Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Эндотелиальная дисфункция и пути её фармакологической коррекции

На правах рукописи

ВОРОНКОВ АНДРЕЙ ВЛАДИСЛАВОВИЧ

ЭНДОТЕЛИАЛЬНАЯ ДИСФУНКЦИЯ И ПУТИ ЕЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ КОРРЕКЦИИ

14.03.06. фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

2 2 СЕН 2011

Волгоград -2011

4853594

Работа выполнена в Государственном общеобразовательном учреждении высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской федерации»

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Тюренков Иван Николаевич

Официальные оппоненты:

ЗДН РФ, доктор медицинских наук, профессор P.C. Мирзоян

ЗДН РФ, доктор медицинских наук, профессор K.M. Резников

доктор медицинских наук, профессор В.А. Косолапов

Ведущая организация:

«НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН» г.Санкт- Петербург

Защита состоится «6» октября 2011 г. в 11™ часов на заседании Диссертационного совета Д 208.008.02 при ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития Российской федерации» (Россия, 400131, Волгоградская область, г. Волгоград, пл. Павших Борцов, 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития Российской федерации» (400131, Волгоградская область, г. Волгоград, пл. Павших Борцов, 1).

Автореферат разослан «_»_2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

А.Р. Бабаева

Актуальность темы

В настоящее время считается общепризнанным, что в основе развития сердечно-сосудистой патологии различного генеза важную роль играет дисфункция эндотелия (ЭД) (Петрищев H.H., 2003; Ярек-Марты-нова И.Р., Шестакова М.В., 2011; Ding Н., 2010; PotenzaM.A., 2010; Maltais S., et all., 2011). Эндотелий рассматривается как самостоятельная мишень терапевтического воздействия для коррекции различных сердечнососудистых заболеваний (ССЗ). Исходя из этого, актуальной проблемой экспериментальной и клинической фармакологии является поиск веществ с эндотелиопротекторным действием (ЭПД) как среди известных препаратов, так и новых соединений (Карпов Ю. А. 2010).

К настоящему времени установлено ЭПД препаратов, уменьшающих влияние РААС и СНС на сердечно-сосудистую систему (иАПФ, Ь-блокаторы и т.д.); снижающих уровень ХС0бщ, ХСЛ[ШП, ХСЛП0НП (особенно статины); регулирующих работу Са2+ каналов (блокаторы Ca каналов), что очевидно связано, как с прямыми эндотелий зависимыми механизмами действия так и их опосредованным комплексным фармакологическим влиянием (Luscher T.F., Noll G., 1995; Aikawa M., 2010; Egashira K., 2010; Jorge P.A., 2010). Многие из проведенных экспериментальных и клинических исследований по изучению ЭПД сердечно-сосудистых средств достаточно противоречивы и не дают однозначного ответа по направленности и выраженности действия препаратов из этих фармакологических групп. Это обусловлено тем, что многие как экспериментальные, так и клинические исследования выполнены с использованием различных методов оценки функционального состояния эндотелия (биохимических, функциональных, инвазивных, неинвазивных и т.д.), клинические же работы, кроме этого, отличаются выбором больных, различных по возрасту, тяжести заболевания, сопутствующим патологиям, протоколам исследований.

Можно предполагать, что вещества с ГАМК-ергической активностью ограничивающие симпатические влияния на сердце и сосуды, уменьшающие активность РААС, обладающие при этом антиоксидантной и антигипоксантной активностью (Перфилова В.Н., 2009; Тюренков И.Н., 2008; Narahashi Т., 1999; Harrison 2000), могут улучшать функцию эндотелия (Недвицкий П.И., 2000; Ishide Т., 2005). Однако изучение влияния ГАМК-ергических средств наэндотелий практически не выполнялось.

Учитывая важную роль в развитии ЭД оксидативного стресса, можно предположить, что и антиоксиданты также могут воздействовать на различные звенья развития ЭД: на систему синтеза и биодоступности NO, гемореологические параметры крови, липидный и углеводный обмен,

воспаление, пролиферацию (Насибуллин Р.С.,2010; Yamamoto, М.2008; Schiffrin Е. L., 2010; Wallace Т. С., 2011). Поэтому поиск высоко активных эндотелиопротекторов среди антиоксидантов, в том числе и флавоноидов, вполне оправдан.

На основании изложенного представилось целесообразным провести комплексное сравнительное изучение ЭПД ряда сердечно-сосудистых средств, производных ГАМК, лекарственных средств, обладающих анти-оксидантной активностью в том числе и флавоноидов в условиях ЭД различного генеза.

Целыо исследования является разработка методологии поиска веществ с эндотелиопротекторным действием и проведение сравнительного изучения эндотелиотропных свойств, сердечно-сосудистых средств и веществ с различными механизмами действия.

Задачи исследования

1. Провести тестирование эндотелия различных сосудистых регионов в условиях нормы и экспериментальной патологии (при недостаточности половых гормонов, экспериментальном сахарном диабете, хирургической травме).

2. Изучить влияние сердечно-сосудистых средств, производных ГАМК, флавоноидов и препаратов, обладающих антиоксидантной активностью на вазодилатирующую функцию эндотелия в условиях ЭСД и НПГ.

3. Изучить влияние сердечно-сосудистых средств, производных ГАМК, препаратов, обладающих антиоксидантной активностью, в том числе и флавоноидов на антитромботическую функцию эндотелия, гемореологию и основные параметры гемостаза в условиях ЭСД и НПГ.

4. Изучить влияние сердечно-сосудистых средств, производных ГАМК, и препаратов, обладающих антиоксидантной активностью, в том числе и флавоноидов на углеводный, липидный и гормональный статус животных с ЭСД и НПГ.

5. Изучить влияние наиболее активных веществ из вновь синтезированных производных ГАМК, флавоноидов и препаратов сравнения на противовоспалительную функцию эндотелия при ЭСД и НПГ.

6. Дать морфологическую оценку состояния эндотелия при ЭСД и НПГ и изучить влияние наиболее активных веществ из вновь синтезированных и препаратов сравнения на морфологическую структуру эндотелия.

7. Изучить механизм эндотелиопротективного действия наиболее активных веществ из вновь синтезированных и препаратов сравнения

у животных с ЭСД и НПГ с помощью иммуногистохимического исследования, с оценкой уровня экспрессии е-МОБ, эндотелина-1, каспазы-3, пБ-кВ, рецепторов ТКЕ1Ь.

8. На основании сравнительного изучения влияния на эндоте-лиальную функцию средств из различных фармакологических групп в условиях нормы и экспериментальной патологии, дать оценку методологии к подходам оценки эндотелиальной функции/дисфункции и эндотелиопро-тективного действия фармакологически активных соединений.

Новизна исследования

Впервые разработан комплексный подход изучения эндотелио-тропных эффектов биологически активных веществ, обоснована возможность моделирования эндотелиальной дисфункции с помощью стрепто-зотоцин индуцированного сахарного диабета и экспериментально вызванной недостаточности половых гормонов.

Впервые выполнено сравнительное комплексное изучение влияния представителей различных фармакологических групп, среди сердечно-сосудистых средств, в сопоставимых условиях: (3-адреноблокаторов (небиволол, бисопролол), ингибиторов АПФ (лизиноприл), антагонистов кальциевых каналов (нифедипин), статинов (симвастатин), гипариноида сулодексида, ряда производных ГАМК (фенибут, пикамилон, РГПУ-189, РГПУ-147), веществ, обладающих антиоксидантной активностью (мексидол, предуктал, дибикор), а также флавоноидов (гесперидин, диосмин, кверцетин й флавицин), на вазодилатирующую, антитромботическую функции, на углеводный, липидный обмен и гормональный статус при ЭСД и НПГ. Показано их неоднозначное эндотелиопротекторное действие.

Впервые выявлена высокая эндотелиопротективная активность и комплексно изучено влияние нового производного ГАМК - соединения РГПУ-189 и флавоноида - флавицина на вазодилатирующую, антитромботическую, противовоспалительную и пролиферативную функции эндотелия при ЭСД и НПГ.

По выраженности эндотелиопротекторного действия РГПУ-189 и флавицин превосходят небилет, конкор, мексидол, предуктал, дибикор, нифедипин, фенибут, пикамилон, производное ГАМК - РГПУ-147 и флаво-ноиды, приближаясь по выраженности действия к Сулодексиду.

Впервые установлено усиление активности е->Ю8, снижение эндотелина-1, а так же снижение экспрессии основных генетических маркеров запускающих апоптоз (каспаза-3, «доменов смерти», ОТ-кВ) у животных с ЭСД и НПГ, под влиянием соединения РГПУ-189 и флавоноида флавицина, что очевидно лежит в основе их эндотелиопротекторного действия.

Научно-практическая ценность работы

Используемый комплексный морфо-функциональный подход может применяться для оценки степени ЭД (вазодилатиругощей, антитромбо-тической, противовоспалительной, антипролиферативной функций эндотелия), мощности функционирования N0 системы, дает возможность оценить эндотелиотропные свойства исследуемых веществ.

Сравнительный анализ полученных данных о влиянии известных сердечно-сосудистых средств, позволит более дифференцированно их использовать при лечении больных с различной кардиологической патологией, а на основе флавоноидов и производных ГАМК - разработать лекарственные средства для лечения ЭД различного генеза.

Полученные данные об эндотелиопротективном действии производных ГАМК и флавоноидов свидетельствуют о перспективности дальнейшей разработки на основе соединения РГПУ-189 и флавицина эндотелио-протекторов для применения в качестве средств профилактики и лечения сосудистых осложнений различного генеза, обусловленных ЭД.

Реализация результатов.

На основании данных диссертационного исследования разработана дальнейшая программа целенаправленного поиска веществ с сердечно-сосудистыми и эндотелиотропными свойствами среди структурных аналогов ГАМК (кафедра органической химии Российского Государственного Педагогического Университета им. А.И.Герцена (г. Санкт-Петербург)), предложен план поиска веществ флавоновой природы для профилактики и лечения сосудистых осложнений, обусловленных СД и НПГ (Пятигорская фармацевтическая академия).

Разработанная комплексная морфофункциональная система поиска и доклинического фармакологического изучения веществ с эндотелио-пртективной активностью используется в научно-исследовательской работе кафедры фармакологии и биофармации ФУВ Волгоградского государственного медицинского университета (ВолгГМУ), НИИ фармакологии ВолгГМУ, кафедрах фармакологии ВолгГМУ и Пятигорской государственной фармацевтической академии. Полученные в ходе исследования результаты оформлены в виде методического пособия «Новая медицинская технология: Использование высокочастотной ультразвуковой допплерографии для изучения влияния фармакологических веществ на региональное кровообращение и эндотелиальную функцию (подписано в печать 04.2010)

Полученные результаты о эндотелиопротекторных свойствах новых производных гамма-аминомасляной кислоты и флавоноидов, а так же сравнительная 'ждотелиопротекторная активность сердечно-сосудистых средств и

веществ, обладающих антиоксидантной активностью, включены в раздел учебных программ курса фармакологии на кафедрах фармакологии и биофармации ФУВ, фармакологии, клинической фармакологии и интенсивной терапии Волгоградского государственного медицинского университета, кафедре биохимии и микробиологии, кафедре органической химии Пятигорской государственной фармацевтической академии, кафедрах фармакологии Воронежской медицинской академии, Ростовского государственного медицинского университета, Белгородского государственного университета. Материалы работы оформлены в виде информационных писем «Изучение эндотелиопротекторных свойств флавоноидов при экспериментальном сахарном диабете», «Эндотелиопротективные свойства производных ГАМКлри недостаточности половых гормонов» которые используются в учебном процессе и научной работе кафедры фармакологии ВолгГМУ (акты о внедрении . от 09.2010; 12.2010), фармакологии и биофармации ФУВ ВолгГМУ (акты о внедрении от 09.2010; 12.2010), лаборатории фармакологии сердечно-сосудистых средств НИИ фармакологии ВолгГМУ (акты о внедрении от 09.2010; 12.2010). По материалам настоящей работы получен 1 патент Российской Федерации на изобретение.

Положения, выносимые на защиту:

1. Стрептозотоцин-индуцированный сахарный диабет в большей степени, а экспериментально вызванная недостаточность половых гормонов, в меньшей степени, приводят к выраженным нарушениям всех функций эндотелия. Операционная травма так же приводит к эндотелиальным нарушениям, однако они носят кратковременный и обратимый характер. Полученные результаты позволяют рекомендовать данные патологические модели для моделирования эндотелиальной дисфункции в эксперименте.

2. Исподьзуемый в работе комплексный морфо-функциональный подход к изучению вазодилатирующей, антитромботической, противовоспалительной, антипролиферативной функций эндотелия, позволяет оценить стабильность и мощность функционирования N0 системы и выраженность ЭД, а также может использоваться для изучения эндоте-лиотропных эффектов исследуемых веществ и различных патологических воздействий на эндотелий.

3. Сердечно-сосудистые средства, гепариноид - сулодексид, производные ГАМК, флавоноиды и вещества, обладающие антиоксидантными свойствами, в разной степени выраженности проявляют эндотелиопро-тективную активность, что проявляется в улучшении вазодилатирующей, антитромботической функций эндотелия. По степени улучшения вазодилатирующей функции эндотелия все исследуемые соединения можно

расположить следующим образом: Вессел Дуэ Ф (сулодексид) > Диротон > Симвагексал > Небилет > РГПУ-189 > Флавицин > РГПУ-147 > Кверцетин > Мексидол > Конкор > Гесперидин > Диосмин > Предуктал > Пикамилон > Нифедипин > Фенибут > Дибикор, а по степени влияния на антитромбо-тическую функцию эндотелия изучаемые соединения можно расставить в следующем порядке: Вессел Дуэ Ф (сулодексид) > Симвагексал > РГПУ-189 > Диротон > Небилет > РГПУ-147 > Флавицин > Кверцетин > Конкор > Нифедипин > Мексидол > Фенибут > Гесперидин > Дибикор > Диосмин > Предуктал > Пикамилон.

4. РГПУ-189 и флавицин выражено улучшают противовоспалительную, антипролиферативную функции эндотелия, уменьшают метаболические нарушения у животных с ЭСД и НПГ (снижают гипергликемию, гиперхолестеринемию, индекс атерогенности), в большей степени эти эффекты выражены у флавицина. Эндотелиопротективное действие отмеченных веществ очевидно обусловлено угнетением экспрессии маркеров апоптоза (TRAIL, каспаза-3, nF-kB), снижением эндотелина-1 и усилением активности e-NOS.

5. Вессел Дуэ Ф по совокупности всех проведенных исследований оказал наиболее выраженное эндотелиопротекторное действие по сравнению со всеми исследуемыми веществами. Полученные результаты позволяют рекомендовать Вессел Дуэ Ф в качестве эталонного препарата сравнения при сопоставлении эндотелиотропных эффектов изучаемых лекарственных препаратов.

