Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:О роли изменений функциональной активности стромальных и гемопоэитических клеток-предшественников в механизме противолучевого действия продигиозана

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ПАТОЛОГИИ II ПАТОФИЗИОЛОГИИ

На правах рукописи ЛЕВИНА Наталья Алекс;шлровпа

О РОЛИ ИЗМЕНЕНИЙ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ СТРОМАЛЬНЫХ И ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ КЛЕТОК-ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ В МЕХАНИЗМЕ ПРОТИВОЛУЧЕВОГО ДЕЙСТВИЯ ПРОДИГИОЗАНА

Ю0Л6 — патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медтцшскпх наук

Москва 1992

Г бУГ" ' росгийег^-

ГС С4/'

Работа выполнена в Институте Биофизики МЗ РФ.

Научный руководитель: Академик РАМИ, профессор Б. Б. МОРОЗ

Официальные о и п о ы о п т ы:

доктор медицинских наук, профессор В. А. ЕВСЕЕВ,

доктор медицинских наук В. И. МАЛЬЦЕВ

Ведущее учреждение — Российский медицинский университет. '

Защита диссертации состоится «»^'^/^^..^О.:}... 199 3г.

с ../£.... ч на заседании Специализированного совета Д 001.03.01 при Научно-исследовательском институте общей патологии и патофизиологии Российской АМН (125315, Москва, ул. Балтийская, 8).

Автореферат разослан <.»993года.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат медицинских наук

Л. Н. СКУРАТОВСКАЯ

ОЩАЯ ХАРАКТЕРНОТИКА РАБОТЫ

' Актуальность проблемы. Знание механизмов радиозащитного действия различных веществ необходимо дая успешного поиска эффективных и приемлемых дая человека противолучевых средств и внедрения их в медицинскую практику. Поэтому исследования, посвященные раскрытию механизма радиозавдтеного эф'екта приобретают особую актуальность,

В механизме действия протекторов о биологиноским механизмом действия (дашополлсахарида, гормоны, интерферош и др.)' существенным моментом является то, что радиационное воздействие приходится на гемопоэт.пескую систему, выведенную из обычного режима функционирования (А.Г.Конопляншков, 1984). Это приводит к тому, что многие стандартные реакции кроветворно.'! спсте.гдг на воздействие ¡шшзлруюдец радиации ;.ш.цаТ.адируатсл вследствие изменения величины пула отзолових клеток, мшаники их пролиферации, направлений диф^еренцирошш, интенсивности циркуляции я эффективности ропопул шда .опустошенных участков ( G.Eiio^uloa , 1979, А.Г.Ко-ношшнняков, 1984),

В наотоящее вромл общепризнано, что основную роль в регуляция пролиферации и даМеренвдрогкн стволовых кроветворных клеток играет стромальное кроветворное макроокружепие и выделяемые им близкодействующие гуморальные Jai:торы { j.Trontia , 1978, И.Л.Чертков, Л.Я.Фриденштейн, £977).. В последние года ряд исследователей отводит ванную роль микроокружению в пострадиационном восстановлении таюпоэза (ь.ь,аолаетеk , 1988, Г.П.Груздев, 1988). G другой оторокы, показано, что один из аспектов гемопоэзстимулирующе-го действия продагиозала и цистамина связан с активацией элементов кроветворноЛ строщ'(О.О.Гоматсо, Б.Б.Мороя, В.Г.Лебедев, 1589, 1990). Однако, не ясно, на какие элементы кроветворного шкроокруженяя могут оказывать влияние эти препараты. Известно, что бактериальный полисахарид продигиозан является мощным стимулятором манрофагальнои системы (Н,;,!.Фурер, 1966) и обладает профилактическим л лечебным эффектом при костномозговой форме острой лучевой болезни (З.В.Йриольеза, Г.Е.Вайсбарг, 1974, К.С.Чер- . тков, 1969). Он интенсифицирует процессы пострадиационного восстановления кроветворения. Однако, кет комплексных данных о динамике восстановления регенераторной способности элементов кроветворно-то мякроокрунейяя, а такжэ гранулоцигарно-макрофагальных предшественников в период посглучевого восстановления гемопоэза в уело-

виях применения продигиозана. Не наследовано радиозащигное действие продигиозана в лтательных культурах костного мозга. Все ати неизученные вопросы стали поводом для проведения зтой работы. Перспективность этого направления подкрепляется также существенным прогрессом в изучение проблемы гуморальных регуллторов кроветворения, а также данными о рациозащитном действии янтерлейки-на-1, интерлейкина-З и Фактора некроза опумолел, которые выделяются и элементами кроветворного шп;ро окружения ( ы.не*а, 1986).

Цель и за чачи исследования. Целью настоящей .работы стало исследование роли кроветворного микроокруненяя в формировании радиорезиотентного состояния под'действием продигиозана, а также изучение'значимости изменений функциональной активности ранних предшественников стромальяого микроокрукения и гемопоэтических клеток-предгаеотвенников в процессах пострадиационного восстановления кроветворения в условиях защиты продигиозаном.

Лля осуществления это!'! цели были поставлены следующие задачи: • • • •

1. Оценить изменения Функциональной активности стромалышх.клеток-предшественников (Кроветворное микроокрухеиие переносящих единиц /ЮТЕ/) и гемопоэтических предшественников (КОЕс и КОЕ-ГМ) под действием продигяозала у янтахтных гзшвотяых в период проявления оптимального радиозащитного эффекта, а также изменения активности колоннестимулирующих факторов (КСЙ),

2. Изучить восстановлениё регенераторной способности КЩЕ, а также динамику восстановления ранних кроветворных клеток-предшественников после облучения в условиях предварительного введения продигиозана.

