Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Влияние рекомбинантного фактора некроза опухолей-альфа человека на пролиферацию и дифференцировку кроветворных предшественников in vitro

г? ач л

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ 'НАУК СССР • ' '

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО'' КРАСНОГО ЗНАМЕНИ

ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ ИМЕНИ ПОЧЁТНОГО АКАДЕМИКА Н.Ф.ГАМАЛЕИ

На правах рукописи

, КАРКАНИЦА Леонид Васильевич

ВЛИЯНИЕ РЕИОГЧНАНТНОГО ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ- ¡L ЧЕЛОВЕКА НА ПРОЛИФЕРАЦИЮ Я ДИЗЖРЕНЦИРОВКУ КРОВЕТВОРНЫХ ПРЕДДЕСТВЕННИКОВ ш vitro

14.00.36 - иммунология и аллергология

Автореферат ,ертации на соискание учёной степени дндидата медицинских наук

Москва - 1991

Работа выполнена .в Научно-исследовательском институте гематологии и переливания крови МЗ БССР и Научно-исследовательском институте эпицемиологии и микробиологии АМН'СССР имени почётного академика Н.Ф.Гамалеи'

Научный руководитель:

доктор биологических наук A.B.Санин

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук А.Я.Суслов доктор медицинских наук И.В.Мирошниченкс

Ведущая организация:

Институт биофизики МЗ СССР

■ Защита состоится ___

в "" часов"на заседании Специализированного Совета в Научно-исследовательском институте эпицемиологии и микробис' логии им.Н.Ф.Гамалеи АМН СССР (123098,Москва,ул.Гамалеи,18) С .диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НШЭМ им.Н.Ф.Гамалеи АМН СССР ¿Щ

Автореферат разослан" "_1991

Учёный секретарь Специализированного Совета доктор медицинских наук

Е.И.К0ШЕ10ВА

ОБЩАЯ-ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

актуальность проблемы.лммунорш'.уляция кроветворения остаётся одной из актуальных проблем современной иммунологии. Основные принципы регуляторных воздействий системы иммунитета на кроветворение были сформулированы-и обоснованы более 20_лет назад и подтверждены в дальнейшем такими фактами,как взаимодей* ствие лимфоцитов и стволовых кроветворных клеток(СКК)(Р.В.Петров,!. С.Сеславина,1977),регуляторные влияния на кроветворные предшественники других иммунокомпетентных клеток,например,В-хелперов »Т-дифференцирующих лимфоцитов(В.М. Манько, 1978;В. М. Ма-нько и др. ,1981) и т.д.По современным представлениям одной из важнейших точек приложения регуляторных сигналов в кроветвор -ной системе являются не сами СКК,а их потомки - кроветворные предшественники,пролиферация и дифференцировка которых под воздействием этих сигналов изменяется(B.Toro3c-Storb,i988). Огромные успехи достигнуты в установлении как механизмов регуляции кроветворения,так и природы регуляторных сигналов,среди которых особенно важны цитокины - полипептиды,опосредующие межклеточные взаимодействия,например,колониестимулирующие факторы (КСФ),интерлейкин-Toi ,интерлейкин-6 и другие.Среди них можно выделить и фактор некроза опухолей«¿/кахектин (ФНО),являющийся, по мнении-многих исследователей,одним из главных регуляторов защитных реакций (Дяс.0дд,1988) .Много фактов свидетельствует о том,что роль ШО особенно важна на начальных этапах развития этих реакций,когда в ответ на проникновение антигена начинают активироваться макрофаги,секретируя ФНО и другие регуляторные молекулы и с их помощью вовлекая в процесс необходимые клетки иммунной системы(Дж.0дд,1988).ЩНО осуществляет регуляцию естественной резистентности организма на аутокрйнном.паракринном и эндокринном уровнях и,очевидно,является одним из универсальных факторов защиты организма( B.Sherry,А.Cerami, 1988). Именно регуляторная роль ШО сейчас представляется наиболее важной,хотя хорошо известно участие этого медиатора в эффектор-ных реакциях иммунитета(Дж.Олд,1988).

Активация защитных сил организма несомненно должна приводить к перестройке функционирования кроветворной системы,так как именно СКК составляют основу иммунного гомеостаза. Роль ФНО в такой перестройке при инфекциях может быть очень важной,

так как установлено,что именно £Н0 вызывает ранние изменен: -кроветворения восле^введения зндотокси на( ■ s ; Vage2r- е > а, 19S; Одкако.роль-и кесто <Ш0 б -регуляции кроветворения,как и so: ¡шмунорегуляцкя кроветворной системы изучены недостаточной Паловцева,1990).Серьёзным ограничением для подобных исследс най является отсутствие методов морфологической идектифика! C2SC. и их EOTOiiKOB(B.lord,r.I>exter ,1988 ). Поэтому до сих г одним из главных подходов в. изучении регудяторных сигналов кроветворения у человека остаётся методика образования коле кроветворных клеток in vitro(M.A.s.Moore , Т990 ). Наряду с результатами клинических испытаний цитокинов(в основном,их комбинавгных аналогов)такие исследования позволяют составит более полную картину участия того или иного медиатора 'иммун тета в регуляции кроветворения.Относительно ФНО такие данны представляют большой интерес в связи с его предполагаемой в ной ролью в патогенезе инфекционных и опухолевых заболевани иммунных реакциях организма,а также в связи с его возможным использованием в клинике как противоопухолевого препарата. Перспективным представляется также применение рекомбикантно: Ш.0 в качестве радиопротектора,причём сильный радиопротект-и: "ный эффект " скорее всего как раз и обусловлен воздействием н< кроветворную систему(l.Slordal е.а., 1989).

Изучению влияния ®0 на пролиферацию и дифференцироз кроветворных предшественников in vitro и посвящена эта раб< та.Для идентификации биологических эффектов в ней был испол; ван рекомбинантный ШНО (р®0) и нейтрализующие его активное! антитела,что отвечает современным требованиям к такого рода следованиям ( М.А.S.Moore,1990).

Цеди и задачи исследования. Делью работы является и; чение влияния рекомбинантного фактора некроза опухолей-«^ че ловека на пролиферацию и дифференцировку кроветворных пред -вественников in vitro.

Для достижения этой цели решались следующие задачи:

1.Изучить влияние рФНО-на пролиферацию костноыозговь предшественников кроветворения человека и ¡шли in vitro.

