Автореферат и диссертация по медицине (14.02.02) на тему:Распространенность гепатита С и молекулярно-генетическая характеристика вируса, циркулирующего у населения Нижегородской обл.

ФЕДЕРАЛЬНОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ «НИЖЕГОРОДСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ

ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ ИМ.АКАДЕМИКА И.Н. БЛОХИНОЙ» ФЕДЕРАЛЬНОЙ СЛУЖБЫ ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗАЩИТЫ ПРАВ ПОТРЕБИТЕЛЕЙ И БЛАГОПОЛУЧИЯ ЧЕЛОВЕКА

РАСПРОСТРАНЕННОСТЬ ГЕПАТИТА С И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУСА, ЦИРКУЛИРУЮЩЕГО У НАСЕЛЕНИЯ НИЖЕГОРОДСКОЙ

ОБЛАСТИ

На г, си

Михайлова

| ! / А,

Юлия Владимировна

" 1

14.02.02 - Эпидемиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Быстрова Татьяна Николаевна

Нижний Новгород - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ........................................ 11

Глава 1. Обзор литературы.............................. 18

1.1. Эпидемиологическая характеристика гепатита С......... 18

1.2. Характеристика вируса гепатита С.................. 23

1.3. Лабораторные методы обнаружения специфических

маркеров гепатита С........................... 28

1.3.1. Иммуноферментный анализ................... 28

1.3.2. Молекулярно-генетические методы.............. 30

1.4. Применение методов лабораторной диагностики

в эпидемиологическом надзоре за гепатит С-инфекцией. ... 33 Глава 2. Собственные исследования. Материалы и методы........ 41

2.1. Материалы................................. 41

2.2. Методы.................................... 44

2.2.1. Сравнительная характеристика серологических тестов для определения маркеров вируса гепатита С......

2.2.2. Определение молекулярно-генетических маркеров вируса гепатита С методом ОТ-ПЦР с различной детекцией продуктов амплификации............ 51

Глава 3. Многолетняя динамика заболеваемости регистрируемыми

формами гепатита С............................. 55

Глава 4. Распространенность специфических маркеров

гепатит С-инфекции среди различных контингентов населения 65

4.1. Частота обнаружения антител к вирусу гепатита С....... 65

4.2. Частота обнаружения РНК вируса гепатита С........... 68

Глава 5. Характеристика структуры генотипов вируса гепатита С

на территории Нижегородской области................ 73

5.1. Региональные особенности распределения генотипов вируса 76

5.2. Геноварианты вируса, циркулирующего среди различных контингентов населения......................... 79

5.3. Особенности распределения генотипов ВГС по тендерному признаку................................... 81

5.4. Генотипическое разнообразие в зависимости от возраста инфицированных лиц.......................... 83

5.5. Динамические изменения структуры генотипов вируса за период с 1995 г. по 2012 г......................... 85

ЗАКЛЮЧЕНИЕ....................................... 87

ВЫВОДЫ........................................... 94

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ....................... 96

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ................ 97

СОКРАЩЕНИЯ

АГ/АТ - тест одновременного обнаружения «антигена-антител»

Анти-ВГС - антитела к вирусу гепатита С

Анти-ВГС Ig M - антитела к вирусу гепатита С иммуноглобулинов класса M

Анти-ВГС Ig G - антитела к вирусу гепатита С иммуноглобулинов класса G

ВГ - вирусный гепатит

ВГС - вирус гепатита С

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения

ГА - гепатит А

ГВ - гепатит В

ГЕ - гепатит Е

ГС - гепатит С

TG - гепатит G

ИФА - иммуноферментный анализ

кДНК - комплиментарная ДНК

ЛПУ - лечебно-профилактическое учреждение

МЕ/мл - международные единицы/миллилитр

МКПК - мононуклеарные клетки периферической крови

ОВГ - острый вирусный гепатит

ОГВ - острый гепатит В

ОГС - острый гепатит С

ОП - оптическая плотность

ОТ-ПЦР «Real- - обратная транскрипция полимеразная цепная реакция

time» в режиме реального времени

РНК ВГС - рибонуклеиновая кислота вируса гепатита С

ХГВ - хронический гепатит В

ХГС - хронический гепатит С

AASLD - американская ассоциация по исследованию заболеваний

печени

1RES - внутренний рибосомальный сайт связывания

(Internal Ribosomal Entry Site)

TTV - вирус TT (Transfusion Transmitted Virus)

0/0000 - заболеваемость в перерасчете на 100 000 населения

ТЕРМИНЫ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ Антигены: биологические тела и молекулы, несущие признаки чужеродной генетической информации.