3. Провести сравнительное изучение действия продигиозана и цяс-тамяна на функциональную активность кроветворного микроокружения до и после воздействия радиации; 1

4. Исследовать влияние продигиозана на кроветворное.' клеткп-пред-шественнлки, пострадиационное восстановление гемопоэза и динамику выделения КС® стромалышм подслоем в длительной культуре костного мозга.

Научная новизна работы, В работе впервые показано, что под .действием продигиозана происходит изменение фона, на который приходится радиационное воздействие: снижение содержания ранних ге-

мопоэтических предшественников и усиление функциональной активности стромалышх предаествешщков (КШЕ) в костном ыозге, а танке повышение количества грануло'вдтарно-макроТагал^ных прещцест-генников в селезенке, причем количественные изменения гемопоэти-ческих предшественников опосредуются через выделение 1С01'. Ироди-гиозан защищает не только значителснуд часть гемолоотических предшественников, но и стромальных предшественников от поражающего действия радиации,- а также ускоряет их пострадиационное восста-новленне, пргг-юм восстановление регенераторной способности ШИЗ предшествует возрастанию уровня КОЕо и КОЕ-П.1. Впервые показана возможность проявления радаозаищтного эффекта продигиозана в длительной культуре костного мозга, в значительной мере связанная с повышением содержания в культурал ноЛ среде КОЕо и КОИ-ГЫ к моменту облучения.

Теоретическая и практическая значимость работы заключается в расг.ш'1ровке одного из аспектов механизма действия эффективного противолучевого средства продигиозана, связанного с активацией стромального микроокруления.

Эта материалы позволяют предтожить, что поиск и применение средств, способных в системе профилактических я лечебных мероприятий активировать строну, может оказаться перспективным для увеличения скорости восстановления костного мозга после облучения.

Положения, вынооимые на защиту; I. Формирование радиорезяс-тенгного состояния кроветворной сиотемы под действием продигиозана сопровождается погашением функциональной активнооти клеток стромального микроокруиения, увеличением колониесяшулирующей активности енворотки крови, усилением проли^еративной активности КОЕо, изменением количества КОЕо и КОЕ-ГМ в костном мозге и селезенке.

2. В условиях защиты продигиозаном наблюдается мзныиая степень поражения стромальных и гемопоэмческих предшественников и ускоренное их'восстановление после облучения.

3, Защитное противолучевое действие продигиозана на клеточном уровне в длительных культурах костного мозга сопровождается активацией микроокругкенля и выделением К0$.

Объем и отруктупа диссертации. Общий объеи цяопегтчцпи составляет ЦП страницы машинописного текста, •Т-акгстсюгс аншше

иллюстрированы 6 рисунками и сведены в 14 таблиц.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы, поовящениой изложению материалов и методов исследования, трех глав, содержащих материалы собственных доследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка цитированной литературы. Список литературы включает 215 источников, из них 161 иностранных.

ШТШАЛ И МЕТОД!] ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на 2 тыс« чистопородных мышей-гибридов (СВА х С57В1)Р , самцах, масоо-> 20-24 г.

ПродягиозЛпн вводила внутрябршинно в радиозащитной дозе 3 мг/кг, дисташш - в дозе 150 мг/кг веса. функциональную активность КЭДШ в костном мозге определяли .через 24 и 48 часов после введения продагиозана и цястшияна (через 15 минут а 24 ч.) методом гетеротопной трансплантации костного мозга под капсулу почка 04,Хауа**о1Л , -1974). Величи ¡у образующегося гегеротопиого очага оценивали через 6 нед. после трансплантация по его клеточности, содержанию зз нем КОЕо и массе костной капсулы. Через 24 часа поо-ле введения продагиозана оценивали содержание КОЕо методом экзогенного клонирования (Г.Я1И , Е.ИрСиПось, 1961) я уровень КОЕ-ГМ в агаровых культурах по методу Т.ВгайХеу , В.ЫеЪеааг (1966) в костном мозге бедренной кости и селезенке. Уровень КС£ в сыворотке крови определяли в теоте оценки КОЗ-ГМ, измеряя его по числу колоний, образующихся из 10® клеток яитакгного костного мозга . при добавлении стандартного КСФ'или плазмы крови шшой, взятой через 3, 24 и 48 часов после введения продагиозана ( ,

о.хддосыгх , 1988). Через 24 л 48 часов после введения продагиозана е костном мозге и селезенке оценивали пролпдератпвный статус КОКс методом инкубации с ояоимочевнной (И.Л.71ортков, О.Л.ГУревич, 1984).

Животных через 24 часа после введения продагиозана я черзз 15 мин после введения циотампна подвергали 2 -облучению ^Св на установке ИГУР в дозе 6 Гр при мощности дозы 1,С5 Гр/шн. Че- , рез I, 7 л 9 сут после воздействия радиация в опытных и.контрольной группе определяли функциональную активность КПЗ в костной мозге. Количество КОЕс и КОЗ-Ш в костном мозге оценивала на I, 3, 7, 14, 21 и 30-е оуг у только облученных и у защплеюшх про-дигиозаном мышей. • :

. Длительныз культури костного мозга декстсровского типа веля обичным способом. Через 3 пзделя ведения культуры, когда образовывался нормально фузипу-ошрущий подслой, снимали воз срзду и заменяли на свежу,о, содержащую 10^ клеток сингенного костного мозга. В часть культур вносил;] продаглозан к конечной .чонцонтра-цаи 0,5 !.®г/нл. Культуры облучали в дозе 2 Гр нарез ¡34 часа поело подсадки костного мозга и внесения продагиозана. До облучения и через I час, I я 3 оут поело Еозделотвля радиация ^ части срсдц со взпесыз клеток, и через 7, 14, 21 и 2(3 сут при смена полоашш среда олределлла в культурах количество КОЕс 'л пОЕ-П.5, а татскз уровень Х02.