2.Исследовать влияние рФНО на .дифференцировку in vit предшественников различных ростков кроветворения человека.

3.Выяснить,оказывает "ли рШО ингибирующее действие к пролиферацию кроветворных предшественников человека,выделены

кз эмбриональной печени ,цупозинной крови новорожденных и периферической крови" взрослых: элодей.

4.Изучить способность pSHG вышвать синтез ингибиторов кроветворения а культурах клеток костного мозга больных острыми лейкозами.

5.Изучить возможность искажения результатов определения биологической активности К® в образцах кондиционированных сред, содержащих одновременно ШКО и КСФ.

Научная новизна -работы. Впервые получены доказательства опосредованного ингибирующего воздействия рФНО на кроветворные предшественники.Сделан вывод о том, что при кратковременной пульсовой обработке рФНО действует на эти клетки цитостатичес-ки,а не цитотоксическн,как это было установлено ранне другими авторами( H.Broxmeycr е.а.,1986 ) .Эти результаты дают воз -мокность считать доказанной концепцию цитостатического механизма воздействия рШО на пролиферацию кроветворных предшественников.Показано,что рШО .может влиять на колониеобразующие клеткиСКОЕн)»находящиеся в S-фазе клеточного цикла .Установлено, что при постоянном присутствии в ыетилцеллюлозных культурах костномозговых клеток человека рФНО больше подавляет образование- мкелошршх колоний,чем эрптровдньк.В то же время,в экспериментах с пульсовой обработкой показано,что рШО одинаково -опосредованно цитосгатичееки - влияет на предшественники миело-поэза(КОЕ-ГМ) и зритропоэзаШОЕэ).Таким образом,селективность эффектов рФНО может быть связана с его воздействием на более поздние предшественники,чем БОЕэ и KQE-ГМ.Экспериментально подтверждено отсутствие видовой специфичности ингибирущего эпфек-та рФНО.Наряду с экспериментами,в которых изучали влияние p4vl^ на пролиферацию КОЕк из эмбриональной печени человека,пуповин-ной крови новорожденных ^периферической крови взрослых лвдей, это свидетельствует об универсальности ингибирувщего эффекта £НО.Учитывая опосредованный механизм подавления пролиферации ' КОЕк,была изучена и установлена способность ®0 вызывать про-, дукщш ингибиторов кроветворения в культурах костномозговых клеток больных острыми лейкозами.

Известно,что биологическая .активность КСФ определяется по их способности стимулировать колоииеобразование в кроветворных культурах in vitro. Показано,что при .содержании в исследуемых образцах КС® и ШО одновременно результаты определения ак-

тивности КЩ значительно искажаются вследствие ингибируклцеи -воздействия ШО-на пролиферацию КОЕк^Такиж-^об^азцагли были*? кондиционированные среды-культур мононуклеаров перкферическо» крови и культур макрофагов человека.

Практическая ценность. Данные об опосредованном ингис ругащем воздействии рШО на кроветворные предшественники могуч быть использованы в.'дальнейших исследованиях,касающихся идеи! фикации продуцирующих клеток и характеристики ингибитора.Тага исследования представляется важными для изучения механизмов % гуляцш кроветворения как в норме,так и при патологии,особен« роли Ш0-в патогенезе опухолевых и инфекционных заболеваний.Э также актуально для изучения опосредованной ФНО радиопротекци Научно-практическую ценность имеет предварительная нейтрализа ция ФНО перед определением биологической активности КСФ мето* цом колониеобразования.Результаты работы используются в лабор тории клеточного иммунитета НИИЭМ им.академика Н.Ф.Гамалеи АМН СССР(зав.лабораторией -д.б.н.А.В.Санин),а также в учебном процессе в цикле лекций для студентов Московского государственного университета.

Основные положения,выносимые на защиту:

1.piHO человека подавляет пролиферацию кроветворных предшественников in vitro как при постоянном присутствии в кроветворных культурах,так и после пульсовой обработки.

2.р®0 может вызвать синтез ингибиторов кроветворенн в культурах костномозговых клеток здоровых людей и больных острыми лейкозами.Таким образом,возможно также опосредованное ингибирущее воздействие рШО на кроветворные предшественники

3.рФНО действует цитостатически на кроветворные предшественники »находящиеся в s-фазе клеточного цикла.Бри постоянном присутствии р<ВД0 подавляет пролиферацию кроветворных предшественников, вьщеяенных из эмбриональной печени человека, пуповинной крови новорожденных,периферической крови взрослых людей.Наряду с отсутствием видоспецкфичности ингибируюгцего эффекта р$Н0,зто свидетельствует об универсальности этого эф -фекта.

4.р$Н0 подавляет в культурах in vitro ' пролиферацию предшественников миелопоэза(КОЕ-ГМ) ,эритропоэза{БОЕэ) и смешанных колоний (КОЕсм) .Некоторая селективность эффектов рШО

для предшественников эритропозза и киелопоэза может опосредо-

6

ваться на уровне более дифференцированных клеток,чем ЕОЕэ и ТОЕ-ГМГ

5.Одновременное присутствие ФНО и КСФ в кондиционированных средах культур клеток человека искажает результаты определения биологической активности КС®.

Апробация. Основные положения работы доложены и обсук-дены'ка 5 международных,3 всесоюзных и 2 республиканских симпозиумах и конференциях: международной конференции "Стволовая кроветворная клетка в норме и при патологии'ЧНовосибирск,СССР, 1988),XXII"конгрессе международного общества гематологов(Милан, Италия, 1988) , 5-м международном симпозиуме "Молекулярная биология гемопоэза'ЧИнисбрук.Австрия, 1989),3-м международном симпозиуме "Рези.дуальные клетки при острой лейкемии"(Роттердам, Голландия,1990).международном симпозиуме "Молекулярные факторы гемопоэза"(СССР,ФРГ,1990),всесоюзном симпозиуме "Биология клетки в культуре"(Ленинград,1937)ЛУ съезде гематологов и грансфузиологов Белоруссии(Минск,1988),1 всесоюзном съезде иммунологов СССР(Дагошс,1989), I иммунологическом съезде Белоруссии (Минск, 1990).всесоюзном симпозиуме "Биохимия опухолевой клетки"(Минск,1990).

Публикации. Основные результаты работы опубликованы в 10 печатных работах,получено I авторское свидетельство.

