Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Роль цитокинов и рецептора ССR5 в формировании предрасположенности и прогрессии рака молочной железы

Злокачественные новообразования молочных желез занимают лидирующее место в структуре онкологических заболеваний женщин. Статистические данные констатируют ежегодное увеличение числа диагностируемых случаев рака молочной железы (РМЖ). В мире выявляют около 1 млн. новых случаев за год, к 2010г. прогнозируется рост числа заболевших до 1,45 млн. В России абсолютное число женщин, впервые заболевших раком молочной железы, в 2002г. достигло 45857. Злокачественная опухоль молочной железы ежедневно диагностируется у 102 женщин [Давыдов М. И, Аксель Е. М., 2001].

Наряду с этим отмечается тенденция к увеличению доброкачественных заболеваний молочной железы, которые встречаются у каждой 4-й женщины в возрасте до 30 лет, а у женщин старшего возраста патологические состояния молочных желез выявляются в 60% случаев. При этом наиболее часто наблюдается диффузная форма фиброзно-кистозной мастопатии (ФКМ), которой, по данным различных авторов, страдает от 50% до 90% женщин. Установлено, что большинство злокачественных новообразований молочных желез развивается на почве длительно текущих дисгормональных доброкачественных процессов, характеризующихся пролиферацией эпителия железистой ткани и изменениями соединительной ткани. Сформировалось представление о мастопатии как предраковом состоянии, которое под влиянием определенных обстоятельств может трансформироваться в РМЖ. Принято считать, что РМЖ на фоне доброкачественных новообразований встречается в 3-5 раз чаще, а при узловой форме мастопатии с наличием пролиферации эпителия в 30-40 раз чаще, чем при отсутствии патологии в тканях молочной железы [Прилепская В.Н. и соавт., 2003; Габуния М.С., 2001; Певгова Г.Ю. и соавт., 2003; Чистяков С.С. и соавт., 2003; Hartmann, 2004].

РМЖ как мультифакториальное заболевание обусловлено изменениями функционирования множества генов, обеспечивающих структурно-функциональный гомеостаз организма, при этом необходимой молекулярной основой злокачественной трансформации является нарушение функций онкогенов и/или генов-супрессоров. Злокачественная трансформация клеток и развитие опухоли происходит в результате дисбаланса процессов пролиферации, апоптоза и дифференцировки клеток, в основе которого лежит комплексное взаимодействие наследственно-генетических, гормонально-метаболических, иммунологических, экзогенных факторов. При этом значимым в определении риска может быть и неблагоприятное сочетание аллелей вовлекаемых в патогенез РМЖ полиморфных генов [Имянитов Е. Н., Хансон К. П., 2004; Берштейн JI. М., 1998; Imyanitov Е:, Hanson К., 2004; Smith etal.,2004; Azmy etal.,2004; Jong et al., 2005].

Современные представления о важной роли системы иммунитета в регуляции пролиферации, дифференцировки и программируемой гибели клеток свидетельствуют о ее существенном вкладе в формирование предрасположенности к развитию неоплазий. Известно, что регуляция онтогенеза клеточных популяций осуществляется благодаря комбинированному воздействию нервной, эндокринной и иммунной систем, функционально тесно связанных друг с другом и практически равноправных [Корнева Е. А., 1993; Корнева Е. А., 2003; Абрамов В. В., 1996; Васильев Н. В. и соавт., 2005]. Это дает основания, несмотря на большие противоречия, имеющиеся в литературе, с полной уверенностью утверждать, что система иммунитета играет в этиопатогенезе злокачественного роста существенную роль. При этом цитокины как универсальные медиаторы межклеточных взаимодействий повсеместно вовлекаются в регуляцию этих процессов.

Исследованиями последних лет показаны взаиморегуляторные отношения цитокинов с эстрогенами, играющими важнейшую роль в патогенезе РМЖ. Результатом этих взаимодействий может быть как индукция пролиферативных процессов, так и активация проапоптотических сигнальных путей в клетках [Fanti et al., 2003; Aronica et al., 2004; Fernando et al., 2004; Huber et al., 2004]. Такая неоднозначность определяется вовлечением в процессы злокачественной трансформации кроме онкогенов и генов-онкосупрессоров множества факторов, способных модифицировать их функции и опосредованно влиять на чувствительность клеток к генотоксическим воздействиям эндогенного либо экзогенного происхождения и процессы опухолевой промоции. Очевидно, что особенности индивидуального генетического фона играют очень существенную роль в детерминации онкологического риска [Abba et al., 2004].

