Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Роль цитокинов и рецептора CCR5 в формировании предрасположенности и прогрессии рака молочной железы

На правах рукописи

БАБЫШКИНА НАТАЛИЯ НИКОЛАЕВНА

РОЛЬ ЦИТОКИНОВ И РЕЦЕПТОРА ССК5 В ФОРМИРОВАНИИ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ И ПРОГРЕССИИ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

14.00.14 - онкология 14.00.16 - патологическая физиология

Автореферат диссертации иа соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Томск -2005

Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательский институт онкологии Томского научного

центра СО РАМН

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

доктор биологических наук

Чердынцева Надежда Викторовна Белявская Валентина Александровна

Официальные оппоненты доктор медицинских наук

Кологривова Елена Николаевна

доктор медицинских наук,

профессор, Заслуженный деятель науки РФ

Удут Владимир Васильевич

Ведущая организация:

ГУ Российский онкологический научный центр им Н Н Блохина РАМН, г Москва

Защита состоится «20» Л 2005г. в -го часов на заседании

диссертационного совета Д 091 32 01 при ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН (634009, г. Томск, пер. Кооперативный, 5)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН

Автореферат разослан « » ¿¿С'Л^р^Я. 2005г

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор 1 Гольдберг В. В

гооь-А г iSWl

3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Злокачественные новообразования молочных желез занимают лидирующее место в структуре онкологических заболеваний женщин. Статистические данные констатируют ежегодное увеличение числа диагностируемых случаев рака молочной железы (РМЖ). В мире выявляют около 1 млн новых случаев за год, к 2010 г прогнозируется рост числа заболевших до 1,45 млн. В России абсолютное число женщин, впервые заболевших раком молочной железы, в 2002 г. достигло 4S8S7 Злокачественная опухоль молочной железы ежедневно диагностируется у 102 женщин [Давыдов М., Аксель Е., 2001].

Наряду с этим отмечается тенденция к увеличению доброкачественных заболеваний молочной железы, которые встречаются у каждой 4-й женщины в возрасте до 30 лет, а у женщин старшего возраста патологические состояния молочных желез выявляются в 60% случаев При этом наиболее часто наблюдается диффузная форма фиброзно-кистозной мастопатии, которой, по данным различных авторов, страдает от 50% до 90% женщин. Установлено, что большинство злокачественных новообразований молочных желез развивается на почве длительно текущих дисгормональных доброкачественных процессов, характеризующихся пролиферацией эпителия железистой ткани и изменениями соединительной ткани Сформировалось представление о мастопатии как предраковом состоянии, которое под влиянием определенных обстоятельств может трансформироваться в РМЖ. Принято считать, что РМЖ на фоне доброкачественных новообразований встречается в 3-S раз чаще, а при узловой форме мастопатии с наличием пролиферации эпителия в 30-40 раз чаще, чем при отсутствии патологии в тканях молочной железы [Прилелская В.Н. и соавт, 2000; Габуния M С, 2001; Певгова Г Ю и соавт, 2003; Чистяков С С. и соавт, 2004, Hartmann L., 2004].

РМЖ как мультифакториальное заболевание, обусловлено изменениями функционирования множества генов, обеспечивающих структурно-функциональный гомеостаз организма, при этом необходимой молекулярной основой злокачественной трансформации является нарушение функций онкогенов и/или генов-су прессоров Злокачественная трансформация клеток и развитие опухоли происходит в результате дисбаланса процессов пролиферации, алоптоза и дифференцировки клеток, в основе которого лежит комплексное взаимодействие наследственно-генетических, гормонально-метаболических, иммунологических, экзогенных факторов При этом значимым в определении риска может быть и неблагоприятное сочетание аллелей вовлекаемых в патогенез РМЖ полиморфных генов [Имянитов Е H , Хаисон К П , 2004; Берштейн Л М„ 2005; Imyanitov Е, Hanson К, 2004, " Smith et al, 2004; Azmy et al, 2004; Jong et al., 2005].