Статистический анализ результатов проведан с помогаю критерия Стьэдеита. Достоверные считали различия при вероятности возможной ошибки (р) меньшей или равной 5$.

■ ЕСЗУ.ЪТТШ 1Г0ЖД>ВЛ1И.'1 И ИХ ОБСУЖтШ

Дал изучения влияния продагиозана и одотамина на функциональную активность кроветворного микроокру;;;е1Шя пердарати вводили в рада!озавдткой дозе интактным :ишотншз. Через 24 и 13 часов после введения продпгиозана и через 24 часа и 15 мин поело введения цисгамина костшш мозг допоров пересаживали под копаулу потаи ин-такгннх реципиентов» Костный м^зг доноров, кото:.и:< до трааоплан-тагдяи вводили про,пигяозанвеличина которого ...••згоаз.мо иревша-ла таковуа у интактных ¡тавотных. Так, отые;ечо увеличение

. оодеряание КОЕо в очаге по сравнению о контра-ил? (./ис. I), а также тенденция к некоторому увеличений меточное,;; очагов. Масса костной капсулы пе отличалась от контроля. Тач:::,* обрчяом, продигяозан стимулировал стромальные клегки-предооот*!';!: .пел, щитом воздействие его на микроокрумекие проявлялось каг: ^з за то время (24 и 48 ч), за которое введение препарата да оотучения обеспечивает его затягный оффекг. Шсгамин не выз.чс;:л ш-тг^апии элементов, переносящих кроветворное шкроокружение, л« тт¿иг введении за 24 часа, йп за 15 мин до трансплантация. " -

Параллельно о исследованием 'функционального состояния КМШ5 под действием продагиозана издали колнчестяпчные изменения кроветворных предшественников (КОЕо а КОЕ-ГМ) п костном мозге и селезенке мшей -через 24 часа после введения продагиозана. Било установлено, что через 24 часа пооле инъекния янтакгтш мншам

радиозащитной дозы продигиоаана в костном мозге бедренной кости доотовирно снижалось количество мивлокариоцитов до &Л% и содержание КОЕо и КОЕ-ГМ до 68 и 69$ от походного уровня (табл. I). В те же ороки в селезенке отмечалось уяеншешае количества КОЕо, г содержание КОБ-ГМ резко возраотало (до 245/5 от нормального уровня).

Изучение влияния лродигиозана на пролитератнвный потенциал иОЕс покапало, что через 24 часа после воздействия повышалось число КОЕо в а-фазе клеточного цикла в селезенке почтя вдвое и через 48 чаоов увеличивалось чиоло КОЕо в а -фазе в костном мозге в 2 раза (табл. 2), Через 48 часов индеко пролдТеращш КОЕо в селезенкр несколько снижается, хотя оотаетоя выпо, чем в контроле на ГСЙ (табл. 2),

*

Г5$

15052

года

9$.

Ингактный контроль

П за 24ч П за 48ч Ц за 15мщ Ц за 24ч

Гио. I Изменение функциональной активности КШГ под действием продагяозана /Д/ и циоташша /V по показателю клегочносги очагов.

Таблица I

Изменение содержания КОЕо и КОЕ-ГМ в костном мозге и оелезонке мышей через 24 часа после ваецегая продигиозана

! Костный мозг бедренной. | Селезенка ! кпетм .

Показатели

Контроль Шродигиозан

Контроль Шродиг;юзан

0бщая6клеточнооть 19>1+1 3(24) к,4+0,^24) 18Г,8+23,5 Г71.4+16, ~ (24) (247

+145 2965+ГЭ

иг. «41-и. ^ хо д.. о-ю.^. а мгл,,-*

Содержание КОЕо 6570+115 4453+111* 4091+145 2965+137' Содержание КОЕ-ГМ Г8Щ^1256 519+104(24) 1348+243*24)

Примечание? в скобках - число, яивотяих; достоверно при

Таблица 2

Изменение оодер,хашш КОЕс О') в фазе синтеза ДЖ в

костном мозге (к/м) и селезенке (о) под действием продигиозана

Число КОЕс

!Штактшй !контроль

! Через 24 п ¡после введения

Через 48 ч поело введения

КОЕс в

к/м

КОСТНОМ „/,,,ПД1

ШК/M+UJ

£

13,8+1,3(30) 11,4+1,0(29) 17

20,3+1,6(24) 16,1+1,5(28)

21

19,9+1,7(23) 12,9+1,0(27)* 35

КОЕс в сел селезен- сел+ОМ не (сел) %

4,6+0,6(29) 3,7+0,3(29)

. 20

6,1+0,5(27) 3,8+0,3(29)*

за

9,3^0,9(28) 6,rJo,7(:i8)* 30

Примечание: в скобках - 'число животных т- достоверно при р<0,05

Всем вышеуказанным изменениям предшествовало повышение уровня КС® в сыворотке крови под действием продигиозана. Уже через 3 ч. после введения лродигиоааа вызывал существенное увеличение количества' К05 в плазме крови(табл. 3), которое достигало 82% значения стандартного KOi\ ^ерез 24 часа уровень К05 в сыворотке крови начинал снижаться и нормализовался через 48 чаоов после введения продагиоэаяа.

! . - . Таблица 3

Уровень KCl» в сыворотке крови мышей пооле введения продигиозана (Л)

---------- —. ■-------------р----

Экспериментальные группы |Уровень К© (колош1й/10ллет.)|Процент

83,3 + 5,3 (7) 13,3 + 1,7.(7)

I0q£ W

Стандартный К05 Плазма интвктшпе мышей Через Зч после введения

продигиозана 68,0 + 7,3Т(7)

Через 24 ч ,,22,7+4,7*(7)

Через 48 ч • ' • 14,0 + 2,4 (7)

Примечание: в скобках - число животных достоверно при р<0,05

Таким образом, формирование радаорезястентного состояния кроветворной системы под действием продигиозана сопровождается

27$ 17%

- ю - . ...______

повышением функциональной активнооти клеток стромального мнкроок- \ рукения (К'уПЕ), увеличением колониес'тшулирующей активнооти снво-ротки крови усилением пролиферативной активности КОЕо и изменением количества КОЕо и КОЕ-ГМ в костном мозге и оелезекке.

