Автореферат и диссертация по медицине (14.00.15) на тему:Электронно-радиоавтографическое исследование сосудов в грануляционной ткани при затянувшемся раневом процессе

5 О*

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ МОРФОЛОГИИ

ЧЕЛОВЕКА

На правах рукописи Смольянникова Вера Анатольевна

ЭЛЕКТРОННО-РАДИОАВТОГРАФИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СОСУДОВ В ГРАНУЛЯЦИОННОЙ ТКАНИ ПРИ ЗАТЯНУВШЕМСЯ РАНЕВОМ ПРОЦЕССЕ

(14.00.15 — патологическая анатомия)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

К/к.

Москва— 1993

/

/

г ''1 \

Работа выполнена в отделе патологической анатомии Института хирургии им. А:В.Вишневского Российской. АМН.

Научные руководители: академик РАМН,

профессор Д.С.Саркисов

доктор медицинских наук, профессор А.М.Светухин

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор Л.В.Кактурский

доктор медицинских наук, профессор В.Г.Петрухин

Ведущее учреждение — Военно-медицинская академия

им.С.М.Кирова

Защита состоится "Э,г 99 У г. в/^ час. на заседании

специализированного совета Д.001.04.01. при Научно-исследовательском институте морфологии человека по адресу: 117418, г.Москва, ул.Цурюпы, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научно-исследовательского института- морфологии человека.

Автореферат разослан 'у г мд993 г.

Ученый секретарь специалтированного совета кандидат! биологических наук

И.Н.Емельяненко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Трудно назвать другую проблему медицины, которая была бы предметом столь же длительного изучения и нашла бы отражение в таком огромном числе клинических и экспериментальных исследований, как проблема раны. И это вполне понятно: бытовой, производственный и военный травматизм "сопровождает" человека уже многие тысячилетия. На основе капитальных трудов отечественных и иностранных исследователей постепенно сложились современные представления о стадиях раневого процесса, .особенностях его течения при различных повреждениях тканей, осложнениях и наиболее эффективных методах лечения.

Первостепенное значение в этом отношении имеет научное наследие Н.И.Пирогова, который в своих классических исследованиях впервые в наиболее полной форме представил клинико-анатомическую картину раневого процесса и сформулировал понятие о "гноекровии" (сепсисе) и "раневой чахотке", как наиболее тяжелых его осложнениях и исходах. Большой вклад в учение о раневом процессе был внесен отечественными хирургами на основании их опыта во время первой мировой и Великой отечественной войн (Н.А.Вельяминов, В.А.Оппель, Н.Н.Бурденко, С.С.Гирголаев, Ю.Н.Джанелидзе и др.). Принципиальное значение имеют фундаментальные труды И.В.Давыдовского, обобщенные им в капитальном исследовании «Огнестрельная рана человека», который впервые поставил вопрос о ране как о биологической проблеме. Н.Н.Аничков, К.Г.Волкова, В.Г.Гаршин (1951) представили детальное и исчерпывающее исследование, касающееся морфогенеза раневого процесса, различных его осложнений и исходов. Наиболее полное освещение проблемы раны на современном этапе представлено в крупных руководствах «Раны и раневая инфекция» под редакцией М.И.Кузина и Б.М.Костюченка (1981, 1990) и В.И.Стручкова, В.К.Гос-тищева и Ю.В.Стручкова «Руководство по гнойной хирургии» (1984).

В исследованиях, выполненных отечественными и зарубежными авторами (Г.Н.Берченко, 1978; В.В.Рывняк, 1977, 1986; В.В.Серов и А.Б.Шехтер, 1981; А.Я.Фриденштейн, 1986; Crosker D. et all, 1970; Gaff ani et all, 1971; Pecock E., van Winkle W., 1970 и др.) в последние

два-три десятилетия с использованием таких современных методов как электронная микроскопия, электронная гистохимия, радиоавтография и др. были представлены данные, касающиеся тонких структурных изменений различных клеточных элементов (фибробластов, макрофагов, эндотелиоцитов, тучных клеток, их бзаимодействия и роли, которую играет каждый из них на этапах очищения раны от омертвевших тканей и её заживления, рубцевания.

Несмотря на важное значение этих исследований, многие вопросы, поставленные в них, остаются открытыми и требуют дальнейших исследований. К ним относится, в частности, вопрос о том, как происходит постепенное уменьшение числа сосудов грануляционной ткани в процессе её созревания, а также вопрос об источниках появления фибробластов, играющих определяющую роль в процессах организации и формирования рубца. Трудности решения этих вопросов пока не позволили придти к четким выводам и в литературе на этот счет мы имеем лишь разные точки зрения.