6. Сравнительный анализ полученных данных о влиянии известных сердечно-сосудистых средств, флавоноидов, веществ, обладающих антиокси-дантной активностью, и производных ГАМК на эндотелиальную дисфункцию в условиях гормональных нарушений различного генеза, свидетельствуют о целесообразности применения Весел Дуэ Ф, диротона, симва-ГЕКСАЛА, небилета, мексидола, для комплексной терапийлсердечно-сосу-дистых заболеваний, профилактики;й лечения сосудистых осложнений, связанных с СД и НПГ. Результаты .исследований позволяют рекомендовать проведение дальнейшего изучения соединения РГПУ-189 и флавицина, для создания на их основе новых,; препаратов с эндотелиопротекторной активностью.

7. Проведенное тестирование вазодилатирующей функции эндотелия различных сосудистых регионов (мозг, печень, почка и кожно-мышеч-ная область) позволяет говорить о том, что направленность эндотелиального ответа одинакова во всех областях, но выраженность разная. Результаты исследования дают возможность экстраполировать полученные в ходе экспе-

римента данные по изменению функции эндотелия в одной сосудистой области и на другие регионы с разным типом эндотелия.

Апробация работы

Материалы работы докладывались и обсуждались на 5-ой научно-практической конференции «Методы исследования регионального кровообращения и микроциркуляции в клинике» (Санкт-Петербург, 2005); на II международной научной конференции «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений» (Алматы, Казахстан, 2007); на 13 Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов (Москва, 2007); Научно-практической конференции «Диагностика и коррекция нарушений регионального кровообращения и микроциркуляции в клинической практики» (Саратов, 2008); на 14 Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов (Москва, 2008); на VIII съезде кардиологов южного федерального округа «Совершенствование оказания медицинской помощи больным с сердечно-сосудистыми заболеваниями. Новые подходы и перспективы» (Ростов-на-Дону, 2009); 56-ой региональной научно-практической конференции Волгоградского государственного медицинского университета «Инновационные достижения фундаментальных и прикладных медицинских исследований в развитии здравоохранении волгоградской области» (Волгоград 2009); Научно практической конференции «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической морфологии» (Волгоград, 2010); II. Всероссийском научно-практическом семинаре «Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии» (Волгоград, 2010). По материалам диссертации опубликовано 60 печатных работ, в том числе 21 работа в журналах, рекомендуемых ВАК, получен 1 патент на изобретение №2374699 от 27 ноября 2009 года.

\ \

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 6 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка используемой литературы, включающего 493 источника, из них 189 отечественных и 304 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 296 страницах машинописного текста, содержит таблиц -27, рисунков -55, схем-1.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование выполнено на 1090 крысах самках и самцах, которые содержались в условиях вивария с естественным световым режимом, на стандартной диете лабораторных животных (ГОСТР 50258-92),

с соблюдением Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях, а также правил лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ 3 51000.3-96 и 51000.4-96) и Приказу МЗ РФ №267 от 19.06.2003г. «Об утверждении правил лабораторной практики» (GLP). Животные были получены из питомников «Столбовая», «Рапполово». Эксперименты были одобрены комитетом по этической экспертизе доклинических исследований ВолгГМУ (протокол № 54-2007 от 28.04.2007).

Исследование было проведено с помощью комплексного морфо-функционального подхода, используемого для оценки эндотелиальной дисфункции (ЭД) и эндотелиотропного действия (ЭПД) веществ. Комплексный морфо-функциональный подход включал в себя определение вазодилатирующей, антитромботической, противовоспалительной и анти-пролиферативной функций эндотелия. При изучении эндотелиопротек-торного действия на животных с ЭСД дополнительно оценивались нарушения в углеводном и липидном обмене, с целью оценки влияния соединений на развитие ЭД. Кроме этого, у всех групп животных с экспериментально-вызванной недостаточностью половых гормонов определялся уровень половых гормонов в плазме крови.

ЭД на всех этапах исследования моделировалась двумя патологиями стрептозотоцин-индуцированным СД и недостаточностью половых гормонов (НПГ).

Экспериментальный сахарный диабет (ЭСД) вызывали введением стрептозотоцина в дозе 4 5 мг/кг внутривенно в хвостовую вену. Через 72 часа производили количественное определение глюкозы в крови ферментативным (глюкозооксидазным методом) с измерением величины оптической плотности надосадочной жидкости в кюветах с длиной оптического пути 10 мм при длине волны 500 на спектрофотометре (ПЭ-5400В, ЭКРОС) с использованием наборов «Глюкоза ФКД» (Россия). За 18 часов до введения цитотоксина крысам ограничивали доступ к пище при свободном доступе к воде. В дальнейшее исследование отбирали животных с уровнем сахара крови 12-15 ммоль/л и выше, то есть крыс с развившимся СД (Баранов В.Г., 1983).

Недостаточность половых гормонов (НПГ) как модель нарушения функции эндотелия воспроизводилась путем экстирпации матки с придатками у крыс самок. Исследование проводилось на крысах-самках, рандомизированных по массе (180-210 гр.) и возрасту (половозрелые - 3 месяца) (патент на изобретение №2374699). С целью оценки изменения уровня гормонов в исследуемых группах при моделировании недостаточности

половых гормонов был использован иммуноферментный анализ (ИФА) с помощью автоматического ридера Е1х800 и с использованием наборов: Прогестерон ELISA EIA-1561, Пролактин ELISA EIA-1291, Фолликуло-стимулирующий гормон ELISA EIA-1288, Эстрадиол ELISA EIA-2693 (DRG Instruments GmbH, Германия).

Контроль эффективности кастрации производился с использованием цитологического метода определения стадии полового цикла у самок. Для анализа разного уровня эндогенных эстрогенов после операции были выбраны три наиболее характерные фазы полового цикла: диэструс, проэструс и эструс. Определение фаз полового цикла (диэструс, проэструс, эструс) у интактных крыс проводили с помощью характерных морфологических признаков по влагалищным мазкам согласно описанию Я. Д. Киршенблата.

Все проведенные нами исследования проходили тремя блока и в несколько этапов.

В первом блоке, на первом этапе работы, проводили сравнительное изучение вазодилатирующей функции эндотелия сосудов головного мозга, печени, почек и кожно-мышечной области, на фоне модификации синтеза эндогенного оксида азота у интактных животных. На втором этапе работы оценивалась выраженность и продолжительность эндотелиальной дисфункции у животных с экспериментально вызванными - сахарным диабетом, недостаточностью половых гормонов и операционной травмой (операционным стрессом), как патологии сопутствующей хирургической кастрации (для исключения ее влияния на развитие эндотелиальных нарушений). В ходе проведения второго этапа исследований использовались методические приемы, позволяющие оценить вазодилатирующую и антитромботическую функции эндотелия (таблица I).

Дальнейшие эксперименты проводились еще двумя отдельными блоками. Так, во втором и третьем блоке исследований изучалось эндотелио-протективное действие сердечно-сосудистых средств: ингибиторов АПФ, антагонистов кальциевых каналов, статинов, сулодексида, флавоноидов, производных ГАМК у животных с ЭСД и НПГ (3 этап) (таблица 1). Эндотелиопротекторные свойства изучались среди:

- сердечно-сосудистых средств: ингибитор АПФ - лизиноприл (диротон, «Гедеон Рихтер А.О., Будапешт - Венгрия») - 5мг/кг; b - блокаторы - небивалол (небилет, «Berlin-Chemie», Берлин, Германия) - 2,5мг/кг, и бисопролол (конкор «Nykomed», МеркКГаА, Германия для Никомед) -5мг/кг; антагонист кальциевых каналов - нифедипин (BalkanpharmaR) -10мг/кг; гипохолестеринимический препарат - симвастатин (симваГЕКСАЛ,

Таблица 1. Дизайн проведения экспериментов

1 этап J гетерогенность эндотелия # Вазодплашруюшая функция -эндотелия доплеровская флоуметрия при модификации сптеза N0 (оценка ЭЗВД при введении ацетилхолина, N-1,-аргпнина)

1 блок ;S s о 5 * с I-£ С ч 1 и ё ^ Вазодилатируюшая функция эндотелия -доплеровская флоуметрия при модификации синтеза N0 (оценка ЭЗВД при введении ацетилхолина, Ь-аргинина, И-Ь-аргинина; ЭНЗВД при введении нитроглицерина; мощности и стабильности N0-синтазной системы при многократном введении АЦХ)

2 этап изучение энд дисфункции при ЭС XT.** Антитромботическая функция эндотелия -скорость образования тромба (артериальный тромбоз) - измерение вязкости крови -оценка агрегации тромбоцитов -тромбиновое время - протромбиновое время -активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) -содержание фибриногена -определение фактора Виллебрандта

S о. с СО н и U э- U Вазодилатируюшая функция эндотелия -доплеровская флоуметрия при модификации синтеза N0 (оценка ЭЗВД при введении ацетилхолина, Ь-аргинина, М-Ь-аргинина; ЭНЗВД при введении нитроглицерина; мощности и стабильности N0-синтазной системы при многократном введении АЦХ)

* ■X о ч 'X . ' ' 3 S w >ч 3 4 о о • S « X 03 . н >я <и 4 Антитромботическая функция эндотелия -скорость образования тромба (артериальный тромбоз) - измерение вязкости крови -оценка агрегации тромбоцитов -тромбиновое время - протромбиновое время -активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) -содержание фибриногена -определение фактора Виллебрандта

г*> о 1-о X а s Оценка метаболических эффектов -уровень глюкозы в крови -липидный спектр (ХСойв, ХСлпвп, ХСлшт ТГ, индекс атерогенности)

о А 5 <и ё с о Оценка гормонального статуса у животных с НПГ -уровень эстрогенов

ч 4J н о Противоспалительная функция эндотелия -уровень СРБ

X л 4J S Я Антипролиферативная функция эндотелия -морфометрическая оценка мозговых сосудов с наличием признаков пролиферации, а так же воспаления, тромбообразования

>>и г» [—< s ш Структурные изменения эндотслиоцитов ультраструктурная оценка эндотелиальных повреждений

С s t 4 о и m СП Определение уровня е-NOS и эндотелина-1, TRAIL, NF-kB, каспаза-3 иммуногистохимическая оценка по степени экспрессии и уровню оптической плотности антител

Примечание: #-исследование проведено на интактных животных; *- исследование проведено через 4 недели после ЭСД и НПГ; * »-исследование проведено в течении 4-х дней после оперативного вмешательства.

HEXAL, Германия) - 10 мг/кг. Дозы препаратов выбраны на основе литературного анализа многочисленных экспериментальных исследовании, в которых эти вещества проявили высокую эндотелиопротекторную, антигипертензивную, противоишемическую и гипохолестеринемическуго активность.

- производных ГАМК: РГПУ-147 (50мг/кг), РГПУ-189 (15мг/кг), фенибут - (25мг/кг), пикамилон (ОАО «Фармстандарт-УфаВИТА») -100мг/кг. Использовались наиболее эффективные дозы данных веществ, выявленные при изучении нейропротекторной, антистрессорной, антиишемической и кардиотропной активности данных соединений. Вещества синтезированы на кафедре органической химии Российского государственного педагогического университета им. А.Н. Герцена (Санкт-Петербург, Россия)'.

- веществ, обладающих антиоксидантными свойствами: мекси-дол («НПК Фармасофт», Россия) в дозе 100 мг/кг; предуктал MB (тримета-зидин, «Servier», Франция) в дозе б мг/кг; дибикор (таурин «ПИК-ФАРМА ПРО») в дозе 168 мг/кг.

- индивидуальных флавоноидов: кверцетин (фирмы Merck), а также флавицин, диосмин, полученные из надземной части растения рода Vicia, сем. Fabaceae) и гесперидин, полученный из кожуры цитрусовых, выделенные на кафедре органической химии Пятигорской фармацевтической академии под руководством доктора фармацевтических наук, профессора Э.Т. Оганесяна, за что выражаем ему искреннюю благодарность. Все флавоноиды вводились в дозе - ЮОмг/кг, способ введения-per os.

Так же был исследован Сулодексид (Весел Дуэ Ф) - 30 EBJI (единицы высвобождения липопротеинлипазы) (Alfa Wassermann, Италия) (Комелягина Е.Ю., 2005). Способ введения всех перечисленных веществ -per os, в течении месяца, в первую половину дня. В качестве растворителя использовали 0,9% раствор хлорида натрия. Контрольным группам животных: интактным, ложнооперированным (ЛО), а также животным с НПГ и ЭСД вводился физиологический раствор в эквивалентном объеме.

Оценка вазодилатирующей функции эндотелия осуществлялась путем регистрации изменений скорости кровотока (CK) при модификации синтеза эндогенного оксида азота введением ацетилхолина (АЦХ) (0,01 мг/кг), L-аргинина (300 мг/кг), нитро-Ь-аргинина («Acros organics», США) (10 мг/кг). Для оценки эидотелионезависимой вазодилатации (ЭНЗВД) в/в вводили нитроглицерин (НТГ) (MTX, Москва) (0,007 мг/кг). Для оценки

'Выражаем искреннюю благодарность завкафедрой органической химии РГПУ им.А.И..Герцена , з.д.н., д.х.н., проф. Берестовицкой В.М., к.х.н., доц. Васильевой О.С. и всем сотрудникам кафедры за предоставленное для исследования вещества

мощность!_ и стабильности NO-синтазной системы был использован метод многократного (10-кратного) введения АЦХ в фиксированной дозе (0,01 мг/кг). CK регистрировали в теменной области мозга крыс, в проекции среднемозговой артерии с помощью ультразвукового допплерографа, датчика УЗОП-010-01 (рабочая частота 25МГц, диаметром 0,3 см) и компьютерной программы ММ-Д-KMinimax Doppler v. 1.9. (Санкт-Петербург, Россия), которая дополнительно позволяла анализировать периферическое сопротивление (индекс Пурселло) и эластичность мозговых сосудов (индекс Гослинга).

Оценка антитромботической функции исследуемых соединений осуществлялась с помощью комплексного подхода для оценки как сосудисто-тромбоцитарного, так и плазменного (коагуляционного) гемостаза. Артериальный тромбоз вызывался по методике Angelillo-Scherrer А., 2004. Показатели вязкости крови изучались на анализаторе крови реологичес-ком АКР-2 (Россия), показатели агрегации тромбоцитов на двухканальном лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов фирмы «Биола» (г. Москва) по методу Born G. (1962) в модификации Габбасова З.А. (1989). Тромбиновое время (ТВ), протромбиновое время (ПВ), активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) и содержание фибриногена определяли хронометрически на анализаторе показателей гемостаза АПГ2-01 «МИНИЛАБ 701» с использованием наборов НПО «Ренам» (Россия). Определение фактора Виллебранда проводилось на двухканальном лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов «Биола» (наборы «Ренам» для определения фактора Вллебранда).

Оценка липидного профиля (ХС„„Ш, ХСЛ1Ш|„ ХСЛП]1П, ТГ) осуществлялась с использованием ферментативных колориметрических тестов «Ольвекс Диагностикум»), значение концентрации ХСЛПНП вычисляли по формуле Фридвальда (1972), индекс атерогенности (ИАТ) по Д.Н. Климову (1999). Уровень глюкозы в плазме крови крыс определялся глюкозо-оксидантым способом с использованием набора «Глюкоза-ФКД» (Россия).

