

9. Нифонтова И.Н., Ольшанская Ю.В., Дризе Н.И. Характеристика стромальных клеточных линий, полученных из суспензионной фракции культур костного мозга мышей, дефицитных по фактору некроза опухоли. Бюлл.экспер.биол.мед., 2004, т.138, №9, с.284-289.

10. Nifontova I.N. Drize N.J. 2004, "Hematopoietic stem cells and mesenchymal stem cells in long-term bone marrow cultures of TNF knock-out mice." The Hematology Journal, vol. 5: Supplement 3, S70.

11. Nifontova I.N., Drize N.J. Effect of wild type stromal cells on hematopoiesis in long-term bone marrow cultures repopulated with bone marrow of TNF knockout mice. Exp.Hematol., 2005, v.33, N7, supplement 1, p. 125.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2005 года, Нифонтова, Ирина Николаевна

1. Воробьев АИ, Чертков ИЛ и Дризе НИ. Схема кроветворения. Пробл Гематол 1: 7-14, 1995.

2. Дерюгина ЕИ, Дризе НИ, Оловникова НИ, Садовникова ЕЮ и Чертков ИЛ.

3. Родоначальная кроветворная клетка: возникновение в онтогенезе,пролиферативная активность и пролиферативный потнциал. Онтогенез 22: 125-132, 1991.

4. Дризе НИ, Друцкая МС, Герасимова ЛП, Манакова ТЕ, Чертков ИЛ, Турецкая РЛ, Купраш ДВ и Недоспасов СА. Особенности изменений в кроветворной системе у мышей, дефицитных по фактору некроза опухоли или лимфотоксину-а. Бюлл эксп биол и мед 130: 76-79, 2000.

5. Друцкая МС, Купраш ДВ, Недоспасов СА, Чертков ИЛ и Дризе НИ. Кроветворение у мышей, дефицитных по фактору некроза опухоли: аномалии, выявляемые в длительной культуре костного мозга. Бюлл эксп биол и мед 131: 184187,2001.

6. Козинец ГИ, Дульцина СМ, Герасимова НА, Дягилева OA и Потапова СГ.

7. Цитохимическая характеристика гемопоэтических клеток здоровых людей. Методические рекомендации. Москва: 1980.

8. Копнин БП. Мишени онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию основных механизмов онкогенеза. Биохимия 65: 2-27,2000.

9. Нифонтова И.Н., Эршлер М.А., Дризе Н.И.,Динамика состава клеток-предшественников в культуре костного мозга мышей, дефицитных по фактору некроза опухоли, Бюлл. экс пер. б иол.мед., том 135, №3, с.330-333,2003.

10. Тодрия ТВ, Гримм Я и Цандер А. Возрастные изменения в активации теломеразы в костном мозге нормальных и тимэктомированных мышей. Бюлл.экспер.биол.мед., том 129: 556-558, 2000.

11. Чертков И.Л. и Гуревич О.А. Стволовая кроветворная клетка и ее микроокружение. Москва: 1984.

12. Aiuti A, Tavian M, Cipponi A, Ficara F, Zappone E, Hoxie J, Peault В and Bordignon C. Expression of CXCR4, the receptor for stromal cell-derived factor-1 on fetal and adult human lympho-hematopoietic progenitors. Eur J Immunol 29: 1823-1831, 1999.

13. Akahane K, Hosoi T, Urabe A, Kawakami M and Takaku F. Effects of recombinant human tumor necrosis factor (rhTNF) on normal human and mouse hemopoietic progenitor cells. Int J Cell Cloning 5: 16-26, 1987.

14. Akashi К, He X, Chen J, Iwasaki H, Niu C, Steenhard B, Zhang J, Haug J and Li L.

15. Transcriptional accessibility for genes of multiple tissues and hematopoietic lineages is hierarchically controlled during early hematopoiesis. Blood 101: 383-389, 2003.

16. Akira S, Hirano T, Taga T and Kishimoto T. Biology of multifunctional cytokines: IL 6 and related molecules (IL 1 and TNF). FASEB J 4: 2860-2867, 1990.

17. Allen TD and Dexter TM. Cellular interrelationships during in vitro granulopoiesis. Differentiation 6: 191-194, 1976.

18. Arai F, Hirao A, Ohmura M, Sato H, Matsuoka S, Takubo K, Ito K, Koh GY and Suda T. Tie2/angiopoietin-1 signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche. Cell 118: 149-161, 2004.

19. A versa G, Punnonen J and de Vries JE. The 26-kD transmembrane form of tumor necrosis factor alpha on activated CD4+ T cell clones provides a costimulatory signal for human В cell activation. / Exp Med 177: 1575-1585, 1993.

20. Azuma Y, Kaji K, Katogi R, Takeshita S and Kudo A. Tumor necrosis factor-alpha induces differentiation of and bone resorption by osteoclasts. J Biol Chem 275: 48584864, 2000.

21. Azuma Y, Kaji K, Katogi R, Takeshita S and Kudo A. Tumor necrosis factor-alpha induces differentiation of and bone resorption by osteoclasts. J Biol Chem 275: 48584864,2000.

22. Azuma Y, Kaji K, Katogi R, Takeshita S and Kudo A. Tumor necrosis factor-alpha induces differentiation of and bone resorption by osteoclasts. J Biol Chem 275: 48584864, 2000.

23. Azuma Y, Kaji K, Katogi R, Takeshita S and Kudo A. Tumor necrosis factor-alpha induces differentiation of and bone resorption by osteoclasts. J Biol Chem 275: 48584864, 2000.

24. Baines P and Visser JW. Analysis and separation of murine bone marrow stem cells by H33342 fluorescence-activated cell sorting. Exp Hematol 11: 701-708, 1983.

25. Baker SJ and Reddy EP. Transducers of life and death: TNF receptor superfamily and associated proteins. Oncogene 12: 1-9, 1996.

26. Bennaceur-Griscelli A, Pondarre C, Schiavon V, Vainchenker W and Coulombel L.

27. Stromal cells retard the differentiation of CD34(+)CD38(low/neg) human primitive progenitors exposed to cytokines independent of their mitotic history. Blood 97: 435-441, 2001.

28. Beran M, McCredie KB, Keating MJ and Gutterman JU. Antileukemic effect of recombinant tumor necrosis factor alpha in vitro and its modulation by alpha and gamma interferons. Blood 72: 728-738, 1988.