В связи с этим мы полагали, что использование такого метода структурно-функционального анализа как электронно-микроскопическая радиоавтография может пролить свет на эту проблему, и, если не разрешить её, то, во всяком случае, продвинуться в её понимании. Для этого у нас были известные основания, поскольку в работах, ранее выполненных в отделе патологической анатомии Института хирургии им. А.В.Вишневского РАМН (Саркисов Д.С. ссоавт., 1985, 1986, 1987, 1988) с помощью элетронно-микроскопической радиоавтографии был поставлен вопрос о важной роли так называемых перицитов в происхождении фибробластов и, тем самым, о значении сосудов грануляционной ткани в процессах организации и рубцевания.

Однако, пока этот вопрос окончательно не решен, что в частности, касается и проблемы длительно незаживающих ран. Динамика гистологических изменений при заживлении таких ран и особенности клеточных взаимодействий в них изученыв несравненно меньшей степени, чем при нормально протекающем раневом процессе. В отечественной литературе этому вопросу посвящена только небольшая глава в монографии Н.Н.Аничкова с соавт.( 1951), написанная В.Г.Гаршиным, и лишь единичные сообщения. Между тем, в современной клинике

гнойной хирургии проблема длительно незаживающих ран является одной из наиболее актуальных.

Цель и задачи исследования. Исходя из изложенного выше, целью нашего исследования было изучение сосудов грануляционной ткани и клеток, их составляющих в длительно незаживающих ранах. Такая постановка цели исследования объясняется тем, что большинство авторов связывают появление различных клеточных элементов, обеспечивающих заживление раны, с клетками, составляющими стенки сосудов грануляционной ткани. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучение ультраструктуры клеток, образующих стенки капилляров грануляционной ткани длительно незаживающих ран с оценкой их функциолнального состояния.

2. Сравнение морфологических изменений и функционального состояния клеток и сосудов грануляционной ткани длительно незаживающих ран с состоянием клеток и сосудов грануляционной ткани ран, заживающих в обычные сроки.

3. Изучение структурных изменений, претерпеваемых сосудами грануляционной ткани в процессе ее созревания и рубцевания раны.

Для решения поставленных задач в качестве основного был выбран метод электронно-микроскопической радиоавтографии.

Научная новизна. В работе впервые были исследованы методом электронно-микроскопической радиоавтографии структура, особенности пролиферации и биосинтеза в клетках грануляционной ткани длительно незаживающих ран. Использование этого метода позволило проследить за процессом перестройки сосудов грануляционной ткани на разных этапах её развития и созревания. Было показано, что сущность этой перестройки заключается в том, что перициты — кле.Тки, облегающие стенки мелких сосудов, как бы отходят от них, сгансьясь фиброластами, а сами сосуды распадаются, превращаются в отдельно лежащие и постепенно разрушающиеся клетки. Установлена корреляция между изменениями пролиферативной активности и синтеза РНК в эндотелиоцитах и фиброластах раны. В длительно незаживающих ранах эти показатели согласованно снижаются, тогда как аналогичные показатели для других видов клеток остаются без изменений.

Для анализа полученных данных был использован оригинальный метод количественного анализа электронно-микроскопических радиоавтографов. Это позволило впервые установить снижение уровня синтеза РНК в эндотелиоцитах и фиброластах длительно незаживающих ран по сравнению с ранами, заживающими в обычные сроки.

Практическое применение. В работе показано, что нарушение нормальной динамики изменения сосудов грануляционной ткани в процессе ее созревания является одним из проявлений задержки заживления, склерозирования и фиброзирования раны. На основании этого положения, наряду с учетом общих причин, особое внимание должно быть обращено на стимуляцию формирования грануляционной ткани, в особенности на процесс перехода перицитов в фиброласты и усиления последними коллагенообразования.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на межотделенческой конференции Института хирургии им. А.В.Вишневского РАМН. Основные положения диссертации обсуждались на заседании Московского общества паталогоанатомов (23 сентября 1992г.).

Пуб^у(кац^и. По теме диссертации опубликована обобщающая статья в центральном журнале.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, раздела с изложением материала и методики исследования, трех разделов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 166 страницах машинописного текста, включая иллюстрации. Диссертация иллюстрирована 2 таблицами, 45 фотографиями. Библиография включает 209 источников, в том числе 143 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для решения поставленных задач на базе отделения ран и раневой инфекции Института хирургии имени А.В.Вишневского РАМН у больных с длительно существующими ранами исследовали биопсии грануляций с помощью гистологического, гистохимического и электронно-радиоавтографического методов.