Противовоспалительная функция эндотелия оценивалась по уровню С-реактивного белка (СРБ) с помощью набора реагентов для качественного и полуколичественного определения СРБ в сыворотке крови методом латекс-агглютинации («Ольвекс Диагностикум»),

Антинролиферативная функция эндотелия оценивалась с помощью комплексного морфологического подхода, основанного на морфомет-рической оценке параметров эндотелиальных клеток (размеры ядер (ус.ед.) и ядерно-цитоплазматическое отношение (ЯЦО)), степени сосудистых и эндотелиальных нарушений на базе компьютерной системы «ВидеоТест-Морфо-4» (Россия), по соотношению интимы/медии эндотелиальной

выстилки, признаков пролиферации сосудистой стенки и воспалительной инфильтрации в микроциркуляторном русле, а также явлений периваску-лярного и перицеллюлярного отека.

Для определения степени повреждения эндотелия проводилась гистологическая оценка десквамации ('циркулирующие эпдотелиоциты). Определение количества десквамированных эндотелиоцитов осуществлялось с помощью метода, основанного на изоляции клеток эндотелия вместе с тромбоцитами с последующим осаждением тромбоцитов с помощью АДФ (Петрищев H.H., 2001 ; Hladovec J., 1978).

Для электроинамикроскопического исследования эндотелия забор фрагментов головного мозга производили с областей, где по данным световой микроскопии наблюдались наибольшие патологические изменения в микроциркуляторном русле, наиболее сильно затрагивающие эндотелиальную выстилку. Фрагмент объемом около 1 мм3 фиксировали в 1% растворе глютарового альдегида 4 часа, и в течение 2 часов в 1% растворе четырехокиси осмия на веррналацетатном буфере при температуре + 4°С. Затем материал подвергали дегидратации в. серии спиртов возрастающей концентрации, проводили в окиси пропилена и заливали в эпоксидную смолу ERL-4206 (A.Spurr, 1968).

Определение уровня eNOS и эндотелшш-1, маркеров апоптоза: каспазы-3, рецепторов TRAIL, NF-kB. Для гистологического исследования под эфирным наркозом производили забор головного мозга крыс. Материал фиксировали в течение 48 часов в 10% растворе нейтрального забуференного формалина (pH 7,4). После фиксации материал проводили по общепринятой гистологической методике через батарею спиртов возрастающей концентрации, хлороформ и заливали в парафин.

На роторном микротоме изготавливали серийные срезы толщиной 5-6 мкм. В дальнейшем производили окрашивание гематоксилином и эозином по общепринятой гистологической методике (депарафинизация в ксилоле, проводка по спиртам убывающей концентрации до воды, окраска гематоксилином Бемера, дифференцировка солянокислым спиртом, окраска эозином, проводка по спиртам возрастающей концентрации до абсолютного этанола, просветление в ксилоле, заключение в канадский бальзам).

Для выявления степени функционирования эндотелия мозга в условиях стрептозотоцинового сахарного диабета, экспериментально вызванной недостаточности половых гормонов и эндотелиопротективного действия изучаемых веществ при данных патологиях оценивали оптическую плотность и использовали моноклональные антитела к эндотелину-1 (Endothelin-1 Receptor (ETA), Clone RJT 24, NCL-L-ETA P (HIER)) и моноклональные антитела к эндотелиальной NOS (Nitric Oxid Synthase, Clone RN5, NCL-NOS-3 F P (HIER)), к каспазе 3 (клон JHM62,

Novocastra), к рецептору TRAIL - апоптоз-индуцирующий лиганд (клон 27В12, Novocastra), к транскрипционному фактору NF-kB (NF-kappa В р65, BioGenex). Визуализацию проводили с помощью непрямого иммуно-пероксидазного метода с высокотемпературной и ферментной демас-кировкой антигенов. Индекс апопотоза рассчитывали как отношение эндотелиальных клеток с имуногистохимическими признаками апопотоза к нормальным эндотелиоцитам (%). Для достоверности полученных результатов применяли позитивные контроля антигенов (лимфатические узлы, печень при недифференцированном лейкозе), негативные контроли антигенов (предстательная железа, головной мозг) и негативные контроли антител (обработка срезов без нанесения первичных антител).

Для анализа морфологических показателей производили микрофотосъемку цифровой камерой Canon (Japan, 5.0 мегапикселей) на базе микроскопа Axiostar plus (Карл Цейс, Германия) с использованием объектива х40, хЮО и окуляра хЮ. Оценивали процентное отношение иммунопозитивных клеток к общему количеству эндотелиальных клеток мозга.

Статистическая обработка результатов исследования:

нормальность распределения выполнялась с использованием W критерия Шапиро-Уилка; анализ статистической значимости различий проводился с применением t-критерия Стьюдента; однофакторного дисперсионного анализа, критерия Стьюдента с поправкой Бонферрони; однофакторного дисперсионного анализа Крускала-Уоллиса, критерия Дана для множественных сравнений; дисперсионного анализа повторных измерений, критерия Тьюки; критерия Фридмана для анализа повторных измерений/критерия Ньюмена—Кейлса

Обработка данных производилась с помощью пакетов программ Microsoft Office Excel, BioStat 2008 5.2.5.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Оценка вазодилатирующей функции эндотелия различных сосудистых регионов.

Проведенный этап исследований позволяет дать суммарную оценку функционирования эндотелия различных сосудистых регионов, как в норме, так и при патологии различного генеза.

Существенно то, что один и тот же датчик, размещенный над тканью органа, регистрирует кровоток в определенной, сопоставимой по массе ткани, а не во всем органе, поэтому возможно корректное сравнение скоростей кровотока или изменений (прироста/падения) кровотока в разных сосудистых регионах.

I I

I

I

Примечание: АЦХ - прирост кровотока в ответ на введение ацетилхолина; н-Л-арг-падение кровотока в ответ на введение нитро-Л-аргинина.

Рисунок 1. Изменение мозгового, почечного, печеночного кровотока и кровотока в кожно-мышечной области при активации (А) (ацетил-холином) и подавлении (Б) (нЪа) синтеза оксида азота.

При введении АЦХ интактным животным скорость мозгового кровотока повышалась на 25%, в почечной ткани на 20%, в сосудах печеночной области (36%), в кожно-мышечной области кровоток увеличился на 19% от исходного I уровня. Введение нитро-Ь-аргинина приводило к снижению скорости кровотока в проекции среднемозговой артерии на 24,6%, в почке на 18,2%, в печени на 32,2%, в кожно-мышечной области на 16,5% (рисунок 1 А, Б). , Таким образом, введение АЦХ вызывало достоверное по отношению к

I исходным данным повышение, а нитро-Ь-аргинина- снижение скорости кровото-' ка во всех изучаемых сосудистых регионах, однако наиболее сильный прирост и ( падение наблюдались в печеночной ткани, органе с наименьшей исходной скоро с-I тью кровотока. Такая сосудистая реакция, возможно, связана с анатомическим строением микроциркуляторного русла печени и нахождением там клеток Купфе-ра, принимающих дополнительное участие в синтезе N0 и активирующихся в результате воздействия различных стимулов (Маянский Д.Н., Висе Э., Декер К., I 1993). Следует отметить, что регистрация кровотока в печени требует вскрытия \ брюшной полости и осложняется помехами связанными с близким расположе-I нием аорты, задней полой вены и диафрагмы легких. Исходя из этого, нами были ' выбраны в качестве объекта изучения эндотелиальных функций сосуды мозга т.к. I в течение опыта, легче обеспечить регистрацию мозгового кровотока, а полученные в ходе работы результаты свидетельствуют о том, что направленность измене-I ний сосудистого тонуса гетерогенных эндотелиальных областей одинакова.

Оценка влияния ЭСД, НПГ и операционной травмы на эндоте-! лиалъную дисфункцию.

1 У животных с ЭСД и НПГ наблюдается снижение стабильности и

мощности эндотелиальной 1ЧО-синтазной системы, ослабление эндотелио-

Б.

н-Л-арг

Ж ж 1

ш

-2:-

Мозговой кровоток Бедренный кровоток

Щ|Щ Печеночный кровоток | ~| Почечный кровоток

зависимой вазодилатации на фоне ЭСД и НПГ в 1,7 раза и 2,3 раза, соответственно (Рисунок 2).

Так же у животных с ЭСД и НПГ наблюдаются нарушения как со стороны коагуляционного (плазменного) гемостаза, так и со стороны сосу-дисто-тромбоцитарного (Рисунок 3,4).

А. Б. _

60%

20%

■20%

ш

Ацх

нтг

Юо нпг

50% 40% 30% 20% 10% 0% -10% -20% -30%

Ацх

НТГ

агд

В ЭСД □ Интакт

Примечание: АЦХ - введение ацетилхолина; НТГ-введенИе нитроглицерина; пЬа^-введение нитроЬаргинина; НПГ-оиерированные животные с удаленными маткой и придатками, ЛО - ложно-оперированные крысы; ЭСД - животные с стрептозотацированным сахарным диабетом, Интак -интактные крысы, * - (Р<0,05); ** - (Р<0,01); достоверно по отношению к группам интактных и ЛО животных (Достоверность оценивалась с помощью критерия Манна-Уитни)

Рисунок 2. Изменения церебрального кровотока животных с НПГ (А) и с ЭСД (Б) при модификации выделения и синтеза эндогенного оксида азота.

Индекс агрегации тромбоцитов

ЛО НПГ Интакт ЭСД

Максимальный наклон

ЛО_НПГ Интакт ЭСД

Индекс дезагрегации тромбоцитов

Интакт ЭСД

Примечание: НПГ-оперированкые животные с удаленными маткой и придатками, ЛО -ложнооперированные крысы; ЭСД - животные с стрептозотацированным сахарным диабетом. Интак - интактные крысы. * - (Р<0,05); *» -(Р<0,01); достоверно по отношению к группам интактных и ЛО животных (ранговый однофакторный анализ Крускала-Уоллиса. критерий Данна для множественных сравнений, непараметрический Ч- критерий Манна-Уитни).

Рисунок 3. Изменения индексов агрегации / дезагрегации тромбоцитов и максимального наклона у животных с недостаточностью половых гормонов и с сахарным диабетом.

Антикоагулянтный и антитромбогенный потенциал сосудистого эндотелия смещается в сторону повышения показателей агрегации тромбоцитов (повышение индекса агрегации тромбоцитов в 1,75 раза при НПГ и 2,25 раза при ЭСД, скорости агрегации в 1,6 раза при НПГ и 1,79 раза при ЭСД, снижение индекса дезагрегации тромбоцитов в 2,86 раза при НПГ и 3,14 раза при ЭСД). Увеличения скорости образования тромба на модели артериального тромбоза в 1,7 раза при НПГ и 2,6 раза при ЭСД (Рисунок 3,4). Под влиянием изучаемых патологий происходит достоверное (Р<0,05) укорочение тромбинового и протромбинового, а также активированного частичного тромбопластинового времени, повышение уровня фибриногена и фактора Виллебранда в крови (Рисунок 9), увеличение вязкости крови на всех скоростях сдвига (Таблица 7,8,9).

— ♦—ЭСД — »--интакт —*—НПГ

Примечание: ЭСД - животные с стрептозотацированным сахарным диабетом, Интак - интактные кры-сы, НПГ-оперированные животные с удаленными маткой и придатками * - (Р<0,05); ** -(Р<0,01); достоверно по отношению к группам интактных животных (ранговый однофаюторный анализ Круекала-Уоллиса, критерий Данна для множественных сравнений, непараметрический и- критерий Манна-Уитни)

Рисунок 4. Скорость образования тромба в сонных артериях у животных с НПГ и ЭСД, при аппликации хлорида железа на адвентицию сосуда.

При оценке вазодилатирующей функции эндотелия при хирургической травме, у интактных животных, отмечено, что в ответ на введение анализаторов СК у животных в первые и четвертые сутки после операции не достоверно отличались друг от друга. Введение же модификаторов синтеза 1 эндогенного оксида азота животным на второй и третий день после операции вызывало повышение скорости кровотока значительно ниже по сравнению со скоростью кровотока животных, тестируемых в первый и четвертый день. Введение Ь-аргинина животным на вторые и третьи сутки после операции приводило к достоверно значимому усилению кровотока в брюшине в отличии от животных прооперированных в первые сутки. Полученные данные свидетельствуют о физиологически обратимом процессе нарушения эндотелиальной функции при хирургическом вмешательстве (Рисунок 5).

нитроЬаргинина;

Рисунок 5. Изменения кровотока брюшины у животных в различные сроки после оперативного вмешательства при модификации синтеза

эндогенного оксида азота.

Стоит отметить, что ЭСД (Таблица 2) и НПГ сопровождаются

существенным повышением уровня ТГ, ХСЛПНП, ХС0бщ и снижением ХСлгаш, что

приводит к увеличению индекса атерогенности (Таблица 2). Таблица 2. Влияние ЭСД на показатели липидного спектра крови у животных (ммоль/л)

Группы животных ХСобщ ХС Лпвп ХС лгшп ТГ ИАТ

Интакт 2,58+0,07 0,85+0,05 1,42+0,09 0,68+0,03 2,09+0,17

ЭСД 3,8+0,15** 0,61±0,03** 2,83±0,15** 0,8±0,03* 5,5±0,46**

Примечание - * - (Р<0,05); ** - (Р<0,01); достоверно по отношению к группам интактных животных (ранговый однофакторный анализ Крускала-Уоллиса, критерий Данна для множественных сравнений, непараметрический и- критерий Манна-Уитни).

Существенно то, что активация атерогенных процессов, на фоне ЭСД и НПГ может лежать в основе нарушения эндотелиальной функции иувеличения вязкости крови (Таблица 3) и, соответственно, скорости напряжения сдвига, так как деформабельность эритроцитов прямо коррелирует с гиперглицерхолестеринемией и повышением содержания липопро-теидов низкой плотности (Ефимов A.C., 1989; Балашова Т.С., 1996; Patel R. Р.,

Hogg N., Kim-Shapiro D. В., 2011).

Нарушение функции эндотелия при ЭСД и НПГ, кроме всех выше перечисленных патофизиологических сдвигов, сопровождается выражен-

ными патологическими изменениями его морфологического состояния (Загидуллин 111.3., и д.р., 2010; СИ^аш К., Онпте1ег Б., 2011). При световой и электронной микроскопии, у животных с ЭСД и НПГ, выявлено усиление тромбообразования и лейкоцитарной инфильтрации, увеличение соотношения интима/медиа и количества циркулирующих эндотелиоцитов. Кроме этого, при НПГ в 1,5 раза и при ЭСД в 2,2 раза наблюдалось увеличение С-реактивного белка и, соответственно, усилении провоспалительного статуса эндотелия.