Современные представления о важной роли системы иммунитета в регуляции пролиферации, дифференцировки и программируемой гибели клеток свидетельствуют о ее существенном вкладе в формирование предрасположенности к развитию неоплазий Известно, что регуляция онтогенеза клеточных популяций осуществляется благодаря комбинированному воздействию нервной, эндокринной и иммунной систем, функционально тесно связанных друг с другом и практически равноправных (Корнева Е А и соавт., 1985; Корнева Е.А, 2003, Абрамов В.В, 1991, Васильев Н.В и соавт., 1999). Это дает основания, несмотря на большие противоречия, имеющиеся в литературе, с полной уверенностью утверждать, что система иммунитета играет в этиопатогенезе злокачественного роста существенную роль При этом цитокины как универсальные медиаторы межклеточных взаимодействий повсеместно вовлекаются в регуляцию этих процессов

Исследованиями последних лег показаны взаиморегуляторные отношения цитокинов с эстрогенами, играющими важнейшую роль в патогенезе РМЖ Результатом этих взаимодействий может быть как индукция пролиферативных процессов, так и активация проапоптотических сигнальных путей в клетках [Fanti et al, 2003, Aronica et al, 2004; Fernando et al, 2004. Huber et al. 2004] Такая неоднозначность определяется вовлечением в процессы ¡локачественной трансформации кроме] <^^ге^)ц^'рюв-онкосупрсссоров

вИБЛИОТГ, \ C.I «8

полги/ им

множества факторов, способных модифицировать их функции и опосредованно влиять на чувствительность клеток к генотоксическим воздействиям эндогенного либо экзогенного происхождения и процессы опухолевой промоции Очевидно, что особенности индивидуального генетического фона играют очень существенную роль в детерминации онкологического риска [Huber et al, 2004].

В число цитокинов входят хемокины, обладающие чрезвычайно широким спектром биологических эффектов, регулирующие активацию и миграцию иммунокомпетентных и других клеток и непосредственно участвующие в специфических и неспецифических реакциях иммунной системы. Следует отметить, что роль цитокинов и хемокинов, в частности, в процессах злокачественной трансформации и опухолевой прогрессии далеко неоднозначна Имеется множество сведений как о противоопухолевой активности различных цитокинов, так и об их функционировании в качестве промоторов опухолевого роста [Ltu et al., 1999, Luboshits et al., 1999; Ueno et al., 2000; Azenshtein et al., 2002, Кадагидэе 3 Г., 2003] Данные ряда авторов свидетельствуют о связи цитокинов (ТФР-бета, ФНО-альфа, ИЛ-6, Ш1-4, НЛ-2, RANTES и др ) с прогнозом клинического течения РМЖ, однако представленные результаты достаточно неоднозначны и порой противоречивы При этом принципиальным моментом является возможность диаметрально противоположной функциональной роли того или иного цитокина на этапах формирования злокачественного новообразования и в прогрессии опухоли, как, например, показано для ТФР-бета, который снижает риск РМЖ, но является фактором, способствующим прогрессированию заболевания [Nikolic-Vukosavljevic et al, 2004, Czeczuga-Semeniuk et al, 2004]

В этой связи изучение уровня продукции цитокинов может дать не только информацию о функциональной активности различных типов иммунокомпетентных клеток, соотношении процессов активации Т-хепперов 1 и II типов, но и позволяет рассматривать его в качестве одного из важных маркеров, характеризующих биологические особенности конкретной опухоли и, следовательно, имеющих прогностическую значимость. Подтверждением вовлечения цитокинов в патогенез РМЖ являются данные о том, что отдельные аллельные варианты их полиморфных генов ассоциированы с восприимчивостью, особенностями клинического течения, неходом онкологического процесса [Benson et al., 2004; Smith et at., 2004; Zafîropoulos et al, 2004]