29. Boggs DR, Saxe DF and Boggs SS. Aging and hematopoiesis. П. The ability of bone marrow cells from young and aged mice to cure and maintain cure in WAVv. Transplantation 37: 300-306, 1984.

30. Bradfute SB, Graubert ТА and Goodell MA. Roles of Sca-1 in hematopoietic stem/progenitor cell function. Exp Hematol 33: 836-843, 2005.

31. Bradley TR and Metcalf D. The growth of mouse bone marrow cells in vitro. Aust J Exp Biol Med Sci 44: 287-299, 1966.

32. Brown KE, Guest SS, Smale ST, Hahm K, Merkenschlager M and Fisher AG.

33. Association of transcriptionally silent genes with Dcaros complexes at centromeric heterochromatin. Cell 91: 845-854, 1997.

34. Calvi LM, Adams GB, Weibrecht KW, Weber JM, Olson DP, Knight MC, Martin RP, Schipani E, Divieti P, Bringhurst FR, Milner LA, Kronenberg HM and Scadden

35. DT. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature 425: 841-846, 2003.

36. Carswell EA, Old LJ, Kassel RL, Green S, Fiore N and Williamson B. An endotoxin-induced serum factor that causes necrosis of tumors. Proc Natl Acad Sci U S All: 36663670, 1975.

37. Caux C, Durand I, Moreau I, Duvert V, Saeland S and Banchereau J. Tumor necrosis factor alpha cooperates with interleukin 3 in the recruitment of a primitive subset of human CD34+ progenitors. J Exp Med ill: 1815-1820, 1993.

38. Caux С, Favre С, Saeland S, Duvert V, Durand I, Mannoni P and Banchereau J.

39. Potentiation of early hematopoiesis by tumor necrosis factor-alpha is followed by inhibition of granulopoietic differentiation and proliferation. Blood 78: 635-644, 1991.

40. Chertkov JL, Drize NJ, Gurevitch OA and Samoylova RS. Origin of hemopoietic stromal progenitor cells in chimeras. Exp Hematol 13: 1217-1222, 1985.

41. Chertkov JL and Gurevitch OA. Self-maintenance ability and kinetics of haemopoietic stroma precursors. Cell Tissue Kinet 13: 535-541, 1980.

42. Chomczynski P and Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem 162: 156-159, 1987.

43. Clark EA, Grabstein KH and Shu GL. Cultured human follicular dendritic cells. Growth characteristics and interactions with В lymphocytes. J Immunol 148: 3327-3335, 1992.

44. De Togni P, Goellner J, Ruddle NH, Streeter PR, Fick A, Mariathasan S, Smith SC, Carlson R, Shornick LP, Strauss-Schoenberger J and . Abnormal development of peripheral lymphoid organs in mice deficient in lymphotoxin. Science 264: 703-707, 1994.

45. Devine SM, Cobbs C, Jennings M, Bartholomew A and Hoffman R. Mesenchymal stem cells distribute to a wide range of tissues following systemic infusion into non-human primates. Blood 2002.

46. Dexter TM, Allen TD and Lajtha LG. Conditions controlling the proliferation of haemopoietic stem cells in vitro. J Cell Physiol 91: 335-344, 1977.

47. Dexter TM, Allen TD and Lajtha LG. Conditions controlling the proliferation of haemopoietic stem cells in vitro. J Cell Physiol 91: 335-344, 1977.

48. Dexter TM, Allen TD and Lajtha LG. Conditions controlling the proliferation of haemopoietic stem cells in vitro. J Cell Physiol 91: 335-344, 1977.

49. Dexter TM, Testa NG, Allen TD, Rutherford T and Scolnick E. Molecular and cell biologic aspects of erythropoiesis in long-term bone marrow cultures. Blood 58: 699-707, 1981.

50. Dick JE, Magli MC, Huszar D, Phillips RA and Bernstein A. Introduction of a selectable gene into primitive stem cells capable of long-term reconstitution of the hemopoietic system of W/Wv mice. Cell 42: 71-79, 1985.

51. Ding AH, Nathan CF and Stuehr DJ. Release of reactive nitrogen intermediates and reactive oxygen intermediates from mouse peritoneal macrophages. Comparison of activating cytokines and evidence for independent production. J Immunol 141: 24072412, 1988.

52. Domen J, Cheshier SH and Weissman IL. The role of apoptosis in the regulation of hematopoietic stem cells: Overexpression of Bcl-2 increases both their number and repopulation potential. J Exp Med 191: 253-264, 2000.

53. Domen J and Weissman IL. Hematopoietic stem cells need two signals to prevent apoptosis; BCL-2 can provide one of these, Kitl/c-Kit signaling the other. J Exp Med 192: 1707-1718,2000.

54. Drapier JC, Wietzerbin J and Hibbs JB, Jr. Interferon-gamma and tumor necrosis factor induce the L-arginine- dependent cytotoxic effector mechanism in murine macrophages. Eur J Immunol 18: 1587-1592, 1988.

55. Drize NJ, Keller JR and Chertkov JL. Local clonal analysis of the hematopoietic system shows that multiple small short-living clones maintain life-long hematopoiesis in reconstituted mice. Blood 88: 2927-2938, 1996.

56. Durig J, de Wynter EA, Kasper C, Cross MA, Chang J, Testa NG and Heyworth

57. CM. Expression of macrophage inflammatory protein-1 receptors in human CD34(+) hematopoietic cells and their modulation by tumor necrosis factor-alpha and interferon-gamma. Blood 92: 3073-3081, 1998.

58. Dybedal I, Bryder D, Fossum A, Rusten LS and Jacobsen SE. Tumor necrosis factor (TNF)-mediated activation of the p55 TNF receptor negatively regulates maintenance of cycling reconstituting human hematopoietic stem cells. Blood 98: 1782-1791,2001.

59. Dybedal I, Bryder D, Fossum A, Rusten LS and Jacobsen SE. Tumor necrosis factor (TNF)-mediated activation of the p55 TNF receptor negatively regulates maintenance of cycling reconstituting human hematopoietic stem cells. Blood 98: 1782-1791, 2001.

60. Dybedal I, Bryder D, Fossum A, Rusten LS and Jacobsen SE. Tumor necrosis factor (TNF)-mediated activation of the p55 TNF receptor negatively regulates maintenance of cycling reconstituting human hematopoietic stem cells. Blood 98: 1782-1791, 2001.