Таблица 3. Влияние ЭСД и НПГ на вязкость крови крыс

Группы животных Скорость сдвига, сПз

300с1 100с' 50с' Юс"1

Интакт 3,64+0,35 4,58+0,31 6,78+0,41 8,41±0,34

ЭСД 4,95±0,18** 6,72+0,34** 9,8+0,67*** 15,12+0,7***

ЛО 3,55±0,14 4,7±0,32 5,91+0,36 7,69+0,45

НПГ 4,15+0,19* 6,5±0,23** 7,12±0,34** 12,01±0,78**

Примечание: НПГ-оперированные животные с удаленными маткой и придатками, ЛО -ложнооперировапиые крысы; ЭСД - животные с стрептозотацированным сахарным диабетом, Иптак -интактные крысы, * - (Р< 0,05); ** - (Р< 0,01); *** - (Р< 0,001); достоверно по отношению к группам интактных и ЛО животных (ранговый однофакгорный анализ Крускала-Уоллиса, критерий Данна для множественных сравнений, нспарамстрический и- критерий Манна-Уитни).

Проведенный комплексный морфо-функциональный анализ развития и выраженности эндотелиальной дисфункции при ЭСД и НПГ позволяет говорить о высокой валидности предложенных нами моделей формирования нарушений функции эндотелия и адекватности подходов к выявлению эндотелиопротекгорной активности фармакологических веществ.

Оценка влияния сердечно-сосудистых средств, производных ГАМК, веществ, обладающих аптиоксидаптной активностью и фла-воноидов па вазодилатирующую функцию эндотелия у животных с ЭСД и НПГ.

У животных с ЭСД и НПГ, диротон, симвагексал, небилет достоверно улучшали вазодилатирующую функцию эндотелия, повышали стабильность системы синтеза N0. Конкор и нифедипин также положительно влияли на вазодилатирующую функцию Эндотелия, хотя и в меньшей степени (Таблица 4).

Полученные результаты о положительном влиянии сердечнососудистых средств на вазодилатирующую функцию эндотелия подтвер-

ждают ранее выполненные исследования (Стрюк Р.И., Воронков Л.Г., 2002, 2003, Jorge РА., 2010; Kalipnda Palian, Weis М, Yamasaki, 2010) и впервые позволяют провести сравнительное ранжирование по данному виду активности как внутри группы сердечно-сосудистых средств, так и между другими классами фармакологических веществ, изучаемых в данном исследовании.

Таблица 4. Изменения кровотока у животных с ЭСД при модификации синтеза NO на фоне введения сердечно-сосудистых средств

Группы животных Изменения кровотока при введении анализаторов от исходного уровня, в %

Прирост кровотока Падение кровотока

Ацетилхолин L-аргинин Нитроглицерин N-L-аргинин

Интакт 44,05+2,35 11,24+1,34 50,25±3,25 37,84±2,23

ЭСД 12,08±1,41* 53,19+4,34** 48,52±2,2 17,34±1,9*

ЭСД +Вессел Дуэ Ф 28,54+2,54# 13,15+1,49^ 47,7+3,27 32,03±2,18#

ЭСД +Диротон 24,13±3,19£¿ 17,32+1,85^ 49,52±2,46 31,5±2,29#

ЭСД+Симвагексал 23,45+1,5 Ш 2-1,86±2,35# 46,58±4,09 30,6±2,52#

ЭСД +Небилет 22,97+3,11^ 23,91±2,21^£ 49,62±3,77 29,13±2,5#

ЭСД+Конкор 17,71±2,43# 36,54+3,93# 50,19+3,51 24,88+1,915t

ЭСД +Нифедипин 14,15+2,03 40,81 ±2,5^ 56,05±4,16 19,89+1,52

ЛО 32,85+4,79 9,74+1,21 47,7+1,37 45,79+6,75

НПГ 13,81+2,16** 58,41+6,47** 51,67+1,87 15,03±2,91**

НПГ+Вессел Дуэф 36,85 +3,78# 15,23±1,84# 52,61+1,75 27,5±3,09#

НПГ +Диротон 30,28+2,37^ 17,29±2,4££ 51,55±2,07 25,1±2,(йФФ

НПГ +Симвагексал 27,35+2,00^ 21,47+1,75^ 48,07+1,68 25,53±3,36#

НПГ +Небилет 26,37±2,09# 20,26+2, 47,91±2,35 25,0±2,57?¥

НПГ +Конкор 19,45+1,73^ 33,37+2,65^ 51,05+1,64 21,02±2,92?¿

НПГ+Нифедипин 16,46±l,29?í 44,53±2,08 55,58+1,33 17,01+2,05

Примечание НПГ-оперированные животные с удаленными маткой и придатками, ЛО -ложнооперированные крысы; ЭСД - группа животных с экспериментальным сахарным диабетом без лечения; интакт - интагсгная группа животных; * - (Р<0,05); **-(Р<0,01) достоверно по отношению к группе интактных и ЛО животных; * - (Р<0,05); * (Р<0,01)- достоверно по отношению к группе животных с ЭСД и НПГ (ранговый однофакторный анализ Крускала-Уоллиса, критерий Дайна для множественных сравнений, непараметрпческий и- критерий Манна-Уитни)

Исследуемые производные ГАМК - соединения РГПУ-189 и РГПУ-147, достоверно улучшают ЭЗВД, фенибут и пикамилон в меньшей степени улучшают вазодилатирующую функцию эндотелия (Таблица 5) у животных сНПГиЭСД.

Таблица 5. Изменения кровотока при модификации синтеза N0 у животных с ЭСД, получавших производные ГАМК.

Группы животных Изменения кровотока при введении анализаторов от исходного уровня, в %

Ацетилхолин Ь-аргинин Нитроглицерин И-Ь-аргинин

Интакт 44,05±2,35 11,24±1,34 50,25±3,25 -37,84*2,23*

ЭСД ,10,23±0,51* 50,2+4,52** 50,91±2,15 -14,05±1,34*

ЭСД +РГПУ-189 17,61±0,73# 25,53+2,28# 53,22±4,25 -22,86±2,19^:

ЭСД +РГПУ-147 16,23+0,75^ 27,38±2,09^ 47,48+2,74 -20,59±1,79#

ЭСД+Пикамилон 11,83±0,89 40,17+3,48 52,37±5,62 -16,6±1,98 '

ЭСД +Фенибут 11,77±0,94 41,46±3,21 49,45±3,43 - -15,45±1,84

ло 36,24±1,94 8,81±0,94 46,73±3,01 -43,88±4,92

нпг 12,41±2,1* 63,54+6,26** 43,02±3,46 -13,55±2,93*

НПГ +РГПУ-189 22,28±3,04# 27,45±2,58# 46,38±2,59 -20,69±2,76#

НПГ +РГПУ-147 20,73±2,11# 29,7+2,71^ 43,71+2,71 -19,47±2,52^ .

НПГ +Пикамилон 14,82±1,71 50,42±5,18 49,34±2,5 -15,89+1,86

НПГ +Фенибут 14,21 ±2,07 50,07±5,37 57,33±4,43 -14,76±1,33

Примечание - обозначения как в таблице 4.

Таблица 6. Изменения прироста кровотока у животных с ЭСД на фоне введения веществ с анитоксидантной активностью

Группы животных Изменения кровотока при введении анализаторов от исходного уровня, в %

Ацетилхолин Ь-аргинин Нитроглицерин М-Ь-аргинин

Иитакт 39,41±2,24 7,48±1,09 43,95±2,77 -35,66±2Д1

ЭСД 11,04±1,58* 45,56±5,87** 48,61*3,27 -15,07 ±2,17**

ЭСД +Флавицин 18,48±1,93?^ 21,89±2,84?^ 47,55±3,64 -23,4±2,3 ФФ

ЭСД ч-Диосмин 14,14+1,61 32,92+4,03 49,94±4,00 -18,74+1,76

ЭСД+Кверцетин 17,2±2,37£ 25,25±3,36£ 50,47±3,03 -21,52+2,05^

ЭСД+Гесперидин 15,03±1,95 34,34+3,06^ 52,48+1,68 -20,25+1,74^

ЭСД +Мексидол 15,74±1,48 29,71+3,51?^ 54,85±2,57 -21,51+1,92^

ЭСД+Предукгал 13,65±1,3 36,21±3,62 49,92±3,38 -18,63+1,38

ЭСД+Дибикор 12,36±1,3 38,75±3,54 50,17+3,37 -16,35+1,69

ло 41,79±5,38 8,69+1,41 48,51±0,98 -38,09±4,51

нпг 14,57±2,03* 50,22±6,94** . 50,76+1,93 -13,65±2,27*

НПГ +Флавицин ч 25,02+2,46# 20,88±2,48# \ 48,94±1,3 -20,0±2,09?^ N.

НЛГ +Диосмин 19,0±1,16# 32,31±3,69# 47,54±2,33 -16,3+1,71

НПГ +Кверцетин 23,92+1,43# 24,23±1,37# 50,99±2,21 -19,5+0,82^

НПГ +Гесперидин 19,51+1,13# 35,87±2,33?ь 45,69±3,3 -18,67±1,42^

НПГ +Мексидол 20,59±1/Ц£ 30,69+3,21;^ 53,11+1,58 -19,14±1,73#

НПГ +Предуктал 18,07+1,8^ 38,45±4,07# 48,3+1,3 -16,84±1,45

НПГ +Дибикор 16,5±1,65 38,76+4,59# 47,54+2,33 -14,72±1,5

Примечание - обозначения как в таблице 4.

Среди исследуемых флавоноидов (кверцетин, флавицин, диосмин, гесперидин) и соединений с антиоксидантным действием (мексидол, предуктал и дибикор) наиболее выраженное действие на ЭЗВД оказали флавицин, кверцетин и мексидол. Другие вещества менее выражено улучшали ЭЗВД у животных с ЭСД и НПГ (Таблица 6).

Сравнивая параметры прироста и падения скорости кровотока в ответ на активацию и блокаду синтеза NO у контрольных животных с ЭСД и НПГ без фармакологической поддержки и у животных, получавших изучаемые соединения, можно расположить вещества из разных фармакологических групп в порядке убывания по степени улучшения ЭЗВД в следующем порядке: Вессел Дуэ Ф > Диротон > Симвагексал > Небилет > РГПУ-189 > Флавицин > РГПУ-147 > Кверцетин > Мексидол > Конкор > Гесперидин > Диосмин > Предуктал > Пикамилон > Нифедипин > Фенибут > Дибикор.

Оценка влияния сердечно-сосудистых средств, производных ГАМК, веществ, обладающих антиокидантной активностью и флавоноидов на антитромботическую функцию эндотелия у животных с ЭСДиНПГ.

Так как ЭПД одних и тех же соединений при разных экспериментальных патологиях была сопоставима, а более выраженная ЭД наблюдалась при ЭСД, то в дальнейшем в автореферате нами представлены рисунки и таблицы по изучению ЭПД веществ только в условиях данной патологии.

Сосудистый эндотелий обладает рысокой тромборезистентностью и играет важную роль в сохранении жидкого состояния крови и предупреж- 4 дении тромбозов, обеспечении адекватной потребностям тканей микроциркуляции (Fitzgerald D.J. 2001; Zaheer Z., Robinson T., Mistri A.K., 2011). Поэтому в комплексном изучении эдотелиотропного действия исследуемых соединений мы изучали их влияние на антитромботическую функцию эндотелия.

Изучение влияния сердечно-сосудистых средств, производных ГАМК, флавоноидов и веществ, обладающих антиоксидантными свойствами, на тромбоцитарный и коагуляционный гемостаз, показало, что все исследуемые соединения обладают способностью повышать антитромбо-генный и антикоагуляционный потенциал эндотелия при эндотелиальной дисфункции, вызванной ЭСД (Рисунок 6,7,8,9) и НПГ.

Примечание: ЭСД - группа животных с экспериментальным сахарным диабетом без лечения; ингакг -интактная группа животных; * - (Р£0,05); **-(Р£0,01) достоверно по отношению к группе интактных животных; *-(Р<0,05); *£(Р<0,01)- достоверно по отношению к группе животных с ЭСД; (ранговый однофакторный анализ Крускала-Уоллиса, критерий Данна для множественных сравнений, непараметрический и-критерий Манна-Уитни).

Рисунок 6. Влияние сердечно-сосудистых средств на индекс агрегации и индекс дезагрегации тромбоцитов у животных с ЭСД.

Примечание: обозначения, как на рисунке 6. !

Рисунок 7. Влияние производных ГАМК на индекс агрегации и индекс дезагрегации тромбоцитов у животных с ЭСД.

Стоит отметить, что наиболее выраженное влияние на антитромбо-тическую функцию эндотелия среди сердечно-сосудистых средств проявил Весел Дуэ Ф, симвагексал, из группы производных ГАМК - соединение РГПУ-189 и из флавоноидов - флавицин, которые лишь незначительно уступали по влиянию на антитромботическую функцию эндотелия гепариноиду-Вессел Дуэ Ф (Рисунок 6,7,8,9).

Примечание: обозначения, как на рисунке 6

Рисунок 8. Влияние антиоксидантов на индекс агрегации и индекс дезагрегации тромбоцитов у животных с ЭСД.

Рисунок 9. Влияние изучаемых веществ на уровень фактора фон Вил-лебранда у животных с ЭСД

При ЭСД (таблица 7, 8, 9) и НПГ, оценивалась вязкость крови, и соответственно влияние на этот показатель исследуемых веществ. Все изучаемые соединения в той или иной мере снижали вязкость крови, однако

Примечание: ЭСД группа животных с экспериментальным сахарным диабетом без лечения: интакт - интактная группа животных; * -(Р<0,05); **-(Р<9.01) достоверно по отношению к группе интактных животных; ^ - (Р<0,05); ^ "Ф-

(Р<0,01)- достоверно по отношению к группе животных с ЭСД; (ранговый однофакторный анализ Крускала-Уоллиса, критерий Данна для множественных сравнений, непараметрический и- критерий Манна-Уитни)

ЗСД+Нифедипин ЭСД+Конкор ЭСД* Небилет ЭСД+Диротон ЭСД+Симеагексал ЭСД+Вессел Дузф

наиболее существенное влияние среди сердечно-сосудистых средств оказал Весел Дуэ Ф, симвагексал, среди производных ГАМК - РГПУ-189, среди флавоноидов-фдавицин.

Таблица 7. Влияние сердечно-сосудистых средств на вязкость крови крыссЭСД

Группы животных Скорость сдвига, сПз

300с'1 100с'1 50с'1 Юс"'

Контроль-интакт 3,41±0,18 4,9+0,25 6,4+0,38 8,54±0,55

ЭСД 4,85±0,22* 6,85±0,56* 9,51 ±0,71 ** 15,48+0,6**

ЭСД+Вессел Дуэ Ф 3,8±0,21 5,1±0,44# 6,81±0,75## 9,7±0,72##

ЭСД +Симвагексал 3,85±0,34 5,15±0,45# 7,13±0,41# 10,03±0,56##

ЭСД+Диротон 3,86±0,41 5,25±0,56# 7,55+0,71 10,46±0,82#

ЭСД +Небилет 3,93+0,31 5,41+0,53 7,87±0,23 10,75±0,73#

ЭСД + Конкор 4,08+0,21 5,9+0,41 8,15±0,23 12,31+0,67

ЭСД + Нифедипин 4,1±0,13 6,13+0,31 8,41±0,42 12,22±0,78

Примечание: ЭСД- группа животных с экспериментальным сахарным диабетом без лечения; интакт -интактная группа животных; * - (Р<0,05); **-(Р<0,01) достоверно по отношению к группе интактных животных; * - (Р<0,05); Ф * (Р<0,01)- достоверно по отношению к группе животных с ЭСД; (ранговый однофакторный анализ Крускала-Уоллиса, критерий Данна для множественных сравнений, непараметрический Ц- критерий Манна-Уитни).