В последние годы внимание исследователей привлекает хемокиновый рецептор CCR5, для которого выявлен генетический дефект, характеризующийся гомозиготной деленией 32 пар оснований в гене CCR5, приводящий к синтезу функционально неактивного белка рецептора, который не способен экспрессироваться на поверхности клетки Для лиц с описанной мутацией риск заражения ВИЧ (макрофаготропным вариантом вируса) существенно снижен, а развитие инфекционного процесса и клинической картины СПИДа носит более благоприятный характер В общей популяции в разных этнических группах около 10-15% лиц являются носителями делеционного аллеля Найдены ассоциации между делеционным полиморфизмом гена CCR5 и прогнозом при ряде инфекционных (ВИЧ-инфекция, туберкулез, грипп) [Dean et al, 1996; Liu et al, 1996] и соматических заболеваний (сахарный диабет, ишемическая болезнь сердца, ревматоидный артрит) [Kalev et al, 2003; Gonzalez et a!, 2001 ; Cooke et al, 1998].

Mânes et al. в 2003 году было показано, что для осуществления эффективного апопгоза модифицированных клеток РМЖ необходимо согласованное взаимодействие белка-рецептора CCR5 и онкосупрессора р53 Этими авторами получены данные, что носительство вариантного аллеля CCR5deI32 ассоциировано с неблагоприятным прогнозом при раке молочной железы у пациенток испанской национальности только при отсутствии соматических мутаций в гене р53 в клетках опухоли

Известно, что белок р53 является регулятором транскрипции гена р21, кодирующего ингибитор циклин-зависимых киназ CIPl[Dulic et al., 1995] Недавно было установлено, что белок р21 может взаимодействовать с транскрипционными факторами NF-AT, АР-1, NF-kB и ингибировать пролиферацию лимфоцитов и экспрессию про воспалительных цитокинов Эти

данные косвенно указывают на возможность регуляции функций иммунокомпетентных клеток CCR5-p53 опосредованным путем [Khanna et al, 2005]

Показано, что клетки рака молочной железы экспрессируктт хемокины и хемокиновые рецепторы [Allinen, 2004] СС хемокин RANTES продуцируется клетками рака молочной железы и действует аутокринно через свой рецептор CCR5, который также экспрессируется на поверхности злокачественных клеток У больных при этом выявлена прямая корреляция высокого уровня RANTES в крови с более агрессивным течением РМЖ [Azenshtein et al, 2002, Luboshits et al, 1999; Walser, 2004] В то же время экспрессия CCR5 на опухоль-инфильтрирующих лимфоцитах свидетельствует о возможности их дифференцировки по Th-I типу и развития специфического противоопухолевого ответа [Qtn et al., 1998; Taub et al, 1996, Siveke and Hamman, 1998] Получены данные о способности ряда цитокинов, таких как ИЛ-2, ИЛ-12, ФНО-альфа, регулировать экспрессию CCR5 и его лигандов на транскрипционном и посттранскрипционном уровнях [Wang et al, 1999].

В литературе практически нет сведший о взаимосвязи полиморфных вариантов гена CCR5 с традиционными прогностическими факторами при РМЖ, и отсутствуют данные об ассоциации его полиморфизма с дисгормональными гиперпластическими процессами в молочной железе В то же время, как указано выше, CCR5 является одним из важных универсальных рецепторов, определяющих инфильтрацию иммуноцигов в очаги воспаления и опухоль, и тесно связан с развитием клеточно-опосредованного иммунного ответа, в том числе на опухолевые клетки, то есть может участвовать в регуляции противоопухолевого иммунитета и роста опухоли. С другой стороны, ею экспрессия на клетках рака молочной железы может быть связана с плохим прогнозом. Все сказанное определяет актуальность исследований взаимосвязи полиморфизма гена CCR5, функциональной активности иммунокомпетентных клеток, их цитокинового баланса с патогенетически и клинически значимыми для рака молочной железы признаками с целью оценки участия изучаемых факторов иммунной системы в риске возникновения и прогрессии РМЖ.