3 опытах с облучением в дозе 6 Гр изучали особенности восстановления гемопоэтдческях и стромальных клеток-предшественников з условиях защиты продигиозаном, Через I сут после облучения отмечалось резкое уменьшение показателей, характеризующих уровень . ) кроветворных клегок-предаеогвенников в защищенной продигиозаном | и контрольной группе. У мышей, которым за 24 часа до облучения ! вводили продигиозан, снижение КОЕо и КОЕ-ГМ было выражено в мекь-шей степени (табл. 4). Начиная с 3-х сут и до 21-х сут количество ! КОЕс, КОЕ-П.1 н миелонариоцитов достоверно превшало контрольные > значения. У мшзей в условиях защиты продигиозаном количество ыие-локариоцнтов достигало значений иптакгного контроля ухе к 14-м сут после облучения, уровень гранулодатарно-макро'Ха^альных клеток-предаественникоЕ достигал нормального значения к .21-м сут, а содержание л'ОВо восстанавливалось к 30-м оут после воздейотвия радиации. В облученном контроле полное восстановлен]« числа шело-каряоцатов наблюдалось только к 21-м сут, а количество КО.Ес д КОЕ-Ш не достигало исходных величин и к 30-м сут после воздействия.(

Таким образом, в условиях предварительного введения цродигяо-зана отмечался выраженный эффект залиты этого препарата не только в отношеш)е КОЕо, но и в отношение гранулоцигарно-макрофагальных предшественников, вследствие чего пострадиационное восстановление гемоноэтдческях предшественников происходило бодео интенсивно, причем различия в уровнях маелокарпоцитов, КОВ—ГТЛ и КОЕс в защищенной и контрольной группах сохранялись до 14-х, 2Г-х и 30-х сут, соответственно.

Восстановление строыалышх,клеток-предаестеошшков КШЕ после-облучения в дозе 6 Гр после досади в условиях'защиты продагао- , заном и циоташком в сравнительных экспериментах, Б;яо показано, что облучение вызывало поражение Ш.51Е во всех группах: контрольной, закцшенчой продиглозаном и группе, защищенной цаетампном . (табл. 5), однако, в двух последних группах поражение сгромаль- . ных предшественников было выраяено в меньшей степени. Так, уро-вонь ОП через Г сут после облучения в контрольной облученной ; • группе снижался до 30* от иктакгного контроля (по показатели кле-точности очагов), тогда как в заэдщонлых продигиозаном л циста-

Таблица 4

Пострагиацпонное восстановление КОЕс и КСЕ-ГЦ в костноы мозге мьтей в условиях предварительного введения продагиозана

Бремя: после

о'блученяя

(сут)

|______;_______Чдслр_клеток ка_бздро________'____

|__Облучение 6 Гр _|_Продигя оз ан + облучение

Iклеток х10С1 К03-та хГО2 Г К02с х 10

оэ х

КОВ-Ш х10г ! КОЗс хЮ

А и

1-е 3-е 7-3 14-й

21-е .

30-е

Лчтахтныд контроль

2,3+0,4(10) 1,20+0,04(9) 0,32+0,04(10) 3,0+0,5(10) 2,7+0,1(7)+ 0,90+0,15(10)*-2.8+0.3(10) 1,7+0,1(7) 4,4+0,6(10) 4,4+0,5(10)* 6,8+1,3(10)+ 19,9+1,1(10)*

7,6+:, 7(10) 7,4+0,6(10)* 34,8+3,1(7)+ 59,1+3,6(10)*

3,5+0,3(10) 8,4+0,6(7) 9,6+1,8(10) 57,3+5,1(7)

16,0+2,3(10) 155,5+9,3(7)

17,5+1,8(10) 122,4+5,6(7)

19,1^1,3 135,3+12,6

105,6+10.6 "(16) 137,2+27,2 "(1б)

374,7+62,8 479,1+13,1

16,2+1,8ЦО]Р 124,0_5,8(7)* 341,5+17,б(10? 17,8+:,3(10) 223,2+13,2(7^295,5+^3,1(10)* 13,0+1,1(10) 143,2+13,9(7) 631,2+31,1(8)*

Примечание: »^-достоверно по сравнена» с ой?учевкк« контролем, р -¿-0,05 -в скобках - число зааоткых

" h

н S

о «— о

К P <я

о о

о и

от Я

г; «

0J

Й р*

о

о

CD

Я О

К M

о

о К

$ СО

о (Й

Ol В

ш р*

$ о

$

<5

M

Sí

ñ я Р. В

g £ о П

£ й ----—

Ф -&

§а

«J -

a jl-lt», (§о2

M

со о м о" w м*

со to о

,<£>, f, СЛ.

J-l +1 +1 NCO о Ю !>

«tf ¡S со

Г-1 ^

со Р W ю to

ш

ai a>

&

гз о

<Ц

tí 4- Ю. о

to а

га + ф и о а п

f4

а

О)

W

s

С-"

s

k

С) I

a о

I—( . » И СЭ. О. -

W О N » » »

о 14 M

% ■* -

Ю 00 О

in со. о-

А» АКР

ю <т> СО CD СО О

tÄ VI

in со st!

СГ5 tí)

О О

О) « H

•—^ 1—-

ю to

ci м о* Ä'oljct'

C4J Ю ^

(U

Ü)

о

о fî1^

СО W сЗ

» to § §

<U и

и

Х> Pi О (-4

? о

п

с5 (-> о

é --1.