Таблица 8. Влияние производных ГАМК на вязкость крови крыс с ЭСД

Группы животных Скорость сдвига, сПз

300с'1 100с"1 50с"' Юс"1

Контроль-интакт 3,64+0,35 4,58+0,31 6,78+0,41 8,41+0,34

ЭСД 4,95+0,18* 6,72+0,34* 9,8±0,67* 15,12+0,7**

ЭСД +РГПУ-189 3,91+0,33 4,7+0,51# 7,11+0,31# 10,39+0,81##

ЭСД + РГПУ-147 4,08+0,22 4,98±0,51 7,45+0,67 11,4+0,65#

ЭСД + Фенибут 4,15+0,41 5,18+0,32 7,9±0,32 11,97+0,71

ЭСД + Пикамилон 4,61+0,18 6,3+0,34 8,91+0,45 13,59±0,72

Примечание: обозначения, как в таблице 7.

Группы животных Скорость сдвига, сПз

300с'1 100с"' 50с 1 10с1

Контроль-интакт 3,81+0,28 4,72+0,21 6,15+0,45 9,11 ±0,67

ЭСД 4,75±0,23* 6,12+0,25* 9,6+0,56* 14,68±0,55**

ЭСД +Флавицин 4,02±0,23 5,1±0,14 6,95+0,31# 10,73±0,77#

ЭСД +Кверцетин 4,2+0,18 5,61+0,23 7,15+0,3 П,28+0,28#

ЭСД + Мексидол 4,25+0,18 5,78+0,34 7,44+0,31 11,39+0,71 #

ЭСД + Гесперидин 4,31+0,14 5,91+0,33 7,56±0,52 11,72±0,б9"

ЭСД + Дибикор 4,44+0,14 5,98+0,31 8,1 ±0.38 11,57+0,43

ЭСД + Диосмин 4,4+0,19 6,02±0,34 8,31 ±0,56 12,03+0,78

ЭСД + Предуктал 4,56+0,19 6,0+0,31 8,79±0,56 12,61+0,78

Примечание: обозначения, как в таблице 7.

По степени влияния натромбоцитарный и коагуляционный гемостаз все изучаемые вещества из исследуемых фармакологических групп можно распределить следующим образом: Вессел Дуэ Ф > Симвагексал > РГПУ-189 > Диротон > Небилет > РГПУ-147 > Флавицин > Кверцетин > Конкор > Нифедипин > Мексидол >"Фенибут > Гесперидин > Дибикор > Диосмин > ~ Предуктал > Пикамилон.

Оценка влияния сердечно-сосудистых средств, производныхГАМК, веществ, обладающих аитиокидаитной активностью и флавоноидов на метаболический профиль у животных с ЭСД иНПГ.

Учитывая выраженные нарушения углеводного и жирового обмена при НПГ и, особенно, при ЭСД и их важной роли в развитии ЭД, представлялось важным дать оценку влияния изучаемых веществ на метаболический профиль на фоне экспериментально вызванного сахарного диабета и недостаточностью половых гормонов, что может расширить представления о возможных механизмах эндотелиотропного эффекта исследуемых веществ (таблица 10).

Таблица 10. Влияние антиоксидантов на уровень глюкозы в крови у крыс с ЭСД (ммоль/л)

~Группа"~— 3 день 7 день 14 день 21 день 30 день

Интакт 2,5±0,24 2,81+0,19 2,75±0,32 2,6±0,28 2,64+0,35

ЭСД 13,1±0,47** 15,55+0,64** 16,18+0,47** 18,14±0,56** 19,71+0,4**

ЭСД +Флавицин 12,87±0,29 10,77+0,46# 13,12+0,5# 14,48±0,7# 15,37+0,6#

ЭСД +Кверцетин 12,42+0,6 11,87+0,65# 14,07+0, 15,52±1,16 16,2±0,62#

ЭСД +Гесперидин 12,92+0,53 14,11+0,72 15,22+0,69 16,48±0,53 17±0,68^

ЭСД +ДИ0СМИН 12,61+0,36 14,68+0,58 15,9+0,61 16,6+0,39 17,28±0,37

ЭСД +Мексидол 13,02+0,34 14,07+0,3 15,3±0,73 16,51±0,87 17±0,74

ЭСД +Предуктал 12,42+0,7 15,08±0,75 17,21+0,4 17,01+0,9 17,65+0,61

ЭСД +Дибикор 13,12+0,53 12,47±0,51^ 14,32+0,58^ 15,31+0,66# 16,5+0,48^"

Примечание: обозначения, как на рисунке 7.

У животных с ЭСД применение соединений с антиоксидантными

свойствами приводило к статистически значимому снижению сахара в крови только под влиянием флавицина, кверцетина, дибикора. Все остальные изучаемые соединения влияния на уровень гипергликемии не оказывали.

Значительный гиполипидемический эффект наблюдался у симва-гексала и флавицина, снижавших ИА в 2,2 и 2 раза, соответственно, а так же мексидола 1,7 раза и РГПУ-189 1,5 раза, которые превосходили по степени влияния на липидный обмен все другие исследуемые вещества.

Оценка влияния изучаемых веществ на противовоспалительную и антипролиферативную функции эндотелия у животных сЭСДиНПГ.

Под воздействием многих повреждающих факторов происходит изменение целостности и структуры эндотелия с нарушением практически

всех его функций, в том числе прогивоспалительной и антипролифера-тивной функций (Maltais S., Perrault L. P., Ly H. Q., 2011 ).

Под влиянием исследуемых соединений, с помощью световой микроскопии, было выявлено достоверное снижение признаков воспаления (уменьшение лейкоцитарной инфильтрации и т.д.), повышенной тромбогенности - снижение количества и размеров пристеночных тромбов и т.д. (что согласуется с данными по изучению влияния РГПУ-189, фенибута, флавнцина, мексидола, Всссел Дуэ Ф на антитромботическую функцию эндотелия), отека стенки сосуда, пролиферации, соотношения комплекса интима/медиа, проницаемости сосудистой стенки, нарушения структуры эндотелиальных клеток, в большей степени в группах, получавших Вессел Дуэ Ф, РГПУ-189 и флавицин.

Одним из маркеров повреждения эндотелия является количество циркулирующих эндотелиоцитов (ЦЭ) (Шумахер Г.И., 2008; Hladovec J. 1978). Исследование показало, что соединения РГПУ - 189 и флавицин статистически значимо снижают число ЦЭ (таблица 11). Таблица 11. Влияние РГПУ-189, фенибута, флавицина, мексидола и Вессел Дуэ Ф на количество циркулирующих эндотелиоцитов у животных сЭСД иНПГ

Группы ЦЭ /100 мкл Группы ЦЭ /100 мкл

Контроль-интакт 3,2+0,85 Контроль- Л О 3,0+0,9

ЭСД 11,3±0,74** НПГ 8,7+0,83**

ЭСД+РГПУ189 4,4+0,98*'' НПГ+РГПУ-189 5,3+0,81*

ЭСД +Фенибут 9,8+0,75 НПГ+Фенибут 7,2+1,01

ЭСД+Флавицин 6,4±1,0Г НПГ+Флавицин 6,0+0,71#

ЭСД+Мексидол 8,8+0,75* НПГ+Мексидол 7,5±0,61

ЭСД+Вессел Дуэ Ф 4,8+0,97"# НПГ+Вессел Дуэ Ф 4,3±1,01##

Примечание: ЦЭ - циркулирующие эндотелноциты; НПГ-оперированные животные с удаленными маткой и придатками, ЛО - ложнооперированные крысы; ЭСД - животные с стрсптозотацированным сахарным диабетом, Интак- интактные крысы. * - (Р<0,05); ** - (Р<0,01) достоверно по отношению к группам интактных и ЛО животных; £ - (Р<0,05); ^ ^ (Р<0,01) - достоверно по отношению к группе животных с ЭСД и НПГ (ранговый однофакторнын анализ Крускала-Уоллиса, критерий Данна для множественных сравнений, непараметрический и - критерий Манна-Уитни)

Кроме этого, при электронной микроскопии эндотелиальных повреждений было выявлено, что ЭСД и НПГ приводит расслоению базальной мембраны, изменению ядер эндотелиоцита по типу апоптоза, вакуолизации митохондрий с уменьшением количества митохондриальных крист. По всей видимости, такого рода нарушения связаны с активацией «внешнего апоптоза», запуск которого ассоциирован с действием свободно-радикальных процессов, активацией провоспалительных агентов (цитоки-нов и интерлейкинов) и т.д. (Непомнящих Л.М., и др., 2011; Ong S.-B., Hausenloy D. J., 2010). Введение изучаемых соединений РГПУ-189 и флавицина животным с ЭСД и НПГ приводило к достоверному снижению признаков апоптоза клеток эндотелиоцитов с восстановлением их ультраструктуры.

Иммупогистохими ческий анализ влияния изучае.мых веществ на уровень экспрессии e-NOS, эндотелина-1 и маркеров апоптоза: TRAIL, каспаза-3, nF-kB.

На сегодняшний день известно, что в не зависимости от причины активации апоптоза, определяющую роль в его развитии занимают каспазы, образующие взаимно активирующий друг друга, разветвленный, многократно дублирующий себя каскад. В результате взаимодействия каспазного каскада активируется эффекторная каспаза 3, которая вызывает расщепление внутриклеточных белков и влечет гибель клетки (Мушкам-баров H.H., Кузнецов C.JL, 2003). Кроме этого, в запуске программы апоптоза важную роль играют расположенные на клеточной мембране специфические рецепторы TRAIL (TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand), являющиеся важнейшим сигнальным путем запуска апоптоза различными факторами: физиологическими; агентами, вызывающими повреждение; лечебными препаратами; токсинами (этанол и др.); другими специфическими лигандами. Активация TRAIL рецепторов через ряд биохимических процессов неразрывна связана с усилением работы «доменов смерти», что в конечном счете приводит к гибели клетки (Мушкамбаров H.H., Кузнецов С.Л., 2003).

Кроме этого стоит отметить, что в основе апоптотического повреждения эндотелиоцитов при различных патологических состояниях лежит активация ядерного фактора каппа В (NFkB) - потенциал-чувствительного транскрипционного фактора, регулирующего, в частности, ген экспрессии многих цитокинов, фактора роста, молекул адгезии и ферментов, включенных в процессы иммунитета и антивоспалительный ответ (Н. F. Galley and N. R. Webster, 2004; Biswas S. K., Lewis С. E„ 2010; Taylor C.Wallace, 2011).

При выполнении блока иммуногистохимических исследований были получены следующие результаты. Стрсптозотоцин индуцированный сахарный диабет, в большей степени, и экспериментально вызванная недостаточность половых гормонов, в меньшей степени, приводит к снижению экспрессии эндотелиальной NOS и увеличение экспрессии эндотелина-1, как специфических маркеров эндотелиальных нарушений (таблица 12). Кроме этого у животных с ЭСД и НПГ по сравнению с интактными животными, было отмечено достоверное увеличение экспрессии маркеров апоптоза (каспазы-3, TRAIL, NFkB) (таблица 13). Таблица 12. Морфометрическая оценка экспрессии эндотелина и эндо-телиальной-NOS по оптической плотности у животных с экспериментальной недостаточностью половых гормонов, сахарным диабетом и животных получавших изучаемые соединения.

Эндотелии (Clone RJT) Эндотелиалытя-NOS (Clone RN5)

Оптическая плотность (единицы яркости)л

Контроль интактные 35,9+3,5 86,3+3,2

НПГ 68,7+3,7 43,7±2,5*

сд 79,2±3,6* 34,4+2,7"

НПГ+Вессел Дуэ Ф 43,7+2,1** 76,3±2,8*#

СД+Вессел Дуэ Ф 50,2±2,6* 69,4±2,4#

НПГ+РГПУ189 51,9+3,6* 54,0+3,5*

СД+ РГПУ189 52,0+2,4* 58,3±2,3#

НПГ+Мексидол 49,1 ±2,7* 60,1+3,2*

СД+Мексидол 50,2+1,9* 62,8+3,1#

НПГ+Флавицин 50,4+1,8* 67,9±2,3##

СД+Флавицин 45,7±4,4## 74,4±2,4##

НПГ+Фенибут 60,6+2,1 54,8+1,8

СД+Фенибут 59,8+2,8 50,3+1,3

Примечание: А- оптическую плотность рассчитывали с помощью программы морфометрического анализа изображений ВидеоТест-Морфо 4.0 (Россия). НПГ-оперированные животные с удаленными маткой и придатками, ЭСД - животные с стрсптозотацированным сахарным диабетом, Интак -интактные крысы;' - р<0,05;'' - р<0,01-достовсрно по отношению к группе интакгных животных; -р<0,05; р<0,01 достоверно по отношению к группам животных с недостаточностью половых гормонов и сахарным диабетом (критерий Уайта-Вилкоксона)

Таблица 13. Иммуногистохимичсские характеристики эндотелиоцитов noAHred D.C. etal. (1998).

Интенсивность экспрессии Количество клеток

Интакт ЭСД Флавицин РГПУ -189 Интакт ЭСД Флавицин РГПУ-189

Каспаза 3 + +++ + ++ + +++ + +

TRAIL + +++ ++ ++ + ++ + +

nF-kB + +++ ++ + + ++ + +

Примечание: ЭСД - животные с стрептозотацированным сахарным диабетом, Интак - интактные крысы

Представленные в таблице данные о влиянии соединения РГПУ-189 и флавицина и свидетельствующие об увеличении концентрации e-NOS и снижении уровня эндотелина, объясняют их эндотелио-протекторное действие. Кроме этого, в ходе работы было отмечено, что РГПУ-189 и флавицин достоверно снижали уровень экспрессии каспазы-3, TRAIL и NF-kB у животных со стрептозотоцин индуцированным сахарным диабетом (таблица 13, 14), что может лежать в основе их антиапоптопи-ческого действия.

Таблица 14. Индекс апоптоза эндотелиоцитов.

Группы Апоптотический индекс %

Интактная 3,6±0,2

ЭСД 36,2±2,9* *

РГПУ-189 14,3±1,2##

Флавицин 19,25±1,9#

Примечание: ЭСД - животные с стрептозотацированным сахарным диабетом, Интак - интактные крысы' - р<0,05; '' - р<0,01-достоверно ио отношению к группе интасгных животных;" - р<0,05; "*-р<0,01 достоверно по отношению к группам животных с недостаточностью половых гормонов и сахарным диабетом (критерий Уайта-Вилкоксона)

Следует отметить, что полученные в при электронной микроскопии данные и в связи с ними выдвинутые ранее предположения о прямом влиянии изучаемых веществ РГПУ-189 и флавицина на систему синтеза эндогенного оксида азота и снижении процессов апоптоза полностью подтвердили результаты имуногистохимического исследования.