61. Enver T, Heyworth CM and Dexter TM. Do stem cells play dice? Blood 92: 348-351, 1998.

62. Enver T, Heyworth CM and Dexter TM. Do stem cells play dice? Blood 92: 348-351, 1998.

63. Fedyk ER, Jones D, Critchley HO, Phipps RP, Blieden TM and Springer ТА.

64. Expression of stromal-derived factor-1 is decreased by IL-1 and TNF and in dermal wound healing. J Immunol 166: 5749-5754, 2001.

65. D. TNF-induced intracellular signaling leading to gene induction or to cytotoxicity by necrosis or by apoptosis. J Inflamm 47: 67-75, 1995.

66. Fornaro M, Plescia J, Chheang S, Tallini G, Zhu YM, King M, Altieri DC and Languino LR. Fibronectin protects prostate cancer cells from tumor necrosis factor-alpha-induced apoptosis via the AKT/survivin pathway. J Biol Chem 278: 50402-50411, 2003.

67. Friedenstein A and Kuralesova AI. Osteogenic precursor cells of bone marrow in radiation chimeras. Transplantation 12: 99-108, 1971.

68. Frisch SM and Ruoslahti E. Integrins and anoikis. Curr Opin Cell Biol 9: 701-706,mi.

69. Galli-Taliadoros LA, Sedgwick JD, Wood SA and Korner H. Gene knock-out technology: a methodological overview for the interested novice. J Immunol Methods 181: 1-15, 1995.

70. Goodell MA, Brose K, Paradis G, Conner AS and Mulligan RC. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med 183: 1797-1806, 1996.

71. Gothot A, Pyatt R, McMahel J, Rice S and Srour EF. Functional heterogeneity of human CD34(+) cells isolated in subcompartments of the GO /G1 phase of the cell cycle. Blood 90: 4384-4393, 1997.

72. Gothot A, Pyatt R, McMahel J, Rice S and Srour EF. Assessment of proliferative and colony-forming capacity after successive in vitro divisions of single human CD34+ cells initially isolated in GO. Exp Hematol 26: 562-570, 1998.

73. Gumley TP, McKenzie IF and Sandrin MS. Tissue expression, structure and function of the murine Ly-6 family of molecules. Immunol Cell Biol 73: 277-296, 1995.

74. Gupta P, Oegema TR, Jr., Brazil JJ, Dudek AZ, Slungaard A and Verfaillie CM.

75. Structurally specific heparan sulfates support primitive human hematopoiesis by formation of a multimolecular stem cell niche. Blood 92: 4641-4651, 1998.

76. Hackney JA, Charbord P, Brunk BP, Stoeckert CJ, Lemischka IR and Moore KA.

77. A molecular profile of a hematopoietic stem cell niche. Proc Natl Acad Sci USA 2002.

78. Harris AL, Grahame-Smith DG, Potter CG and Bunch C. Cytosine arabinoside deamination in human leukaemic myeloblasts and resistance to cytosine arabinoside therapy. Clin Sci(Lond) 60: 191-198, 1981.

79. Hilton DJ, Nicola NA, Gough NM and Metcalf D. Resolution and purification of three distinct factors produced by Krebs ascites cells which have differentiation-inducing activity on murine myeloid leukemic cell lines. J Biol Chem 263: 9238-9243, 1988.

80. Hotz MA, Gong J, Traganos F and Darzynkiewicz Z. Flow cytometric detection of apoptosis: comparison of the assays of in situ DNA degradation and chromatin changes. Cytometry 15: 237-244, 1994.

81. Huang S, Law P, Francis K, Palsson BO and Ho AD. Symmetry of initial cell divisions among primitive hematopoietic progenitors is independent of ontogenic age and regulatory molecules. Blood 94: 2595-2604, 1999.

82. Huang S, Law P, Francis K, Palsson BO and Ho AD. Symmetry of initial cell divisions among primitive hematopoietic progenitors is independent of ontogenic age and regulatory molecules. Blood 94: 2595-2604, 1999.

83. Hube F and Hauner H. The two tumor necrosis factor receptors mediate opposite effects on differentiation and glucose metabolism in human adipocytes in primary culture. Endocrinology 141: 2582-2588, 2000.

84. Hube F and Hauner H. The two tumor necrosis factor receptors mediate opposite effects on differentiation and glucose metabolism in human adipocytes in primary culture. Endocrinology 141: 2582-2588, 2000.

85. Hurley RW, McCarthy JB and Verfaillie CM. Direct adhesion to bone marrow stroma via fibronectin receptors inhibits hematopoietic progenitor proliferation. J Clin Invest 96: 511-519, 1995.

86. Ikebuchi K, Clark SC, Ihle JN, Souza LM and Ogawa M. Granulocyte colony-stimulating factor enhances interleukin 3-dependent proliferation of multipotential hemopoietic progenitors. Proc Natl Acad Sci U S A 85: 3445-3449, 1988.

87. Ikebuchi K, Wong GG, Clark SC, Ihle JN, Hirai Y and Ogawa M. Interleukin 6 enhancement of interleukin 3-dependent proliferation of multipotential hemopoietic progenitors. Proc Natl Acad Sci USA 84: 9035-9039, 1987.

88. Jacobsen FW, Veiby OP, Stokke T and Jacobsen SE. TNF-alpha bidirectionally modulates the viability of primitive murine hematopoietic progenitor cells in vitro. J Immunol 157: 1193-1199,1996.

89. Jacobsen FW, Veiby OP, Stokke T and Jacobsen SE. TNF-alpha bidirectionally modulates the viability of primitive murine hematopoietic progenitor cells in vitro. J Immunol 157: 1193-1199, 1996.

90. Jacobsen FW, Veiby OP, Stokke T and Jacobsen SE. TNF-alpha bidirectionally modulates the viability of primitive murine hematopoietic progenitor cells in vitro. J Immunol 157: 1193-1199, 1996.

91. Jacobsen FW, Veiby OP, Stokke T and Jacobsen SE. TNF-alpha bidirectionally modulates the viability of primitive murine hematopoietic progenitor cells in vitro. J Immunol 157: 1193-1199, 1996.