I I I 1

СО СО M ( 4P .

о. ci о. i о.

+1 + I + I . +

СО Cv СО I M

омы t с\Г

* '

СО M N СО СО

о о со СО CV <м

V!. te frío О О

О 1Л M *

л ^

о; a о,

W N и CVJ to ся

ООО

ct'4'á' со <м ю

. й) s

<и о

^ s & + ё

СО ж со

ai ' со я О U¡ 5» О Рч

I

I «

, Й -ю

I M

I,

■ I 1

'S & К

t; о о

ХЗ Р. я О tt rf

1 ( i. I I

' V

I o>

о

I p.

^

-I к о I «

' I «

a

M ' §

(U

к «

CV) « о

V__• СЗ f-l

СО га

■ а w

о о

+ о

CD ■ .« о

» ч

ю 1 ó о

. я ¡3

Й) 1

• Pi

о

Ei «

О си

О

1 о

о

» «

а

я.

мином группах- только до. 70 ог нормы и 73%, соответственно. ¡lo показателю содержания КОЕо в очаге регенеративная способность КШБ в группах, защищенных продагяозаном а циотояйнои, была BKcie i чем в контроле, на первые сутки поело облучения. По мао. се костной капсулы никаких достоверных отличий ыо:,щу опйтнш/.и и контрольной группами выявлено не .было ни на 1-е, ни на 7-е ш: на 9-е сутки после, облучения,' ' • '

Пострадиационной восстановление 1СШ в заэддаиноЛ продигао-эаном группе происходило интенсивнее, чем в копт-юле. Ухе :: 7-м сут численность КОЕо в гегерогопних очагах достигала 93,* нормального значения, а в контрольной облученной группе •дют Л4%, 3 груп-' пе с-предварительным введением цистамяна к 9-м сут значения клбточио-оти и содержания'КОЕо в очаге дазе немного лревыпалн контрольные значения и составляли S¿0 + 0,9 х Ю5 и 1285 + О:', соответствий * но, при 5,6 + 0,3 х 10® и 1512 + 84 в интактном необлученном кон- ' троле.

Таким образом, продягиозан интенсифицировал восстановление стромальных предиесувенников после получения, причем различия , ■ сохранялись до 7-х сут, Щоташа в *акой ке степени, как и про- ' • дигиозан защищай стволовый клетки огромы от порагкащего действия ' • радиации и также обладал эЬ'ектом ускорять восатаповлсг'ше X5IS.

Серия экспериментов in vivo показала, что лродлгиозан, введенный в организм экспериментальны-; животных, оказыпает активирующее влияние на строку селезенки н костного мозга, а таклее вызывает существенные изменен;; ч содержания гемогсоэмческях пред-шеедзэшшков к моменту облучения* . Активация отрога, по-видимому, мояет сопровождаться выделением ростово-до'ИеренцироЕочных факторов, которые начинают действовать на клетки-предшественники. Чтобы проверить это продполояеяле, а токяса исключить какие-либо, организмепше влияния проведены эксперименты в системе длительного культивирования костного мозга, где функции подпер •■иваюцей огромы выполняет слой прилипающих -клеток. Штод длительного куль-тивяр'ор;:;шя также дает возможность проводить комплексную оценку пострадиационного восстановления. КОЕо и КОЕ-ГМ и изучать динамику выделения КС* стромалышм подслоен'в условиях применения продагиозана, .'.•'■ В 3-недельяых декстерогскях культурах через 24 ч после введения продагиозана отмечалось увеличение количества КОЕо во взвеси ло сравнению с пнгахтннмя культурами ii число КОЕо на матрао составило 474,0 ¿ 22,5 я 357,0 ¿ 17,Г, соответственно. 11аблица-

лось такяе возрастание под влиянием продигиозанч содержание КОЕ-. Г'.! в куль туоалыюй среде. Количество КОЕ-ГМ в опытных и интактных культурах Д" облучения ооствблчло 283? + 192 и 2240 +126, соответственно. /ровгпь ХО^ ччрез 24 ч пооле добавления продигиозана такзз существенно повышался и колониестимулирувщая активность, в&Х®чт®«* кола честном КОЗ-ГЫ на 10° клеток аятактяого костного мозга, для падосадков из культуры поело введения продигиозана а из интактных культур составляла 45,6 + 3,6 и 24,0 + 1,3, соответственно.

Так;!:.: образом., к моменту облучения в культурах коотного мозга поа влипшей продт'Н'шиа увеличивались количество КОЬ'с н КОВ-Г.' в .сульгурал .по!; среде, причем возрастание оодеряания грануло-1'Д!таряо-.*:акро1;ага1ькых предшественников в этот временной интервал обуславливалось выделением значительного.количества К04>.

После облучения костномозговых культур в дозе 2 Гр уже через; I ч наблюдалось значительное уменьшение ковмсстйЬ рвигаис гемоц^тиче-ских клеток-предаеотвеьняков (ряо. 2 и 3). Содержание КОЕс з контрольных облучзшаяс кул..турах составляло 63,5 + 5,2, .в то Ерем:-: как л опытных культурах и/а предварительном введении ' продпгИ'Ъапа уровень КОЕс составлял 145,8 ± 13,4, Число КОЗс в меоблу/гнаых культурах было 370,0 + :Л,0. Сникенде количества Х0Б-П.1 через I ч после облучения в защищенных лродагиозаноы культурах. Число К0В-П.1 в контрольно« облучено;*!, задает ¡ой прода-" гаозаяом "л актактной ку;.ьтурах составляло 405 + 41, 2075 + 138 и 2280 + 152, соответственно.

