Автореферат и диссертация по медицине (14.00.23) на тему:Состояние модулирующих субсистем ЦНС крысы при трансплантации эмбриональных закладок голубого пятна и черной субстанции

Российский государственный медицинский университет

На правах рукописи МАЛИНИНА Ирина Евгеньевна

УДК-.616.089.843:611.8

СОСТОЯНИЕ МОДУЛИРУЮЩИХ СУБСИСТЕМ ЦНС КРЫСЫ ПРИ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ ЗАКЛАДОК ГОЛУБОГО ПЯТНА И ЧЕРНОЙ СУБСТАНЦИИ

14.00.23 - гистология, цитология, эмбриология

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель -академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор В. Н. ЯРЫГИН

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

СОКРАЩЕНИЯ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ В ТЕКСТЕ ДИССЕРТАЦИИ................5

ВВЕДЕНИЕ.......................................................................................................................................................6

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................................13

1.1. ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНАЛЬНОЙ НЕРВНОЙ ТКАНИ В ГОЛОВНОЙ МОЗГ МЛЕКОПИТАЮЩИХ И ЧЕЛОВЕКА......................13

1.2. НОР АДРЕНАЛИН- И ДОФАМИНЕРГИЧЕСКИЕ НЕЙРОННЫЕ

СИСТЕМЫ И ИХ ЗНАЧЕНИЕ В РЕГУЛЯЦИИ СОМАТИЧЕСКИХ И ВЕГЕТАТИВНЫХ ФУНКЦИЙ.........................................................................................................26

1.3. ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВЯЗИ ЦЕНТРАЛЬНОЙ

И ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ НОРАДРЕНЕРГИЧЕСКИХ СТРУКТУР НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ..............................................................................................................................37

1.4. РЕЗЮМЕ....................................................................................................................................................................39

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ .....................................................................................43

2.1. ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЯ....................................................................................................................43

2.2. ТРАНСПЛАНТАЦИЯ НЕРВНОЙ ТКАНИ В ПОЛОСТЬ ТРЕТЬЕГО

ЖЕЛУДОЧКА ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС......................................................................45

2.3. МОРФОЛОГИЧЕСКИЙ И МОРФОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗЫ.....................47

2.4. РАДИОАВТОГРАФИЧЕСКИЙ МЕТОД ОЦЕНКИ ТРАНСКРИПЦИОННОЙ

АКТИВНОСТИ ХРОМАТИНА.........................................................................................................48

2.5. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ПОВЕДЕНИЯ ЖИВОТНЫХ.......................................50

2.5.1.МЕТОД "ОТКРЫТОЕ ПОЛЕ" ..............................................................................50

2.5.2. АНАЛИЗ РЕПРОДУКТИВНОЙ СПОСОБНОСТИ ЖИВОТНЫХ ............................................................................................................................52

2.5.3. АНАЛИЗ ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТИ ЖИЗНИ ЖИВОТНЫХ ............................................................................................................................52

2.6. СТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ДАННЫХ.......53

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.....................54

3.1. МОРФО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ НЕЙРОНОВ

ЭМБРИОНАЛЬНОЙ ТКАНИ, ПЕРЕСАЖЕННОЙ В ПОЛОСТЬ

ТРЕТЬЕГО ЖЕЛУДОЧКА ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС........................................54

3.1.1. Оценка степени дифференцировки нейронов пересаженной ткани..................................................................................................................................................56

3.1.2. Особенности пространственной организации нейронов пересаженной ткани...........................................................................................................58

3.2. ВЛИЯНИЕ ТРАНСПЛАНТАЦИИ НА СОСТОЯНИЕ НЕРВНЫХ КЛЕТОК

ГОЛУБОГО ПЯТНА, ЧЕРНОЙ СУБСТАНЦИИ И КРАНИАЛЬНОГО

ШЕЙНОГО СИМПАТИЧЕСКОГО ГАНГЛИЯ, МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ И

МОРФОМЕТРИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКИ.............................................................59

3.3. ТРАНСКРИПЦИОННАЯ АКТИВНОСТЬ ХРОМАТИНА НЕВРОЦИТОВ

ГОЛУБОГО ПЯТНА, СИМПАТИЧЕСКОГО ГАНГЛИЯ, ЧЕРНОЙ

СУБСТАНЦИИ В НОРМЕ И В УСЛОВИЯХ ТРАНСПЛАНТАЦИИ............60

3.3.1. Возрастная динамика транскрипционной активности хроматина невроцитов голубого пятна в норме и в условиях трансплантации.......................................................................................................................60