92. Jacobsen FW, Veiby OP, Stokke T and Jacobsen SE. TNF-alpha bidirectionally modulates the viability of primitive murine hematopoietic progenitor cells in vitro. J Immunol 157: 1193-1199, 1996.

93. Jacobsen SE, Ruscetti FW, Dubois CM and Keller JR. Tumor necrosis factor alpha directly and indirectly regulates hematopoietic progenitor cell proliferation: role of colony-stimulating factor receptor modulation. J Exp Med 175: 1759-1772, 1992.

94. Jacobsen SE, Ruscetti FW, Dubois CM and Keller JR. Tumor necrosis factor alpha directly and indirectly regulates hematopoietic progenitor cell proliferation: role of colony-stimulating factor receptor modulation. J Exp Med 175: 1759-1772, 1992.

95. Jacobsen SE, Ruscetti FW, Dubois CM and Keller JR. Tumor necrosis factor alpha directly and indirectly regulates hematopoietic progenitor cell proliferation: role of colony-stimulating factor receptor modulation. J Exp Med 175: 1759-1772, 1992.

96. Jacobsen SE, Ruscetti FW, Dubois CM and Keller JR. Tumor necrosis factor alpha directly and indirectly regulates hematopoietic progenitor cell proliferation: role of colony-stimulating factor receptor modulation. J Exp Med 175: 1759-1772, 1992.

97. Jacobsen SE, Ruscetti FW, Dubois CM and Keller JR. Tumor necrosis factor alpha directly and indirectly regulates hematopoietic progenitor cell proliferation: role of colony-stimulating factor receptor modulation. J Exp Med 175: 1759-1772, 1992.

98. Jacobsen SE, Ruscetti FW, Dubois CM and Keller JR. Tumor necrosis factor alpha directly and indirectly regulates hematopoietic progenitor cell proliferation: role of colony-stimulating factor receptor modulation. J Exp Med 175: 1759-1772, 1992.

99. Jacobsen SE, Ruscetti FW, Dubois CM and Keller JR. Tumor necrosis factor alpha directly and indirectly regulates hematopoietic progenitor cell proliferation: role of colony-stimulating factor receptor modulation. J Exp Med 175: 1759-1772, 1992.

100. Jacobsen SE, Ruscetti FW, Dubois CM and Keller JR. Tumor necrosis factor alpha directly and indirectly regulates hematopoietic progenitor cell proliferation: role of colony-stimulating factor receptor modulation. J Exp Med 175: 1759-1772, 1992.

101. Janeway С A, Travers P, Walport M and Shlomnik M. Immunology. New York, NY: Garland Publishing, 2001.

102. Jiang Y, Vaessen B, Lenvik T, Blackstad M, Reyes M and Verfaillie C. Multipotent progenitor cells can be isolated from postnatal murine bone marrow, muscle, and brain. Exp Hematol 30: 896,2002.

103. Jimenez G, Griffiths SD, Ford AM, Greaves MF and Enver T. Activation of the beta-globin locus control region precedes commitment to the erythroid lineage. Proc Natl AcadSci USA 89: 10618-10622, 1992.

104. Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, Harley CB, West MD, Ho PL, Coviello GM, Wright WE, Weinrich SL and Shay JW. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science 266: 2011-2015, 1994.

105. Klarmann K, Ortiz M, Davies M and Keller JR. Identification of in vitro growth conditions for c-Kit-negative hematopoietic stem cells. Blood 102: 3120-3128,2003.

106. Koeffler HP, Gasson J, Ranyard J, Souza L, Shepard M and Munker R.

107. Recombinant human TNF alpha stimulates production of granulocyte colony- stimulating factor. Blood 70: 55-59, 1987.

108. Koeffler HP, Gasson J, Ranyard J, Souza L, Shepard M and Munker R.

109. Recombinant human TNF alpha stimulates production of granulocyte colony- stimulating factor. Blood 70: 55-59, 1987.

110. Koike К, Ogavva M, Ihle JN, Miyake T, Shimizu T, Miyajima A, Yokota T and Arai

111. K. Recombinant murine granulocyte-macrophage (GM) colony-stimulating factor supports formation of GM and multipotential blast cell colonies in culture: comparison with the effects of interleukin-3. J Cell Physiol 131: 458-464, 1987.

112. Kondo M, Weissman IL and Akashi K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell 91: 661-672, 1997.

113. Kondo S, Wang B, Fujisawa H, Shivji GM, Echtenacher В, Мак TW and Sauder

114. DN. Effect of gene-targeted mutation in TNF receptor (p55) on contact hypersensitivity and ultraviolet B-induced immunosuppression. J Immunol 155: 3801-3805, 1995.

115. Koury MJ. Programmed cell death (apoptosis) in hematopoiesis. Exp Hematol 20: 391394, 1992.

116. Koury MJ. Programmed cell death (apoptosis) in hematopoiesis. Exp Hematol 20: 391394, 1992.

117. Kriegler M, Perez C, DeFay K, Albert I and Lu SD. A novel form of TNF/cachectin is a cell surface cytotoxic transmembrane protein: ramifications for the complex physiology of TNF. Cell 53:45-53, 1988.

118. Laj'tha LG. Stem cell concepts. Nouv Rev Fr Hematol 21: 59-65, 1979.

119. Leary AG, Strauss LC, Civin CI and Ogawa M. Disparate differentiation in hemopoietic colonies derived from human paired progenitors. Blood 66: 327-332, 1985.

120. Leary AG, Wong GG, Clark SC, Smith AG and Ogawa M. Leukemia inhibitory factor differentiation-inhibiting activity/human interleukin for DA cells augments proliferation of human hematopoietic stem cells. Blood 75: 1960-1964, 1990.

121. Ledbetter JA and Herzenberg LA. Xenogeneic monoclonal antibodies to mouse lymphoid differentiation antigens. Immunol Rev 47: 63-90, 1979.

122. Liesveld JL, Winslow JM, Frediani KE, Ryan DH and Abboud CN. Expression of integrins and examination of their adhesive function in normal and leukemic hematopoietic cells. Blood SI: 112-121, 1993.

123. Loetscher H, Pan YC, Lahm HW, Gentz R, Brockhaus M, Tabuchi H and Lesslauer

124. W. Molecular cloning and expression of the human 55 kd tumor necrosis factor receptor. Cell 61:351-359, 1990.

125. Luria EA, Panasyuk AF and Friedenstein AY. Fibroblast colony formation from monolayer cultures of blood cells. Transfusion 11: 345-349, 1971.