Ур'овень КС'£ в культурах через 1 ч после облучения бил резко повышен, причем в оавдцешмх продигиозаиом культурах наблюдалась меньвое выделение КО!» (рпо. 4), , ,

После первоначального снижения количества КОЕо и КОЕ—ПЛ пооле облучения, начиная с 3-х оут после воздействие 1-вдации наблюдалось постепенное Еооотановление исследуемых показателе.!. До 14-х сут в -ку ьтурах о предварительным введением продигиозана восота-ноЕлэняе проходило на более высоком уровне, Полного воесгановле-няя количества КОЕо к 28-м сут доотзгнуго не было ни в контроль-' ной облученной, ни в опытной группе, Максимальное содержание КОЕо в контрольных облученных культурах составляло 612.от исходного на 14-е сут после облучения, в то время как уровень КОЕ-ГМ к 21-м • сут Составлял 10® от интактнего. Количество ядросодер-каишх клеток в длительных культурах восстанавливалось полностью и к 28-м оут

Pao. 2 Изменение числа ХОТЗс н длитзлышх культупах костного мозга кшяей посла введения проднгнозана я облучения.

По оси абсцисс - время до и после облучения (ч л сут) •

По оси орда на г - число Х02с на матрас, Т> к интяктлнм культурам

I - облучение в доза 2 Гр

2- облучеме о предварительным введением продигиозапа (0,5 мкг/мл) за 24 ч до воздействия радиации

составляло 128 + 14 я 114 + 16,1 в контрольных'облученных я aavar-иенньгс культурах, соответственно, по сравнению с интантннми культурами.

Содержание ХС1> в хоотнонояговых культурах в точэнце I-7-x сут находилось на онлтеннах уровнях. 3 заметенных' культурах выделе nie бкло достоверно Hn.'te,; чем при одном обучении. Затем • к 14-м сут огпе далось вторая волна подъема уровня KCl' л в конг-ролыгах облучеммх культурах содер -stnse КС5 достигало 350,0 + . 34,51, 'а в зазщщечпнх культурах IG0.0 + 14,0П. В дальнейшем, на 21-23-е сут поело воздеЛстзтя радиации лде защищенных культур отмечалась постен эк .чая нормализация уровня Köl>, а для культур, подвергнутых одному облученитэ, наблвдаллсь колебания выделения KCl' - снижение до 03,0 £ 7,4' ;;я 21-е сут и возрастание до 137,Сь

12,1% на 28-е сут. к

га <и т к

. I ° 1 а

Й ^

4 ч

О о о, о с*

28оут

Рис. 3 Изменен :е числа КОЕ-ГМ в дательных культурах костного мозга мшей.

По оси ординат -- число КСь-Ш на матрас, % к интактным культурам.

Остальные обозначения как на рис. 2.

Таким образом, введение продагиоаана в дателышо культуры костного мозга мшей приводило к увеличению качества гемопоэти-чеслих клеток-прздаестьешшков КОБо и К013-Ш в.культуральной среде и возрастанию концентрации К05 к моменту облучения. После обручения отмечалось более высокое содержание КОЕо и КОа-Ш в защищенный культурах и-более умереплое выделенае по сравнению.; с Ьблучея.шм контролема-также более-быстрая нормализация.уров- ■ ня К».' : .:•..'. ' : ' \ V ' ■

В целом, полученный.экспериментальный материал овядетельст- ; иует о том, что вод действием продатиозаиа происходит изменение <рона, на который приходится радиационное гоздейсгвие: происходит повышение функциональной активности 1С.Ш, увол;г;баде колонд.ести-.

мулирушюй активности сыворотки крови, усиление нролл{е;>:!т:!гно.'1 активности КОЕо, изменение количества КОЛс и лОП-П,! в иоеггго?.:

Рио. 4 Концентрация. КОГ> в суцепкаганте из длительных культур костного мозга мшаей после впедапия продмг.чозана и облучения :

По оси ординат - уровень КО> в культурах, % к интактнил культурам» Оотадыше обозначения, как на рас. 2.

Широкий спектр исследований'механизмов действия радиопротекторов различных классов позволил выявить- ряд ведущих реакция в форгаров ;шп радпорезястбнтного состояния: кислородный э-^ект, • влияние на тслеточпиП цикл, стимулирующее действие, на систолу ко-' . понуклеаряах фагоцитов и. др. (В.Г.Владимироа и др., 1939>. В последнее время появляются'данные, указыБающие на то, что радиоза-щитноо действие ряда противолучевых средств опосредуется а чегез

- rs -

cacto:?? Гфоьотгсрпого пн:-:роскру ( tt»íl«e»*cher, Ы.Вгоп», 153'.', ¡-.".Уо:.:а.::у>, F.E. ..'.ороз, 2.Г.Лебедев, 1989), ,

Результаты оаигсв по пзу^ш») •Тунк.'Щоналлого сосго.-лая КШВ .-пряно '/кгжьпт i¡c у ¡астас 'строма-аного кроветворного микромеру- ". яонкд в * c:tfr,;-omn«íi раднорсзистоптпого состояния, 1ушсцаопальная акпппость .CU™ возрастает через 'М и 48 ч после 'в-одл'ал продв-г:!0'.!она на .,:С сооггетсгйо-.по, .'l\:eimo за oía орокм введение

upp.'vu-iur.ü ta 'до облучения обеспечивает его заистшЗ э1>~ект,

О зно^постп йкт плашнтов отрош в рса.'шз;,j;:í:i меха— iui3r.sc лч..сгс-ir. эндотоксина говорлт окол-.,р:шелты на мышах о дефект-ннм сгромр.г.-нпи и^роокрученпеа (мутация Ы.' ). Противолучевая о" екгзвьость эи-деочсниз у :.¡in;oíi это-i лиши отсутствует ала зка-чптел-.но c:-::¡/зетсп ( й.ЛьешмЬег, М.Вгвак , 193?).