Цель исследования:

Изучить полиморфизм гена хемокинового рецептора CCR5 по CCR5del32, уровень продукции регуляторных и эффекторных цитокинов и показателей иммунитета у больных с предопухолевыми заболеваниями и раком молочной железы и исследовать их взаимосвязь с характером клинического течения и исходом заболевания

Задачи исследования:

1 Оценить частоту встречаемости полиморфных вариантов гена CCR5 у пациенток с раком молочной железы, фиброаденомой и фиброзяо-кисгозной мастопатией

2 Оценить уровень экспрессии рецептора CCR5 на лимфоцитах периферической крови у больных раком молочной железы.

3. Изучить уровень продукции цитокинов и иммунный статус у больных с дисгормональными доброкачественными заболеваниями и злокачественными новообразованиями молочной железы.

4. Изучить продукцию цитокинов и показатели иммунитета у больных с ФКМ, ФА и раком молочной железы в зависимости от выраженности патологического процесса

5 Оценить взаимосвязь полиморфизма гена хемокинового рецептора CCRS с клиническими особенностями и исходом заболевания у больных раком молочной железы

6 Изучить уровень продукции цитокинов и параметры системного иммунитета у больных с предопухолевой патологией и злокачественными новообразованиями молочной железы в зависимости Ol генотипа гена CCR5

Научная новизна

Впервые проведено исследование полиморфизма гена ССЯ5 у больных с дисгормональными доброкачественными заболеваниями и раком молочной железы и его взаимосвязи с характером клинического течения заболевания.

Получены новые данные о роли хемокинового рецептора СС1*5 во взаимосвязи с иммунологическими параметрами и цитокиновым статусом организма в разветии и прогрессии злокачественных опухолей молочной железы.

Показано, что уже на стадии предопухолевых изменений в ткани молочной железы отмечаются выраженные изменения как функциональной активности иммуноцитов, так и и их субпопуляционного состава, характерные и для больных со злокачественными новообразованиями.

Применение факторного анализа позволило выявить наиболее значимые иммунологические показатели, ассоциированные с характером клинического течения заболевания у больных РМЖ (уровень продукции ИЛ-4) и выраженностью патологического процесса в ткани молочной железы при ФА и ФКМ (уровень продукции ИЛ-2, ИЛ-4, количество лимфоцитов, имеющих рецептор к ИЛ-2).

Выявлена четкая ассоциация вариантного генотипа гена ССЯ5 и продукции ИЛ-4 с клинико-морфологическимн признаками, характери <ующими благоприятное клиническое течение РМЖ (отсутствие лимфогенного метастазирования, умеренная степень дифференцировки опухолевых клеток, благоприятный исход).

Выявлены различия продукции цитокинов и параметров иммунитета у больных с дисгормональными доброкачественными процессами и РМЖ в зависимости от генотипа ССЯ5, что свидетельствует об определенном вкладе иммунологической компоненты в риск возникновения и прогрессию РМЖ.

Теоретическая и практическая значимость

Полученные результаты расширяют представления об участии цитокинов и хемокиновых рецепторов в механизмах формирования злокачественных новообразований молочной железы.

Получены данные о вкладе хемокинового рецептора ССЯ5 в формирование состояния повышенного онкологического риска и прогрессию рака молочной железы

Данные о взаимосвязи выраженности клинических проявлений заболевания у больных с доброкачественными дисгормональными процессами с уровнем продукции цитокинов, функциональной активности иммунокомпетентных клеток и генотипом СС(<5 свидетельствуют о возможности использования изученных показателей в качестве дополнительных критериев при формировании групп повышенного риска

Данные о связи уровня цитокинов и генотипа ССЯ5 с факторами, характеризующими прогрессию заболевания, и с его исходом указывают на возможную прогностическую значимость зтих параметров при раке молочной железы

Апробация диссертации

Основные положения и результаты научных исследований были доложены на II конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» I Томск (2001), Всероссийском научном форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (2002, 2004), V молодежной научной конференции СО РАМН, г Новосибирск (2004), объединенном иммунологическом форуме с международным участием, г Екатеринбург (2004), конкурсах молодых ученых НИИ онкологии, г Томск (2001-2005), Всероссийском научном симпозиуме с международным участием «I (итокины Стволовая клетка. Иммунитет», г. Новосибирск (2005).