126. Ma Q, Jones D, Borghesani PR, Segal RA, Nagasawa T, Kishimoto T, Bronson RT and Springer ТА. Impaired B-lymphopoiesis, myelopoiesis, and derailed cerebellar neuron migration in C. Proc Natl Acad Sci USA 95: 9448-9453, 1998.

127. Macchia D, Almerigogna F, Parronchi P, Ravina A, Maggi E and Romagnani S.

128. Membrane tumour necrosis factor-alpha is involved in the polyclonal B- cell activation induced by HIV-infected human T cells. Nature 363: 464-466, 1993.

129. Majka SM, Jackson KA, Kienstra KA, Majesky MW, Goodell MA and Hirschi KK.

130. Distinct progenitor populations in skeletal muscle are bone marrow derived and exhibit different cell fates during vascular regeneration. J Clin Invest 111: 71-79, 2003.

131. Mamus SW, Oken MM and Zanjani ED. Suppression of normal human erythropoiesis by human recombinant DNA- produced alpha-2-interferon in vitro. Exp Hematol 14: 1015-1022, 1986.

132. Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 1982.

133. Marino MW, Dunn A, Grail D, Inglese M, Noguchi Y, Richards E, Jungbluth A, Wada H, Moore M, Williamson B, Basu S and Old LJ. Characterization of tumor necrosis factor-deficient mice. Proc Natl Acad Sci USA 94: 8093-8098, 1997.

134. Marino MW, Dunn A, Grail D, Inglese M, Noguchi Y, Richards E, Jungbluth A, Wada H, Moore M, Williamson B, Basu S and Old LJ. Characterization of tumor necrosis factor-deficient mice. Proc Natl Acad Sci USA 94: 8093-8098, 1997.

135. Marino MW, Dunn A, Grail D, Inglese M, Noguchi Y, Richards E, Jungbluth A, Wada H, Moore M, Williamson B, Basu S and Old LJ. Characterization of tumor necrosis factor-deficient mice. Proc Natl Acad Sci USA 94: 8093-8098, 1997.

136. Marino MW, Dunn A, Grail D, Inglese M, Noguchi Y, Richards E, Jungbluth A, Wada H, Moore M, Williamson B, Basu S and Old LJ. Characterization of tumor necrosis factor-deficient mice. Proc Natl Acad Sci USA 94: 8093-8098, 1997.

137. Marino MW, Dunn A, Grail D, Inglese M, Noguchi Y, Richards E, Jungbluth A, Wada H, Moore M, Williamson B, Basu S and Old LJ. Characterization of tumor necrosis factor-deficient mice. Proc Natl Acad Sci USA 94: 8093-8098, 1997.

138. Marino MW, Dunn A, Grail D, Inglese M, Noguchi Y, Richards E, Jungbluth A, Wada H, Moore M, Williamson B, Basu S and Old LJ. Characterization of tumor necrosis factor-deficient mice. Proc Natl Acad Sci USA 94: 8093-8098, 1997.

139. Marino MW, Dunn A, Grail D, Inglese M, Noguchi Y, Richards E, Jungbluth A, Wada H, Moore M, Williamson B, Basu S and Old LJ. Characterization of tumor necrosis factor-deficient mice. Proc Natl Acad Sci USA 94: 8093-8098, 1997.

140. Marino MW, Dunn A, Grail D, Inglese M, Noguchi Y, Richards E, Jungbluth A, Wada H, Moore M, Williamson B, Basu S and Old LJ. Characterization of tumor necrosis factor-deficient mice. Proc Natl Acad Sci USA 94: 8093-8098, 1997.

141. Marino MW, Dunn A, Grail D, Inglese M, Noguchi Y, Richards E, Jungbluth A, Wada H, Moore M, Williamson B, Basu S and Old LJ. Characterization of tumor necrosis factor-deficient mice. Proc Natl Acad Sci US A 94: 8093-8098, 1997.

142. Marino MW, Dunn A, Grail D, Inglese M, Noguchi Y, Richards E, Jungbluth A, Wada H, Moore M, Williamson B, Basu S and Old LJ. Characterization of tumor necrosis factor-deficient mice. Proc Natl Acad Sci USA 94: 8093-8098, 1997.

143. Marino MW, Dunn A, Grail D, Inglese M, Noguchi Y, Richards E, Jungbluth A, Wada H, Moore M, Williamson B, Basu S and Old LJ. Characterization of tumor necrosis factor-deficient mice. Proc Natl Acad Sci USA 94: 8093-8098, 1997.

144. Matsumoto M, Mariathasan S, Nahm MH, Baranyay F, Peschon J J and Chaplin

145. DD. Role of lymphotoxin and the type I TNF receptor in the formation of germinal centers. Science 271: 1289-1291, 1996.

146. Mayer P. The growth of swine bone marrow cells in the presence of heterologous colony stimulating factor: characterization of the developing cell population. Comp Immunol Microbiol Infect Dis 6: 171-187, 1983.

147. Mazurier F, Gan 01, McKenzie JL, Doedens M and Dick JE. Lentivector-mediated clonal tracking reveals intrinsic heterogeneity in the human hematopoietic stem cell compartment and culture-induced stem cell impairment. Blood 103: 545-552,2004.

148. McDonald TP and Sullivan PS. Megakaryocyte and erythrocytic cell lines share a common precursor cell. Exp Hematol 21: 1316-1320, 1993.

149. McNiece IK, Bertoncello I, Kriegler AB and Quesenberry PJ. Colony-forming cells with high proliferative potential (HPP-CFC). IntJCell Cloning 8: 146-160, 1990.

150. Mertelsmann R. Hematopoietic cytokines: from biology and pathophysiology to clinical application. Leukemia 7 Suppl 2: S168-S177, 1993.

151. Metcalf D. Lineage commitment and maturation in hematopoietic cells: the case for extrinsic regulation. Blood 92: 345-347, 1998.

152. Metcalf D and Johnson GR. Production by spleen and lymph node cells of conditioned medium with erythroid and other hemopoietic colony-stimulating activity. J Cell Physiol 96:31-42, 1978.

153. Metcalf D, Johnson GR and Burgess AW. Direct stimulation by purified GM-CSF of the proliferation of multipotential and erythroid precursor cells. Blood 55: 138-147, 1980.