В число цитокинов входят хемокины, обладающие чрезвычайно широким спектром биологических эффектов, регулирующие активацию, миграцию иммунокомпетентных и других клеток и непосредственно участвующие в специфических и неспецифических реакциях иммунной системы. Следует отметить, что роль цитокинов и хемокинов, в частности, в процессах злокачественной трансформации и опухолевой прогрессии далеко неоднозначна. Имеется множество сведений как о противоопухолевой активности различных цитокинов, так и об их функционировании в качестве промоторов опухолевого роста [Liu et al., 1996; Luboshits et al., 1999; Azenshtein et al., 2002; Кадагидзе З.Г., 2002]. Данные ряда авторов свидетельствуют о связи цитокинов (ТФР-бета, ФНО-альфа, ИЛ-6, ИЛ-4, ИЛ-2, RANTES и др.) с прогнозом клинического течения РМЖ, однако представленные результаты достаточно неоднозначны и порой противоречивы. При этом принципиальным моментом является возможность диаметрально противоположной функциональной роли того или иного цитокина на этапах формирования злокачественного новообразования и в прогрессии опухоли, как, например, показано для ТФР-бета, который снижает риск РМЖ, но является фактором, способствующим прогрессированию заболевания [Nikolic-Vukosavljevic et al., 2004; Czeczuga-Semeniuk et al., 2004].

В этой связи изучение уровня продукции цитокинов может дать не только информацию о функциональной активности различных типов иммунокомпетентных клеток, соотношении процессов активации Т-хелперов I и II типов, но и позволяет рассматривать его в качестве одного из важных маркеров, характеризующих биологические особенности конкретной опухоли и, следовательно, имеющих прогностическую значимость. Подтверждением вовлечения цитокинов в патогенез РМЖ являются данные о том, что отдельные аллельные варианты их полиморфных генов ассоциированы с восприимчивостью, особенностями клинического течения, исходом онкологического процесса [Benson et al., 2004; Smith et al., 2004; Zafiropoulos et al., 2004].

В последние годы внимание исследователей привлекает хемокиновый рецептор CCR5, для которого выявлен генетический дефект, характеризующийся гомозиготной делецией 32 пар оснований в гене CCR5, приводящий к синтезу функционально неактивного белка рецептора, который не способен экспрессироваться на поверхности клетки. Для лиц с описанной мутацией риск заражения ВИЧ (макрофаготропным вариантом вируса) существенно снижен, а развитие инфекционного процесса и клинической картины СПИДа носит более благоприятный характер. В общей популяции в разных этнических группах около 10-15% лиц являются носителями делеционного аллеля. Найдены ассоциации между делеционным полиморфизмом гена CCR5 и прогнозом при ряде инфекционных (ВИЧ-инфекция, туберкулез, грипп) [Dean et al., 1996; Liu et al., 1996] и соматических заболеваниий (сахарный диабет, ишемическая болезнь сердца, ревматоидный артрит) [Kalev et al., 2003; Gonzalez et al., 2001; Cooke et al., 1998].

Manes et al. в 2003 году было показано, что для осуществления эффективного апоптоза модифицированных клеток РМЖ, необходимо согласованное взаимодействие белка-рецептора CCR5 и онкосупрессора р53. Этими авторами получены данные, что носительство вариантного аллеля CCR5del32 ассоциировано с неблагоприятным прогнозом при раке молочной железы у пациенток испанской национальности только при отсутствии соматических мутаций в гене р53 в клетках опухоли.

Известно, что белок р53 является регулятором транскрипции гена р21, кодирующего ингибитор циклин-зависимых киназ CIP1 [Dyson et al., 1999]. Недавно было установлено, что белок р21 может взаимодействовать с транскрипционными факторами NF-AT, АР-1, NF-kB и ингибировать пролиферацию лимфоцитов и экспрессию провоспалительных цитокинов. Эти данные косвенно указывают на возможность регуляции функций иммунокомпетентных клеток CCR5-p53 опосредованным путем [Khanna et al., 2005].