Публикации

Результаты исследования опубликованы в 25 печатных работах, отражающих основные положения диссертации

Объем н структур« диссертации

Диссертационная работа изложена на 170 страницах машинописного текста, состоит из введения, трех глав, включающих обзор литературы, материалы и методы исследования, главы с изложением собственных результатов, заключения, выводов, списка цитируемой литературы Библиографический указатель включает 180 источников, из них 70 отечественных, 110 зарубежных Работа иллюстрирована 26 таблицами и 16 рисунками

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Характеристика групп больных

Полиморфизм гена хемокинового рецептора CCR5 и показатели системы иммунитета были изучены у 318 женщин. Первую группу составили 44 женщины с фиброз но-кислотной мастопатией (возраст 18-67 лет, средний 37±5,7 лет); вторую - 92 пациентки с доброкачественными опухолями - фиброаденомами (возраст 16-69 лет, средний 38+4,8 лет). В третью группу вошли 182 больных раком молочной железы TmNo-jMo (возраст 28-65 лет, средний 49±6,4 лет). Для сравнения использовали среднепопуляционные данные по частоте распределения генотипов CCR5 гена у здоровых доноров региона Западной Сибири [Юдин Н., 1998].В группу контроля для сравнения иммунологических параметров и уровня продукции цитокинов включены 53 практически здоровые женщины без патологических изменений в молочных железах (возраст 26 -68 лег, средний 45±6,1 лет).

Для характеристики степени выраженности клинических проявлений заболевания у больных фиброзно- кистозной мастопатией в отделении общей онкологии НИИ онкологии ТНЦСО РАМН профессором Слонимской ЕМ и к.м.н. Гарбуковым Е Ю разработан бальный кодификатор [Гарбуков Е Ю, 2000] Учитывались результаты клинического осмотра, маммографии, ультразвукового и цитологического исследований Информация, полученная в результате проведения каждого из методов обследования, оценивалась в баллах, от 1 до 3-х в зависимости от выраженности процесса в ткани молочной железы. Общая клиническая картина определялась как сумма баллов, полученная после выполнения всех исследований. Изменения в молочной железе трактовались как выраженные, если сумма баллов была в диапазоне от 7до 9, и умеренные - при сумме 6 баллов и менее. У 50% обследованных пациенток мастопатия носила выраженный характер. У 50% больных клинические проявления были умеренными.

Поскольку фиброаденомы могут развиваться как в нормальной ткани молочной железы, так и на фоне фиброзно-кистозных изменений, оценивалось наличие и выраженность процессов пролиферации в самом опухолевом узле, а также характеризовались изменения, наблюдающиеся в окружающих тканях (наличие ФКМ).

При характеристике больных раком молочной железы в первую очередь принимали во внимание регионарную распространенность опухолевого процесса. У 92 пациенток заболевание носило локализованный характер T1-4N0M0 Количество больных с метастазами в регионарные лимфоузлы T1-4N1-2M0 составило 82. Исход заболевания оценивали как неблагоприятный, если в период наблюдения от 2 до 5 лет у пациентов выявлялись отдаленные метастазы, рецидивы или наступал летальный исход.

Методы исследования

Материалом для исследования служила периферическая кровь

Генотипирование гена CCR5 проводилось методом ПЦР-амплификации фрагмента размером 276 п н, несущего потенциальную делецию в 32 п н, с использованием фланкирующих праймеров (Юдин H С. и соавт.,1998)

Уровень экспрессии мРНК гена хемокинового рецептора CCR5 в мононуклеарах периферической крови оценивался методом обратной транскрипции, совмещенной с ПЦР (Херринпгон С, Макги Дж., 1999).

Уровень жспрсссии хемокинового рецептора CCR5 на мембранах моионуклеарных клеток периферической крови оценивался иммуноцитохимичееким методом с

использованием мышиных моноклонапьных антител класса Ig(j2» (клон G155-178) к антигену CCR5 производства «Novocastra Laboratories Ltd».

