Автореферат и диссертация по медицине (14.00.23) на тему:Электронно-радиоавтографическое исследование клеток сердца, мозга человека после смерти

РГб од

о ОПТ £-93

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи ЗАХАРОВА Ольга Александровна

ЭЛЕКТРОННО-РАДИОАВТОГРАФИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КЛЕТОК СЕРДЦА, МОЗГА ЧЕЛОВЕКА ПОСЛЕ СМЕРТИ

14.00.23 - гистология, цитология, эмбриология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 1993

х-у

/

N

/

Работа выполнена в отделе патологической анатомии Института

хирургии им. А.В.Вишневского Российской АМН

Научный рукводитель:

доктор медицинских наук, профессор В. П. Туманов

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Е. Ф. Котовский доктор медицинских наук, профессор Ю'.К. Елецкий

Ведущая организация: Институт морфологии человека РАМН

Защита состоится" " 1993 г.

в часов на заседании специализированного ученого

совета Д.084Л 4.04 при Российском Государственном Медицинском Университете по адресу: 117869, Москва, ул. Островитянова, д. 1

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке РГМУ

Автореферат разослан "_"__1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета

доктор медицинских наук, профессор А.Н.ТИХОМИРОВ

/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы,

Изучение жизнеспособности клеток органов после смерти позволяет точнее представить их функции, особенности метаболизма и межклеточных отношений в живом организме, и, кроме того, имеет непосредственное практическое значение для решения ряда задач реанйматологии и трансплантологии.

До недавнего времени о жизнеспособности клеток судили лишь по структурным изменениям, происходящим в органах и клетках (Саркисов Д. С. , Втюрин Б. В. , 1967; Боголепов Н. Н. , 1979; Уол-кер А. Э., 1988), активности ферментов и веществ промежуточного обмена (Ажялис В., 1980; Шаров В.Г., 1984; ). В работах И.Р.Петрова (1936—1938) было установлено, что после остановки сердца можно оживить организм, при этом происходит не только оживление сердца, но и восстановление функций мозга. В последние годы эти представления были развиты в работах В.А.Неговского (1951), М.С.Гаевской (1963), А.М.Гурвича(1966), В.И.Соболева (1970), К.А.Нозяшап (1980), К.\У1Ше (1978) и др.

Для более полного представления о процессах, происходящих на ультраструктурном уровне, необходимо было дополнить предшествующие исследования данными по белоксинтезирующим функциям. На основании современного электронно-радиоавтографического анализа нами была определена способность клеток сердца и мозга переживать неблагоприятные условия.В работе в качестве такого критерия была выбрана способность клеток синтезироать РНК. Поскольку все основные функции клеток определяются геномом, сохранение его активности является обязательным условием жизнедеятельности клетки после констатации смерти организма. Определение переживаемости и длительности синтетической способности клеток сердца и мозга после смерти в работе имеет ведущее значение.

Анализ данных литерету ры свидетельствует о том, что до настоящего времени вопрос о переживаемости клеток ряда органов (сердца, мозга) на различных сроках требуют дальнейшего уточнения, а особенности синтетической активности клеток мозга (нейронов, глиальных), с учетом их различной организации ранеее не изучались.

В связи с этим была поставлена цель исследования и определены задачи.

Цель исследования:

изучить микро- и ультраструктурные особенности строения миоци-тов, эндотелиоцитов миокарда, нейронов, олигодендроглиоцитов, эндо-телиоцитов мозга в различные сроки после констатации смерти, через 4,8,13 часов, а также определить, в каких клетках и в какие сроки после смерти сохраняется способность к синтезу РНК.

В залами исследования вхолило:

1. Определение способности клеток к синтезу РНК в образцах ткани, удаленных при жизни человека с лечебной или диагностической целью (биопсийный материал).

2. Качественное и количественное сопоставление способности клеток к синтезу РНК в ткани, полученной из трупов через 4 часа после смерти с биопсийным материалом (сердце, мозг).

3. Определение переживаемости клеток сердца и мозга на более поздних сроках после констатации смерти (через 8-13 часов).