Объём и структура диссертации. Работа написана по традиционному плану и включает следующие разделы: Введение,Обзор литературы,Собственные исследований 4 главы),Выводы,Список литературы(239 источников,з том числе 23 работы отечественных авторов).Общий объём диссертации - 163 страницы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. В. экспериментах был использован рекомбинантный <Ш0-<£. человека производства'НПО "Фермент"(Вильнюс,Литва).Рекомбинактккй интерлейккн~3 человека (рМ-3) был предоставлен Dr.G.F/agemkex (Радиобиологический Институт,Рейсвейк,Голландия) .Рекомбинантнкй зритропоэтин человека был предоставлен ст.н.с. НЩ мецбиотехнологии МЗ СССР С.Д.Колобковым(г.Москва).В качестве контрольного образца КСФ в некоторых опытах использовали кондиционированную среду стимулированных лектином мононуклеароз периферической крови человека (ШПК) .собранную через 120 часов культивирования.

Источником нормальных кроветворных предшественников 7

человека были фрагменты подвздошных костей»полученные из Н№ травматологии й ортопедии МЗ'БССРСглЧинск)¡во" время операций по поводу переломов костей газа.Образцы костного мозга гема1 -логический-больных были получены и предоставлены ст.н.с.НИИ ГПК МЗ БССР Л.В.Козич.Эмбриональная печень человека была вы,с лена из ёмбрионов,полученных во время абортов от здоровых женщин в Минском городском-абортарии.Пуповинную кровь доноше ных здоровых новорожденных человека забирали во время родов из плацентарного сегмента пуповины в Минском городском родил нон доме И.

В. экспериментах использовали линейных мышей С57В1/6 (Н-2Ъ) ,Balb/o(H-2d) , AXK(H-2k) в возрасте 2-6 месяс из питомников "Столбовая" и "Рапполово".

Нейтрализующие монокдональные антитела против рФНО ь. ловека были получены совместно с м.н.с. НИИГПК МЗ БССР М.Е.Н маровской.Продуцирующая гибридома ЗСШ была получена и. предоставлена ст.н.с. А.Б.Панютичем. ,,

Для работы с клетками использовали питательные сре.дк ' 1МШ,ШЕМ,И?М1 1640 ("Gibco" ; Англия; "Serva", ФРГ).

Получение мононуклеарних клеток перисЬерической крови костного мозга человека. Для выделения использовали градиент плотности фикопл-верографина по описанной методикеШ.Н.Войте нок и др.,1937).Там,где это было нужно,удаляли Т-лимфоциты и акцессорные клетки.Для удаления Т-лимфоцитов использовали ме тод розеткообразования с эритроцитами барана,обработанными аминоэтшшзотиоуронием бромидом,а акцессорные клетки удаляли адгезией на пластике и в некоторых опытах с помощью частиц карбонильного железа(Л.В.Карканица и др.,1990).После этого к тки несколько раз отмывали в питательной среце(с добавлением сыворотки) центрифугированием в течение 10 мин при 250g.

Выделение костномозговых клеток мышей. Костный мозг стерильно вымывали из бедренной кости мышей,пропускали несколько раз через шприц для подкожных инъекций и дважды отмывали центрифугированием в среде с добавлением эмбриональнс телячьей сыворотки(ЭТС).

Замораживание и размораживание клеток.5-10. млн/мл к.7 ток в среде с 4Q% ЭТС ресуспендировали в малом объёме среда, которой затем добавляли такой же объём замораживающей смеси Ссреца-ЭТС-диметилсульфоксиц,2:2:1).Затем клетки в ампулах ,г

я

замораживания помещали на I час на -20°С,после чего переносили в-пары и затем в жидкий-азот.Клетки размораживали быстро на_во-дянсй баке при 37-40°С,приливали 10 объёмов'охлакдё'нной среда и дважды отмывали.

Жизнеспособность клеток подсчитывали по исключению трипанового синего.

Определение биологической активности ШО.В большинстве случаев активность ФНО и pfflO была определена м.н.с.М.Е.Кома-ровской или же совместно с ней.Для этого использовали общепринятый цитотоксический тест на мышиных опухолевых клетках L929 (А.В.Пангатич и др.,1988).

Пульсовая обработка клеток рФНР. 5 млн/мл клеток инкубировали в бессыворогочной среде с разведениями рФНО в течение I часа при 37°С.Затем клетки дважды отмывали от р®0(установ-лено,что этого было достаточно для полного удаления рФНО).Жизнеспособность клеток после этого была не.ниже 90%.

Определение пролиферации кроветворных предшественников. Для определения числа пролиферируютцих колониеобразующих единиц культуры (KOZk) использовали метод клеточного самоубийства , основанный на поражении клеток в фазе синтеза ДНК í s-фаза клеточного цикла) оксимочевиной.по методике ir.Kaiisuaa.ru с.а. 1982. I млн/мл клеток инкубировали с 200 мкг/мл оксимочевины в бессывороточной среде ином в течение I часа при 37°С.Клетки трижды отмывали от оксимочевины(ОМ ) и подсчитывали жизнеспособность. Величину КОЕк в S -фазе клеточного цикла учитывали по колониеобразовангао в культурах in vitro по формуле(И.Л.Чертков, 1984).

Агаровые культуры кроветворных предшественников. Для исследования пролиферации и дифференцировки КОЕ-ГМ человека и мыши использовали метод клонирования кроветворных предшественников в полутвёрдом агаре с небольшими модификациями(А.В.Дэ-нютич и др.,1988; Л.З.Карканица и др.,1990).В качестве контрольного образца КСФ для стимуляции мышиных КОЕк использовали кондиционированную среду культур гибридных клеток MKI, продуцирующих мышиный гранулоцитомакрофагальный КСЗНЛ.В.Карка-кица,А.В.Панвтич,авторское свидетельство М585330 от 15.08.90, бюлл.№30).Агаровые культуры клеток человека готовили без добавления меркаптоэтанола.Для идентификации КОЕ-ГМ использовал^

метод окраски in sitnHD.Metcalf ,-i9&0.