Показано, что клетки рака молочной железы экспрессируют хемокины и хемокиновые рецепторы [Allinen, 2004]. СС хемокин RANTES продуцируется клетками рака молочной железы и действует аутокринно через свой рецептор CCR5, который также экспрессируется на поверхности злокачественных клеток. У больных при этом выявлена прямая корреляция высокого уровня RANTES в крови с более агрессивным течением РМЖ [Azenshtein et al., 2002; Luboshits et al., 1999; Walser, 2004]. В то же время экспрессия CCR5 на опухоль-инфильтрирующих лимфоцитах свидетельствует о возможности их дифференцировки по Th-1 типу и развития специфического противоопухолевого ответа [Qin et al., 1998; Siveke et al., 1998]. Получены данные о способности ряда цитокинов, таких как ИЛ-2, ИЛ-12, ФНО-альфа, регулировать экспрессию CCR5 и его лигандов на транскрипционном и посттранскрипционном уровнях [Wang et al., 1999].

В литературе практически нет сведений о взаимосвязи полиморфных вариантов гена CCR5 с традиционными прогностическими факторами при РМЖ, и отсутствуют данные об ассоциации его полиморфизма с дисгормональными гиперпластическими процессами в молочной железе. В то же время, как указано выше, CCR5 является одним из важных универсальных рецепторов, определяющих инфильтрацию иммуноцитов в очаги воспаления и опухоль, и тесно связан с развитием клеточно-опосредованного иммунного ответа, в том числе на опухолевые клетки, то есть может участвовать в регуляции противоопухолевого иммунитета и роста опухоли. С другой стороны, его экспрессия на клетках рака молочной железы может быть связана с плохим прогнозом. Все сказанное определяет актуальность исследований взаимосвязи полиморфизма гена CCR5, функциональной активности иммунокомпетентных клеток, их цитокинового баланса с патогенетически и клинически значимыми для рака молочной железы признаками с целью оценки участия изучаемых факторов иммунной системы в риске возникновения и прогрессии РМЖ.

Цель исследования:

Изучить полиморфизм гена хемокинового рецептора CCR5 по CCR5del32, уровень продукции регуляторных и эффекторных цитокинов и показателей иммунитета у больных с предопухолевыми заболеваниями и раком молочной железы и исследовать их взаимосвязь с характером клинического течения и исходом заболевания.

Задачи исследования:

1. Оценить частоту встречаемости полиморфных вариантов гена CCR5 у пациенток с раком молочной железы, фиброаденомой и фиброзно-кистозной мастопатией.

2. Оценить уровень экспрессии рецептора CCR5 на лимфоцитах периферической крови у больных раком молочной железы.

3. Изучить уровень продукции цитокинов и иммунный статус у больных с дисгормональными доброкачественными заболеваниями и злокачественными новообразованиями молочной железы.

4. Изучить продукцию цитокинов и показатели иммунитета у больных с ФКМ, ФА и раком молочной железы в зависимости от выраженности патологического процесса.

5. Оценить взаимосвязь полиморфизма гена хемокинового рецептора CCR5 с клиническими особенностями и исходом заболевания у больных раком молочной железы.

6. Изучить уровень продукции цитокинов и параметры системного иммунитета у больных с предопухолевой патологией и злокачественными новообразованиями молочной железы в зависимости от генотипа CCR5 гена.

Научная новизна

Впервые проведено исследование полиморфизма гена CCR5 у больных с дисгормональными доброкачественными заболеваниями и раком молочной железы и его взаимосвязи с характером клинического течения заболевания.

Получены новые данные о роли хемокинового рецептора CCR5 во взаимосвязи с иммунологическими параметрами и цитокиновым статусом организма в развитии и прогрессии злокачественных опухолей молочной железы.

Показано, что уже на стадии предопухолевых изменений в ткани молочной железы отмечаются выраженные изменения как функциональной активности иммуноцитов, так и их субпопуляционного состава, характерные и для больных со злокачественными новообразованиями.

Применение факторного анализа позволило выявить наиболее значимые иммунологические показатели, ассоциированные с характером клинического течения заболевания у больных РМЖ (уровень продукции ИЛ-4) и выраженностью патологического процесса в ткани молочной железы при ФА и ФКМ (уровень продукции ИЛ-2, ИЛ-4, количество лимфоцитов, имеющих рецептор к ИЛ-2).

Выявлена четкая ассоциация вариантного генотипа гена CCR5 и продукции ИЛ-4 с клинико-морфологическими признаками, характеризующими благоприятное клиническое течение РМЖ (отсутствие лимфогенного метастазирования, умеренная степень дифференцировки опухолевых клеток, благоприятный исход).