Научная новизна. В работе, наряду с анализом собственных данных, суммированы разрозненные данные литературы о структурных и функциональных изменениях, происходящих в клетках организма в различные промежутки времени после смерти.

На основании электронно-микроскопического радиоавтографического анализа впервые выделены основные временные особенности переживаемости клеток мозга и сердца и способности их к длительной синтетической активности после смерти. Этот метод позволяет с большой точностью по ультраструктурным особенностям идентифицировать синтезирующую РНК клетку, что важно для ряда различных биологических и медицинских исследований.

Подобные исследования до настоящего времени не проводились.

Практическая ценность диссертации.

Применение полученных результатов позволит дать более точную структурно-функциональную характеристику способности клеток, а также их синтетическую активность по синтезу РНК, при длительной гипоксии.

Результаты исследования на светооптическом и ультраструктурном уровнях дают более полное представление о процессах протекающих в сердце, мозге и могут служить основой для уточнения данных о жизнеспособности этих клеток после смерти. Полученные данные позволяют уточнить вопросы "клинической" и "биологической" смерти, разработать новые критерии по срокам реанимационных мероприятий, внести коррективы для ряда задач трансплантологии, а также по

рациональной разработке приемов трансплантологии и консервации органов.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на межотделенческой конференции института хирургии им. А.В.Вишневского РАМН. Основные положения работы доложены и обсуждены в докладах на международном конгрессе молодых ученых по клинической медицине (Киев, 10-14 марта 1992); на XIV Конференции поэлектронной.микроскопии (Москва, г.Черноголовка, 1-5 июня 1992).

Публикации. По теме диссертации опубликовано в журналах и сборниках 5 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введи гия, обзора литературы, раздела с изложением материала и методики исследования, двух разделов собственных исследований; заключения; выводов; списка литературы. Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста, включая иллюстрации. Диссертация иллюстрирована 7 таблицами, 5 графиками, 26 фотографиями. Библиография включает 202 источника, в том числе 120 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования. Для решения поставленных задач были проведены светооптическое и электронно-радиоавтографическое исследования участков сердца и мозга, взятых во время хирургических операций, а также аутопсийный материал, полученный в различные сроки после смерти, от 4 до 13 часов из аналогичных органов (табл.1,2).

Таблица 1

Распределение наблюдений в биопсийном материале

I органы общее количество количество количество 1

| блокои полутонких срезов ультратоиких

| срезов (бленд)

в Мозг 240 260 1080

1 Сердца 100 150 700

Таблица 2

Распределение наблюдений в аутопсийном материале

Органы Общее количество (блоков) Количество полутонких срезов (стекол) Количество ультратонких срезов (бленд)

Время 4 8 13 4 8 13 4 8 13

Мозг 265 205 206 265 205 205 1390 780 200

Сердце 200 177 177 200 177 177 700 560 220 I

Для электронно-микроскопической радиоавтографии фрагменты исследуемого материала помещали в питательную среду 199 при температуре 37°С, а затем на следующем этапе разрезали на кусочки размером для сердца — 1 мм , для мозга — 0,2-0,5 мм и инкубировали при температуре 37°С в течение 80 минут в среде 199, содержащей Н-уридин 100 мкКи/мл <удельная радиоактивность 26 Ки/мМ). По окончанию инкубации материал отмывали от невключившегося Н-уридина холодным раствором фосфатного буфера с сахарозой рН - 7,4 несколько раз в течение 30 минут при температуре +4°С, далее фиксировали 2,5% раствором глютарового альдегида в течение 12 часов. После фиксации раствором глютарового альдегида кусочки ткани промывали фосфатным буфером с сахарозой 2 часа. Дополнительно фиксировали 1 % раствором четырехокиси осмия в течение 2 часов. Затем материал обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и заливали для пропитывания эпоксидной смолой с пропиленоксидом. На завершающей стадии материал помещали в капсулы, заливали эпоксидной смолой и пол-имеризовали двое суток.