9

Определенна смешанных колоний и буретобразующих един«; эрктрошэза^СбразоЁание 'смеягнньк холоний'(КОЕсй) и БОЕэ'"иссле довали в метилцеллюлозных культурах (D.Uetcalf ,15S4) .Для образования бурстов на 3-й сугки - в краветворныз культуры добав® ПИ 2 Ед/'мя рекомбинангного зрйтролаэтина человека .Для иденткф! йацин БОЕэ культура окрзшвали in situ ■ бекэидином("Р1ика ас Швейцария) .Для' подсчёта КОЕсм мсподьэовали критерии,предлагаемые D.Ustcali (1964) :за КОЗсм ."принимали.мультицснтрические колонии,состоящие из нескольких а?ипов клеток,в том числе зрит^ цктов(бурсгы,входящие в состав КОЕсм,не учитывались как БОЕэ).

Статистическая. обработка. Достоверность различий полученных Ееличин устанавливали,испольэуя критерий Огъодента.В pi-сунках и графиках приведены доверительные интервалы,вычисленнь при Р <з 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ I .Ингибирующее воздействие рШО.на пролиферацию КОЕ-ГМ .человека., и щщи. Теоретически ®Н0 способен воздействовать на кроветворные предшественники прямо-или опосредованно.Ранее,в исследованиях других автор_ов_было установлено сильное подавление пролиферации КОЕк в присутствии рШ0(з,АЪЬоца е.о.,19В7; Н.Згохшеуег е.а.' ,1986 ) .Этот Инпибирующий эффект являете, скорее всего результатом пр<шого воздействия ФНО на KOSk (K.Barber е.а.1987).Однако,опосредованно -через индукцию синтеза КОЗ в клетках микроокружения -4Ш0 стимулировать пролифе-

рацию KOECR.MueiJeer е.а. ,1936).

В наших исследованиях при постоянном присутствии р$Н0 также подавлял пролиферацию КОЕк-в культурах костномозговых клеток человека (рис Л). Это подавление было обусловлено только р£Н0,тах как нейтрализация его активности антителами отменяла этот эффект.Однако,при постоянной присутствии рФНО в культурах невозможно ответить на следующие вопросы: является ли данное подавление результатом цятотокоического или. цитостатического эс| фёктй? влияе-i ли рФНО в данном случае на кроветворные .предшественники в s "фазе(по некоторым данным,именно на эти клетки действу»': регуляторные сигналы)?

Поэтому в наших исследованиях применялся также другой подход»основанный на предварительной пульсовой обработке -костномозговых клеток рШО в теченаа I ¿шаа лш 37°С.Въи»шше дос-

Ю . -

Рисунок I.Ингибирующзе воздействие рФНО на пролиферацию KQ3-. ГМ в агаровых культурах костномозговых клеток человека(оотмена подавления после нейтрализации рФНО антителами(* )

не такой обработки КОЕк определяли по их способности к uqmkbs-образованию в агаровых или метилцеллюлозных культурах.Это? ход позволяет также оценить,влияет ли рФНО на КОЕк з S -фаза» для чего использовали оксимочезину - цитосгатик,селективно иг— . давлящий клетки в S -фазе(Е.мвсав,чу'/Ь;J.Rustnoven е.a, Установлено,что пульсовая обработка костномозговых клеток чггк> века рФНО приводила к сильному подавлению пролиферации кроветворных предшественников in vitro . На этом основании можно <5f~ ло бы заключить,что р$НО действует цятотоксически на КОЕк,что « сделали В.Вгохтеуег е. а. ('iy86). Этот вывод кажется закономерным. Более того,аналогичные результаты были получены в экспериментах с костномозговыми клетками мышей.Однако,изучение влияния р&НО на популяцию КОЕк bs -фазе клеточного цикла показало (таблица П; 1)после пульсовой.обработки рФНО почти все КОЕк были вне 8» фазы; 2)после обработки рФНО и дополнительной обработки оксиж-чевиной наблюдали отмену подавления,- таким образом,оно мог.*; быть связано с какими-то клетками»которые находились в 3. -фази

Таблица I.Число КОЗ-ГМ в агаровых культурах костномозговых клеток человека после пульсовой обработки их рФНО и дополнительной обработки оясииочезиной(в скобках приведены значения г

культурах клеток,необработанна« оксимочдвиной)_,_ ..

№ опы- Необработанные Обработанные ОМ клетки____

та г>ФН0 и ОМ Вез рФНО 5ЭЕц/мл 200Ед/мл 400Еп/п:

I 30,7 • ¿5,7 28,7(15,0) 29,7(10,7) 28,ШБ^;

г 32,8 30,3 3I,3(IS,3> 30,0(10,0) 30,3(5,3)

3 22,7............. 21,7 21,3(11,0) 20,7( 5,3) 17,3(2,3)'

SP> 0.05,во всех остальных случаях - Rs0.05

11

клеточного цикла; 3)данные клетки не являются КОЕк,так как число: последних'в'конечном итоге практически йе изменилось;Основываясь на результатах этих опытов можно- предположить сле.ду-ющее:рФН0 способен активировать какие-то костномозговые клетки не относящиеся к кроветворным предшественникам,и эти клетки, возможно,продуцируют после этого вторичный ингибитор кроветворения.Такая возможность была проверена.Мононуклеары 'костного мозга человека!свежевыдеденные или размороженные после хранения в жидком азоте) преинкубировали с 200 Ед/мл рФНО в течение I часа при 37°С,несколько раз отмывали центрифугированием и ресуспендировали в питательной среде IMDM с добавлением 1% ЭТС(концентрация клеток - 2 млн/мл).После 24 часов культивирования собирали кондиционированные среды (КС) культур клеток и определяли в них наличие ингибитора по подавлению колониеобра-зования в агаровых культурах костномозговых клеток человека. Колониеобразование стимулировали добавлением в культуры рИЛ-3 .(2,5 нг/мл).Установлено,что после пульсовой обработки рФНО мононуклеары костного мозга человека продуцировали ингибитор кроветворения,в том числе и размороженные после хранения в жидком азоте(в таких культурах не было исходно активированных клеток)(табл.2).Показано,что в данном случае продукция'ингиби-

Таблица 2.Подавление колониеобразования in vitro в присутствии кондиционированной среды культур костномозговых клето

человека,обработанных 200 Ец/мл рФНО*_

№№ Продуцирующие клетки Число КОЕк в присутствии кондициони-

рованной среды и рИЛ-3(2,5нг/мл)

I интактные 52,3 + 2,0

2 обработанные ОМ 51,7 + 1,4

3 обработанные рФНО 38,3 2,2 (36,3 i 1,8)

4 обработанные рФНО и ОМ 51,0 + 0

5 обработанные рФНО,нейтра-

лизованным антителами 50,3 + 1,8

5 обработанные антителами 52,7 + 0,3

контрольный уровень колониеобразования - 53,7 — 0,7 КОЕк на лунку.В скобках показан уровень колониеобразования в аналогичных культурах в присутствии антител против рФНО.Во всех приведенных случаях Рс0.01.