Таким образом, соединение РГПУ-189 и флавицин у животных с ЭСД и НПГ вызывают улучшение вазодилатирующей, антитромботической,

антипролиферативной, противовосполительной функций эндотелия. В основе высокой эндотелиопротекторной активности соединения РГПУ-189 и флавицина по всей видимости лежит снижение апоптоза (каспазы-3, TRAIL, NF-kB), увеличении активности c-NOS и снижении экспрессии эпдотелина-1.

ВЫВОДЫ:

1.При экспериментальном сахарном диабете (ЭСД) и недостаточности половых гормонов (НПГ) отмечается выраженная эндотелиальная дисфункция (ЭД), что проявляется в снижении вазодилатиругощей в 2,5 и 1,7 раза, соответственно, антитромботической в 1,7 и 1,3 раза, противовоспалительной функций в 2,2 и 1,5 раза, и увеличение количества циркулирующих эндотелиоцитов в 3,5 раза и 2,9 раза. При операционной травме также наблюдается выраженная эндотелиальная дисфункция, однако она носит относительно кратковременный, обратимый характер и через трое -четверо суток нормальная функция восстанавливается. Полученные результаты позволяют рекомендовать ЭСД и НПГ для моделирования эндоте-лиальной дисфункции в эксперименте.

2. При проведении тестирования вазодилатирующей функции эндотелия различных сосудистых регионов (мозг, печень, почка и кожно-мышечная область), выявлен однонаправленный ответ сосудов. Наибольшая вазодилатирующая реакция наблюдалась в сосудах печени и мозга, в меньшей степени в почке и кожно мышечной области. Результаты исследования позволяют экстраполировать полученные в ходе эксперимента данные по изменению функции эндотелия в одной сосудистой области и на другие сосуды с разным типом эндотелия.

3. Разработанный комплексный морфо-функциональный подход изучения эндотелиальной функции/дисфункции может применяться для оценки вазодилатирующей, антитромботической, противовоспалительной, антипролиферативной функций эндотелия, позволяет оценить мощность функционирования N0 системы и выраженность ЭД, а также эндотелио-протективное действие изучаемых веществ.

4. По степени улучшения вазодилатирующей функции эндотелия под влиянием исследуемых соединений их можно расположить следующим образом: Вессел Дуэ Ф > Диротон > Симвагексал > Небилет > РГПУ-189 > Флавицин > РГПУ-147 > Кверцетин > Мексидол > Конкор > Гесперидин > Диосмин > Предуктал > Пикамилон > Нифедипин > Фенибут> Дибикор.

5. По степени улучшения антитромботической функции эндотелия под влиянием изучаемых соединений их можно расставить в следующем порядке: Вессел Дуэ Ф > Симвагексал > РГПУ-189 > Диротон > Небилет >

РГПУ-147 > Флавицин > Кверцетин > Конкор > Нифедипин > Мексидол > Фенибут > Гесперидин > Дибикор > Диосмин > Предуктал > П икамилон.

6. Новое производное ГАМК - РГПУ-189 и флавицин выражено улучшают противовоспалительную и антипролиферативную функции эндотелия, что проявляется в снижении уровня С-реактивного белка, уменьшении морфологических признаков воспаления, уменьшении соотношения интима/медиа, пролиферации и проницаемости сосудистой стенки, восстановлении структуры эндотелиоцитов, снижении их десква-мации, апоптоза и некроза у животных с ЭСД и НПГ.

7. Исследуемые производные ГАМК - соединения РГПУ-189 и РГПУ-147 и флавоноиды уменьшают гиперхолестеринемию, индекс атерогенности у животных с ЭСД и НПГ. Флавицин и в меньшей степени другие исследуемые флавоноиды снижают гипергликемию.

■ 8. Соединения РГПУ-189 и флавицин вызывают угнетение экспрессии маркеров апоптоза (TRAIL, каспаза-3, NF-kB), снижение экспрессии эндотелина-1 и усиление активности e-NOS, что очевидно лежит в основе их эндотелиопротекторного действия.

9. Из всех исследуемых веществ Вессел Дуэ Ф оказал наиболее выраженное эндотелиопротекгорное действие, что позволяет рекомендовать его в качестве эталонного препарата сравнения при сопоставлении эндо-телиотропных эффектов различных исследуемых веществ.

Практические рекомендации

Разработанный комплексный морфо-функциональный подход может применяться для оценки степени ЭД (вазодилатирующей, антитромбо-тической, противовоспалительной, антипролиферативной функций эндотелия), мощности функционирования N0 системы, а также дает возможность оценить эндотелиотропные свойства исследуемых веществ.

Проведенный сравнительный анализ полученных данных о влиянии известных сердечно-сосудистых средств, флавоноидов, веществ, обладающих антиоксидантной активностью, и производных ГАМК и гепариноида на эндотелиальную дисфункцию в условиях гормональных нарушений различного генеза позволил выявить соединения с высокой эндотелио-протективной активностью: Вессел Дуэ Ф, диротон, симваГЕКСАЛ, небилет, мексидол, которые могут применяться в комплексной терапии ЭД при ассоциированных с нею сердечно-сосудистых заболеваниях, а также для профилактики и лечения сосудистых осложнений, связанных с СД и НПГ. Полученные данные свидетельствуют о перспективности дальнейшего изучения соединения РГПУ-189 и флавицина, для создания на их базе новых препаратов с эндотелиопротекгорной активностью. Полученные в ходе работы

результаты также позволяют рекомендовать проведение целенаправленного поиска высоко эффективных эндотелнопротекторов среди производных ГАМК ифлавоноидов.

Список опубликованных работ по теме диссертации:

Статьи, опубликованные в научных журналах и изданиях рекомендованных ВАКРФ

1. Тюренков И.Н. Влияние нового производного фенибута на церебральное кровообращение в условиях модификации синтеза оксида азота на фоне ишемии мозга / И.Н. Тюренков, A.B. Воронков, М.Н. Багметов, Л.Е. Бородкина // ж. «Регионарное кровообращение и микроцирку-ляция».-2005.-Т.4.-№1(18).-С. 139-141.

2. Тюренков И.Н. Сравнительная оценка нейропротекторного действия фенибута и пирацетама в условиях экспериментальной ишемии мозга у крыс / И.Н. Тюренков, М.Н. Багметов, В.В. Епишина, Л.Е. Бородкина, A.B. Воронков // ж. «Экспериментальная и клин. фармакология».-М.-2006.-С.19-22.

3. Тюренков И.Н. Влияние гесперидина и флавицина на печеночный кровоток в норме и условиях активации и блокады синтеза эндогенного оксида азота / И.Н. Тюренков, A.B. Воронков, Е.Г. Доркина // ж. «Регионарное кровообращение и микроциркуляция».-СПб.-2006.-Т.5.-№3(13).-С.84-87.

4. Воронков A.B. Изменение кровотока в различных сосудистых регионах при стимуляции и блокаде синтеза эндогенного оксида азота / И.Н. Тюренков, A.B. Воронков // ж. «Регионарное кровообращение имикроциркуляция».-СПб.-2006.-Т.5.-№3(19).-С.93-95.

5. Тюренков И.Н. Допплерографическое изучение эндотелиальной дисфункции церебральных сосудов крыс при недостаточности половых гормонов / И.Н. Тюренков, A.B. Воронков, А.И. Робертус, С.А. Воскресенский, Д.В. Куркин // Региональное кровообращение и микроцир-куляция.-2007.-Т.6.-№1(21).-С. 175-176.

6. Тюренков И.Н. Методический подход к оценке эндотелиальной дисфункции в эксперименте / И.Н. Тюренков, A.B. Воронков // Экспериментальная и клиническая фармакология.-2008.-Т.71.-№1.-С.49-51.

7. Воробьев A.A. Послеоперационная функциональная дисрегуляция брюшины и ее морфологический субстрат / A.A. Воробьев, C.B. Порой-ский, И.Н. Тюренков, A.B. Воронков, В.Б. Барканов, Б.Б. Полуосьмак // Вестник ВолГМУ.-2008.-№3.-С.34-37.

8. Воронков A.B. Изучение «L-аргининового парадокса» для оценки эндотелиалыюй функции в норме и патологии / A.B. Воронков, А.И. Робертус, И.Н. Тюренков // Региональное кровообращение и микроциркуляция. .-2008.-Т.7.-№3(27).-С.54-58.

9. Тюренков И.Н. Использование многократного введения ацетилхолина для оценки эндотелиальной функции и возможной стабильности системы синтеза оксида азота / И.Н. Тюренков, A.B. Воронков, А.И. Робертус // Региональное кровообращение и микроциркуляция.-2009.-Т.8.-№1(29).-С.50-53.

10. Тюренков И.Н. Изучение дисфункции эндотелия у животных с экспериментально вызванной недостаточностью половых гормонов / И.Н. Тюренков, А.В.Воронков, А.И. Робертус // Кардиология.-2009.-№5.-С.64-65.

11. Тюренков И.Н. Недостаточность половых гормонов. Эндотели-альная функция и ее коррекция эстрогенами / И.Н. Тюренков, A.B. Воронков, А.И. Робертус // Экспериментальная и клиническая фармакология.-2009.-Т.72.-№6.-С.57-59.

12. Тюренков И.Н. Развитие эндотелиальной дисфункции при недостаточности половых гормонов // И.Н. Тюренков, A.B. Воронков, А.И. Робертус //Патологическая физиология и экспериментальная терапия.-2009.-№4.-C.33-36.

13. Тюренков И.Н. Зависимость между антиоксидантным действием флавоноидов и их влиянием на вазодилатирующую функцию эндотелия в условиях эндотелиальной дисфункции / И.Н. Тюренков, A.B. Воронков, Е.В. Петрова, Е.Г. Доркина // Экспериментальная и клиническая фармакология. -2010. - Т. 73,№10. -С.14-17.

14. Тюренков И.Н. Влияние флавицина на вазодилатирующую и антит-ромботическую функции эндотелия у животных с экспериментальным сахарным диабетом / И.Н. Тюренков, A.B. Воронков, Е.В. Петрова, A.A. Слиецанс, Э.Т. Оганесян // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2010. - Т. 73,№12. - С.17-20.

15. Тгоренков И.Н. Сравнительная оценка влияния небиволола и бисо-пролола на вазодилатуруюшую и антнтромботическую функции эндотелия мозговых сосудов у животных с сахарным диабетом / И.Н. Тюренков, A.B. Воронков // Вестник новых медицинских технологий.-Тула.-2010.-№4(36).-С.152-155.

16. Тюренков И.Н. Влияние лизиноприла на вазидилатирующую и антн-тромбнческую функции эндотелия при сахарном диабете / И.Н. Тюренков, A.B. Воронков//ж. «Врач».-2011.-№2.-С.35-37.

17. Тюренков И.Н. Морфологические и функциональные критерии оценки эндотелиальной дисфункции сосудов головного мозга крыс при гормональных патологиях различного генеза / И.Н. Тюренков, A.B. Воронков, Г.Л. Снигур, С.В. Поройский, A.A. Слиецанс, А.И. Робертус // Вестник новых медицинскихтехнолопш.-Тула.-2011.-№1.-С.197-200.

18. Тюренков И.Н. Влияние симвастатина на эндотелийзависимую вазодилатацию мозговых сосудов у животных со стрептозотацин-индуцированным сахарным диабетом / И.Н. Тюренков, A.B. Воронков // Вестник ВолГМУ.-2010.-№4.-С.87-90.

19. Воронков A.B. Коррекция эндотелиальной дисфункции, вызванная экспериментальным сахарным диабетом соединениями с антиоксидант-ным действием / A.B. Воронков, И.Н. Тюренков, A.A. Слиецанс // Региональное кровообращение и микроциркуляция.-2011.-в печати.

20. Тюренков И.Н. Сравнительная оценка вазодилатирующей функции эндотелия при патологиях различного генеза / И.Н. Тюренков, A.B. Воронков, Е.В. Петрова, A.A. Слиецанс, А.И. Робертус, Е.В. Болотова //Региональное кровообращение и микроциркуляция.-2011.-в печати.

21. Воронков A.B. Влияние сердечно-сосудистых средств на вазодила-тирующую функцию животных с экспериментальной недостаточностью половых гормонов /A.B. Воронков, И.Н. Тюренков // Экспериментальная и клиническая фармакология. -2011. - в печати.

Статьи, опубликованные в научных сборниках и журналах: 1. Воронков A.B. Эффективность влияния мефебута на скорость церебрального кровотока по результатам доплерографического исследования у крыс с острой ишемической патологией головного мозга / A.B. Воронков,

И.Н. Тюренков, JI.E. Бородкина, М.Н. Багметов, В.В. Епишина// Материалы научной конференции «Современные проблемы экспериментальной и клинической медицины», Папайя, (Таиланд), ж. «Успехи современного естествознания», Москва «Академия естествознания».-2004.-№12.-С.41.

2. Тюренков И.Н. Защитное действие фенильных производных кислоты гамма-аминомасляной в условиях тотальной и региональной ишемии / И.Н. Тюренков, Л.Е. Бородкина, B.H. Перфилова, A.B. Воронков // «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции». Сборник научных трудов (Пятигорская государственная фармацевтическая академия), Вып. 60.-Пятигорск.-2005.-С.429-431.

3. Воронков A.B. Влияние блокады и активации синтеза эндогенного оксида азота на мозговой и печеночный кровоток / A.B. Воронков, Л.Е. Бородкина // Материалы научной конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии», Тунис, ж. «Фундаментальные исследования», Москва «Академия Естествознания»,-

2005.-№5.-С.44.

4. Тюренков И.Н. Влияние активации и блокады выработки нитрооксида на кровообращение мозга, печени, почек и костно-мышечной области /, И.Н. Тюренков, A.B. Воронков // 13-ый Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». Сборник материалов конгресса.-Москва,-

2006.-С.307.

5. Воронков A.B. Влияние недостаточности половых гормонов на структуру эндотелия сосудов почек у крыс обоего пола / A.B. Воронков, И.Н. Тюренков, Г.Л. CHerypV/ Бюллютень Волгоградского научного центра. РАМН.-Волго-град.-2006.-С. 13-15.

6. Тюренков И.Н. Изучение скорости локального мозгового кровотока с модификацией синтеза эндогенного оксида азота на фоне недостаточности половых гормонов у крыс обоего пола/ Тюренков И.Н., Воронков A.B., РобертусА.И., Воскресенский С.А, Куркин Д.В., Слиецанс A.A., Драгилев Г.В. // Научные труды VII международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке»,-Москва, 2006.- С. 510-511.

7. Воронков A.B. Влияние нового производного ГАМК на мозговой кровоток в условиях подавления и усиления синтеза эндогенного оксида азота на фоне ишемии мозга / A.B. Воронков, А.И. Робертус, С.А. Воскресенский,

Д.В. Куркин // Сборник трудов III Международной медико-фармацевтической конференции студентов и молодых ученых Черновцы,- Украина,- 2006.-С. 115.

8. Тюренков И.Н. Оценка эндотелиальной дисфункции методом высокочастотной допплерографии для профилактики послеоперационных нарушений микроциркуляции и тромбоэмболических осложнений / И.Н. Тюренков, A.B. Воронков, A.A. Воробьев, C.B. Поройский // Бюллетень НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН. Сердечно-сосудистые заболевания,-Москва.-2007.-Т.8.-№6.-С.348.