С каждого блока делали полутонкие срезы (1-1,5 мкм) для приготовления светомикроскопических радиоавтографов. По результатам анализа полутонких радиоавтографов подбирался прицельно материал для ультратоми. Соответствующая методика описана в работах Д. С. Саркисова ссоавт., (1975;1980). О продолжении синтеза РНК судили по зернам серебра, видимым над ядрами клеток сердца и мозга. Статистическая обработка исследуемого материала проводилась по общепринятой методике вычисления средних величин. Достоверность различий сравниваемых показателей определяли с помощью критерия Стьюдента.

Результаты собственных исследований.

За последние годы в отечественной и зарубежной литературе опубликован ряд работ, свидетельствующих об успехах реанимационных мероприятий после длительного периода клинической смерти, о "размытости" границ клинической и биологической смерти (А.М.Гурвич, 1966; В.И.Соболева, 1970; М.О.Гаевский, 1963; Black Р, 1980; Araujo S., Saraiva G.F.K., Gomer M.J. and Fern K.G.G., 1990; и др.).

Использование комплексного методического подхода позволило охарактеризовать гистологическую и ультраструктурную организацию мозг£ и сердца человека и выявить как значительную их временную вариабельность (имеется ввиду зависимость их от промежутка времени, прошедшего после констатации смерти), так и вариабельность в сохранении способности ядер этих клеток синтезировать РНК. Примененная методика исследования позволила сопоставить свето- и электрснно-радиоавтографическйе картины с одного и того же препарата.

Результаты ралиоавтогоафического исследования посмертных изменений в головном мозге человека.

Учитывая полученные данные о структурно-функциональном состоянии клеток мозга на светооптическом уровне, целесообразно рассмотреть ультраструктурные изменения тканей мозга. Анализируя данные исследований изучаемого материала, мы применили схему ка-пилляр-нейрон-глия.

Эндотелиоииты. При сравнении биопсийного и аутопсийного материала выявлены определенные особенности в строении эндотелиоцитов. Обращает на себя внимание то, что с учетом развивающихся структурных изменений эндотелиоцитов в аутопсийном материале сохраняется их высокая биологическая активность.- В первые 4 часа после констатации смерти был проведен подсчет эндотелиоцитов, включивших в ядро 3Н-уридин и проведено сравнение ультраструктуры биопсийного материала с учетом изменений, происходящих в аутопсийном материале (в биопсий-ном - 40 клеток, а в аутопсийном — 35 клеток) .При этом установлено, что в цитоплазме происходят отдельные изменения структур: уменьшение числа элементов гранулярной сети, незначительное просветление матрикса митохондрий, образование единичных вакуолей. С увеличением времени от 8 до 13 часов после констатации- смерти происходит нарастание деструктивных изменений:

—в ядре — выраженная конденсация хроматина около нуклеолеммы;

- в цитоплазме — увеличение пиноцитозных пузырьков, просветление матрикса митохондрий с частичной потерей крист, более значительная вакуолизация, отдельные фрагменты гранулярного эндоп-лазматического ретикулума.

В ядрах отдельных эндотелиальных клеток происходит через 8 часов включение 3Н-уридина, что свидетельствует о продолжении синтеза РНК (15клеток в 100 полях зрения) (рис. 1).

Рис. 1. Динамика угасания синтетической активности в эндотелиальных клетках мозга (аутопсийный материал).

Нейроны. Наблюдения, проведенные через 4 часа после смерти показали, что трансформация нейронов из гипохромного в гиперхромное состояние являются приспособительной реакцией клетки на интоксикацию. В ядре происходит конденсация хроматина около нуклеолеммы. В цитоплазме отмечается увеличение количества лизосом, изменение гранулярной сети, набухание единичных митохондрий с набухшими и частично редуцированными кристами. Количественный анализ показал— включение Н-уридина в биопсийном материале —25 нейронов в 100 полях зрения, а в аутопсийном — соответственно 19 нейронов.