Об уровне продукции ИЛ-ф, ИЛ-2, ИЛ-4 и ФНО-а мононуклеариыми клетками периферической крови судили по их концентрации в суточных супернатантах, которую определяли иммуноферментным методом с использованием тест-систем Института особо чистых биопрепаратов (Санкт-Петербург) Для получения супернатантов мононуклеарные клетки культивировали в полной культурапьной среде в течение 24 часов при 37*С в атмосфере 5% СОг с липополисахаридом (ЛПС, 10мкг/мл, «Serva», Германия) для ФНО-а и ИЛ-ip, или с фитогемаглютинином (ФГА, 10мкг/мл, «Serva», Германия) для ИЛ-4, ИЛ-2; а также без митогенов (стимулированная и базальная продукция соответственно)

Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови определяли с использованием моноклональных антител против дифференцировочных и активационных антигенов CD3, CD4, CD8, CDI6, CD22, CD25, CD95 («Медбиоспектр», Россия) в реакции непрямой иммунофлюоресценции Функциональную активность лимфоцитов периферической крови оценивали в реакции властной трансформации по включению 3Н-тимидина в ДНК делящихся клеток при добавлении в культуральную среду Т-клеточного митогена фитогемагглютинина (ФГА) в оптимальной концентрации 10мкг/мл («Serva», Германия) и без него (спонтанная пролиферация) Естественную киллериую активность лимфоцитов крови оценивали в мембранотоксическом тесте по отношению к клеткам-мишеням человеческого эритромиеполейкоза К-562, меченным 'Н-уридином («Изотоп», Москва) (М П.Рыкова, И В Спиранде, 1981) Функциональную активность нейтрофилов определяли по их способности генерировать активные формы кислорода в реакции восстановления нитросинего тетразолия (Нестерова И.В. с соавт., 1999). Содержание иммуноглобулинов в сыворотке крови определяли методом простой радиальной иммунодиффузии по Манчини

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием пакета прикладных программ «Statistica for Windows 6 0» Проверка на нормальность распределения проводилась по критерию согласия Колмогорова-Смирнова Для сравнения частот аллелей и генотипов между различными группами использовали критерий Фишера, х2 Для отклонения нулевой гипотезы (отсутствие различий) принимали уровни статистической значимости р<0,05 Относительный риск (OR) развития заболевания при определенном генотипе рассчитывался по стандартной формуле OR=a/b х d/c, где а и b - количество больных, имеющих и не имеющих мутантный генотип соответственно, и d и с - количество человек в контрольной группе, имеющих и не имеющих мутантный генотип OR указывали с 95%-ным доверительным интервалом [Флейс Д., 1989].

Для оценки статистической значимости различий средних значений иммунологических показателей в изучаемых группах были использованы методы параметрической и непараметрической статистики: t-критерий Стьюдента для нормально распределенных показателей и U-критерий Манна-Уитни для остальных, а также однофакторный дисперсионный анализ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Нарушения в функционировании иммунной системы отмечаются на всех -этапах развития злокачественного процесса, начиная с предопухолевых изменений Известно, что развитие дисгормональных пролиферативных процессов в ткани молочной железы обусловлено целым комплексом нарушений на уровне нейрогуморальной регуляции, в которую на правах полноценного партнера вовлекается иммунная система. Это делает целесообразным оценку функциональной активности иммунокомпетентных клеток как в плане их эффекторного, так и регуляторного потенциала у больных с дисгормональиыми доброкачественными заболеваниями молочной железы Согласно многочисленным литературным данным, фиброаденома достаточно часто развивается на фоне дисгормональных доброкачественных заболеваний молочной железы (мастопатии) [Тагиева ТТ. 2002; Летя1ии ВН. 2002] Ранее нами было покагано. что у больных ФА и ФКМ

иммунологические показатели существенно не различаются, а также получены данные о том, что именно ФКМ как фоновая патология у больных ФА определяет наиболее рельефные изменения в показателях системы иммунитета и продукции цитокинов. Все это послужило основанием для объединения больных ФА и ФКМ в общую группу пациенток с предопухолевой патологией.