Выявлены различия продукции цитокинов и параметров иммунитета у больных с дисгормональными доброкачественными процессами и РМЖ в зависимости от генотипа CCR5, что свидетельствует об определенном вкладе иммунологической компоненты в риск возникновения и прогрессию РМЖ.

Теоретическая и практическая значимость

Полученные результаты расширяют представления об участии цитокинов и хемокиновых рецепторов в механизмах формирования злокачественных новообразований молочной железы.

Получены данные о вкладе хемокинового рецептора CCR5 в формирование состояния повышенного онкологического риска и прогрессию рака молочной железы.

Данные о взаимосвязи выраженности клинических проявлений заболевания у больных с доброкачественными дисгормональными процессами с уровнем продукции цитокинов, функциональной активности иммунокомпетентных клеток и генотипом CCR5 свидетельствуют о возможности использования изученных показателей в качестве дополнительных критериев при формировании групп повышенного риска.

Данные о связи уровня цитокинов и генотипа CCR5 с факторами, характеризующими прогрессию заболевания, и с его исходом указывают на возможную прогностическую значимость этих параметров при раке молочной железы.

Апробация диссертации Основные положения и результаты научных исследований были доложены на II конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» г. Томск (2001), Всероссийском научном форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (2002, 2004); V молодежной научной конференции СО РАМН, г. Новосибирск (2004), объединенном иммунологическом форуме с международным участием, г. Екатеринбург (2004), конкурсах молодых ученых НИИ онкологии, г. Томск (2001-2005), Всероссийском научном симпозиуме с международным участием «Цитокины. Стволовая клетка. Иммунитет», г. Новосибирск (2005).

Публикации

Результаты исследования опубликованы в 25 печатных работах, отражающих основные положения диссертации.

ВЫВОДЫ

1. Частота встречаемости генотипа CCR5/CCR5del32 у больных РМЖ составила 23,9%, что статистически значимо выше, чем в группе популяционного контроля (12,5%; р<0,02). У пациенток с предопухолевой патологией молочной железы выявлено значимое двукратное увеличение частоты генотипа CCR5/CCR5del32 по сравнению с популяционной нормой (24,3%; р<0,03).

2. В группе больных РМЖ, имеющих генотип CCR5/CCR5, относительное количество CCR5 положительных мононуклеарных клеток крови составило 21,5%; у пациенток с CCR5/CCR5del32 генотипом — 19,4% (р>0,05). Выявлено несоответствие между уровнем экспрессии мРНК в лимфоцитах и экспрессией белка CCR5 на мембранах клеток периферической крови.

3. В группе больных ФА и ФКМ выявлено увеличение уровня продукции провоспалительных цитокинов ФНО-а и ИЛ-ip, спонтанной пролиферации лимфоцитов, снижение индекса стимуляции пролиферации в ответ на митогенный стимул, активности нейтрофилов крови по сравнению со здоровыми женщинами (р<0,05).

4. Для пациенток с РМЖ характерны следующие функциональные изменения в системе иммунитета: высокий уровень продукции ИЛ-ip, увеличение спонтанной пролиферации лимфоцитов, снижение митоген-индуцированного пролиферативного ответа Т-лимфоцитов, функциональной активности нейтрофилов, значимое повышение уровня С08+-лимфоцитов, уменьшение числа CD 16+- и С095+-лимфоцитов по сравнению с контрольной группой (р<0,05).

5. У пациенток с ФКМ с выраженными клиническими проявлениями заболевания выявлен более высокий уровень продукции ИЛ-2 (р<0,02), более низкий уровень продукции ИЛ-4 (р<0,03) и повышение абсолютного количества CD25+ (несущих рецептор к ИЛ-2) - лимфоцитов (р<0,01) по сравнению с больными ФКМ, имеющими клинические проявления умеренной степени выраженности. ФКМ как фоновая патология определяет изменения показателей иммунитета у больных с доброкачественными опухолями.

6. У больных РМЖ лимфогенное метастазирование статистически значимо ассоциировано с более низким уровнем продукции ИЛ-4 лимфоцитами крови (8,9±6,5 пг/мл у больных с метастазами против 41,4±13,5 пг/мл у пациенток с локализованным процессом, р<0,04).

7. Среди больных РМЖ с благоприятным исходом заболевания выявлен более высокий процент лиц с генотипом CCR5/CCR5del32 по сравнению с группой пациенток с неблагоприятным исходом (26,9% и 11,5% соответственно, р<0,02). У больных РМЖ с локализованным процессом в ткани молочной железы наблюдается увеличение частоты встречаемости вариантного генотипа гена CCR5 по сравнению с популяционным контролем (25,7% и 12,5% соответственно, р<0,01).