В материале, полученном через 8 часов после констатации смерти наблюдаются значительные деструктивные изменения, выражающиеся в просветлении нуклеолеммы с хлопьевидной конденсацией хроматина, ) расширением перинуклеарного пространства. Включение Н-уридина в ядра нейронов единичное (1 клетка в 100 полях зрения).

Исследование нейронов через 13 часов после смерти показало, что деструктивные процессы в них привели к гибели и распаду клеточных

з

структур. На этом сроке не отмечается включения Н-уридина в ядра нейронов, что свидетельствует о прекращении синтеза РНК (Рис. 2),

Рис. 2. Динамика угасания синтетической активности в нейронах больших полушарий головного мозга (аутопсийный материал).

Глиальные клетки. В результате исследований по включению ЗН-уридина олигодендроглиоцитами аутопсийного материала показано, что при наличии структурных изменений, происходящих через 4 часа после констатации смерти в цитоплазме (увеличение числа лизосом, гранул гликогена, вакуолей, деформации цистерн гранулярной сети, изменений митохондрий) в ядре при неравномерном распределении хроматина, отмечается активное включение Н-уридина, что свидетельствует о продолжении синтеза РНК (19 клеток в 100 полях зрения).

С увеличением времени (через 8 часов после констатации смерти) в олигодендроглиоцитах отмечены более выраженные деструктивные изменения в цитоплазме, нарастание вакуолизации, увеличение гранул гликогена, просветление матрикса митохондрий с нарушением ориентации крист, уменьшение числа рибосом. В ядре наблюдается глыбчатое скопление хроматина, расширение перинуклеарного пространства. Однако включение Н-уридина в ядро свидетельствует о продолжении синтеза РНК в нем и через 8 часов (10 клеток в 100 полях зрения).

В 13 часовом аутопсийном материале проведенные исследования показали, что деструктивные процессы еще более ярко выражены: в цитоплазме наблюдаются элементы клеточного детрита, увеличение количества вакуолей, в ядре — просветлениекариолеммы, в 1-2клетках отмечено включение Н-уридина (Рис. 3).

Рис. 3. Динамика угасания синтетической активности в

олигодендроглиоцитах головного мозга (аутопсийный материал).

Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что в аутопсий-ном материале, исследуемом по схеме капилляр-нейрон-глия продолжается жизнедеятельность клеток через 4-8 часов после констатации смерти. Однако отмечается вариабельность в количественном составе клеток, синтезирующих РНК. Наши данные по исследованию переживаемое™ клеток мозга свидетельствуют о том, что наибольшая глубина дистрофических изменений и меньшая переживаемость выражёна в клетках коры больших полушарий головного мозга, меньшая — в нижележащих отделах (подкорковые узлы, глия) и большая переживаемость клеток в них. Это подтверждает фундаментальные исследования о меньшей стойкости фило- и онтогенетически более молодых и "высоко" расположенных областей головного мозга, по сравнению с более древними и "ниже" расположенными областями.

Ралиоавтографическое исследование посмертных изменений в сердечной мышце человека.

Проведенные исследования миокарда показали, что ранние изменения в сердце неразрывно связаны с состоянием ультраструктуры капилляров, т.е. основных компонентов системы, обеспечивающей микроциркуляцию тканей.

Энлотелиоииты. Исследуя биопсийный и аутопсийный материал, установлено, что в первом и втором материале (полученном через 4 часа после констатации смерти), способность клеток эндотелия миокарда включать Н-уридин в ядро свидетельствует о высокой синтетической

Ю

активности в ядре эндотелиоцитов РНК, т.е. эндотелиоциты в аутопсий-ном материале (в первые 4 часа после констатации смерти) по своей биологической активности мало чем отличается от биопсийного материала (в аутопсийном материале 299 клеток, в биопсийном материале — 327 клеток активно синтезирующих РНК). На этом сроке наблюдается увеличение размеров ядра с концентрацией хроматина узкой полосой около нуклеолеммы. В цитоплазме отмечаются многочисленные вакуоли, расширение гранулярной цитоплазматической сети, отечность митохондрий.