Сравнительная оценка распределения генотипов гена ССЯ5 у больных с патологией молочной железы выявила значимое повышение частоты встречаемости гетерозиготного генотипа СС115/СС115<к132 у больных предопухолевыми заболеваниями (24,3% при Х^Ц^Г, р<0,03, (Ж=2,74 С195% =0,94-7,95) и раком молочной железы (23,9% при Хг=5,09; р<0,02; (Ж=2,20 С195% = 1,05-4,70), по сравнению со среднепопуляционной нормой (12,5%), что можно рассматривать как свидетельство его ассоциации с повышением риска РМЖ (табл. 1)

Таблица 1

Распределение генотипов гена ССЯ5 у больных с патологией молочной железы

Группы Генотипы ССИ5

ССЛ5/ССЯ5 ССК5/ССЯ5аеШ ССЯ5деВ2/ССЯ5дсВ2

Популяционный 86/104 13/104 5/104

конгроль(п=104) 82,6% 12,5% 4,8%

РМЖ 107/142 34/142 1/142

(п=!42) 68,6% 23,9%* 0,7%

Х*=5,09 Р<0,02

ФА+ФКМ (п=107) 81/107 26/107 -

75,7% 24,3%*

Х^.Ю Р<0,02

Примечание: *- различия с группой контроля

При разделении больных РМЖ на группы в зависимости от возраста (пациентки моложе 50 лет; пациентки от 50 лет и старше), нами получены данные, свидетельствующие, что у женщин более молодого возраста частота встречаемости генотипа с мутантным аллелем ССИ5 составила 25,7% и значимо превышала среднепопуляционную 12,5% р<0,02; ОР=2,43; С195%=1,02-5,84; табл.2). Эти результаты позволяют полагать, что носители гетерозиготного генотипа ССИ5/ССК5<1еШ имеют повышенный риск развития РМЖ в более молодом возрасте.

Таблица 2

Частота распределения генотипов гена ССЮ у больных РМЖ в зависимости от возраста

Группы Генотипы ССЯ5

ССЯ5/ССЯ5 ССЯ 5/ССЯ5сШ2 СС|?5с1е132/ССК5с1е132

контроль(п=104) 86/104 13/104 5/104

82,6% 12,5% 4,8%

<50 лет (п=66) 49/66 17/66 -

74 Л% 25,7%«

Х*=4,88 Р<0,02

>50 лет (п=59) 46/59 12/59 1/59

77,9% 20,3% 0,02%

Примечание: *- различия с группой контроля

Согласно литературным данным, при наличии делеционного аллеля СО<5с1е132 у здоровых лиц не выявлено каких-либо серьезных нарушений иммуноло! ической реактивности, несмотря на разный уровень экспрессии рецептора СС1?5 на мембранах

соответствующих клеток [Mueller A., Strange P., 2004]. Мы сочли целесообразным оценить уровень его экспрессии на мембранах иммунокомпетентных клеток у больных РМЖ, однако при этом не было выявлено существенных различий у пациентов с вариантным и нормальным генотипом (рис. I).

Вом & WhMar Plot жспраесжм СС RS

во -■-■----

50

«

к

О СрвАНМА

I lîWt-75% Т ИМИ»

Рис I Уровень экспрессии хемокинового рецептора CCR5 на мононуклеарах периферической крови у больных РМЖ