154. Metcalf D and Moore MAS. Hematopoietic cells. Amsterdam-London: North-Holland Publishing Company, 1971.

155. Miyamoto T, Iwasaki H, Reizis B, Ye M, Graf T, Weissman IL and Akashi K.

156. Myeloid or lymphoid promiscuity as a critical step in hematopoietic lineage commitment. DevCell 3: 137-147,2002.

157. Moreau G, Leite-De-Moraes M, Ezine S, Di Santo JP, Dy M and Schneider E.

158. Natural killer cell-dependent apoptosis of peripheral murine hematopoietic progenitor cells in response to Fas cross-linking: involvement of tumor necrosis factor-alpha. Blood 97: 3069-3074,2001.

159. Moreau G, Leite-De-Moraes M, Ezine S, Di Santo JP, Dy M and Schneider E.

160. Natural killer cell-dependent apoptosis of peripheral murine hematopoietic progenitor cells in response to Fas cross-linking: involvement of tumor necrosis factor-alpha. Blood 97: 3069-3074,2001.

161. Moreau G, Leite-De-Moraes M, Ezine S, Di Santo JP, Dy M and Schneider E.

162. Natural killer cell-dependent apoptosis of peripheral murine hematopoietic progenitor cells in response to Fas cross-linking: involvement of tumor necrosis factor-alpha. Blood 97: 3069-3074,2001.

163. Mowdsley R HGA. Fate of transplanted bone. Nature 198: 495-496, 1963.

164. Munker R, Gasson J, Ogawa M and Koeffler HP. Recombinant human TNF induces production of granulocyte-monocyte colony- stimulating factor. Nature 323: 79-82, 1986.

165. Munker R, Gasson J, Ogawa M and Koeffler HP. Recombinant human TNF induces production of granulocyte-monocyte colony- stimulating factor. Nature 323: 79-82, 1986.

166. Murase T, Hotta T, Saito H and Ohno R. Effect of recombinant human tumor necrosis factor on the colony growth of human leukemia progenitor cells and normal hematopoietic progenitor cells. Blood 69: 467-472, 1987.

167. Musashi M, Yang YC, Paul SR, Clark SC, Sudo T and Ogawa M. Direct and synergistic effects of interleukin 11 on murine hemopoiesis in culture. Proc Natl Acad Sci USA 88: 765-769, 1991.

168. Nagata S and Golstein P. The Fas death factor. Science 267: 1449-1456, 1995.

169. Nawroth PP, Bank I, Handley D, Cassimeris J, Chess L and Stern D. Tumor necrosis factor/cachectin interacts with endothelial cell receptors to induce release of interleukin 1 .J Exp Med 163: 1363-1375, 1986.

170. Nesbitt MN and Francke U. A system of nomenclature for band patterns of mouse chromosomes. Chromosoma 41: 145-158, 1973.

171. Neumann В, Luz A, Pfeffer К and Holzmann B. Defective Peyer's patch organogenesis in mice lacking the 55-kD receptor for tumor necrosis factor. J Exp Med 184: 259-264, 1996.

172. Neumann B, Luz A, Pfeffer К and Holzmann B. Defective Peyer's patch organogenesis in mice lacking the 55-kD receptor for tumor necrosis factor. J Exp Med 184: 259-264, 1996.

173. Neumann B, Luz A, Pfeffer К and Holzmann B. Defective Peyer's patch organogenesis in mice lacking the 55-kD receptor for tumor necrosis factor. J Exp Med 184: 259-264, 1996.

174. Nosaka T and Kitamura T. Janus kinases (JAKs) and signal transducers and activators of transcription (STATs) in hematopoietic cells. Int J Hematol 71: 309-319, 2000.

175. Ogawa M. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood 81: 28442853, 1993.

176. Ogawa M. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood 81: 28442853, 1993.

177. Ogawa M. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood 81: 28442853, 1993.

178. Ogawa M. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood 81: 28442853, 1993.

179. Ogawa M. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood 81: 28442853, 1993.

180. Ogawa M, Porter PN and Nakahata T. Renewal and commitment to differentiation of hemopoietic stem cells (an interpretive review). Blood 61: 823-829, 1983.

181. Ohta M, Greenberger JS, Anklesaria P, Bassols A and Massague J. Two forms of transforming growth factor-beta distinguished by multipotential haematopoietic progenitor cells. Nature 329: 539-541, 1987.

182. Old LJ. Tumor necrosis factor. Sci Am 258: 59-75, 1988.

183. Passegue E, Jamieson CH, Ailles LE and Weissman IL. Normal and leukemic hematopoiesis: are leukemias a stem cell disorder or a reacquisition of stem cell characteristics? Proc Natl Acad Sci USA100 Suppl 1:11842-11849,2003.

184. Peschel C, Paul WE, Ohara J and Green I. Effects of В cell stimulatory factor-1/interleukin 4 on hematopoietic progenitor cells. Blood 70: 254-263, 1987.

185. Pinckard JK, Sheehan КС and Schreiber RD. Ligand-induced formation of p55 and p75 tumor necrosis factor receptor heterocomplexes on intact cells. J Biol Chem 272: 10784-10789, 1997.

186. Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, Douglas R, Mosca JD, Moorman MA, Simonetti DW, Craig S and Marshak DR. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 284: 143-147, 1999.

187. Ploemacher RE, van der Sluijs JP, Voerman JS and Brons NH. An in vitro limiting-dilution assay of long-term repopulating hematopoietic stem cells in the mouse. Blood 74: 2755-2763,1989.

188. Ploemacher RE, van der Sluijs JP, Voerman JS and Brons NH. An in vitro limiting-dilution assay of long-term repopulating hematopoietic stem cells in the mouse. Blood 74: 2155-2163, 1989.

189. Ploemacher RE, van der Sluijs JP, Voerman JS and Brons NH. An in vitro limiting-dilution assay of long-term repopulating hematopoietic stem cells in the mouse. Blood 74: 2755-2763, 1989.

190. Ploemacher RE, van der Sluijs JP, Voerman JS and Brons NH. An in vitro limiting-dilution assay of long-term repopulating hematopoietic stem cells in the mouse. Blood 74: 2755-2763, 1989.

191. Ploemacher RE, van der Sluijs JP, Voerman JS and Brons NH. An in vitro limiting-dilution assay of long-term repopulating hematopoietic stem cells in the mouse. Blood 74: 2755-2763, 1989.