8. У больных с предопухолевыми заболеваниями молочной железы с нормальным генотипом CCR5 отмечено повышение числа активированных (CD25+)- клеток, спонтанной пролиферации лимфоцитов, их способности продуцировать ФНО-альфа в ответ на стимул по сравнению с показателями здоровых лиц.

9. У больных РМЖ с нормальным генотипом CCR5 отмечено снижение уровня Т-хелперов (CD4+), естественных киллерных (CD 16+) клеток крови, повышение способности лимфоцитов к стимулированной продукции ФНО-альфа по сравнению со здоровым контролем. При этом выявлено снижение ФГА-стимулированной пролиферации и повышение продукции ИЛ-4 по сравнению с больными РМЖ, несущими вариантный аллель CCR5del32.

153

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

РМЖ - гормонзависимая опухоль, в патогенезе которой важную роль играют эстрогены. Известно два механизма участия эстрогенов в канцерогенезе - промоторный, при котором в результате высокой продукции эстрогенов активируется пролиферация эпителия и повышается риск генетических повреждений, и генотоксический, связанный с непосредственным повреждением эпителиальных клеток при внегонадном синтезе эстрогенов и их метаболизме в ткани молочной железы. В последние годы получены фундаментальные данные о тесной взаимосвязи различных генов и их продуктов на уровне межсистемных, межорганных и межклеточных взаимодействий, а также выявлены тонкие механизмы регуляции клеточных функций на уровне внутриклеточных сигнальных путей при формировании и прогрессии РМЖ. Выявлены новые взаимоотношения эстрогенов и цитокинов в регуляции процессов пролиферации, программируемой гибели и дифференцировки клеток эпителия молочной железы.

При изучении связи полиморфизма генов цитокинов и их рецепторов с риском возникновения и прогрессией РМЖ было показано, что отдельные аллельные варианты генов ассоциированы с восприимчивостью, тяжестью течения, исходом онкологических заболеваний.

Взаимодействие иммунной системы и опухоли — вопрос чрезвычайно сложный в связи с амбивалентностью этих взаимоотношений, которые могут реализоваться в противоположные по результату события в зависимости от условий. Однако при этом четко показано, что иммунная система играет важную роль в опухолевой прогрессии и здесь определяющим является не только и не столько ее участие в специфическом ответе на опухоль, но и широкие регуляторные функции путем продукции цитокинов как на системном, так и особенно на местном уровне опухолевого микроокружения.

Хемокиновый рецептор CCR5 весьма многофункционален по своим свойствам, участвует в иммунных реакциях и экспрессируется воспалительными и опухолевыми клетками. В последние годы показаны высокие регуляторные способности CCR5, проявляющиеся как на уровне внутриклеточных каскадов, а именно вовлечение его в передачу сигнала на белок онкосупрессор р53, так и на уровне модуляции опухолевого микроокружения путем инфильтрации воспалительными клетками, а также непосредственно за счет экспрессии на опухолевых клетках.

Все эти данные, указывая на вовлечение CCR5 в патогенез РМЖ, не позволяют сделать однозначных выводов о роли CCR5 в развитии и прогрессии этого заболевания и делают актуальными исследования полиморфизма этого гена, а также возможных его взаимосвязей с продукцией цитокинов и функциональной активностью системы иммунитета у больных с предопухолевой патологией и больных со злокачественными новообразованиями молочной железы.

Все вышесказанное обусловило проведение исследований по оценке взаимосвязи полиморфизма гена CCR5 с активностью провоспалительных и противовоспалительных цитокинов как медиаторов межклеточных взаимодействий, регулируемых системой иммунитета, с предопухолевыми заболеваниями и злокачественными новообразованиями молочной железы в плане определения их возможной роли в формировании риска и механизмах прогрессии РМЖ.

Повышение частоты встречаемости гетерозиготного генотипа CCR5/CCR5del32 у больных предопухолевыми заболеваниями и раком молочной железы можно рассматривать как свидетельство его ассоциации с повышением риска РМЖ.