гора была вызвана только воздействием рШО.так как предварительная нейтрализация его антителами-отменяла эту продукцию.Сами антитела в использованных количествах не вызывали продукцию зторичной активности в культурах мононуклеаров костного мозга, 1 также не влияли на колониеобразование в агаровых или метил-целлюлозных культурах.

Результаты этой серии экспериментов позволяют сделать зле,дующие выводы:1)рФН0 мокет влиять на кроветворные предшественники Bs-фазе клеточного цикла; 2)рФН0 может оказывать опосредованное ингибирующее воздействие на пролиферацию кроветвор--ibix предшественников.Эти результаты,несомненно,не отрицают того,что ФНО может воздействовать на данные клетки в других фазах клеточного цикла,что предстоит изучить в будущем.Большой интерес представляет идентификация ингибитора и продуцирующих гго клеток.Установлено,что ФНО способен активировать лракти-iecKH все типы клеток,предположительно формирующих кроветворное микроокружение( B.Torok-storb, 1988). Хотя в наших экс-1ериментах мононуклеары костного мозга человека были предварительно очищены от Т-лимфоцитов и макрофагов,тем не менее нельзя отрицать их в качестве возможных кандидатов на роль продуцирующих клеток,так как хорошо известна сильная гетерогенность этих клеток.Например,недавно описана субпопуляция моноцитов/ макрофагов человека с весьма слабыми адгезивными и фагоцмтиру-ощими свойствами (В,Passlick е.а.,1989). Предстоит детально изучить возможность активации в этом случае и Т-супрессоров (А.В.Санин,1939)'.Выяснение природа вторичного ингибитора также представляется грудной задачей,так как в настоящее время негативная регуляция кроветворения изучена недостаточно(в. Metealf ,1988). Этот ингибитор может и не быть цитокином,так как ранее установлена важная роль кислых изоферритинов в регуляции кроветворения( н.Вгохтеуег е.а. ,1982возможно,будет выявлено сходство медцу опосредованным ингабируюцим эффектом ВДО и аналогичным эффектом штерлейкина-4,способного вызывать лродукцию ингибитора в стромальных клетках(s.Peschel е.а., 1989 )• установлено в наших экспериментах,продуцируемый под воздействием рФНО ингибитор- не является самим ФНО,так как присутствие антител против него в агаровых культурах не отменяло подавление колониеобразования.Можно заключить также,что

клетки продуцируют данный ингибитор в S -фазе цикла.

53

Важно обсудить такке,как соотносятся различные зффек ты ФИО - прямой"ингибирующий,опосредованный стимулирующий и опосредованный ингибирующий ? Можно предположить,что они разделены во времени и в пространстве.Гак,в первое время при акт] вации защитных сил организма(например,острый инфекционный процесс) определяющим мокет быть ингибирующее воздействие(как на костномозговые предшественники - опосредованное,так и на циркулирующие - прямое).Его цель - резко ограничить пролиферацию и,возможно,миграцию этих клеток,тем самым снизить вероятность их повреждения.В последующем■ более существенным может быть стимулирующий эффект - через продукцию К®. Опосредованный эффект подавления,возможно,важен также*с точки зрения негативно] регуляции кроветворения.Косвенно подтверждает это лрецположе-ние динамика продукции ШО и К® в культурах мононуклеаров периферической крови человека (Л.В.Карканица.и др.,1990).Таким образом,с этой точки зрения нет противоречий в объяснении существования нескольких регуляторных воздействий ШО на кроветворную систему,а все его эффекты имеют выраженный защитный характер и соответствуют роли ФНО как воэмо?шого универсального фактора естествешой резистентности организма.

Ранее,используя пульсовую обработку кроветворных предшественников рФНО,Н.Втохзаеуег е.а. (1986) установили,ЧТО в этих условиях рФНО действовал цитотоксически ка КОЕк.Другими авторами,,даже в опытах с предварительной инкубацией костномозговых клеток с рШО(правда,в течение более длительного времени)было показано,что ФНО скорее действует цитостатичас-ки,однако эти результаты можно оспорить(Т.Мигазе е,а, ,1987; а.АЪЬоиа е.а.,1987; К.В*хЪег е.а.,198?; М.МигрЬу е.а., 1988; 1».Хи е.ь.,198а ). В наших экспериментах были сначала подтверждены результаты,полученные н.Вгсишзу-ег в.а. (1986). Однако,после дополнительной обработки клеток оксимочевиной было установлено,что и в этих условиях рФНО действовал цито-статически.Таким образом,в настоящее время нет доказательств цитотоксического влияния ШО на кроветворные предшественники, наоборот.обоснованной представляется концепция цитостатичес-кого механизма воздействия ШНО.Однако,для её окончательного доказательства необходимы исследования в культурах чистых кроветворных предшественников,получение которых пока неосу-ществимо( в.ЮТй, Т.ВезЛег,'1989 >. Учитывая наличие несколь-=

их возможных механизмов воздействия ®0 на кроветворные прэд-¡ественники,допустимо предположить также,что ответ этих клеток а ФНО монет определяться в конкретный момент времени фунгаио-альньтм состоянием кроветворного м1-пфоонружения,в формировании оторого участвуют многие другие стимулы! -I. СГ.ТгеггЫп , 1970). ¡озмояно,имеют место и индивидуальные различия в ответе на воз-ействие ШО.В этом случае предстоит выяснить их роль в.норме при патологии.

Способность ШО вызывать продукцию ингибиторов кормаль-ого кроветворения была изучена такие в культурах костномозго-ых клеток больных острыми лимфобластным и миелабластньгм лейко-ами.Костный тлозг больных забирали в фазе рецидива без учета оличеотв предыдущих ремиссий,клинически" диагноз в каждом слу-ае был подтверждён цитологическим исследованием стернаяьного унктата.Кондиционированные среды клеточных культур получали налогично тому,как это описано выше для-нормальных костчоэ-овнх клеток.Наличие ингибитора определяли по подавлению коло-иеобразования в агаровых культурах костномозговых клеток здо-овых людей в присутствии исследуемых образцов.