9. Воробьев A.A. Использование высокочастотной допплерографии для оценки эндотелиальной функции и рисков спаечной болезни у больных сахарным диабетом в полеоперационном периоде (экспериментальное исследование) / A.A. Воробьев, C.B. Поройский, И.Н. Тюренков, A.B. Воронков '// Симпозиум «Регионарное кровообращение и микроциркуляция в клинической практике», на базе Всероссийского съезда хирургов НЦССХ им. Бакулева, 2007.-С.351.

10. Тюренков И.Н. Оценка эндотелиальной дисфункции методом высоко- ■ частотной допплерографии для профилактики: послеоперационных нарушений микроциркуляции и тромбоэмболических осложнений / : И,Н. Тюренков, A.B. Воронков, A.A. Воробьев, C.B. Поройский // Бюллетень . НЦССХ им.А.Н, Бакулева РАМН. Сердечно сосудистые заболевания-2007,-Т.8.-№6.-С.348.

11. Тюренков И.Н. Влияние овариэктомии на мнестические и когнетивные процессы животных с оценкой эндотелиальной функции церебральных сосудов кастрированных крыс / И.Н. Тюренков, A.B. Воронков, А.И. Робертус, Д.R Куркин, С.А. Воскресенский, A.A. Слиецанс // Научные труды VIII международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке; '

концепции болезней цивилизации», РУДН.-Москва.-2007.-С.639-640. :'.,

12. Тюренков И.Н. Фармакологическая коррекция эндотелиальной дисфункции, вызванной гормональной недостаточностью / И.Н. Тюренков, A.B. Воронков, А.И. Робертус // Психофармакология и биологическая наркология: материалы III съезда фармакологов России, Фармакология - практическому

здравоохранению.-Санкт-Петербург.-2007.-Т.7.-Спец.вып., часть 2.-С.2-1983.

13. Тюренков И.Н. Морфологическая оценка эндотелия сосудов почек после ампутации матки с придатками / И.Н. Тюренков, A.A. Воробьев,

A.B. Воронков, C.B. Поройский, В.Б Барканов // Международная конфе- , ренция «Структурные преобразования органов и тканей на этапах онтогенеза в норме и при воздействии антропогенных факторов. Экология и здоровье человека» Астрахань.-2007.-№2.-С.-187-188.

14. Тюренков И.Н. Изучение влияния биофлавоноидов на печеночную микроциркуляцию в условиях нормы и модификации синтеза эндогенного оксида азота (NO) / И.Н. Тюренков, A.B. Воронков, А:И. Робертус // Сборник ; материалов и тезисов: VI Международная конференция «Гемореология и микроциркуляция» (от молекулярных мишеней к органным и системным изменениям).-Ярославль.-2007.-С.193. -

15. Тюренков И.Н. Влияние нового производного ГАМК на эндотелиальную дисфункцию при ишемии головного мозга / И.Н. Тюренков, A.B. Воронков, А.И. Робертус, С.А. Воскресенский, Д.В. Куркин, A.A. Слиецанс // Материалы 14-ого Российского национального конгресса «Человек и лекарство». 18-22 апреля 2007.-Москва.-2007.-С.632.

16. Тюренков И.Н. Влияние гесперидина на церебральный кровоток животных, подвергшихся овариоэктомии на фоне модификации синтеза эндогенного оксида: азота / И.Н. Тюренков, A.B. Воронков, Е.Г. Доркина // Материалы II международная научная конференция «Химия, технология

V t* , ] ' ' -V

и медицинские аспекты природных соединений».-Алматы.-Казахстан.-2007.-С.107-108.

17. Воробьев A.A. Изменения микроциркуляции брюшины в динамике экспериментальной операционной травмы / A.A. Воробьев, C.B. Поройский,>И.Н. Тюренков, A.B. ВЪронков, В.Б. Барканов V Международная дистанционная научно-практическая конференция, посвященная памяти выдающегося ученого и хирурга профессора Василия Николаевича Парина. Внедрение инновационных технологий в хирургическую практику (фундаментальные и прикладные аспекты). Пермь.- 2008.-70-72.

18. Тюренков И.Н. Изучение скорости кровотока у животных с экспериментальным сахарным диабетом в условиях тромбообразования и модификации синтеза эндогенного N0 / И.Н. Тюренков, Воронков A.B., Заитениди И.К., Робертус А.И., Воскресенский С.А., Слиецанс A.A. // IX Международный конгресс молодых ученых «Науки о человеке»: материалы. ..- Томск, 2008. - С. 108-109.

19. Тгоренков И.H. Морфологические изменения эндотслиоцитов мозга крыс с экспериментально вызванной недостаточностью половых гормонов / И.Н. Тюренков, A.B. Воронков, А.И. Робсртус, A.A. Воробьев, C.B. Поройский, A.B. Поройская // Человек и лекарство: тезисы докладов 15-го Российского национального конгресса. - Москва, 2008. - С. 421.

20. Тюренков И.Н. Диагностика эндотелиальной функции в эксперименте / И.Н. Тюренков, A.B. Воронков, А.И. Робертус, И.К. Заитсниди, С.А. Воскресенский // Ангиология и сосудистая хирургия.-2008.-Т.14.-№3.-Прило-жение.-С.155-156.

21. Тюренков И.Н. Основные методические приемы изучения эндотелиальной функции в эксперименте / И.Н. Тюренков, A.B. Воронков, А.И. Робертус, A.A. Воробьев, C.B. Поройский // Бюллетень НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН сердечно-сосудистых заболеваний. Приложение №1: тезисы докладов и сообщений XIV Всероссийского съезда сердечнососудистых хирургов.-Москва.-2008.-Т. 9.-№6.-С. 156.

22. Воробьев A.A. Состояние микроциркуляции сосудов брюшины в динамике операционной травмы / A.A. Воробьев, И.Н. Тюренков, C.B. Поройский, A.B. Воронков III Бюллетень ВМЦ PAMH.-2008.-J421 .-С.50-53.

23. Тюренков И.Н. Основные методические приемы изучения эндотелиальной функции в эксперименте / И.Н. Тюренков, A.B. Воронков, А.И. Робертус, A.A. Воробьев, C.B. Поройский // Четвертая всероссийская конференция «Клиническая гемостезиология и гемореология в сердечнососудистой хирургии» (с международным участием).-Москва.-2009.-С.188-189.

24. Воронков A.B. Определение десквамированных эндотелиоцитов в крови крыс с недостаточностью половых гормонов / A.B. Воронков, И.Н. Тюренков, А.И. Робертус, A.A. Слиецанс, Д.В. Куркин // Человек и лекарство: тезисы докладов 16-го Российского национал, конгресса 2009г. -Москва, 2009. - С.635.

25. Тюренков И.Н. Недостаточность половых гормонов, эндотелиальная дисфункция и коррекция ее ГАМК-ергическими средствами / И.Н. Тюренков, A.B. Воронков, А.И. Робертус, Е.В. Петрова // Материалы VIII Съезда кардиологов ЮФО,- Ростов-на-Дону,- 2009.-С.201 -202.

26. Робертус А.И. Оценка взаимосвязи между уровнем фибриногена и скоростью тромбообразования у животных с недостаточностью половых гормонов на фоне введения производного ГАМК РГПУ-189 / А.И. Робертус,

A.B. Воронков // Сборник трудов межвузовской научной конференции, посвященной памяти профессора Владислава Васильевича Пичугина и 75-летию КГМУ. «Актуальные вопросы фармакологии и фармации» 400с.-Курск.-2009.-С.308-309.

27. Тюренков И.Н. Эндотелиопротективное действие структурных аналогов ГАМК / И.Н. Тюренков, A.B. Воронков, А.И. Робертус, A.A. Слиецанс, Е.В. Петрова, Д.В. Куркин // Сборник научных трудов (под редакцией академика РАМН В.ИЛетрова) 56-ой региональной научно-практической конференции профессорско-преподавательского коллектива ВолГМУ: Инновационные достижения фундаментальных и прикладных мед. исследований в развитии здравоохранения Волгоградской обл.-Издательство ВолГМУ.-Волгоград.-2009.-С.289-291.

28. Слиецанс A.A. Изучение антитромботической активности флавицина у животных с экспериментальным сахарным диабетом / A.A. Слиецанс, И.Н. Тюренков, A.B. Воронков, Е.В. Петрова// Научная конференция «Актуальные вопросы фармакологии и фармации»: сб.науч.тр. - Курск, 2009. -С. 322-323.

29. Слиецанс A.A. Влияние дибикора на уровень липопротеидов высокой плотности и общий холестерин у крыс при экспериментальном сахарном диабете / A.A. Слиецанс, A.B. Воронков, Е.В. Петрова // X Международный конгресс «Здоровье и образование в XXI веке РУДН»: сб.науч.тр. - Москва, 2009.-С. 845.

30. Тюренков И.Н. Эндотелиальная дисфункция при экспериментальном сахарном диабете и возможность ее коррекции флавоноидами / И.Н. Тюренков, A.B. Воронков, A.A. Слиецанс, Е.Г. Доркина // VIII съезд кардиологов Южного Федерального округа «Совершенствование оказания медицинской помощи больным с сердечно-сосудистыми заболеваниями - новые подходы и перспективы»: материалы... -Ростов-на-Дону, 2009. -С. 199-200.

31. Тюренков И.Н. Изучение влияния гесперидина на эндотелиальную функцию животных с экспериментально вызванным сахарным диабетом / И.Н. Тюренков, A.B. Воронков, Е.Г. Доркина, A.A. Слиецанс // Бюллетень Волгоградского научного центра РАМН. - 2009. - № 1. - С. 19-21.

32. Тюренков И.Н. Влияние мексидола на эндотелиальную функцию церебральных сосудов у животных с экспериментальным сахарным диабетом / И.Н. Тюренков, A.B.Воронков, A.A. Слиецанс, Е.В.Петрова //

X Международный конгресс «Здоровье и образование в XXI веке РУДН»: сб.науч.тр. - Москва, 2009. - С. 797-798.

33. Тюренков И.Н. Оценка функционального состояния эндотелия по изменению сосудистой вазодилатации и показателям свертываемости крови у животных с экспериментальным сахарным диабетом / И.Н. Тюренков, A.B. Воронков, Е.В. Петрова, A.A. Слиецанс // Научная конференция «Актуальные вопросы фармакологии и фармации»: сб.науч.тр. - Курск, 2009. -С.336-338.

34. Поройский C.B. Послеоперационные микроциркуляторные нарушения брюшины и способы их фармакологической коррекции / C.B. Поройский, A.A. Воробьев, И.Н. Тюренков, A.B. Воронков // Четвертая всероссийская конференция «Клиническая гемостезиология и гемореология в сердечнососудистой хирургии» (с международным участием).-Москва.-2009.-С. 160-161.

35. Тюренков И.Н. Вещества с эндотелиопротективными свойствами новое направление в создании сердечно-сосудистых средств / И.Н. Тюренков, A.B. Воронков // Материалы 8 съезда кардиологов Южного Федерального округа «Совершенствование оказания медицинской помо-щи больным с сердечнососудистыми заболеваниями - новые подходы и перспективы».-Ростов-на-Дону.-2009.-С. 198-199.

36. Слиецанс A.A. Изучение антитромботической активности диосмина как компонента его эндотелиопротективного действия у животных с экспериментальным сахарным диабетом / A.A. Слиецанс, Е.В. Петрова, A.B. Воронков, А.Й. Робертус // II Всероссийский научно-практический семинар для молодых ученых «Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии»: материалы... - Волгоград, 2010.- С. 108-109.

37. Слиецанс A.A. Изучение влияния гесперидина на вазодилатирующую функцию церебральных сосудов у животных с эндотелиальной дисфункцией на фоне экспериментального сахарного диабета / А. А. Слиецанс, A.B. Воронков, Е.В. Петрова // V Международная (XIV Всероссийская) Пироговская научная медицинская конференция студентов и молодых ученых: материалы... - Москва, 2010 г.- С. 552.

38. Тюренков И.Н. Морфологическая оценка эндотелиальной дисфункции, в сосудах почек крыс обоего пола, с экспериментально вызванной недостаточностью половых гормонов / И.Н. Тюренков, A.B. Воронков, Г.Л. Снигур, C.B. Поройский, A.B. Пороиская, А.И. Робертус, A.A. Слиецанс, Е.В. Петрова

••// Сборник трудов научно-практической конференции «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической морфологии» посвященной памяти член корр. РАМН, з.д.н. РФ, д.м.н., проф. В.Б. Писарева,- Волгоград.-2010.-С. 145-149. 39. Робертус А.И. Изучение антитромботической активности производного ГАМК РГПУ-189 в условиях эндотелиальной дисфункции при экспериментально вызванной недостаточностью половых гормонов / А.И. Робертус, (А.В. Воронков // Вестник РГМУ. Периодический медицинский журнал. -М.: ГОУ ВПОРГМУ Росздрава. - 2010, Специальный выпуск № 2. -С.542.

. I

В ходе работы получен: Патент Российской Федерации

на изобретение №2374699. зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27 ноября 2009 года.

Список сокращений

АЦХ - ацетилхолин АЧТВ-активированное частичное НПГ - недостаточность половых гормонов

НТГ - нитроглицерин тромбопластиновое время ОС- оксидативный стресс ПВ - протромбиновое время СК-скорость мозгового кровотока

СРБ-С-реактивный белок ТВ-тромбиновое время ЭД- эндотелиальная дисфункция ЭЗВД - эндотелиозависимая вазодилатация

ЭНЗВД - эндотелионезависимая

вазодилатация

ЭСД - экспериментальный

сахарный диабет

Воронков Андрей Владиславович

ЭНДОТЕЛИАЛЬНАЯ ДИСФУНКЦИЯ И ПУТИ ЕЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ КОРРЕКЦИИ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Подписано в печать 25 августа 2011 г. Формат бумаги 60x84 1/16 Бумага кн.-журнальная. Печать офсетная. ИП Новикова Татьяна Николаевна, 400123, г. Волгоград, ул. Депутатская, 11а-30,

ИНН 344502067458 Усл. печ. л. 1,0. Тираж 150 экз. Заказ № 158.

Государственное общеобразовательное учреждение высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации», 400131, г. Волгоград, Пл. Павших Борцов, 1.

Актуальность темы

В настоящее время-считается общепризнанным," что в основе развития сердечнот-сосудистой патологии; различного гёнеза. лежит дисфункция эндотелия (ЭД) [Петрищев H.H., 2003; Ярек-Мартынова ИР., Шестакова М.В., 2011; Ding II. 2010; Potenza М.Л., 2010; Maltais: S., et all., 2011]. Эндотелий рассматривается как самостоятельная мишень TepàneBTH4ecK0r0i воздействия для? коррекции различных сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ). Исходя из этого, актуальной проблемой экспериментальной; и клинической? фармакологии является поиск веществ с эндотелиопротекторным действием (ЭПД) как средш известных препаратов; так и новых соединений [Карпов Ю.А. 2010].