При исследовании функциональной активности иммунокомпетентных клеток посредством оценки их пролиферации и способности к продукции цитокинов получены результаты, указывающие на однонаправленность изменений изучаемых параметров у больных с предопухолевыми изменениями в ткани молочной железы и РМЖ. При этом следует обратить внимание на то, что выраженность отклонений показателей от нормального уровня (по сравнению с практически здоровыми женщинами) была более значимой у пациенток с ФКБ и ФА, чем с РМЖ, что может быть связано с сохранение резервов, которые обеспечивают выраженную реакцию иммунной системы на начальных этапах патологического процесса. Мы обнаружили, что именно ФКМ как фоновая патология, обусловливает изменения показателей иммунной системы у больных с ФА.

Ранее уже отмечалось, что риск РМЖ существенно возрастает при выраженной пролиферативной форме фоновой патологии. Поэтому мы разделили больных с дисгормональными заболеваниями на группы в зависимости от выраженности процесса с учетом пролиферативного потенциала эпителиальных клеток, который определялся на основании показателей инструментального, клинического обследования и цитологического заключения. Мы выявили, что при более тяжелой форме клинического течения ФКМ отмечается повышение продукции ИЛ-2 с одновременным усилением экспрессии рецептора к нему на лимфоцитах, что можно трактовать как активацию иммунокомпетентных клеток. При этом результат такой активации может быть неоднозначным. С одной стороны эти адаптационные изменения, очевидно, направлены на защиту организма при развивающемся патологическом процессе, на фоне гормонального дисбаланса, нарушения структурно-функционального гомеостаза, диспластических изменений эпителия молочной железы. С другой стороны, ИЛ-2 как ростовой фактор, может выступать стимулятором пролиферации диспластических клеток при наличии на них рецепторов к ИЛ-2 и промотировать тем самым развитие опухолевого процесса. В литературе имеются сведения о том, что если клетки рака молочной железы имеют рецепторы к ИЛ-2, наблюдается стимуляция опухолевого роста, при этом она может происходить и по аутокринному механизму, поскольку показана способность клеток опухоли к продукции этого цитокина. Одновременно выявленное нами снижение продукции ИЛ-4 также является фактором, способствующим развитию опухоли, поскольку показано, что он обладает способностью ингибировать опухолевый рост при наличии соответствующих рецепторов на опухолевых клетках [Бережная Н.М., Чехун В.Ф., 2000; Кадагидзе З.Г., 2002].

Поскольку делеционный аллель CCR5del32 может вносить свой вклад в повышение риска РМЖ, и, принимая во внимание данные о вовлечении хемокинов и хемокинового рецептора CCR5 в формирование противоопухолевого иммунного ответа, было целесообразным оценить функциональную активность иммунокомпетентных клеток у пациентов с предопухолевыми заболеваниями в зависимости от наличия вариантного аллеля. Согласно полученным данным, пациенты с нормальным генотипом (у которых риск РМЖ ниже) обладают способностью отвечать более высокой продукцией ФНО-альфа лимфоцитами крови на адекватный стимул, чем здоровые доноры. При этом у них также выявлена повышенная спонтанная пролиферация лимфоцитов и доля активированных - несущих на своей мембране рецептор к ИЛ-2 — клеток. Лимфоциты пациентов, несущих гетерозиготный генотип, не обладают способностью к повышенной продукции ФНО-альфа в ответ на стимул. Эти данные можно трактовать как опосредованное свидетельство вовлечения иммунной системы в защитную реакцию при ФКБ.

В плане продукции цитокинов выявлены однонаправленные изменения по сравнению со здоровыми лицами у больных раком и преопухолевыми заболеваниями. Как уже отмечалось выше, более рельефны эти изменения у больных с предопухолевыми процессами в ткани молочной железы. По-видимому, у больных РМЖ преобладает угнетающее влияние на показатели иммунной системы ингибирующих факторов, продуцируемых опухолевыми клетками, или индуцированных опухолью иммуносупрессорных факторов организма. Согласно литературным данным, при наличии делеционного аллеля CCR5del32 у здоровых лиц не выявлено каких-либо серьезных нарушений иммунологической реактивности, несмотря на разный уровень его экспрессии на соответствующих клетках [Mueller et al., 2004]. Мы сочли целесообразным оценить уровень его экспрессии на мембранах иммунокомпетентных клеток у больных РМЖ, при этом не выявили существенных различий у пациентов с вариантным и нормальным генотипом. Мы оценивали также и экспрессию гена CCR5 путем детекции мРНК методом ОТ-ПЦР и сопоставили ее с выявлением белка CCR5 на клеточной поверхности иммуноцитохимическим методом с использованием моноклональных антител у этих же больных. Анализ полученных результатов свидетельствует о несоответствии этих показателей у большинства обследованных больных, которое заключалось в более низкой экспрессии белка при высоком уровне мРНК. Такое несоответствие может быть обусловлено рядом причин, среди которых наиболее вероятной и объяснимой является повышение уровня хемокинов — лигандов рецептора CCR5 (MIP-1 альфа, MIP-1 бета, RANTES), экранирующих рецептор при взаимодействии с ним, и низкая чувствительность метода детекции белка из-за специфичности антитела к сайту связывания в районе активного центра, обеспечивающего контакт с лигандом. Действительно, есть данные о том, что усиление экспрессии мРНК CCR5 в лимфоцитах под влиянием ИЛ-12 сочетается с уменьшением экспрессии белка на клеточных мембранах, что связано с одновременным увеличением продукции RANTES и его взаимодействием с рецептором. Полученные нами данные указывают на то, что экспрессия CCR5 у больных РМЖ обусловлена не столько наличием нормальных или вариантных аллелей этого гена, сколько регуляторным влиянием на посттранскрипционном уровне.