Антитела: белки группы иммуноглобулинов, образующиеся в организме человека при попадании в него антигенов и нейтрализующие их вредное действие [58].

Вирусная нагрузка: мера тяжести вирусной инфекции, рассчитывается путем оценки количества вирусных частиц в жидкости тела зараженного организма. Количественное содержание РНК ВГС определяется в плазме крови методом ПЦР и измеряется в международных единицах/копиях на мл.

Вирусы: мельчайшие неклеточные частицы, состоящие из нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) и белковой оболочки (капсид).

Генетическая (генотнпнческая) гетерогенность популяции возбудителя:

неоднородность составляющих популяцию особей, обусловленная разнообразием генотипов в пределах популяции возбудителя и выражающаяся в вариабельности составляющих популяцию особей по вирулентности, иммуногенности, антигенной специфичности, устойчивости к воздействию различных факторов окружающей среды, лекарственных средств и т.д.

Геном: совокупность генов, содержащаяся в вирусной частице, в бактериальной клетке, в гаплоидном наборе хромосом организма человека.

Генотип: совокупность генов, присущих клонам микроорганизмов, микропопуляциям, изолятам вирусов. Для ВГС генотип определяется различиями в нуклеотидной последовательности, которые составляют 3135%. Если различия внутри генотипа достигают 15-20% выделяют субтипы вируса, при вариабельности нуклеотидной последовательности внутри субтипа от 1% до 10% говорят о квазивидах ВГС.

Генотипическая изменчивость: свойство организмов приобретать новые или утрачивать исходные признаки в результате мутаций, происходящих в геноме. Сопровождается изменениями генетического кода и передачей приобретенных признаков потомству [6].

Группы риска (контингенты риска): контингенты населения, подвергающиеся повышенному риску заражения возбудителем данной болезни в силу определенных природных, социальных условий труда или быта.

Динамика эпидемического процесса: изменение уровня заболеваемости людей инфекционными болезнями по годам за многолетний период (цикличность), по месяцам в течение года (сезонность).

Доля этиологическая (атрибутивная фракция): удельный вес (доля) тех случаев болезни, которые могли бы быть предотвращены при отсутствии влияния фактора риска. Отношение разности рисков к абсолютному риску у подвергшихся воздействию изучаемого фактора, выраженное в процентах (доля всех случаев заболевания, обусловленных данным фактором).

«Золотой стандарт»: метод, позволяющий с высокой степенью вероятности подтвердить выдвинутую гипотезу (позволяет подтвердить диагноз болезни).

Иммуноферментный анализ (ИФА): метод лабораторной диагностики, применяющийся для выявления антигена в клиническом материале от больного или антител в сыворотке крови с определением их принадлежности к иммуноглобулинам различных классов. ИФА обладает высокой чувствительностью, высокой специфичностью, возможностью использования минимального объема исследуемого материала, автоматизацией всех этапов проведения исследования.

Инфекция: представляет собой широкое общебиологическое понятие, характеризующее проникновение патогенного возбудителя в другой более

высокоорганизованный растительный или животный организм и последующее их антагонистическое взаимоотношение. Термин используется также для обозначения нозологической формы и локализации возбудителя в макроорганизме (например, кишечная инфекция).

Инфекция латентная: форма проявления инфекции, характеризующаяся длительным сохранением возбудителя в организме без клинических проявлений, которые могут возникнуть при воздействиях, вызывающих ослабление организма.

Инфекция манифестная: форма проявления инфекции, характеризующаяся полным набором типичных клинических симптомов.