192. Ploemacher RE, van der Sluijs JP, Voerman JS and Brons NH. An in vitro limiting-dilution assay of long-term repopulating hematopoietic stem cells in the mouse. Blood 74: 2755-2763, 1989.

193. Ploemacher RE, van der Sluijs JP, Voerman JS and Brons NH. An in vitro limiting-dilution assay of long-term repopulating hematopoietic stem cells in the mouse. Blood 74: 2755-2763, 1989.

194. Pluznik DH and Sachs L. The cloning of normal "mast" cells in tissue culture. J Cell Physiol 66:319-324, 1965.

195. Price G, Brenner MK, Prentice HG, Hoffbrand AV and Newland AC. Cytotoxic effects of tumour necrosis factor and gamma-interferon on acute myeloid leukaemia blasts. Br J Cancer 55: 287-290, 1987.

196. Prosper F, Stroncek D, McCarthy JB and Verfaillie CM. Mobilization and homing of peripheral blood progenitors is related to reversible downregulation of alpha4 betal integrin expression and function. J Clin Invest 101: 2456-2467, 1998.

197. Raefsky EL, Platanias LC, Zoumbos NC and Young NS. Studies of interferon as a regulator of hematopoietic cell proliferation. J Immunol 135: 2507-2512, 1985.

198. Rebel VI, Hartnett S, Hill GR, Lazo-Kallanian SB, Ferrara JL and Sieff CA.

199. Essential role for the p55 tumor necrosis factor receptor in regulating hematopoiesis at a stem cell level. J Exp Med 190: 1493-1504, 1999.

200. Rebel VI, Hartnett S, Hill GR, Lazo-Kallanian SB, Ferrara JL and Sieff CA.

201. Essential role for the p55 tumor necrosis factor receptor in regulating hematopoiesis at a stem cell level. J Exp Med 190: 1493-1504, 1999.

202. Rebel VI, Hartnett S, Hill GR, Lazo-Kallanian SB, Ferrara JL and Sieff CA.

203. Essential role for the p55 tumor necrosis factor receptor in regulating hematopoiesis at a stem cell level. J Exp Med 190: 1493-1504, 1999.

204. Reyes M, Dudek A, Jahagirdar B, Koodie L, Marker PH and Verfaillie CM. Origin of endothelial progenitors in human postnatal bone marrow. J Clin Invest 109: 337-346, 2002.

205. Reyes M, Lund T, Lenvik T, Aguiar D, Koodie L and Verfaillie CM. Purification and ex vivo expansion of postnatal human marrow mesodermal progenitor cells. Blood 98: 2615-2625,2001.

206. Rogers JA and Berman JW. A tumor necrosis factor-responsive long-term-culture-initiating cell is associated with the stromal layer of mouse long-term bone marrow cultures. Proc Natl Acad Sci USA 90: 5777-5780, 1993.

207. Rogers JA and Berman JW. A tumor necrosis factor-responsive Iong-term-cultureinitiating cell is associated with the stromal layer of mouse long-term bone marrow cultures. Proc Natl Acad Sci USA 90: 5777-5780, 1993.

208. Rogers J A and Berman JW. TNF-alpha inhibits the further development of committed progenitors while stimulating multipotential progenitors in mouse long-term bone marrow cultures. J Immunol 153: 4694-4703, 1994.

209. Rogers J A and Berman JW. TNF-alpha inhibits the further development of committed progenitors while stimulating multipotential progenitors in mouse long-term bone marrow cultures. J Immunol 153: 4694-4703, 1994.

210. Rogers J A and Berman JW. TNF-alpha inhibits the further development of committed progenitors while stimulating multipotential progenitors in mouse long-term bone marrow cultures. J Immunol 153:4694-4703, 1994.

211. Rusten LS, Jacobsen FW, Lesslauer W, Loetscher H, Smeland EB and Jacobsen SE.

212. Bifunctional effects of tumor necrosis factor alpha (TNF alpha) on the growth of mature and primitive human hematopoietic progenitor cells: involvement of p55 and p75 TNF receptors. Blood%3: 3152-3159, 1994.

213. Rusten LS, Jacobsen FW, Lesslauer W, Loetscher H, Smeland EB and Jacobsen SE.

214. Bifunctional effects of tumor necrosis factor alpha (TNF alpha) on the growth of mature and primitive human hematopoietic progenitor cells: involvement of p55 and p75 TNF receptors. Blood ЪЪ: 3152-3159, 1994.

215. Rusten LS, Jacobsen FW, Lesslauer W, Loetscher H, Smeland EB and Jacobsen SE.

216. Bifunctional effects of tumor necrosis factor alpha (TNF alpha) on the growth of mature and primitive human hematopoietic progenitor cells: involvement of p55 and p75 TNF receptors. Blood 83: 3152-3159, 1994.

217. Satoh M, Mioh H, Shiotsu Y, Ogawa Y and Tamaoki T. Mouse bone marrow stromal cell line MC3T3-G2/PA6 with hematopoietic-supporting activity expresses high levels of stem cell antigen Sca-1. Exp Hematol 25: 972-979, 1997.

218. Sauvageau G, Iscove NN and Humphries RK. In vitro and in vivo expansion of hematopoietic stem cells. Oncogene 23: 7223-7232, 2004.

219. Schofield R. The relationship between the spleen colony-forming cell and the haemopoietic stem cell. Blood Cells 4: 7-25, 1978.

220. Schooltink H and Rose-John S. Cytokines as therapeutic drugs. J Interferon Cytokine Res 22: 505-516,2002.

221. Seabright M. A rapid banding technique for human chromosomes. Lancet 2: 971-972, 1971.

222. Shieh JH, Peterson RH, Warren DJ and Moore MA. Modulation of colony-stimulating factor-1 receptors on macrophages by tumor necrosis factor. J Immunol 143: 2534-2539, 1989.

223. Smith RA and Baglioni C. Characterization of TNF receptors. Immunol Ser 56: 131147, 1992.

224. Socolovsky M, Lodish HF and Daley GQ. Control of hematopoietic differentiation: lack of specificity in signaling by cytokine receptors. Proc Natl Acad Sci USA 95: 65736575, 1998.

225. Spangrude GJ, Heimfeld S and Weissman IL. Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science 241: 58-62, 1988.