Были изучены материалы, взятые у 22 больных. У 19 больных срок существования ран составил от 1 месяца до 2-х лет, у 3-х репоративные процессы не были замедлены, раны заполнялись розовыми грануляциями, быстро эпителизировались, а после завершения эпителизации на месте бывшего повреждения оставался плотный тонкий рубец. У этих больных материал исследовали через 15-20 суток после образования раны, рассматривая его в качестве контроля. Для этих целей мы использовали также ранее полученные в нашей лаборатории данные по электронно-радиоавтографическому изучению заживления ран у крыс, которое протекает в принципе однотипно с тем, что наблюдается у человека.

Возраст больных составил 18-67 лет, из них 13 женщин и 9 мужчин (таблица 1).

Причинами возникновения ран послужили: мехническая травма - 9 случаев, послеоперационное нагноение — 4 случая, трофические язвы, обусловленные посттромбофлебитическим синдромом, облитерирую-щим атеросклерозом сосудов нижних конечностей, сахарным диабетом, поражением нервов — 6 случаев. В контрольной группе были представлены послеопреационные осложнения — 2 случая, механическая травма — 1 случай (таблица 2). Раны локализировались преимущественно в мягких тканях нижних конечностей, у одного больного — на

о о

щеке. Площадь поражения составила от 6 см до 1200 см , в основном — 200 см2 - 500 см2.

Таблица 1. Распределение больных по полу и срокам существования

ран.

Количество больных пол сроки существования ран

М Ж до 1 мес до 6 мес до 1 г. более 1 г. •

22 9 13 3 8 5 6

Таблица 2. Распределение больных по причинам возникновения ран.

Причины возникновения ран количество наблюдений

исследуемая группа контрольная группа

Травма 9 1

Послеоперационные 4 2

осложнения

Трофические наруше- 6 —

ния

Материал брали, как правило, при поступлении больного в клинику. В 8 наблюдениях проводили повторное гистологическое и электронно-радиоавтографическое исследование через 1 месяц после первичного взятия биопсии.

Для удобства изложения мы разделили все наблюдения по срокам существования ран на 3 группы: в первую вошли больные с ранами, существующими от 1 до 6 месяцев. Среди причин вялого течения раневого процесса в этой группе можно выделить как общие (возраст больных, наличие белковой недостаточности и др.), так и местные — недостаточно активная хирургическая тактика на первых этапах оказания медицинской помощи, наличие венозной недостаточности. Во второй группе наблюдались больные с ранами, существующими 6 месяцев 1 год. В этой группе причинами длительного существования ран явились также недостаточно активная хирургическая тактика в первые дни после травмы, наличие нервно-трофических нарушений. В третьей группе были объединены больные, у которых раны не заживали более 1 года. По вариантам течения третья группа больных была разделена на две подгруппы: в первую вошли больные, у которых раны и язвы возникли на фоне артериальной (атеросклероз сосудов нижних конечностейц) или венозной (варикозное расширение вен нижних конечностей) патологии. Необходимо отметить, что коррекция основного заболевания, т.е. оперативного лечения на сосудах больным не проводилась, они получали только местное лечение, при этом удавалось добиться временного положительного эффекта, раны закрывались,

однако, зрелой полноценной соединительной ткани не возникало и через некоторое время раны (язвы) рецидивировали. В институте хирургии им. А.В.Вишневского РАМН этим больным проводилось лечение в условиях абактериальной управляемой среды с созданием местной гипероксигенации ткани, что создавало условия для оживления репаративных процессов и закрытия ран и язв. Во второй подгруппе наблюдались больные с ранами, возникшими в результате травм и послеопреационных осложнений и существовавшими более 1 года клинически без положительной динамики. Причинами такого затяжного течения чаще всего являлось наличие в ране некротически измененных тканей, у одного больного, наиболее вероятно — иммуные нарушения, т.к. после проведения курса лечения преднизалоном рана у него была закрыта.

Во всех трех группах больных раны при осмотре выглядели приблизительно одинаково, они были покрыты вялыми грануляциями, неко-. торые с сероватым налетом, края ран часто были воспалены, в третьей группе больных края ран более плотныё, часто подрытые.

В отделении ран и раневой и нфекции института хирургии им. А.В.Вишневского РАМН больным проводилось стандартное лечение, основанное на принципах активной хирургической тактики, заключающейся в очищении ран от нежизнеспособных тканей, использование широкого спектра антибиотиков с учетом чувствительности к ним микрофлоры. Местно применялись осмотически активные мази на полиэтиленгликолевой основе (ПЭГ), содержащие антибиотики и асептики. В некоторых случаях, как уже об этом упоминалось, лечение проводилось в условиях абактериальной управляемой среды.