Установлено,что в 5 из 7 случаев клетки костного мозга зльных продуцировали ингибитор нормального кроветворения без акого-либо внешнего воздействия.Предварительная пульсовая об-аботка клеток рФНО(200 Ест/мл) опять же в 5 из '? случаев(не-оторые из них не совпали с результатами для необработанных четок) или вызывала продукцию ингибитора,или те усиливала её. зтановлено.что и в этих культурах продукция ингибитора была лззана только воздействием р®НО,а ингибитор не является ШО. 1таресно отметить,что в б из 7 случаев обработка оксимочеви-эй отменяла продукцию ингибитора только посла предварительной /льсовой обработки р®0.

Эти данные свидетельствуют о том, что рФНО способен вызвать продукцию ингибиторов кроветворения в клетках костного ззга леякозннх больных.Таким образом,применение, рФНО 3 т ера-га лейкозов с этой точки зрения может быть неоправданным.Так { избыточная про,нунция ФНО может иметь место при икфекпиях-1с*ых осложнениях лейкозов - предстой? более тщательно изу-«рь роль ФИО и инфекционных заболеваний в патогенезе лейко->в.При подавлении нормального кроветворения преимущество в

>сте могут получить клоны опухолевых клеток,некоторые из них

15

не только не подвержены цитотоксическому воздействию ФНО,но и отвечают на ФНО усилением csoetl пролиферации! лдаЬШо е.а.,

Необходимо изучать также влияние на кроветворную систе комбинированного применения рФНО.и химиотерапии.

2.Влияние рШО на дифференцировку кроветворных предтое вевников человека in vitro Имещиеся данные о влиянии ФНО дифференцировку кроветворных предшественников крайне противоре чивы как в экспериментах in vitra( С.Johnson е.a.,1988;L.Lu е. '¡988;Н.Бэтшпеуех е.а.,Ч9В6) так И in vivo( С.Johnsen ©.а. ,19Е E.Johnson е.а,. ,'i989; K.Hiller с.а. , 1989). Наиболее часто встречается вывод о подавлении in vitro р присутствии Ш0_про-лиферации всех кроветворных предшественников различных ростксв п.Murphy е. а. (198В) установлено,что в малых дозах ФНО вызывал сдвиг дифференпирозки предшественников в сторону миелопос за,точнее макрофагопоэза.Однако,это могло быть и неспецифичеси проявлением,так как подобный сдвиг часто наблюдается при наличии в кроветворных культурах любого ингибитора ( D.ite^cali^M-3 наших опытах было изучено влияние рФНО на колониеобразование в метилпеллголозных культурах костномозговых клеток человека ка? при постоянном присутствии р$Н0,так и после пульсовой обрабогв 'Исследовали предшественники гранулсцитов/макрсфагов(КОЕ-ГМ) ,эри троиитовШОНЫ и смешанных колоний КОЕсм,обшиЧ предшественник гранулоцитов,эритроцитов,мегакариоцитов,макрофагов) .Учитывая не больше количество КОЕсм в ксстном мозге по сравнению с другими предшественниками,в этой серии экспериментов использовали концентрации клеток ICQ тнс/мл.Нами установлено,что при постоянном присутствии рФНО подавляет образование всех типов колоний (рис.2).Менее выраженным эффект подавления был для БОЕэ чем для КОЕ-ГМ.Подавление было обусловлено только воздействием рФНО и отменялось при нейтрализации р5Н0 антителами.Наиболее сильно подавлялось образование смешанных колоний.Полученные результаты дают возможность рассчитать соотношение миелоидных я эритроидных колонии в культурах с различным содержанием рФНО (при таких рассчетах не учитывали число КОЕсм.так как это обаий предшественник для эритропоэза и миелопоэза).Можно видеть,что с увеличением дозы рШО на фоне абсолютного подавления колониеобразования отмечается относительное увеличение доли эритроидньп кэлоний(рис.2).

Б экспериментах с использованием пульсовой обработки

КОЕкШ

30 pi'Гч~Г

60Q 40 20 О

6,25 12,5 25 50 100 200 рФНО,Ед/мл

Рисунок 2.Колониеобразование- КОЕ-ГЙ( д ),Б0Еэ(о ), КОЕсм( = ) - в метилцеллюлозных культурах костномозговых клеток человека при постоянном присутствии рФНО костномозговых клеток рФНО и дополнительной обработки оксимоче-виной были получены аналогичные результаты.Пульсовая обработка клетск рФНО вызывала подавление всех типов колониеобразозания (рис.3).Для БОЕэ и в этом случае эффект подавления был менее выражен. Дополнительная обработка оксимочевиной(после обработки рФНО) также отменяла ингибирующий эффект,после этого не было выявлено селективности для предшественников миелопоэза и эритро-поэза.Это даёт основание предположить, что~некоторая селективность ингибирующего эффекта рФНО для эритроидных и миелоидных предшественников может быть связана с его воздействием на более поздние предшественники,чем БОЕэ и КОЕ-ГМ.И в данной серии экспериментов при увеличении дозы р£Н0 на фоне абсолютного подавления колониеобразования наблюдался сдвиг в сторону эритропоэ-за.Касаясь эффектов рФНО для КОЕсм,можно было бы сделать вывод

КОЕкШ

10%А—L

Р<0.01

6,25 12,5 25 50 100 200 рФН0,Ед/мл

Рисунок З.Колониеобразованке KGB-ГЖ л ),БСЕэ( о ) и

КОЕсм в метилцеялшкззшх культурах костномозговых клеток

человека после пульсовой обработки pSHO и дополнительной

обработки оксгкзчевяной(тёмные сгнгуры)

17*

0 том,что эти"клетки очень сильно подвержены его ингибирующем; воздействию.Однако,для более точных выводов необходимы исслед вакия в культурах Ексскосчжценкых- КОЕсм.так как абсолютное чт ло этих клеток в наших экспериментах было мало.Такие же исследования нужно провести и с другими предшественниками,в том чи( ле с КОЕ-ГМ и БОЕэ .На современном этапе такие эксперименты не-поставимы,так как,несмотря на успехи-в получении высокоочшцен-ных К0Ек,не доказано получение гомогенных клеточных популяций (B.Lord,T.M.Derter, 1989).По данным. К.ВагЪег е.а. (1988)

1 КОЕ-ПМ (7-суточные колонии) содержится среди I 407 клеток костного мозга человека,а I 14-суточная КОЕ-ГМ - среди 574 кле ток.Отсюда видно,что даже 100-кратная очистка по предшествекга-кам исходной клеточной попудяции будет недостаточной.В некоторых работах по изучен™ влияния рШО на колониеобразование в культурах КОЕк была достигнута 10-20 - кратная очистка .например^ экспериментах м.Murphy- е.а.(1988):понятно,что такая степень очистки недостаточна, для точных выводов.'