226. Starr R, Willson ТА, Viney EM, Murray LJ, Rayner JR, Jenkins BJ, Gonda TJ, Alexander WS, Metcalf D, Nicola NA and Hilton DJ. A family of cytokine-inducible inhibitors of signalling. Nature 387: 917-921, 1997.

227. Suda T, Suda J and Ogawa M. Single-cell origin of mouse hemopoietic colonies expressing multiple lineages in variable combinations. Proc Natl Acad Sci USA 80: 6689-6693, 1983.

228. Suda T, Suda J, Ogawa M and Ihle JN. Permissive role of interleukin 3 (IL-3) in proliferation and differentiation of multipotential hemopoietic progenitors in culture. J Cell Physiol 124: 182-190, 1985.

229. Tartaglia LA, Ayres TM, Wong GH and Goeddel DV. A novel domain within the 55 kd TNF receptor signals cell death. Cell 74: 845-853, 1993.

230. Tartaglia LA and Goeddel DV. Two TNF receptors. Immunol Today 13: 151-153, 1992.

231. Tartaglia LA, Goeddel DV, Reynolds C, Figari IS, Weber RF, Fendly BM and Palladino MA, Jr. Stimulation of human T-cell proliferation by specific activation of the 75-kDa tumor necrosis factor receptor. J Immunol 151: 4637-4641, 1993.

232. Tartaglia LA, Pennica D and Goeddel DV. Ligand passing: the 75-kDa tumor necrosis factor (TNF) receptor recruits TNF for signaling by the 55-kDa TNF receptor. J Biol Chem 268: 18542-18548, 1993.

233. Tartaglia LA, Pennica D and Goeddel DV. Ligand passing: the 75-kDa tumor necrosis factor (TNF) receptor recruits TNF for signaling by the 55-kDa TNF receptor. J Biol Chem 268: 18542-18548, 1993.

234. Tateda K, Matsumoto T, Miyazaki S and Yamaguchi K. Lipopolysaccharide-induced lethality and cytokine production in aged mice. Infect Immun 64: 769-774, 1996.

235. Till JE and Mc Culloch EA. A direct measurement of the radiation sensitivity of normal bone marrow cells. Radiat Res 14: 213-222, 1961.

236. Till JE and McCulloch EA. A direct measurement of radiation sencitivity of normal mouse bone marrow. Radiation Research 14: 213-221, 1961.

237. Till JE and McCulloch EA. Hemopoietic stem cell differentiation. Biochim Biophys Acta 605: 431-459, 1980.

238. Till JE, McCulloch EA and Siminovitch L. A Stochastic Model of Stem Cell Proliferation, Based on the Growth of Spleen Colony-Forming Cells. Proc Natl Acad Sci USA 51: 29-36, 1964.

239. Trentin JJ. Hemopoietic inductive microenvironment. In: Stem cells of renewing cell populations., New York: 1976, p. 255-264.

240. Trevisan M and Iscove NN. Phenotypic analysis of murine long-term hemopoietic reconstituting cells quantitated competitively in vivo and comparison with more advanced colony-forming progeny. J Exp Med 181: 93-103, 1995.

241. Tsuji K, Zsebo KM and Ogawa M. Enhancement of murine blast cell colony formation in culture by recombinant rat stem cell factor, ligand for c-kit. Blood 78: 1223-1229, 1991.

242. Verfaillie CM. Adhesion receptors as regulators of the hematopoietic process. Blood 92: 2609-2612, 1998.

243. Verfaillie CM. Adhesion receptors as regulators of the hematopoietic process. Blood 92: 2609-2612, 1998.

244. Wallach D, Varfolomeev EE, Malinin NL, Goltsev YV, Kovalenko AV and Boldin

245. MP. Tumor necrosis factor receptor and Fas signaling mechanisms. Annu Rev Immunol 17: 331-367,1999.

246. Wang JC, Warner JK, Erdmann N, Lansdorp PM, Harrington L and Dick JE.

247. Dissociation of telomerase activity and telomere length maintenance in primitive human hematopoietic cells. Proc Natl Acad Sci U S A 102: 14398-14403, 2005.

248. Watt SM, Buhring Щ, Rappold I, Chan JY, Lee-Prudhoe J, Jones T, Zannettino AC, Simmons PJ, Doyonnas R, Sheer D and Butler LH. CD 164, a novel sialomucin on CD34(+) and erythroid subsets, is located on human chromosome 6q21. Blood 92: 849-866, 1998.

249. Wei S, Kitaura H, Zhou P, Ross FP and Teitelbaum SL. IL-1 mediates TNF-induced osteoclastogenesis. J Clin Invest 115: 282-290, 2005.

250. Whitlock CA and Witte ON. Long-term culture of murine bone marrow precursors of В lymphocytes. Methods Enzymol 150: 275-286, 1987.

251. Wickremasinghe RG and Hoffbrand AV. Biochemical and genetic control of apoptosis: relevance to normal hematopoiesis and hematological malignancies. Blood 93: 3587-3600, 1999.

252. Wu AM, Siminovitch L, Till JE and McCulIoch EA. Evidence for a relationship between mouse hemopoietic stem cells and cells forming colonies in culture. Proc Natl Acad Sci U SA59: 1209-1215, 1968.

253. Yarbro JW. Mechanism of action of hydroxyurea. Semin Oncol 19: 1-10, 1992.

254. Yuan J. Transducing signals of life and death. Curr Opin Cell Biol 9: 247-251, 1997.

255. Zeng H, Masuko M, Jin L, Neff T, Otto KG and Blau CA. Receptor specificity in the self-renewal and differentiation of primary multipotential hemopoietic cells. Blood 98: 328-334, 2001.

256. Zhang J, Niu C, Ye L, Huang H, He X, Tong WG, Ross J, Haug J, Johnson T, Feng JQ, Harris S, Wiedemann LM, Mishina Y and Li L. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. Nature 425: 836-841, 2003.

257. Zheng L, Fisher G, Miller RE, Peschon J, Lynch DH and Lenardo MJ. Induction of apoptosis in mature T cells by tumour necrosis factor. Nature 377: 348-351, 1995.

258. Zheng L, Fisher G, Miller RE, Peschon J, Lynch DH and Lenardo MJ. Induction of apoptosis in mature T cells by tumour necrosis factor. Nature 377: 348-351, 1995.