х-рол'лю, интегральна.. результат шгтпз^Щ! ¡ кроветворного-м:и:раа;<^у'о:пл под гллишй:-, ародагноааиа 'яр-зд/оматринает включена с ра:>л:1 жх кл-лочних популяций кроветворно": строци. Например, mitpolsvz как со-птаснзя часть гсиояоотнчосгого млкроокрумшм иачяпат генерировать ряд m.i.yiioperyxipy»"íiíc коле -ул# включая (фактор некроза опухолей я антердеЛюш-Г (J.Grocpia&a et el.

), которые в свой очередь, обладшэх раадозегитнш эффектом (м.Ьеъь , X9Í36, ICS9). Аг«ти нация макрофагов под делотчём яродлтч:озона, по-едшому, долгага саировахдаться и. впделешем ростовых Такторэв. Это предпач». ;еняи подтсер^дается повышением .уровня Г:.1-К(№ уча через 3 ч послс введения прс'дигиозана,

Установлено, 4jo через 24 ч после введон.щ радиозащитной дозы продагнозала общее число КОЕо п миелокариоцитов в костном мозге и селезенке достоверно снижалось. Сняжение количества КОЕо к моменту облучения мо::ет бить связано как о действием лродагио- • ) зана на дхМереицировку птах меток, так я с миграцией их в периферическую кровь. Повышение оодер:гайля КОЕ-ГГ»-! в селезенке в те ж сроки (через 24 ч пооле введения продигиозана), по -видимому, свидетельствует о том, что продиглозан стимулирует да Мерен-цировку КОЕо в направление грануло;итопоэза. Это мояег быть связано как с его прямым действием на КОЕо, так и опосредованным через элементы кроветворного мпкдоокружения, Мо:хио предположить-, что выделение значительных количеств XOi секреторными клеткамя микроокружения уке через 3 ч после введения просшгиозяна обеспе- '1 чивадт повыиеняе уровня КОЕ-ГМ к моменту облучения.

В тот хе срок (через 24 ч пооле введения) продагиозан уве-

личивал в селезенке процент КОКс, находящихся в фазе'синтеза ДНК. Известно, что это наиболее радиорезистентная Лаза клеточного цикла (А.Г.Коноплянников, 1984). Повышенное содержание КГЕс в более резистентной фазе клеточного цикла вс время облучения, по-вндикому, также вносит определенная вклад в формирование радиорезистентного состояния под действием продигиозана.

Тают образом, повышение ^ункпяонэльноК активности К^ПК под действием,продигиозана сопровождалось количественным изменениями содержания в' костном у.сзге и селезенке ранних геиопоэтических предшественников (снижение К (Ее в костной, мезге и селезенке я повышение КСБ-ГМ в селезенке), усилением проликератйвно.ч' актив- . ности КОЕс, а также увеличением колониестниулирустг.е^ актппностй • сыворотки крови.

Неясно, действует ли продигиозан на К.ЛЕ непосредственно или стимуляция их является бледствием снижения Кс;;с и КП^-Г" и опустошения костномозговых "ниш". В обоих случаях деМствие ;:они-эирущего излучения приходится на тот момент, когда регуляторняя система уже стимулирована н восполнению потери гекопозтнчеекпх ■ предшественников, в результате чего у защищенных лздвотннх могут раньше запускаться процессы восстановления КСЕс и КОЕ-ГУ., а так-ке стромльншх предшественников - КШЕ. ' . ■ ,. .

В экспериментах с облучение«. мышеЯ в дозе 6 Гр в условиях защиты продигиозан ом показано, что продигиозан обладает выраженным защитным з'У»'ектом не только в отношение КСЕс и КСЕ-П', но и в отношейяе К!,!ПЕ. В результате этого пострадиационное восстановление гекопоэтическйх предшественников, а также регенерзторкоЯ способности К?,НЕ происходило более интенсивно, чек в контрольной облученной группе. Ускорение восстановления регенераторной способности строгальннх преда» ствэяяяков после облучения пед действием продигиозана м.от.ет служить для восполнения недостатка зрелых клегок мякроокружеотя, котернй будет выявляться после транзптордого времени, несбходакоЛ) для пх пополнения из отдела более радиочувствительных преяшёствэяяяков.

В условиях введения дастакйяч роль гакроокруженяя не является ведущей в ^оркировакии радяорезпетентного состояния, хотя . отмечается его занятное действие на КИПЕ п ускорение восстановления регенераторной способности ЮЛЕ после облучения.

Спыти на длительных культурах костного коэга при введении продигиозана позволил! в определенной мере расшифровать характер

участия кроветворного mi к р сокрушения в механизме формирования . рсдисрезистентнсгс состояния кроветворной системы и процессах, пострадиационного восстановления. В длительных культурах под вли-' янием продигиозана к моменту облучения повышается содержание в культу рально!! среде КС-Ес и КСЕ-ГМ, причем повышение уровня КОК-~Г.\! гбуслэвлиБалось увеличением примерно в 2 раза выделения КСФ из-от рог/я ль него псдслоя. Известно, что эндотоксин такте виэывает пг г* толпе урорля КС'; через 21 ч после введения г культуру ( К, Wupfi, D.lilpfcCliiVi f Jiff). ВОЗКОННМУ. ислулят-р"»' ПГ,0«уцпя Kv'T г-стгягг ""Т'гог.кру-"етлг !»т.ет являться внтерлв'.1г.ин-1. Если под :;e:!cTT"ev. пг-дигиозано выделяется и интерле!1кин-1, то могет проявляться его опнергичнсе действие с КСР, так кг.к они проявляют адитяшкй э^Гект в стимуляции восстановления гемопоэза после облучения и воздействия 5-6луорацила ( tí.isocre, fi.títolfi^.^artia 1390),

; Увеличение числа КСЕс и KCrî-PI.! Б культуральной-среде к моменту облучения может быть следствием не только возрастания их прслк<Тчгратавной активности, но и результатом миграции и перерас- •. . пределения меаду строналышм подслое«, и культуральнсй средой, ■ что объясняет кажущееся противоречие кежду результатам, получен-' ниш', in vivo и in vitro.