Инфекция смешанная (ассоциированная, сочетанная, микст-инфекция):

инфекция с участием двух или более различных возбудителей (чаще вирусов), проявляется преобладанием клинической картины болезни, вызываемой одним из них, либо атипичным, более тяжелым течением.

Инфекционный процесс: процесс взаимодействия организма возбудителя и хозяина (человека, животного), проявляющийся клинически выраженным заболеванием или носительством.

Инфекционный процесс острый (острая форма инфекции): форма инфекционного процесса, характеризующаяся обычно тяжестью клинических проявлений, выраженной интоксикацией и сравнительно быстрым формированием иммунитета с последующим наступлением выздоровления или хронизацией.

Инфекционный процесс хронический (хроническая форма инфекции):

форма инфекционного процесса, характеризующаяся длительным, умеренным по тяжести течением с периодами обострения и ремиссиями (рецидивирующие течение), для которого типично длительное (не менее 6

месяцев) пребывание возбудителя в организме и периодическая его активация (персистенция).

Инфицированность: состояние зараженности организма человека или животного, вызванное внедрением (введением) возбудителя и проявляющееся в виде клинически выраженного заболевания или носительства.

Механизм передачи возбудителя: совокупность эволюционно сложившихся закономерных и специфических способов перемещения возбудителя от источника в восприимчивый организм человека или животного.

Молекулярно-генетические методы диагностики: методы, основанные на обнаружении в исследуемом материале родо-, видо- или типоспецифических последовательностей ДНК или РНК микроорганизма, выявление которых позволяет определить наличие возбудителя в материале от больного.

Носительство: сохранение в организме человека или животного и выделение в окружающую среду возбудителя инфекционной (паразитарной) болезни, без клинически выраженного проявления заболевания.

Периодичность (цикличность) эпидемического процесса: закономерно чередующиеся подъемы и спады заболеваемости, повторяющиеся через определенные промежутки времени (год, несколько лет).

Показатель заболеваемости (показатель инцидентности): отношение числа новых случаев инфекции или заболевания в определенной популяции в данный период времени к численности популяции риска. Показатель, отражающий частоту вновь выявленных случаев данной болезни в какой-либо группе населения (группе риска) за данный период времени на данной территории. Этот показатель выражается как количество новых случаев заболеваний на тысячи (1000, 10 ООО, 100 000) в год.

Показатель превалентности (распространенности, болезненности, пораженности): частота всех имеющихся среди населения заболеваний, как впервые выявленных в данном календарном году, так и зарегистрированных в предыдущие годы, по поводу которых больной вновь обратился за медицинской помощью в данном году.

Путь передачи возбудителя инфекции: форма реализации механизма передачи инфекции от источника восприимчивому человеку при участии объектов окружающей среды (факторов передачи).

Специфичность диагностического теста: способность теста достоверно определять отсутствие данного заболевания у обследуемого лица.

Чувствительность диагностического теста: способность теста достоверно определять наличие данного заболевания у обследуемого лица.

Эпидемиологический метод: специфическая совокупность методических приемов и способов, позволяющих обеспечивать анализ и синтез явлений, касающихся возникновения, развития, ограничения и прекращения эпидемического процесса.

Эпидемический процесс: процесс возникновения, распространения и прекращения среди населения специфических инфекционных состояний (в виде клинически выраженных заболеваний или носительства).

Эпидемиологический надзор: система динамического и комплексного слежения за эпидемическим процессом инфекционной болезни на определенной территории, включающая сбор, передачу, анализ и оценку эпидемиологической информации в целях разработки и коррекции рекомендаций (управленческих решений) по рационализации и повышению эффективности профилактических и противоэпидемических мероприятий и формированию эпидемиологического прогноза [58].

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность. В настоящее время парентеральные вирусные гепатиты занимают одно из ведущих мест в инфекционной патологии человека как в России, так и в целом по миру. Актуальность проблемы гепатита С (ГС) обусловлена повсеместным распространением, значительным социально-экономическим ущербом, тяжестью течения заболевания, высокой частотой хронизации, активным вовлечением в эпидемический процесс лиц репродуктивного и трудоспособного возраста. По оценкам экспертов Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) и Американской ассоциации по исследованию заболеваний печени (AASLD), 3-4 миллиона человек ежегодно в мире инфицируются ГС. Только хронической формой инфекции (ХГС) страдают около 150 миллионов человек, подвергая своё здоровье высокому риску развития цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы [9, 24, 46, 69, 81, 92, 106]. Вместе с тем, ряд отечественных и зарубежных ученых связывают с ХГС множественные внепеченочные проявления, что позволяет рассматривать данную инфекцию как системное заболевание [46, 96, 105, 143].