симпатического ганглия нормально развивавшихся и в условиях

трансплантации крыс разного возраста............................................................68

3.4. ВЛИЯНИЕ ТРАНСПЛАНТАЦИИ НА ПОВЕДЕНИЕ ЖИВОТНЫХ.................69

3.4.1. Влияние трансплантации на динамическую, ориентировочную и исследовательскую активности животных................................................69

3.4.2. Влияние трансплантации на репродуктивную способность животных......................................................................................................................................78

3.4.3. Влияние трансплантации на продолжительность жизни животных......................................................................................................................................79

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ...................................................................82

ВЫВОДЫ........................................................................................................................................................91

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.........................................................................................................................................92

БИБЛИОГРАФИЯ..................................................................................................................................93

СОКРАЩЕНИЯ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ В ТЕКСТЕ

ДИССЕРТАЦИИ

А- адреналин,

А-ергический - адренергический,

гп- голубое пятно,

ГЭБ- гемато-энцефалический барьер,

днк- дезоксирибонуклеиновая кислота,

ДА- дофамин,

ДА-ергический - дофаминергический,

КА- катехоламин,

КА-ергический - катехоламинергический,

кшсг- краниальный шейный симпатический ганглий,

НА- норадреналин,

НА-ергичеекий - норадренергический,

РНК- рибонуклеиновая кислота,

цнс- центральная нервная система,

чс- черная субстанция,

CCSG- cranial cervicalis sympatheticus ganglion

LC- locus coeruleus,

LCS- locus subcoeruleus,

SN- substantia nigra,

6-ОНДА - 6-гидрокеидофамин

ВВЕДЕНИЕ

Трансплантация эмбриональной нервной ткани является одним из перспективных направлений в нейробиоло-гии и медицине. Среди реципиентных органов наибольший интерес представляет головной мозг (Сеченов И. М., 1952, Александрова М. А., Полежаев JI. В., 1982; Подачин В. П., 1992; Hoogendijk W. J. et al., 1995; Murata Y., Masuko S., 1996; Svanidze I. K. et al., 1997). Накопленный материал свидетельствует о значительной роли центральных образований мозга в регуляции внутренней среды организма. При различных повреждениях мозга возникают дефекты и логичным способом компенсации утраченных либо нарушенных функций является трансплантация нервной ткани головного мозга. Эти обстоятельства явились основным мотивом данной работы, в которой проводится трансплантация эмбриональных закладок locus coeruleus (LC) и substantia nigra (SN) в интактный мозг крыс разного возраста и делается попытка рассмотреть влияние трансплантата на взаимоотношения центральных и периферических нора дренергических и дофаминергических структур нервной системы.

К настоящему времени получены данные, свидетельствующие о том, что locus coeruleus — голубое пятно — вегетативное ядро ствола мозга является самым крупным норадренергическим образованием, a substantia nigra —

черное вещество одним из основных дофаминергических образований головного мозга. Нарушение функции в сим-патоадреналовой системе приводит к нарушению содержания дофамина в окончаниях аксонов допаминергиче-ских нейронов в черной субстанции и к нарушению двигательной функции. Недостаточность синтеза дофамина ведет к паркинсонизму с его характерными двигательным и вегетативным симптомокомплексом (Кандель Э. И., 1981). Синдром паркинсонизма выражается в нарушении двигательной функции: треморе, ригидности, трудности начать движение и др. В настоящее время считается, что синдром вызван недостаточностью секреции дофамина нейронами черной субстанции и подачи его к полосатому телу; традиционно лечат его, вводя больным L-ДОПА, который в мозге превращается в дофамин. Однако, это лечение далеко не радикально, так как патолого-анатомическое исследование мозга в таких случаях выявляет изменения в подкорковой области, затрагивающие базальные ядра, бледный шар и особенно черную субстанцию, в которой исчезает пигмент, а нервные клетки атрофируются. Таким образом, возможным методом компенсации недостатка дофамина могла бы стать трансплантация эмбриональной нервной ткани черной субстанции в мозг реципиента.