В культурах с предварительным введением продигиозана, как и в системе la vivo отмечается его защитны!! эЛТект в отношение КОЕс и КСЕ-ГМ. До 14-х сут восстановление гег.опозтичесьч'.х предшественников проходило на более внсоких уровнях. Известно, что процесса регуляций восстановлен-пл кроветворения в системе длительного культивирования зависят от функционирования в не!1 подслол прилипающих клеток. Наиболее важное значение в контактах с КС£с имеют (Тибробласти и иакро^оги, как показало электрсмикроскогачес-кое изучение подслоя (b.Bentiey , 19ь4), Под влиянием поласаха-; рздов усиливается продукция кульгилинеЯиых ростовых факторов облученным подслоем (Ь.иащш et *a, f 1988). В нашей работе в культурах, защищенных продигиозаном отмечалось кеныпее выделение КСФ после облучения, чем в облученных контрольных культурах и более быстрая нормализация уровня КСФ, что, по-видимому, отражает более благоприятное состояние гекопоэтических клетск-прздиест-венников в защищенных культурах. Вместе о тем умеренное выдвле-<•' ние КСФ способствует сохранению и дает возможность для восстанов-■ ления КОЕс и КСЕ-ГМ до оптикальянх значения.

;

' Таким, образом, м.огдо считать установлен1««/., чтг ъредл каскада . реакций, связанннх с бор v.n сованием раднорезисгеитного состояния и интенсификацией процессов пострадиационного восстановления Юд влиянием продигиозана, существенное значение имеет его стимулирующее действие на кроветворную строку. Продигиозян активирует строгальные предшественники по-видимому, зрел те клетки ¿трокы, стимуляция которкх реализуется через выделение КС5 еероятно, ряда других ростово-ди^'е рении ровсчннх <Т*1ктсрйв. Под действием. ростовых факторов происходит повышение пралине гатквноЯ активности КОКс, ускорение их диф-'ереншровкл в сторону граяуло-поэза, увеличивается скорость миграции КОЗс из костного мозга в -селезенку и их оседание в селезенке. Tew. сают., гемопоэтическая система выводится из состояния равновесия и имеет возможность быстрее реагировать на пораяащее' действие радиации, что внрпга-. ется как в сохранении большего количества стволотнх клетгк и предшественников неповрежденными, так и в ускорении скорости их восстановления. Исследования, выполненные с использование"/, длительных культур костного мозга* показали, что сформирование сади-оустойчивости под действие« продигиозана кокет осуществляться на клетсччсм уровнз, в отсутствие органпзменпнх влияний.

•'выведи

1. Через 24 ч после вреде;!"я телпозтгдатнб!! дез к поемпт-.^за-

п-гявче.чря гакс?».'рлт-чг,г" гзчзт-'з^гнтиого эЛ'екта) в костном мозге происходит повышение (рункотональн'оЛ активности стромяльннх клеток-предЕественников {К,TIB). В те же сроки отмечается енпнение количества КСЕс, КСЕ-ЧГМ и общей клеточности костного мозга бедра и существенное'повышение количества КОК—I'M в селезенке. . .

2. Продигиозая.приводит к активации зрелых клеток стропы, о чек свидетельствует увеличение уровня КСФ в сыворотке крови через 3 ч после введения продигпоз'ана, Через 24 ч после введения препарата уровень КСФ начинает снижаться л нормализуется через 4В ч. - •; . - . .

3. ПролшТегативная активности КСЬ'с увеличивается в селезенке и костнок мозге через 24 и 48 ч после вгедеяия. радиозашитной ■

'• дозы продигиозана, соответственно. '.

4. Б условиях введения продагиозана в длительную культуру костного мозга к моменту облучения отмечается выделение зяачи-

о

тельного количества КС", повышение содержания КОЕс и КСЕ-ГМ в . культуральной среде,, по-видимому, за счет выхода их из строгального подслоя.

5. При облучении кышей в дозе 6 Гр предварительное введение продигиозаня (за 24 ч) приводило к меньшей степени поражения стромальных и гемолоэтических предшественников, а также более интенсивному восстановлению К'.МЕ, КОЕс, КОЕ-ГМ и миелохариоцитов, причем восстановление регененраторкой способности КШЕ предшествовало возрастанию уровня КОЕс и КОЕ-ГМ.

6. Б динамике пострадиационного восстановления в декстеров-ских культурах костного мозга продигиозая снижал поражающий э'ч-*ект радиации в отношение КСЕс и КОЗ-ГЫ и приводил к более раннему и более полному восстановлении гемспоэтических клеток-предшественников. Уровень КОС в защищенных культурах был блике к нормальному значении, в то время как б облученной контроле отмечаюсь периодические повышения активности КСФ.

7. Цистамия не вызывал изменений функциональной активности КД1Е к 'моменту облучения, однако, сн завдащл значительную часть строгальных предшественников ст поражающего'действия радиации

и ускорял восстановление регенераторной способности КШЕ после облучения.

1. Влияние продагиозана ка состояние генопоэтичесяих и строгальных клеток-преяаественников интактных мывей // Патол. (Тязяол.- и эксп. тер. -1993. -Х> I. -С. (соавт. В.Г.Лебедев).

2. Пострадиационное восстановление ге&опоэтических и стро-' мальккх клеток-предшествекников у шней в услошях предварительного введения продагиозана // Радиобяол. -1992. -Т. 32, Я 6, -С, 779-783. (соавт. Б,Б.Мороз, В.Г.Лебедев, О.О.Роудшко).

СЦИССК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ ПО ГШ ДИССЕРТАЦИИ