К настоящему времени установлено ЭПД препаратов, уменьшающих влияние РААС и СНС на сердечно-сосудистую систему (иАПФ, Ь-блокаторы и т.д:); снижающих уровень ХС0бщ, ХСЛПнп, ХСлпонп (особенно статины); регулирующих работу Ca" каналов (блокаторы Ca каналов), что; очевидно, связано,,как с:прямыми эндотелий зависимыми механизмами действия, так и их; опосредованным комплексным фармакологическим? влиянием [Luscher Т.1\, Noll G., 1995; Aikawa M., 2010; Egashira K.? 2010; Jorge P.A., 2010]. Однако^ из-за отсутствия одномоментного выполнения исследований с большим количеством препаратов и применения комплексного t подхода к оценке ЭД многие из проведенных экспериментальных и клиничесьсих исследований по изучению ЭПД сердечно-сосудистых средств достаточно противоречивы и не дают однозначного ответа по вектору направленности и силе действия препаратов из этих фармакологических групп.

Можно предполагать, что вещества с ГАМК—ергической активностью, ограничивающие симпатические влияния на сердце и сосуды, уменьшающие активность, РААС, обладающие при этом антиоксидантной и антигипоксантной активностью [Тюренков И.Н., 2008; Перфилова В.Н., 2009;

Narahashi T., 1999; Harrison 2000], могут улучшать функцию эндотелия [Недвицкий П.И., 2000; Ishide Т., 2005]. Однако изучение влияния ГАМК-ергических средств на эндотелий практически не выполнялось.

Учитывая важную роль оксидативного стресса в развитии ЭД, можш> предположить, что и антиоксиданты также могут воздействовать на различные звенья- развития ЭД: на систему синтеза и биодоступности NO, гемореологические параметры крови, липидный и углеводный обмен,, воспаление, пролиферацию [Насибуллин P.C.,2010; Yamamoto, М.2008; Schiffrin Е. L., 2010; Wallace Т. С., 2011]. Поэтому поиск высоко активных эндотелиопротекторов среди антиоксидантов; в том. числе и флавоноидов, вполне оправдан.

На основании изложенного представилось, целесообразным провести комплексное сравнительное изучение ЭПД ряда сердечно-сосудистых средств, производных ГАМК, флавоноидов и других лекарственных средств; обладающих антиоксидантной активностью, в условиях ЭД различного' генеза [Петрищев Н.Н., 2003; Calles-Escandon J., 2001; Vitale С. et all, 2008; F. Gungor et all. 2009; Denison F. С., et all., 2010].

Целью« исследования является разработка методологии- поиска веществ с эндотелиопротекторным действием^ и проведение сравнительного изучения эндотелиотропных свойств препаратов с.различными механизмами действия.

Задачи исследования

1. Провести тестирование эндотелия различных сосудистых регионов в условиях нормы и экспериментальной патологии (при недостаточности половых гормонов, экспериментальном сахарном диабете, хирургической травме).

2. Изучить влияние сердечно-сосудистых средств, производных ГАМК, флавоноидов и препаратов, обладающих антиоксидантной активностью на вазодилатирующую функцию эндотелия в условиях ЭСД и НПГ.

3. Изучить влияние сердечно-сосудистых средств, производных ГАМК, препаратов, обладающих антиоксидантной активностью, в том числе и флавоноидов на антитромботическую функцию эндотелия, гемореологию и основные параметры гемостаза в условиях ЭСД и НПГ.

4. Изучить влияние сердечно-сосудистых средству производных ГАМК, и препаратов, обладающих антиоксидантной* активностью; в том числе и флавоноидов на углеводный, липидный и гормональный статус животных с ЭСД и НПГ.

5. Изучить влияние наиболее активных веществ из вновь* синтезированныхпроизводных ГАМК, флавоноидов и препаратов, сравнения, на противовоспалительную функцию эндотелия при ЭСД и НПГ.

6. Дать морфологическую оценку состояния эндотелия при ЭСД И' Hill и изучить, влияние наиболее активных веществ из вновь синтезированных и препаратов сравнения на морфологическую структуру эндотелия.

7. Изучить механизм эндотелиопротёктивного действия наиболее активных веществ из вновь синтезированных и препаратов сравнения у животных с ЭСД и НПГ с помощью иммуногистохимического исследования, с оценкой уровня, экспрессии e-NOS, эндотелина-1, каспазы -3, nF-kB, рецепторов TREIL.

8. На основании сравнительного изучения-влияния на эндотелиальную функцию средств из различных фармакологических групп в условиях нормы и экспериментальной патологии, дать оценку методологии к подходам оценки эндотелиальной функции/дисфункции и эндотелиопротективного действия фармакологически активных соединений.

Новизна исследования

Впервые разработан комплексный подход изучения эндотелиотропных эффектов биологически активных веществ, обоснована возможность моделирования эндотелиальной дисфункции с помощью стрептозотоцин индуцированного сахарного диабета и экспериментально вызванной недостаточности половых гормонов.

Впервые выполнено сравнительное комплексное изучение влияния представителей различных фармакологических групп, среди сердечнососудистых средств, в сопоставимых условиях,: ß-адреноблокаторов (небиволол, бисопролол), ингибиторов АПФ (лизиноприл), антагонистов кальциевых каналов (нифедипин), статинов (симвастатин), гипариноида сулодексида, ряда производных ГАМК (фенибут, пикамилон, РГПУ-189, РИТУ-147), веществ, обладающих антиоксидантной активностью (мексидол, предуктал, дибикор), а также флавоноидов (гесперидин, диосмин, кверцетин и- флавицин), на вазодилатирующую, антитромботическую функции, на углеводный, липидный обмен и гормональный статус при ЭСД' и НПГ. Показано их неоднозначное эндотелиопротекторное действие.

Впервые выявлена высокая эндотелиопротективная активность г и комплексно изучено влияние нового производного FAMK — соединения РГПУ-189 и« флавоноида - флавицина на вазодилатирующую, антитромботическую,.противовоспалительную и пролиферативную. функции» эндотелия при ЭСД и НПГ.

По- выраженности эндотелиопротекторного действия РГПУ-189 и флавицин превосходят небилет, конкор, мексидол, предуктал, дибикор, нифедипин, фенибут, пикамилон, производное ГАМК - РГПУ-147 и флавоноиды, приближаясь по выраженности действия к Сулодексиду.

Впервые установлено усиление активности e-NOS, снижение эндотелина-1, а так же снижение экспрессии основных генетических маркеров запускающих апоптоз (каспаза-3, «доменов смерти», NF-kB) у животных с ЭСД и НПГ, под влиянием соединения РГПУ-189и флавоноида флавицина, что очевидно лежит в основе их эндотелиопротекторного действия.

Научно-практическая ценность работы

Используемый комплексный морфо-функциональный подход может применяться для оценки степени ЭД (вазодилатирующей, антитромботической, противовоспалительной, антипролиферативной функций эндотелия), мощности функционирования» NO системы, дает возможность оценить эндотелиотропные свойства исследуемых веществ.

Сравнительный анализ полученных данных о влиянии известных сердечно-сосудистых средств, позволит более дифференцированно их использовать при лечении больных с различной^ кардиологической^ патологией, а на основе флавоноидов и производных ГАМК — разработать лекарственные средства для лечения ЭД различного генеза.

Полученные данные об эндотелиопротективном действии производных ГАМК и флавоноидов свидетельствуют о перспективности дальнейшей разработки на основе соединения РГПУ-189 и флавицина эндотелиопротекторов для применения в качестве средств профилактики и лечения сосудистых осложнений различного генеза, обусловленных ЭД.

Реализациярезультатов.

На основании данных диссертационного исследования разработана дальнейшая программа целенаправленного поиска веществ с сердечнососудистыми и эндотелиотропными свойствами среди структурных аналогов ГАМК (кафедра органической химии Российского Государственного Педагогического Университета им. А.И.Герцена (г. Санкт-Петербург)), предложен план поиска веществ флавоновой природы для профилактики и лечения сосудистых осложнений, обусловленных СД и Hill (Пятигорская фармацевтическая академия).

Разработанная комплексная морфофункциональная система поиска и доклинического фармакологического изучения веществ с эндотелиопртективной активностью используется в научно-исследовательской работе кафедры фармакологии и биофармации ФУВ Волгоградского государственного медицинского университета (ВолгГМУ),

НИИ фармакологии ВолгГМУ, кафедрах фармакологии ВолгГМУ и Пятигорской государственной фармацевтической академии. Полученные в ходе исследования результаты оформлены в виде методического пособия «Новая медицинская технология: Использование высокочастотной ультразвуковой допплерографии для изучения влияния фармакологических веществ на региональное кровообращение и эндотелиальную функцию (подписано в печать 04.2010)

Полученные результаты о эндотелиопротекторных свойствах новых производных гамма-аминомасляной кислоты и флавоноидов, а так же сравнительная эндотелиопротекторная активность сердечно-сосудистых средств и веществ, обладающих антиоксидантной активностью, включены в раздел учебных программ курса фармакологии на кафедрах фармакологии и биофармации ФУВ, фармакологии, клинической фармакологии и интенсивной терапии Волгоградского государственного медицинского университета, кафедре биохимии и микробиологии, кафедре органической химии Пятигорской государственной фармацевтической академии, кафедрах фармакологии Воронежской медицинской академии, Ростовского государственного медицинского университета, Белгородского государственного университета. Материалы работы оформлены в виде информационных писем "Изучение эндотелиопротекторных свойств флавоноидов при экспериментальном сахарном диабете", «Эндотелиопротективные свойства производных ГАМК при недостаточности половых гормонов» которые используются в учебном процессе и научной работе кафедры фармакологии ВолгГМУ (акты о внедрении от 09.2010; 12.2010), фармакологии и биофармации ФУВ ВолгГМУ (акты о внедрении от 09.2010; 12.2010), лаборатории фармакологии сердечно-сосудистых средств НИИ фармакологии ВолгГМУ (акты о внедрении от 09.2010; 12.2010). По материалам настоящей работы получен 1 патент Российской Федерации на изобретение.

Положения, выносимые на защиту:

1. Стрептозотоцин-индуцированный сахарный диабет в большей степени, а экспериментально вызванная недостаточность половых гормонов, в меньшей степени, приводят к выраженным нарушениям всех функций эндотелия. Операционная травма так же приводит к эндотелиальным нарушениям, однако они носят кратковременный и обратимый характер. Полученные результаты позволяют рекомендовать данные патологические модели для моделирования эндотелиальной дисфункции в эксперименте.

2. Используемый в работе комплексный морфо-функциональный подход к изучению вазодилатирующей, антитромботической, противовоспалительной, антипролиферативной функций эндотелия, позволяет оценить стабильность и мощность функционирования N0 системы и выраженность ЭД, а также может использоваться для изучения эндотелиотропных эффектов исследуемых веществ и различных патологических воздействий на эндотелий.

3. Сердечно-сосудистые средства, гепариноид — сулодексид, производные ГАМК, флавоноиды и вещества, обладающие антиоксидантными свойствами, в разной степени выраженности проявляют эндотелиопротективную активность, что проявляется» в улучшении вазодилатирующей, антитромботической функций эндотелия. По степени улучшения вазодилатирующей функции эндотелия все исследуемые соединения можно расположить следующим образом: Вессел Дуэ Ф (сулодексид) > Диротон > Симвагексал > Небилет > РГПУ-189 > Флавицин > РГПУ-147 > Кверцетин > Мексидол > Конкор > Гесперидин > Диосмин > Предуктал > Пикамилон > Нифедипин > Фенибут > Дибикор, а по степени влияния на антитромботическую функцию эндотелия изучаемые соединения можно расставить в следующем порядке: Вессел Дуэ Ф (сулодексид) > Симвагексал > РГПУ-189 > Диротон > Небилет > РГПУ-147> Флавицин > Кверцетин > Конкор > Нифедипин > Мексидол > Фенибут > Гесперидин > Дибикор > Диосмин > Предуктал > Пикамилон.

4. РГПУ-189 и флавицин выражено улучшают противовоспалительную, антипролиферативную функции эндотелия, уменьшают метаболические нарушения у животных с ЭСД и Hi IT (снижают гипергликемию, гиперхолестеринемию, индекс атерогенности), в большей степени эти эффекты выражены у флавицина. Эндотелиопротективное действие отмеченных веществ очевидно обусловлено угнетением экспрессии маркеров апоптоза (TRAIL, каспаза-3, nF-kB), снижением эндотелина-1 и усилением активности e-NOS.

5. Вессел Дуэ Ф по совокупности всех проведенных исследований оказал наиболее выраженное эндотелиопротекторное действие по сравнению со всеми исследуемыми веществами. Полученные результаты позволяют рекомендовать Вессел Дуэ Ф в качестве эталонного препарата сравнения при сопоставлении эндотелиотропных эффектов изучаемых лекарственных препаратов.

6. Сравнительный анализ полученных данных о влиянии известных сердечно-сосудистых средств, флавоноидов, веществ, обладающих антиоксидантной активностью, и производных ГАМК на эндотелиальную дисфункцию в условиях гормональных нарушений различного генеза, свидетельствуют о целесообразности применения Весел Дуэ Ф, диротона, симваГЕКСАЛА, небилета, мексидола, для комплексной» терапии сердечнососудистых заболеваний, профилактики и лечения сосудистых осложнений, связанных с СД и HI И . Результаты исследований позволяют рекомендовать проведение дальнейшего изучения соединения РГПУ-189 и флавицина, для создания на их основе новых препаратов с эндотелиопротекторной активностью.

7. Проведенное тестирование вазодилатирующей функции эндотелия различных сосудистых регионов (мозг, печень, почка и кожно мышечная область) позволяет говорить о том, что направленность эндотелиального ответа одинакова во всех областях, но выраженность разная. Результаты исследования дают возможность экстраполировать полученные в ходе эксперимента данные по изменению функции эндотелия в одной сосудистой * области и на другие регионы с разным типом эндотелия.

Апробация работы

Материалы работы докладывались и обсуждались на 5-ой научно-практической конференции «Методы исследования регионального кровообращения и микроциркуляции в клинике» (Санкт-Петербург, 2005); на II международной научной конференции «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений» (Алматы, Казахстан, 2007); на 13 Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов: (Москва, 2007); Научно-практической конференции «Диагностика и коррекция нарушений регионального кровообращения и микроциркуляции в клинической практики» (Саратов, 2008); на 14 Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов (Москва, 2008); на VIII съезде кардиологов южного федерального округа* «Совершенствование оказания медицинской помощи больным с сердечно-сосудистыми заболеваниями. Новые подходы и перспективы» (Ростов-на-Дону, 2009); 56-ой региональной научно-практической конференции Волгоградского государственного медицинского университета-«Инновационные достижения фундаментальных и прикладных медицинских исследований в развитии здравоохранении волгоградской области» (Волгоград 2009); Научно практической конференции «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической морфологии» (Волгоград, 2010); II Всероссийском научно-практическом семинаре "Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии" (Волгоград, 2010). По материалам диссертации опубликовано 60 печатных работ, в том числе 21 работ в журналах, рекомендуемых ВАК, получен 1 патент на изобретение №2374699 от 27 ноября 2009 года.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 6 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка используемой литературы, включающего 493 источника, из