Locus coeruleus является основным компонентом центрального аппарата функциональной системы гомеостаза, что следует и определяется его функциональным единст-

вом с мезенцефалическим ядром тройничного нерва. ГП влияет на вегетативные функции: участвует в обеспечении потребностей организма необходимыми компонентами жизнедеятельности и в адаптивных реакциях. Отмечены сходные биохимические процессы и физиологические эффекты между норадренергической системой мозга и симпатическим отделом периферической нервной системы, что указывает на их тесную взаимосвязь (Белова Т. И., Го-лубева Е. Л., Судаков К. В., 1980; Abercrombie J., 1987; Jones G., 1987; Gimenez у Ribotta М. G. et al., 1996; Hudson J. L. et al., 1994; Orsal D. et al., 1997).

Одним из возможных экспериментальных подходов к проблеме компенсации нарушенных функций организма является модель трансплантации. В частности, обращение к трансплантации эмбриональных закладок locus coeruleus и substantia nigra в интактный мозг позволяет проследить как за морфо-функциональным состоянием нервно-клеточных элементов LC и SN, так и за функциональной взаимосвязью норадренергической и дофаминер-гической систем в условиях трансплантации.

Целью настоящего исследования явилось изучение динамики морфо-функционального состояния нейронов голубого пятна, краниального шейного симпатического ганглия, черной субстанции в условиях трансплантации эмбриональной нервной ткани и эффектов трансплантации на состояние центральной и периферической

норадренергических, а также дофаминергической структур нервной системы.

В данной работе были поставлены следующие основные задачи:

1. Отработать методику трансплантации эмбриональной ткани locus coeruleus, substantia nigra в полость третьего желудочка головного мозга крыс;

2. Оценить развитие эмбриональной нервной ткани, взятой из разных отделов мозга (locus coeruleus, substantia nigra), при пересадке в одно и то же место (полость третьего желудочка головного мозга);

3. Провести морфологический и морфометрический анализ голубого пятна, краниального шейного симпатического ганглия, черной субстанции в условиях трансплантации;

4. Радиоавтографическим методом дать оценку транскрипционной активности хроматина ядер невроцитов ГП, КЫ1СГ, "ЧС в условиях трансплантации;

5. Определить состояние трансплантатов в поздние сроки опытов;

6. Изучить влияние трансплантации locus coeruleus, substantia nigra на общее состояние и поведение экспериментальных животных разного возраста и пола.

Научная новизна работы:

1. Впервые использована модель трансплантации эмбриональных locus coeruleus и substantia nigra в полость третьего желудочка головного мозга крыс для выяснения влияния трансплантации эмбриональной нервной ткани на состояние центральной и периферической норадренергических и дофаминергической структур нервной системы организма;

2. Впервые проведено комплексное исследование морфо-функционального развития нейронов голубого пятна, краниального шейного симпатического ганглия, черной субстанции в условиях трансплантации эмбриональной ткани LC и SN в полость третьего желудочка головного мозга крыс;

3. Показан эффект присутствия и развития трансплантата locus coeruleus и substantia nigra на невроциты ГП, КШСГ, ЧС.

Практическое значение работы

Полученные результаты имеют значение для понимания закономерностей функционирования центральной и периферической норадренергической и дофаминергической структур нервной системы организма. Данные о структурных и метаболических изменениях в невроцитах голубого пятна, симпатического ганглия, черной субстанции в условиях трансплантации по-новому освещают и

подтверждают предположение об определенной зависимости морфо-функциональных характеристик вышеперечисленных структур от наличия, степени развития и функционирования трансплантата. Полученные результаты могут быть использованы в нейробиологических и клинических исследованиях, а также в курсах биологии, гистологии, иммунологии и физиологии биологических факультетов университетов, медицинских академий и институтов.

Апробация работы

Результаты исследований доложены на российско-шведском симпозиуме "Новое в нейробиологии" в г. Москве — 1996 г., Конгрессе Ассоциации морфологов (АГЭ) в г. Твери — 1996 г., российско-швейцарском симпозиуме "Гипоксия в медицине" в г. Москве — 1996 г. и на совместной научной конференции кафедры биологии и гистологии лечебного факультета российского государственного медицинского университета — 1998 г.

На защиту выносятся следующие основные положения работы:

1. При трансплантации эмбриональных закладок как ЬС, так и БЫ в полость третьего желудочка головного мозга крыс воспроизводится режим генерации нейронов, характерный для нормального онтогенеза. Клетки трансплантатов характеризуются высоким уровнем

дифференцировки и приобретают характерные черты ЬС и БЫ соответственно.

2. В ходе специфической дифференцировки нейроны пересаженной эмбриональной ткани ЬС и вЫ "функционально" интегрируют в ткань мозга крыс-реципиентов.