Опухолевая прогрессия - это процесс возникновения и отбора более злокачественных клонов опухолевых клеток. Злокачественность опухоли выражается в разных формах, которые имеют соответствующие клинико-морфологические проявления, такие, как лимфогенное или гематогенное метастазирование, мультифокусный характер роста опухоли, рецидивирование. Манифестация различных форм прогрессии у разных больных предполагает и различие обеспечивающих их механизмов. Мы оценили взаимосвязь полиморфизма гена CCR5 с прогрессией РМЖ. Одним из вариантов опухолевой прогрессии и одновременно фактором, связанным с плохим прогнозом, является метастазирование в регионарные лимфатические узлы. Согласно полученным нами данным, частота гетерозиготного генотипа CCR5/CCR5del32 в группе больных РМЖ, не имеющих лимфогенного метастазирования, статистически значимо превышала популяционный показатель, при этом OR составил 2,43 (С195% 1,02-5,64; р<0,02), что указывает на ассоциацию этого генотипа с более благоприятным прогнозом клинического течения заболевания.

Подтверждением этому являются и наши данные о повышении частоты встречаемости гетерозигот среди больных РМЖ, у которых морфологически подтверждена умеренная степень дифференцировки опухолевых клеток -достаточно благоприятный в прогностическом плане критерий злокачественности опухоли.

Интегральным показателем эффективности лечения является продолжительность жизни больного без признаков заболевания (благоприятный или неблагоприятный исход). Несомненно, важную роль при этом играет характер терапевтических воздействий, однако часто при сходных показаниях к лечению и использовании стандартных методов терапии у разных больных наблюдается совершенно разный исход. Очевидно, что при стандартных терапевтических подходах эффективность лечения больного, (по сути, определяющая исход заболевания), является результирующей целого ряда составляющих, среди которых важное значение имеет чувствительность опухоли к цитодеструктивным воздействиям, морфофункциональное состояние опухоли и генетически детерминированные особенности организма больного, определяющие взаимоотношения с опухолью и реакцию на терапевтические воздействия. Наши данные показали существенное статистически значимое повышение частоты встречаемости индивидуумов с гетерозиготным генотипом среди больных РМЖ с благоприятным исходом, который определялся на основании отсутствия гематогенного метастазирования или рецидивирования заболевания в период наблюдения от 2 до 5 лет. Различия с группой больных РМЖ с неблагоприятным исходом (у которых наблюдалось прогрессирование опухолевого процесса в виде рецидивов, отдаленных метастазов или летального исхода) были также значимы.

Мы не выявили значимых различий продукции цитокинов или других факторов системы иммунитета в зависимости от исхода заболевания, однако следует отметить, что у больных РМЖ с лимфогенными метастазами отмечен более низкий уровень продукции ИЛ-4 наряду с тенденцией к снижению стимулированной митогеном продукции ФНО-альфа.