Материал, взятый для исследования, помещали в теплую среду 199 (температура среды 39°С), затем его делили на две части, одну фиксировали в 10% растворе формалина и далее исследовали гистологически и гистохимически, для чего заливали в парафин и срезы окрашивали гематоксилин-эозином и по методу ван-Гизона. С целью характеристики основного вещества грануляционной ткани ран парафиновые срезы окрашивались альциановым синим и рутеневым красным. При этом учитывали то обстоятельство, что гликозаминогликаны, гликопротеины и протеогликаны принимают активное участие в процессах регенерации

соединительной ткани, в регулировании процессов роста и дифферен-цировкн клеток, а так же в фибриллогекезе коллагена (В.В.Серов, А.Б.Шехтер, 1981).

Другую часть исследуемого кусочка изучали методом электронной радиоавтографии. Сущность этого метода заключается в том, что вводимый в организм или питательную среду, в которой находится живая ткань, низкомолекулярный предшественник тех илииных синтезируемых в организме макромолекулярных веществ включается в процесс биосинтеза этих веществ.

В течение некоторого времени, называемого импульсом, экзогенный меченый предшественник находится в системе (организме или культу-ральной среде), проникает в клетки и участвует, наряду с эндогенным аналогичным веществом, в биосинтезе макромолекул. По истечению импульса включение меченого предшественника должно быть прекращено.

Для подготовки радиоавтографических препаратов (радиоавтографов) на гистологические или элнетронно-микроскопические срезы наносится фотоэмульсия. Распад радиоактивных атомов, входящих в состав исследуемых макромолекул, восстанавливает кристаллы гологё-ноида серебра фотоэмульсии. Образуется так называемое "скрытое" изображение. При проявлении центры скрытого изображения превращаются в зёрна металлического (восстановленного) серебра. Эти зёрна в световом микроскопе при исследовании в проходящем свете выглядят черными точками. В отраженном свете зёрна металлического серебра ярко блестят на фоне структур среза.

Зёрна серебра, расположенные над структурами среза ткани, указывают с определенной степенью точности, называемой разрешающей способностью метода электронной радиоавтографии, на локализацию в срезе исследуемых макромолекул. Количество зёрен, расположенных над определенной площадью структуры (плотность зерен серебра), позволяет судить об интенсивности синтеза исследуемых макромолекул.

Так как основной задачей нашего исследования был вопрос о проли-феративной активности клеток грануляционной ткани, в особенности фибробластов, перицитов и эндотелиоцитов, мы использовали инкуби-

рование материала с Н3-тимидином (предшественником ДНК), а так же с Н3-уридином (предшественником РНК), что дало нам возможность судить о биосинтезе белка в исследуемых клетках.

Для проведения электронно-радиоавтографического исследования полученный материал разрезали на кусочки размером до 1 мм в диаметре, часть этого материала инкубировали при температуре 37-38°С в среде 199 с 20 мкКи/мл Н3-тимидином (удельная активность 21,6 Ки/мМ), другую часть в тех же условиях с 100 мкКи/мл Н3-уридином (удельная активность 20,0 Ки/мМ). Время инкубации 1,5 часа. После инкубации из ткани удаляли радиоактивный предшественник, не включившийся в макромолекулы, материал промывали холодным фосфатным буфером (температура +4°С, рН • 7,4) четыре раза по 15 минут, после чего фиксировали в 2,5% растворе глютарного альдегида, затем вновь промывали холодным фосфатным буфером (температура +4°С, рН - 7,4) в течение двух часов с четырехкратной сменой буфера, дофиксировали 1 % раствором четырехокиси осмия в течение двух часов. Для обезвоживания материала его проводили через несколько смен спирта и ацетона возрастающей концентрации. Поскольку грануляционная ткань содержит достаточно плотные коллагеновые волокна, материал заливали в более мягкую аралдитовую смолу, что обеспечивало возможность получать тонкие и качественные срезы. С каждого блока делали полутонкие срезы, на основе которых готовили светомикроскопические радиоавтографы, заливали фотоэмульсией *М», экспонировали трое суток, проявляли проявителем Д-19, окрашивали толуидиновым синим.