Несмотря на успехи, достигнутые в изучении ГС, значительная генетическая гетерогенность вируса, многофакторность развития и сложность структуры эпидемического процесса до сих пор не позволили в полной мере раскрыть закономерности течения этой инфекции [7, 87]. Наиболее детально изучен манифестный компонент эпидемического процесса ГС, вместе с тем у подавляющего большинства больных заболевание протекает скрыто (латентно) и, как правило, остается не диагностированным [23, 69, 71, 78, 79, 84, 87]. Именно хронические и латентные варианты ГС определяют основную часть эпидемического процесса, при этом данные официальной статистики отражают лишь «видимую часть айсберга». На ряду с этим, ГС характеризуется выраженной территориальной неравномерностью в широте распространения инфекции и

по уровню заболеваемости, что является следствием влияния различных социально-экономических факторов и географических условий [23, 29, 85]. Поэтому объективная оценка интенсивности эпидемического процесса ГС в отдельных регионах России должна быть основана на данных официальной статистики и результатах лабораторного обследования населения.

Как и при других инфекциях с полиморфной клиникой, решение различных аспектов проблемы ГС, в том числе для целей эпидемиологического надзора, во многом определяется используемыми методическими подходами для обнаружения специфических маркеров инфекции. Регламентированное нормативными документами определение косвенного показателя инфицированности ГС - антител к вирусу ГС (анти-ВГС) методом иммуноферментного анализа (ИФА) осложняется отсутствием стандартизации в интерпретации результатов и не позволяет диагностировать заболевание на ранних стадиях инфекции до сероконверсии [14, 63, 67, 74, 103, 107]. Обнаружить скрытопротекающую ГС-инфекцию позволяет определение молекулярно-генетических маркеров вируса. При этом, в последние годы появились сведения о существовании новой формы латентной ГС-инфекции с наличием рибонуклеиновой кислоты (РНК) ВГС в ткани печени при недетектируемом уровне в сыворотке крови [20, 99, 128]. Поскольку биопсия печени является не всегда доступным методом, то особую диагностическую ценность в качестве доступного субстрата для исследования приобретают мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК), в которых РНК ВГС по разным данным выявляется в 24-90 % [21, 39, 40, 46, 128].

С использованием молекулярно-генетических методов исследования была установлена высокая генетическая гетерогенность ВГС [18, 20, 32, 35, 52, 59, 61, 83, 84, 87, 100, 113, 117]. Современная классификация (Эттопс^ Р. е1 а1., 1998) включает 6 генотипов, более 100 субтипов и множество квазивидов вируса. В настоящее время качественное, количественное определение РНК и генотипа вируса имеет не только безусловное

клиническое значение для подбора схемы и контроля лечения, но и может быть перспективным для решения эпидемиологических задач [44, 80, 81, 87, 142]. Известно, что наиболее распространены в мире генотипы 1, 2 и 3, при этом в разных географических зонах превалирует тот или иной их субтип [18, 22, 32]. Несмотря на это, о распространенности отдельных генотипов ВГС в различных регионах России имеется ограниченное количество работ. Отечественными авторами показано доминирование разных субтипов вируса в общей популяции населения в зависимости от исследуемой территории [11, 12, 26, 32, 43, 48, 52, 59, 62, 80, 83]. Так, установлено доминирование субтипа 1Ь на некоторых территориях Северо-Западного региона РФ, в то время как в Центральной и Южной частях России генотипы 1Ь и За выявляются с одинаковой частотой [23, 24, 32, 81, 87, 89]. При этом, редко встречаются сведения об особенностях распределения субтипов вируса у отдельных контингентов населения с учетом возраста и пола обследованных лиц