Для оценки возможной роли иммунологических факторов в прогрессии РМЖ у пациентов с разными генотипами CCR5 мы изучили у них активность иммунокомпетентных клеток. При носительстве делеционного аллеля CCR5del32 (гетерозиготный генотип, связанный с более благоприятным клиническим течением заболевания) отмечена более низкая продукция ИЛ-4 и более высокий пролиферативный ответ лимфоцитов на ФГА по сравнению с соответствующими показателями у пациентов с нормальным генотипом. У больных РМЖ с диким генотипом, который ассоциирован с более высоким риском прогрессии, отмечается повышение продукции ФНО-альфа лимфоцитами в ответ на стимул при снижении доли Т-хелперов и естественных киллерных клеток по сравнению с уровнем здорового контроля. Эти результаты дают основания полагать, что факторы иммунной системы могут вовлекаться в механизмы прогрессии РМЖ. В частности, есть сведения о неблагоприятной прогностической значимости высокого уровня ФНО-альфа при злокачественных новообразованиях. На уровне опухолевого микроокружения ФНО обеспечивает ингибицию дифференцировки фибробластов стромы и развитию десмопластической реакции, обеспечивающей структурное и функциональное поддержание роста опухоли [Deb et al., 2004].

Примечательно, что ИЛ -А оказался достаточно информативным показателем, ассоциированным с тяжестью клинического течения как при оценке групп больных независимо от статуса гена CCR5, так и при учете наличия вариантного аллеля.

Таким образом, согласно полученным нами данным, гетерозиготный генотип гена хемокинового рецептора CCR5 ассоциируется с повышенным риском возникновения РМЖ, но при этом связан с благоприятным прогнозом течения заболевания. Неоднозначная роль гена CCR5 на этапах злокачественной трансформации и при опухолевой прогрессии связана, по-видимому, с различными механизмами, обеспечивающими малигнизацию и формирование опухоли с одной стороны, и развитие разных форм опухолевой прогрессии — с другой.

Вовлечение хемокинового рецептора CCR5 в формирование опухоли (т.е. на этапах инициации и промоции) может быть опосредовано двумя основными путями, а именно, влиянием его на становление специфического противоопухолевого ответа по Thl-механизму [Azenshtein et al., 2002; Luboshits et al., 1999], и способностью регулировать апоптоз модифицированных клеток р53-зависимым путем [Manes et al., 2003]. В этой связи у индивидуумов, несущих вариантный аллель CCR5del32, вероятна ингибиция иммунного ответа в связи со сниженной экспрессией CCR5 на иммунокомпетентных клетках. Косвенно это подтверждается нашими данными о том, что функциональная активность лимфоцитов повышается у больных с предопухолевой патологией, имеющих только нормальные аллели CCR5, при этом у пациентов с наличием делеционного аллеля такой активации не наблюдается. Более низкая экспрессия CCR5 также может отрицательно сказаться на реализации р53-зависимого апоптоза трансформированных клеток.

Участие CCR5 в опухолевой прогрессии может осуществляться посредством регуляции пролиферации опухолевых клеток по аутокринному механизму продуцируемыми опухолью соответствующими хемокинами.

Источником провоспалительных цитокинов (хемокинов) могут выступать и клетки системы иммунитета, инфильтрирующие опухоль. Можно ожидать, что у лиц-носителей делеционного аллеля CCR5del32 за счет снижения экспрессии CCR5 на иммунокомпетентных клетках инфильтрация воспалительными клетками ниже, чем при нормальном генотипе. Кроме этого вклад в благоприятный прогноз может вносить и тот факт, что более низкая экспрессия CCR5 на клетках опухоли в определенной степени предотвращает стимуляцию опухолевого роста воспалительными цитокинами.

Таким образом, полученные нами результаты указывают на увеличение частоты встречаемости CCR5/CCR5del32 генотипа у больных РМЖ, в большей степени у пациенток до 50 лет, по сравнению со среднепопуляционной нормой, и позволяют связать этот генотип с повышением риска развития РМЖ у женщин репродуктивного возраста. Однонаправленность изменений продукции цитокинов и иммунологических показателей у больных с дисгормональными доброкачественными заболеваниями и злокачественными новобразованиями свидетельствует о вовлечении иммунной системы в формирование риска развития рака. Четкая ассоциация вариантного гена CCR5 и продукции ИЛ-4 с клинико-морфологическими признаками, характеризующими благоприятное клиническое течение РМЖ (отсутствие лимфогенного метастазирования, умеренная степень дифференцировки опухолевых клеток, благоприятный исход), свидетельствуют о возможности считать их защитными факторами в плане прогрессии заболевания. Выявленные различия продукции цитокинов и параметров иммунитета у больных с предопухолевыми заболеваниями и РМЖ в зависимости от генотипа гена CCR5 свидетельствуют об определенном вкладе иммунологической компоненты в риск возникновения и прогрессию РМЖ.

151