По результатам анализа радиоавтографов на полутонких срезах на блоках вырезали пирамидки для ультратомии. Ультратонкие срезы толщиной около 100 нм помещали на покрытое формваровой пленкой бленды, затем на бленды наносили монослой эмульсии «М» с помощью проволочной петли (Саркисов Д.С. с соавт., 1975). Электронно-микроскопические радиоавтографы экспонировали в течение 30-35 суток, проявляли разбавленным (чтобы уменьшить величину зерен) проявителем Д-19. Сразу после проявления из фотослоя удаляли желатину, расщепляя её в растворе проназы (1 мл на 10 мл воды) в течение 30 минут при температуре Проявленные срезы контрастировали

уранил-ацетатом и цитратом свинца по Рейнольдсу. Полученные электронно-микроскопические радиоавтографы изучали в электронном микроскопе СМ 10 PHILIPS при увеличении от 1000 до 30000.

С целью количественного анализа электронно-микроскопических радиоавтографов мы провели относительное определение концентрации меченого вещества сравниваемых объектов, т.е. мы определяли содер-' жание метки в препаратах опытной группы по сравнению с контрольной. О содержании метки мы судили по числу зерен восстановленного серебра на единицу площади исследуемой структуры, в литературе эту характеристику принято называть плотностью зерен серебра. Плотность зерен серебра измеряли над ядрами клеток, инкубированных в течение

О

1,5 часов с Н -уридином, т.е. в нашем материале эта величина выражала скорость синтеза РНК. Измерение производили на микроскопе-фотометре "Opton". Исследовали пропускание света через стандартную область

о

препарата площадью 3,2 мм , ограниченную диафрагмой. Для уменьшения погрешности, вносимой неодинаковой фотографической плотностью негативов, в каждой клетке устанавливали интенсивность освещения и чувствительность усиления так, чтобы средняя' величина сигнала цитоплазмы была 20-22 ед., не меняя настройки светз и усилителя, измеряли сигнал ядра. При выборе измеряемых зон соблюдали следующие условия:

1. Зона должна была быть полностью расположенной в ядре или цитоплазме.

2. Ни одна зона полностью, ни какая-либо её часть не должны быть измерены дважды.

3. Площадь ядра и цитоплазмы должна быть измерена полностью.

Указанная методика устраняет одну из трудностей анализа электронно-микроскопических радиоавтографов — при достаточно плотном расположении зерен они сливаются и становится невозможным объективно и надёжно подсчитать их число. При использованной нами методике необходимость такого подсчёта отпадает. Очевидно, что величина сигнала определяется не только числом зерен, но и их размером, причём этот показатель отражает не столько число зерен, сколько содержание восстановленного серебра в определяемой зоне. Эта особенность методики, по нашему мнению, не вносит существенной

погрешности в количественный анализ. Цель такого анализа состоит в том, чтобы определить содержание радиоактивного вещества в исследуемых клетках, а зерна восстановленного серебра являются результатом радиоактивного распада.

Как известно по литературным данным (Д.С.Саркисов с соавт., 1975), что и подтверждается в практической работе, при усиленном облучении кристалла галогенида серебра, например, при попадании в него двух-трех ^З-частиц образуется большое число центров скрытого изображения, которые быстрее проявляются и дают начало более крупным зернам серебра. Таким образом, содержание металлического серебра на срезах прямо пропорционально содержанию метки в срезе и фотометрическое определение концентрации серебра по нашей методике не вносит погрешностей. При исследовании негативов сигнал отражал величину пропускания света и был прямо пропорционален концентрации метки. Эту концентрацию определяли как разность между средней величиной сигнала ядра и средней величиной сигнала цитоплазмы.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ НАБЛЮДЕНИЙ

Электронно-микроскопическое и электронно-радиоавтографическое исследование длительно не заживающих ран выявило ряд морфологических особенностей последних, отличающих их от типичной картины нормально протекающего заживления раневого дефекта по типу первичного или вторичного натяжения. На эти особенности указывали и ранее (Н.Н.Аничков, В.Г.Гаршин, 1951), однако электронная микроскопия в сочетании с радиоавтографией позволила во-первых, детализировать эти особенности, во-вторых, подметить и такие, которые ранее не были известны.

Одним из наиболее харатерных признаков нормального хода заживления раны является прогессирующее уменьшение числа сосудов грануляционной ткани с постепенным, почти полным замещением их фиброзной тканью. Следует особо подчеркнуть, что если сам факт уменьшения числа сосудов грануляционной ткани по мере ее созревания давно и хорошо известен (Аничков H.H. с соавт., 1951; Есипова Й.К., 1966; Серов В.В. и Шехтер А.Б., 1981 и др.), то как это происходит

до настоящего времени оставалось не ясным. Все авторы ограничиваются только констатацией этого факта, без раскрытия его морфологической сущности, между тем, как оказалось, расшифровка его имеет принципиальное значение для более глубокого понимания механизмов заживления раны и её рубцевания.