Таким образом,результаты этой серии экспериментов свидетельствуют о том;что: 1)рФН0 подавляет образование всех исследованных типов колоний в культурах in vitro;2)менее,выражен зффект~падавленшгдля'-прецшественников эритролоэза,чем миелопоэза; 3)некоторая селективность эффектов рФНО может быть связана с различной чувствительностью более поздних предшественников, чем БОЕэ и КОЕ-ГМ.

Наиболее важным вопросом являетея;как соотносятся в данном случае эксперименты in vitro и in vivo .Как уже отмечено выше,результаты исследований влияния <Ш0 на дифференцировку in vitro противоречивы.В некоторых работах установлено сильное подавление рШО эритропоэза(с.Johnson е.а.,1988;R.Johnson е.а.

1989) ,причём отмечена селективность эффекта для ранних (БОЕэ) и поздних(КОЕэ) предшественников.Описана и стимуляция & ■гролоэза,особенно костномозговых БОЕэ,как считают авторы — опосредованно, через стимуляцию продукции эритропоэтина (T.Dlich е.а., 1990 ) .Получены противоречивые результаты о влиянии рФНО на другие кроветворные предшественник^ R.Johnson е.а.. 1989; С.Johnson, е.а.,1988; R.Urbaschek е.а.;1987;К.Miller е.а.,1939; T.Ulich е.а.,1990).

Такая противоречивость объясняется,возможно,сложным воздействием <Ш0 на кроветворение,наличием нескольких эффекто:

Возможная селектит ость монет быть связана не только с инги-бици§й_пролиферации КОЕ,но и с продукцией различных типов КСФ клетками кроветворного- микроокружения под влиянием ФНО.Нельзя отрицать возможности индивидуальных различий,а также завискмос-.ти конечного результата от воэдеястяия других сигналов.Всё это свидетельствует о тем,что влияние ФНО на ди?йерентровку кроветворных предшественников монет сильно различаться,Возможно, такие различия могут быть .затенным в предрасположенности к определённым заболеваниями том числе инфекционным.

З.Ингибирустее воздействие рФНО человека на пролиферацию кроветворных предшественников.выделенных из эмбриональной печени. пуповинной крови новорожденных и периферической крови взрослых людея.Известно,что кроме костного мозга кроветворные пред-нественники можно выделить из других органов и тканей ( D.Met-cali , 1984 ). Присутствие этих клеток в эмбриональной печени, пуповинной крози новорожденных,периферической крови взрослых людей отра^ет сложное формирование и организацию кроветворное системы человека.В последнее время такие "альтернативные" источники широко используются нэ только в научных исследованиях, но и р клинике при пересадках кроветворно" ткани( M.Ratajczak е.а.,1988; S.Saeland е.а.,1989; D.Iiang е.а.,1989 ).

Показано,что костномозговые предшественники кроветворения по некоторым характеристикам отличаются от указайных аналогов,что свидетельстпует о возможных различиях в механизмах регуляции их пролиферации ( S.Emerson e.a.,1989;C.Richman е.а., 1986; Т.НоЪак е.в., 1984 ).

В связи с этим нами было изучено влияние pfflO человека на пролиферацию кроветворных предшественников из указанных органов и тканей.Эксперимента проводили в -агарознх и . метилцеллюлозньтх культурах_при постоянном присутствии рФНО. 3 результате установлено,что рШО подавляет пролиферацию КОЕк во всех указанных случаях.На рисунке 4 приведены результаты экспериментов в агаровых культурах клеток периферической крови взрослых людей1очищенные от Т-лимфоцитов и прилипающих клеток мононуклеары,конечная концентрация- 400 тыс/мл^.Ео всех случаях подавление колониеобразования было обусловлено только воздействием рФНО и отменялось после нейтрализации антителами.

Эти данные,а также подавление, пролиферации костномозговых кроветворных предшественников мыши в присутствии рФНО,

rt

КОЕкШ т

80 60 40 29

6,25 12,5 25 50 100- 200 рФН0,Ед/1

Рисунок 4.Колониеобразование в агаровых культурах нонуклеаров периферической крови человека в присутствии р$Н( и при его нейтрализации антителаш1» ) .Пролиферацию КОЕк cti .игпевали добавлением в культуры 2.5 нг/мл тМ-З человека. дают основание предположить-,что йнгибирущий эффект.этого ме агора кроветворения для предшественников, зозг/ожно,универсал« Такая стабильность свидетельствует о вакной роли ФН0 в регуд ним кроветворения.

4.Влияние ФН0 на определение биологической активное? КС$ методом кожониеобразоваякя.Активность КСЗ> - кроветворных ростовых факторов - оценивается как раз по их способности ст мулировать колониеобразование в культурах краветворньрс пред тественкикзв in vitro .Существующие методики опредлеЫя биологической активности КСФ с использованием фактор-зависимы клеточных линии,хотя и обладают рядом неоспоримых преимущест: не позволяют оценить влияние КСФ на самоподдерясание и диффе-ренцировку кроветворных предшественников ( D.Metoalf,1984). Известно такке,что кондиционированные среды культур клеток человека могут содержать одновременно Ш0 и KCS .действие коте рых на"колониеобразование противоположно.Можно предположить, что в таких случаях шкет вдеть место искажение результатов определения биологической активности К®,что и "было пока -заяо нами ранее дчя кондиционированных сред культур активированных макрофагов человекаСА.В.Панитич и др.,Г938>.Как установлено в нагмх исследованиях,это искажение характерно и при определении КС<5 в кондиционированных средах культур мононук-леаров периферической крови человека!табл.3).* Видно,что поел нейтрализации цитотоксическоя активности ФН0 колониеотимули-•рувшая активность -исследованных образцов была выше.Ранее по-

*Эксперимента проведены совместно с «.!' ^«товскей М.Е.