Сравнивая аутопсийный материал, полученный через 8 часов с 4 часовым, обращает внимание, что способность ядра клетки синтезировать РНК также сохраняется на высоком уровне (271 клетка в 100 полях зрения). При ультраструктурном анализе в ядре хроматин расположен в виде крупных глыбок и хлопьев, нуклеолемма представлена плотной осмофильной полосой, в цитоплазме отмечаются единичные митохондрии с явлениями отека (нарушение ориентации крист, просветление матрикса, многочисленные вакуоли).

В 13-часовом материале наблюдаются более выраженные деструктивные изменения ультраструктурных элементов клетки, по сравнению с 8-часовым материалом. Включение Н-уридина в ядро эндотелиоцитов остается довольно значительным (260 клеток в 100 полях зрения) (рис. 4).

340 320 300 280 260 240 220 200 180 140

| 4 ч. 8 ч. 13 ч. Время, ч.

Биопсийный материал

Рис. 4. Изменение синтетической активности эндотелиоцитов миокарда в аутопсийном материале в различные сроки после смерти.

Электронно-микроскопическое исследование капилляров показало, что ранние изменения в них неразрывно связаны с состоянием ультраструктуры миокарда.

Карлиомиоииты. Для оценки структурных изменений, происходящих в аутопсийном материале, использовали в качестве контроля биоптаты, полученные во время операций. При электронно-радиоавтографическом исследовании установлено, что существенной разницы между биопсийным и аутопсийным материалом (через 4 часа после констатации смерти) со стороны структурной организации нет. Отмечается интенсивное включение Н-уридина в ядрах биопсийного материала (129 клеток в 100 полях зрения) и аутопсийном материале (86 клеток в 100 полях зрения). В кардиомиоцитах ядро содержит мелкозернистый хроматин, четко контурируется ядрышко; около ядра наблюдается скопление мнтохондрий с выраженным ультраструктурным полиморфизмом, умеренно электронно-плотным матриксом. Большое скопление гранул гликогена в цитоплазме способствует поддержанию энергетического обмена при экстремальных условиях или патологических процессах.

130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 .10

| 4 ч. 8 ч. 13 ч. Время, ч.

Биопсийный материал

Рис. 5. Угасание синтетической актишюсти в миоцитах в различные сроки после смерти (аутопсийный материал).

На более поздних сроках через 8 часов, а также 13 часов после констатации смерти нарастают более выраженные деструктивные изменения миоцитов. В ядре наблюдается просветление нуклеоплазмы, растворение ядрышка, разрыхление нуклеолеммы; в цитоплазме — разрушение митохондрий, большое количество клеточного детрита. К 8-ми часам отмечаетлся сниженеие синтетической активности ( ^клеток в 100 полях зрения ), а к 13-ти часам включение Н-уридина отсутствует, что свидетельствует о прекращении синтеза РНК в указанном промежутке времени. (Рис. 5).

Таким образом, результаты настоящего исследования, а также данные литературы позволяют констатировать, что синтез РНК в миоцитах продолжается от 4 до 8-ми часов после смерти организма и к 13 часам синтетическая активность клеток полностью прекращается, тогда как в эндотелиальных клетках миокарда белок- синтезирующая функция от 4 до 13 часов продолжается.

ВЫВОДЫ

1. Изучение переживаемости клеток организма проведено с помощью метода электронно-микроскопической радиоавторадиографии, осуществлен анализ морфо-функциональных изменений, происходящих в аутопсийном материале через 4,8, 13 часов после констатации биологической смерти.

2. В ядрах миоцитов через 4 часа после смерти продолжается активный синтез РНК—это свидетельствует о синтетической активности клеток (86 клеток включивших Н-уридин в 100 полях зрения ). К8часам после смерти отмечается снижение синтетической активностиности (19 клеток в 100 полях зрения ), а в 13-ти часовом аутопсийном материале на фоне более выраженных декструктивных изменений миоцитов синтетическая активность прекращается.