Процесс уменьшения числа сосудов грануляционной ткани и постепенное их исчезновение оставался до сих пор многим неясным потому, что тонкие детали этого процесса трудно было наблюдать с помощью светооптического микроскопа. Это оказалось возможным при изучении раневого процесса в электронном микроскопе, однако в многочисленных электронно-микроскопических исследованиях этот вопрос по непонятным причинам до сих пор был обойдён молчанием.

Нами установлено, что уменьшение числа сосудов грануляционной ткани происходит двояким путём. Один из них состоит в том, что клеточные элементы стенки сосудов (эндотелиоциты, перициты) подвергаются дистрофии, всё труднее дифференцируются на электронног-раммах, как бы тают и постепенно вовсе исчезают. Если этот путь вполне можно было предположить, то второй явился для нас неожиданностью. Он заключается в том, что клетки, составляющие стенку сосуда, теряют связь между собой, как бы расходятся друг от друга, вследствие чего сосуд постепенно утрачивает свой типичный вид кольца и только сохраняющиеся группы эритроцитов сидетельствуют о том, что здесь был просвет сосуда. Поначалу логично было думать, что клетки, ранее составляющие стенку сосуда, затем подвергаются гибели.. Однако, радиоавтографическое исследование показало, что это не так, а, именно, что многие из этих клеток не гибнут, а сохраняют жизнеспособность, причём, не только в плане своей биосинтетической активности (мечение при использовании Н3-уридина), но и способности к репродукции (мечение при использовании Н3-тимидина). Это особенно характерно для так называемых перицитов — клеток, располагающихся в наружных слоях стенки сосуда и наподобие муфты окутывающих последний. Известно, что перициты рассматривают в качестве полипо-тентной мезенхимальной клетки, дающей начало различным клеткам соединительной ткани, в частности, фибробластам. Ряд исследователей давно уже высказали мнение о том, что источником появления боль-

лого числа фибробластов в грануляционной ткани являются периад-зентициальные клетки (А.А.Максимов 1925; А.Н.Заварзин, 1934; Мае Donald R. et Hadfield G., 1963; Grillo H.C., 1964; Ross R. et ail, 1970; Sine D.E., 1986), однако, все это оказалось предположением, существу-ощим параллельно с точкой зрения Н.Г.Хрущева с соавт. (1974, 1976), 3eresford J.N. (1989) и др., полагавших, что фибробласты грануляционной ткани имеют не местное, а гематогенное происхождение, или :о взглядом А.Я.Фриденштейна (1970, 1974, 1986), допускающего эдновременно обе эти возможности.

Наши данные, в принципе не отвергающие гипотезу о гематогенном троисхождении фибробластов, тем не менее можно рассматривать в качестве весьма серьезного аргумента в пользу точки зрения о перицитах как о важном источнике появления фибробластов в стадии организации и появления рубца. Это вполне согласуется с данными А.В.Смольянникова, Д.С.Саркисова и А.А.Пальцына (1984), Blanshard J., Veitch D. (1989), которые на основании злектронно-радиоавтографи-íecKHX исследований придерживаются мнения о том, что перициты являются клетками, которые, дифференцируясь в различные клетки :оединительной ткани — фибробласты, адипоциты, остеобласты и др., юд влиянием неизвестных онкогенных факторов дают начало соответ-ггвующим доброкачественным и злокачественным опухолям.

Мы полагаем, что достаточно точные доказательства того, что сосуды грануляционной ткани непросто исчезают, а "распадаясь", дают начало £ибробластам, являются одним из важных выводов нашей работы. Целается понятным "для чего" в ране формируется грануляционная гкань столь богатая сосудами — последние не только несут с кровью питательные вещества, необходимые для регенерации, но одновременно являются источником клеток, которые в дальнейшем становятся эсновным "строительным материалом" для процессов организации и рубцевания.