-20

добное перекрывание активностей было установлено для КСФ и других ингибиторов - иммунного интерферона и-лимфотоксинаг(-М.Ыиг-рлу е.а., 1333). Таким образом, можно заключить, что в подобны? случаях необходимо применять предварительную нейтрализацию ин-гибирующих активностей, например, с помощью антител.

Таблица З.Колониестимулируюдая активность кондиционирован- ных сред культур ШГЖ человека до и после нейтрализации со. державшегося в них ФИО.

№№ Клеточная культура ФНО, Колониестимулируюшая активностг

Еа/мл без антител с антителами

I ЩК нестим.,24 ч 14 3,0 + 0,58 7,7 £ 0,88

; 2 МНШ нестим. ,72 ч 32 10,0 1 0 20,0 ± 0

'3 МНПК-ФГА, 24 ч 18 12,3 2 0,88 22,0 ± 1,5

1 4 Ш1Ш-ФГА, 72 ч 26 19,0 ± 1.0 42,3 ± 4,8

хСами по себе антитела в использованных разведениях не влияли на колониеобразование. Во всех случаях Р<0,С5.

вывода:

1.Рекомбинантный фактор некроза опухолей-^ человека подавляет пролиферацию кроветворных предшественников как при постоянном присутствии в культуре, так и после предварительной пульсовой обработки. Показано, что рФНО оказывает цитостатичес-кое воздействие на эти клетки в б -фазе клеточного цикла.

2. Ингибирующее действие рФНО на пролиферацию кроветворных предшественников может быть опосредованным. Установлено, что р5Н0 способен вызывать продукцию ингибиторов кроветворения в культурах костномозговых клеток здоровых людей и больных острьми лейкозами.

3. Ингибирующее воздействие рШО на пролиферацию кроветворных предшественников, по-зидкмому, универсально и наблюдается при внесении рФНО в агаровые' и метилцеллшозные куль- • •туры клеток, выделенных из эмбриональной печени человека, пу-позиняой крови новорожденных и периферической крови взрослых людей, а также костномозговых клеток мышей. Последнее свидетельствует также об отсутствии'видовой специфичности ингиби-рующего эффекта рФНО человека.

4. При постоянном присутствии-рФНО в культурах костномозговых клеток человека в большей степени подавляется

образование миелоидных колоний, чем эритроидных. Результат • ченные-в-экспериментах- с-пульсовой обработкой клеток рФИО. двтельстзуют о тем, чте возмс?кная селективность икгибируке эффекта ШО может опосредоваться на уровне более дифферени ванных предшественников, чем КОЗ-ГМ и БОЕэ.

. 5. Наличие ШО в кондиционированных средах кдеточн культур, например, макрофагов и мононуклеаров.периферическ ви человека, может искажать результаты количественного- опр ления биологической активности.KOS, а также содержащихся в ных образцах. Это связано с противоположным, ингибирующим ; действием ®0 на колониейбразавание. Для адекватного опред« ния биологической активности в таких случаях необхо.цимс проводить предварительную нейтрализацию активности ФНО.

Список работ, опубликованных по материалам циссертаи

I; Н.Н.Войтенок, М.Е.Комаровская, Л.В.Карканица.С.И.Невмерн А.В.Панютич. Подавление активности колониеетимулирующих факторов, синтезируемых in vitro макрофагами оцновремен фактором некроза опухолей.// Тез..докл.мезедународной конф| рекции "Стволовая кроветворная клетка в норме и при пато. гии". Новосибирск, СССР.-1988.-С.31-32.

2. Л.В.Карканица. Т-Т-гибридомы как модель для изучения гемс поэтических ростовых факторов.// Тез.докл. 1У съезда гемг тологов и трансфузиологов Белоруссии. Минск,1933.-С.50-51

3. Л.В.Карканица, М.Е.Комаровская, А.Л.Йуравков. Ингибируще влияние рекомбинантного фактора некроза опухолей-Х на пролиферацию кроветворных клеток-предшественниц, выделенн из различных тканей.// Тез.докл. 1У съезда гематологов и трансфузиологов Белоруссии. Минск, 1938.-С.51-52.

4. А.В.Панютич. Л.В.Карканица, М.Е.Комаровская, С.й.Невмержи; Н.Н.Войтенок. Применение нейтрализующих антител против фа; тора некроза опухолей для определения; активности колоние-стимулирующих факторов в культурах, содержащих макрофаги./ Гематология и трансфузиология.-1988.-№12.-0.21-25.

5. Л.В.Карканица, А.В.Санин. Опосредованный эффект подавлена фактором некроза опухолей колониеобразавакия in vitro нормальными кроветворными предшественниками.//Тез.докл. 5-го международного симпозиума "Молекулярная биология гемопо

эза. Иннсбрук, Австрия, 1989.*-С.57

■■&.■ Л.В.Карканица.-®0-как- возможный регулятор синтеза колоние-стимулирукицих факторов моконунаеарами периферической крови человека.// Тез.докл. I Всесоюзного съезда иммунологов.СССР. .Дагомыс, 1989.-С.62.

7. Л.В.Карканица, А.В.Санин. Опосредованный эффект подавления рекомбинантным фактором некроза опухолей колониеобразования КОЕ-ГМ, БОЕэ И КОЕсм человека in vitro // Тез. докл. международного симпозиума "Молекулярные факторы гемопоэза". СССР,©Т. I990.-C.I8.

8. Л.В.Карканица, М.Е.Комаровская, С.Й.Кривенко. К вопросу о продукции колониестимулиргуюцих факторов мононуклеарами периферической крови человека.// Иммунология. 1990.-)г4.-С.45-49.

9. Л.В.Карканица, С.Б^Шелег. Фактор некроза опухолей/кахектин как ростовой фактор опухолевых клеток in vitro .// Тез. докл. Всесоюзного симпозиума "Биохимия опухолевой клетки." Минск,1990.-С.I3I-I32.

10. Л.В.Карканица, С.И.Кривенко. Радиозащитное действие фактора некроза опухолей-«£ на кроветворные предшественники эмбриональной печени человека.// Тез.докл. I иммунологического съезда Белоруссии. Минск,1990.-0.70-71.

11. Л.В.Карканица, А.В.Панютич. Штамм гибридных культивируемых клеток мыши MK-I - продуцент гемопоэтического ростового фактора.// Авторское свидетельство М58330 от 15.08.90.Балл.30.

Зак. 33. Т.100. "Бел.ГЕО".