3. Отмечена высокая синтетическая активность эндотелиоцитов по включению Н-уридина через 4 часа после смерти ( 299 клеток в 100 полях зрения). К 8-ми часам на фоне нарастаниия деструктивных изменений, сохраняется способность ядер эндотелиоцитов включать Н-уридин (271 клеток в 100 полях зрения), к 13 часам способность клеток синтезировать РНК снижается до 260 клеток в 100 полях зрения. Следовательно, ядра эндотелиоцитов в период от 4-13 часов после смерти остаются способными синтезировать РНК.

4. При количественном сравнении синтетической активности эндотелиоцитов мозга аутопсийного материала (4 часа после смерти) с био-псийным не было выявлено существенной разницы—(соответственно 35 клеток в 100 полях зрения и 45 клеток в 100 полях зрения): Через 8 часов нарастают деструктивные изменения в эндотелиоцитах и происходит снижение способности клеток включать Н-уридин ( 25 клеток в 100

13

полях зрения), а к 13 часам синтетическая активность полностью угасает.

5. В нейронах мозга через 4 часа после смерти происходит изменение цитоплазмы при сохраняющемся ядре. Способность клеток синтезировать РНК в аутопсийном материале снижается до 19 клрток в 100 полях зрения, а в биопсийном материале — до 25. Через 8 часов после смерти нарастают деструктивные изменения в цитоплазме и ядре и отмечается слабое включение Н-уридина ( 1 клетка в 100 полях зрения), а к 13 часам синтез РНК прекращается.-

6. Изменения, происходящие в олигодендроглиоцитах через 4 часа после смерти в цитоплазме и ядре незначительны. Синтетическая активность снижается в аутопсийном материале (19 клеток в 100 полях зрения), по сравнению с биопсийным (22 клетки в 100 полях зрения). Через 8 часов происходит снижение способности клеток включать Н-уридин—(10 клеток в 100 полях зрения), а к 13 часам, с нарастанием деструктивных изменений в клетках, происходит дальнейшее снижение синтетической активности клеток (1 клетка в 100 полях зрения).

. 7. Полученные результаты можно интерпретировать как первый этап для уточнения концепции о сроках клинической и биологической смерти, продолжительности реанимационных мероприятий, а также временных параметров по извлечению органов в трансплантологии.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Полученные с помощью современных методов морфологического исследования (электронная микроскопия, электрононно-микроскопиче-ская радиоавтография) результаты по переживаемости клеток сердца и мозга легли в основу научно-практической деятельности отдела патологической анатомии института хирургии им. А.В.Вишневского Российской Академии медицинских наук. Эти данные используются в отделении анестезиологии и реаниматологии института хирургии им. А.В.Вишневского РАМН и института общей реаниматологии РАМН для определения более четких границ "биологической" и "клинической" смерти.

Выявленные временные параметры синтеза РНК в клетках столь важных органов, как мозг и сердце, существенно расширяют представления о пререживаемости клеточных элементов, нацеливают клиницистов и экспериментальных патологов на поиск более адекватных методов интенсивной терапии в постреанимационном периоде.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Электронно-радиоавтографическое исследование жизнеспособности клеток человека после смерти. Посмертная активация синтеза РНК в нейтрофилах.

Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1991, № 2, с.199-201. (Соавт. А.А.Пальцын, Р.И.Каем, А.К.Бадикова, Н.В.Чер-вонская).

2. Электронно-радиоавтографическое исследование жизнеспособности клеток сердца человека после смерти организма.

Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1991, № 6, с.661-663. (Соавт. А.А.Пальцын).

3. Некоторые вопросы реаниматологии с позиций морфофункцио-нального анализа изменений клеток ЦНС и миокарда.

Международный конгресс молодых ученых по клинической медицине. Киев, 1992, с.35. (Соавт. ЕЛ.Туманова) .

4. Электронно-радиоавтографическое изучение синтеза РНК в клетках умирающего мозга человека.

XIV Всесоюзная конференция по электронной микроскопии (биология и медицина). Москва, 1992, с. 119. (Соавт. В.П.Туманов).

5. Динамика угасания биосинтеза клеток мозга в различные сроки после смерти.

Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1992, № 11, с.536-539. (Соавт. В.П.Туманов).