Если предположение о двух путях преобразования сосудов грануляционной ткани — гибели одних и распаде других на клетки, обеспечи-зающие процессы организации — можно считать на основании электранно-радиоавтографического исследования в достаточной мере эбоснованным, хотя и требующим дальнейших уточнений, то вопрос о

том, какие клетки сосудистой стенки дают начало фибробластам, остается открытым. Мы, как и большинство авторов, придерживаемся той позиции, что этими клетками являются перициты. Но это не единственная точка зрения. Так, Вегалек'Л.Т. с соавт. (1986, 1988, 1989) высказывают предположение, а подчас и утверждают, что источником фибробластов, играющих важную роль в процессах организации и склерозирования, являются клетки эндотелия мелких сосудов. Практически не существует исследователей, поддерживающих это мнение, поскольку большинство отечественных и зарубежных гистологов придерживаются взгляда на эндотелий как на жестко детерминированную структуру, не склонную к метаплазии и другим тканевым преобразованиям. Однако мы считаем целесообразным упомянуть о нем в связи с тем, что наши данные, если и не подтверждают точку зрения Вегапек Л.К., то во всяком случае, делают целесообразным ее обсуждение. Дело в том, что эндотелиоциты грануляционной ткани, как правило, метятся уридином и тимидииом столь же интенсивно, как и перициты и когда клетки стенки сосудов расходятся и лежат в межуточном веществе поодиночке, нередко трудно бывает определить, что это — эндотелио-цит или перицит. Сложность их идентификации усугубляется еще и тем, что и тот, и другой электронно-микроскопически имеют некоторое сходство с фибробластами. В связи с этим, не присоединяясь к точке зрения Вегапек ,1.Т., мы, вместе с тем, считаем, что она представляет интерес и несомненно заслуживает дальнейшего изучения с помощью новейших методов биологического анализа тканевой принадлежности клеток организма.

Трудности решения проблемы о преобразованиях клеток сосудов в фибробласты усугубляются еще и тем, что по мере дальнейших исследований возникает целый ряд новых ракурсов этой проблемы и, в частности, состоящего в том, что теперь при её обсуждении приходится оперировать более широким "ассортиментом" клеток, участвующих в этом процессе, и, как полагают, обладающих значительной способностью к взаимным трансформациям и образованию переходных форм. Сегодня в поле зрения исследователя, занятого этой проблемой, должны находиться эндотелиоциты, перициты, гладкомышечные клетки, так называемые миофибробласты и, наконец, сами фибробласты. Электрон-

но-микроскопически весьма трудно, а, подчас, бывает невозможно достаточно четко определить, что это — еще перицит или уже фиброб-ласт, или миофибробласт и т.д. Сильно затрудняет такую идентификацию и расположение этих клеток по отношению к просвету сосуда и между собой. Все это объясняет некоторую неопределенность и дискус-сионность нашей интерпретации клеток и те вопросительные знаки, которые встречаются в тексте. Несомненно, что в решении всех этих вопросов окончательная роль принадлежит современным методам молекулярной биологии. Более уверенно можно говорить о другом, не менее важном факте, а, именно, о том, что не все клетки стенки сосуда гибнут, что они оказываются свободно лежащими и, что самое главное, при этом могут сохранять функциональную и пролиферативную активность.

В длительно незаживающих ранах мы, как правило, встречали сосуды, строение которых мало отличалось от тех, которые в изобилии можно наблюдать в ране на стадии развивающихся грануляций. Другими словами, в длительно существующей ране сохранились сосуды, характерные для начальных стадий раневого процесса, т.е. как бы задерживалось их постепенное исчезновение. Следует отметить также, что при сравнении картин нормально заживающих ран (Д.С.Саркисов, Е.Г.Колокольчикова, 1989) с длительно незаживающими можно сделать вывод о том, что в последних "распадающиеся" сосуды встречаются чаще, а составляющие их эндотелиоциты и перициты отличаются менее интенсивным синтезом РНК, чем клетки стенки сосудов обычной грануляционной ткани.

Что касается различных клеток, располагающихся в межуточном веществе грануляционной ткани, то в длительно незаживающих ранах их значительно больше, чем при нормальном ходе раневого процесса, где они в стадии организации наблюдаются в виде редко расположенных одиночных макрофагов, тучных клеток, лейкоцитов и лимфоцитов. Здесь этих клеток так же много, как в стадии начала формирования грануляционной ткани после очищения раны. Особенно часто встречаются крупные' макрофаги с огромными вакуолями, заполненными детритом. Следует отметить также, что в длительно незаживающих ранах в межуточном веществе располагается не только много различных

клеточных элементов, но среди последних в состоянии дистрофии и распада находится значительно большее их число, чем в нормальной соединительной ткани. Характерно, что если в одних из них хорошо сохраняется ядро клетки при наличии выраженных деструктивных изменений ультраструктур цитоплазмы, то в других, наоборот, цитоплазма структурно вполне сохранена, в то время как ядро уже едва различимо.