3. Присутствие трансплантатов ЬС и БЫ в полости третьего желудочка головного мозга крыс оказывает различное влияние на функциональное состояние собственных ГП, ЧС и КШСГ.

4. Присутствие трансплантатов ЬС и 8Ы по-разному влияет на ответы в поведенческих тестах крыс-реципиентов.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано семь работ, список которых приводится в конце автореферата.

Структура диссертации

Диссертация состоит из введения, четырех глав (1 — «Обзор литературы», 2 — «Материалы и методы исследования», 3 — «Результаты собственных исследований», 4 — «Обсуждение результатов»), выводов, заключения и списка литературы. Работа изложена на 124 страницах, содержит 10 таблиц и 35 рисунков (7 микрофотографий, 27 графиков и схема). Список литературы включает 268 ис-

точников, из которых 75 опубликовано в отечественных и 193 в зарубежных изданиях.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНАЛЬНОЙ НЕРВНОЙ ТКАНИ В ГОЛОВНОЙ МОЗГ МЛЕКОПИТАЮЩИХ И ЧЕЛОВЕКА

Трансплантация целостных органов или их частей представляется логичным способом компенсации утраченных либо нарушенных функций (Маковецкий К. К., 1994). Это положение подкрепляется успешными операциями по трансплантации почек, сердца и других органов (Савельев C.B., 1992). Проблема трансплантации нервной ткани в головной и спинной мозг изучается уже более ста лет, начиная с опытов Томпсона, который провел трансплантацию нервной ткани в мозг млекопитающих (Tompson W. G., 1890). Основной период современной трансплантологии начинается с 70-х годов нашего столетия.

Наиболее распространены трансплантации хромаффинных клеток из коры надпочечников в головной и спинной мозг млекопитающих и человека. Пересаживали выращенные в культуре диссоциированные клетки мозгового вещества надпочечников в боковой желудочек головного мозга взрослых крыс. При исследовании экстрапирамидальной моторной функции отмечалось значительное улучшение моторной координации (до 84 дней) (Garsia-Hernandes F. et al., 1993). Обнаружено, что низкая выживаемость трансплантированных клеток мозгового вещества надпочечников, содержащих как хромаффинные клетки, так и фибробласты и эндотелиальные клетки, связана с наличием низкого уровня NGF (фактора роста нервов)

в стриатуме. В эксперименте была продемонстрирована хорошая выживаемость клеток надпочечников коровы, очищенных от фиб-робластов и эндотелиальных клеток, трансплантированных в стриа-тум грызунов и нечеловекообразных обезьян. (Shueler S. В., Ortega J. D., Sagen J., Kordower J. H., 1993). Был предложен вариант трансплантации хромаффинных клеток мозгового вещества надпочечников в спинальное субарахноидальное пространство с целью снижения порога болевой чувствительности путем поддержания локальной доставки катехоламинов и опиоидных пептидов. В эксперименте крысам репродуктивного возраста были пересажены коровьи изолированные хромаффинные клетки, инкапсулированные в полимерную полупроницаемую мембрану; болевая чувствительность оценивалась в течение 3 месяцев после трансплантации и результаты были положительные (Sagen J., Wang H., Tresco P.A., Aebi-scherP., 1993). Можно добавить, что использование ксеногенных доноров помогло бы преодолеть одно из главных ограничений клинического применения нейротрансплантации - недостаток донорского материала. Трансплантации хромаффинных клеток из коры надпочечников проводятся при лечении больных паркинсонизмом. Эти операции проводятся 20 группами исследователей, в основном, в США и Швеции. В результате снижается необходимая доза L-ДОФА (L-диоксифенилаланин), но значительного улучшения состояния не наблюдается (WidnerH., Rehncrona S., 1993), а у пожилых людей трансплантация приводила к расстройству памяти (Allen G. S., Burns R., Tulipán N. В. et al., 1983). В целом этот вид ауто-трансплантаций не привел к ожидаемым результатам, а возникшие

после операций осложнения поставили под сомнения смысл подобных пересадок (Morrison К., 1987). Невысокий терапевтический эффект аллогенных пересадок хромаффинных клеток стимулировал поиск новых источников донорских клеток. Предположительным представлялось использование эмбриональной нервной ткани, поэтому наибольшее распространение получили опыты по трансплантации различных её участков в нервные стволы, желудочки мозга или непосредственно в структуры мозга животных и человека.

Среди реципиентных тканей наибольший интерес представляет головной мозг. Иммунологическая привилегированность головного мозга, открытая еще в 1948 г. Медаваро