Межуточное вещество в длительно незаживающих ранах отличается отечностью, рыхлостью, в нем, по данным гистохимических исследований, снижен уровень гликозо-аминогликанов. В отношении коллагена следует отметить, что вместо хорошо сформированных многочисленных, плотно расположенных пучков коллагеновых волокон, что типично для нормально заживающей раны, в наших наблюдениях отмечались единичные тонкие коллагеновые волокна без характерной исчерченно-сти, хаотично расположенные среди отечной межуточной ткани.

Следует отметить, что отличительные особенности длительно незаживающих ран были более четко выражены в случаях, когда на протяжении нескольких месяцев рана все время находилась в состоянии незаживления, в отличие от периодически рецидивирующих, т.е. то заживающих, то вновь открывающихся. Последние по своей морфологии были ближе к нормально текущему раневому процессу. Это следует скорее всего объяснить тем, что в рецидивирующих ранах процесс заживления периодически в той или иной мере доходил "до своего конца" и рана в связи с этим приобретала сходство с нормально заживающей, в то время как в нерецидивирующих ранах процесс протекал непрерывно на протяжении длительного времени по типу патологической регенерации.

Все указанные выше морфологические особенности длительно незаживающих ран, конечно, не отвечают на главный вопрос — почему эти раны не заживают. Эти особенности уточняют, детализируют и в некоторых отношениях вносят новые фактические данные в существующие представления о том, в чем морфологически выражается это незаживление. Корни же патологического течения регенеративного процесса лежат глубже, они уходят в проблему реактивности организма, нервной трофики, иммуных и других нарушений в каждом конк-

ретном случае. Вместе с тем нельзя не учитывать и важности, а во многих случаях и определяющего значения качества лечебных мероприятий в каждом конкретном случае. Опыт отделения ран и раневых инфекций Института хирургиии им. А.В.Вишневского РАМН свидетельствует о том, что хронизация раневого процесса нередко является прямым следствием недостаточно грамотного и интенсивного лечения раны. Напротив, активное использование современных методов борьбы с инфекционными осложнениями раневого процесса и, в частности, с сепсисом (лечение в абактериальной среде и др.), четкая идентификация микрофлоры, применение разнообразных мазей, стимулирующих репаративные процессы и т.п. способствует нормализации раневого процесса и полному выздоровлению больного.

В заключении подчеркнем, что в разработке большой, сложной и практически очень важной проблемы нарушений нормального хода раневого процесса морфологическим исследованиям принадлежит определенное место, и, наряду с биохимическими, физиологическими, иммунологическими, генетическими и другими они вносят свой конкретный вклад в ее решение.

ВЫВОДЫ

1.Длительно незаживающие раны характеризуются периодическим обострением процесса в виде затормаживания регенерации и вспышки воспаления. В связи с этим в такой ране присутствуют самые различные клеточные элементы (лейкоциты, лимфоциты, макрофаги, фибробласты и др.) и поэтому трудно бывает определить, в какой фазе своей эволюции находится такая рана в данный момент.

2. Установлена характерная для грануляционной ткани "перестройка" ее мелких сосудов, заключающаяся в том, что перициты — клетки, облегающие стенки мелких сосудов, как бы отходят от них, приобретая вид фибробластов, а сами сосуды превращаются в отдельно лежащие клетки. Эти данные делают более обоснованным давно уже высказанное разными авторами предположение о том, что перицит является плюри-потентной мезенхимальной клеткой, способной трансформироваться в различные клеточные элементы соединительной ткани, в частности, в фибробласты.

3. На основании полученных данных можно выдвинуть принципиально важный тезис о том, что сосуды грануляционной ткани являются не только транспортной системой, доставляющей в рану питательные вещества, но одновременно и основным источником клеточных элементов соединительной ткани (фибробластов), обеспечивающих процесс заживления раневого дефекта.

4. Проведенное исследование показывает как происходит уменьшение числа сосудов грануляционной ткани — клетки одних из них погибают, в то время как другие теряют связь между собой, оказываются свободно лежащими и трансформируются в фибробласты, тем самым способствуя коллагенообразованию и рубцеванию раны. Электронно-радиоавтографические данные свидетельствуют о том, что клетки, свободно лежащие после распада сосуда в межуточной ткани, сохраняют функциональную и пролиферативную активность.

5. Можно с известным основанием полагать, что описанные изменения сосудов грануляционной ткани имеют в качестве своего физиологического прототипа медленно текущие в нормальной коже превращения периадвенгициальных клеток её немногочисленных сосудов в фибробласты, что и обеспечивает непрерывное физиологическое обновление последних и волокнистых структур.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Электронно-радиоавтографическое изучение длительно незаживающих ран. //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, Ш91, № 12, С.647-650 (в соавторстве с Е.Г.Колокольчиковой).