Мы оценили также экспрессию гена CCR5 путем детекции мРНК методом ОТ-ПЦР и сопоставили ее с выявлением белка CCR5 на клеточной поверхности иммуноцитохимическим методом с использованием моноклональных антител у этих же больных Анализ полученных результатов свидетельствует о несоответствии этих показателей между собой у большинства обследованных больных, которое заключалось в более низкой экспрессии белка при высоком уровне мРНК Такое несовпадение может быть обусловлено рядом причин, среди которых наиболее вероятной и объяснимой является повышение уровня хемокинов - лигандов рецептора CCR5 (MIP-1 альфа, MIP-I бета, RANTES), способных взаимодействуя с активным центром рецептора экранировать его и делать менее доступным для связывания со специфическими антителами Это является следствием низкой чувствительности метода детекции белка из-за специфичности антитела к сайту связывания в районе активного центра, обеспечивающего контакт с лигандом. Действительно, есть данные о том, что усиление экспрессии мРНК CCR5 в лимфоцитах под влиянием ИЛ-12 сочетается с уменьшением экспрессии белка на клеточных мембранах, что связано с одновременным увеличением продукции RANTES и его взаимодействием с рецептором [Wang et al, 1999] Полученные нами данные указывают на то, что экспрессия CCR5 у больных РМЖ обусловлена не столько наличием нормальных или вариантных аллелей этого гена, сколько регуляторным влиянием на постгранскрипционном уровне, в которое вовлекаются цитокины и хемокины

При исследовании функциональной активности иммунокомпетентных клеток посредством оценки их пролиферации и способности к продукции цитокинов получены результаты, указывающие на однонаправленность изменений изучаемых параметров у больных с предопухолевыми изменениями в ткани молочной железы и РМЖ (рис 2)

ФНО-а/1г/ил ФНО-а,стам.пг<ш1 ИЛ-1р,пгЛ|л

Рис.2 Уровень продукции щггокинов мононуклеарами периферической крови у больных

РМЖ, ФА и ФКМ. *- значимые различия с группой контроля, **- значимые различия с группой РМЖ

При этом следует обратить внимание на то, что выраженность отклонений показателей от нормального уровня (по сравнению с практически здоровыми женщинами) была более значимой у пациенток с ФКМ и ФА, чем с РМЖ Это проявлялось в увеличении относительного количества зрелых Т-лимфоцитов, относительного и абсолютного количества С08+- и СЭ22+- субпопуляций лимфоцитов, относительного числа ЫК-клеток, что может быть связано с сохранением резервов, которые обеспечивают выраженную реакцию иммунной системы на начальных этапах патологического процесса (рис 3)

CD3+,% CD8+,% CD22+,% CD16+,%

Рис 3 Субпопуляционный состав иммунокомпетентных клеток у больных РМЖ, ФА и ФКМ *- значимые различия с группой контроля,**- значимые различия с группой РМЖ

Мы оценили также уровень иммунокомпетентных клеток крови, репрессирующих маркеры активации CD95 (Fas/APO-1), CD25 (табл. 3) Было выявлено значительное снижение числа лимфоцитов с маркером апоптоза CD95+ у больных с предопухолевыми заболеваниями и злокачественными новообразованиями молочной железы, особенно выраженное у больных РМЖ Эти результаты аиласуются с данными других авторов [Кадагидзе З.Г и соавт, 1999,2001, Бушуева Т В и соавт, 2004] Весьма вероятно, что CD95 рецепторы экранируются растворимой формой FasL, которая может ингибировать функциональную активность CD95+ лимфоцитов и NK-клеток, вследствие чего снижается эффективность их цнтотоксического действия на опухолевые клетки, экспрессирующие Fas-антиген [Spiegelman et al. 1993]

Таблица 3

Уровень экспрессии актавационных антигенов на лимфоцитах периферической крови у

больных РМЖ, ФА и ФКМ

Параметры Контроль (п=53) РМЖ <в=186) ФА+ФКМ (п=135)

С025+, % 16,3 ±1,55 19,1 ±0,69 21,6±1,1* **

"107л 0,35± 0,04 0,32±0,02 0,38±0,03

С1Э95+, % 29,4+2,5 15,311,2* 22,2+2,2* ♦*

4107л 0,44±0,2 0,28±0,03 * 038+0,02**

Примечание. * - значимые различия с группой контроля, р<0,05; " - значимые различия с группой РМЖ, р<0,05;

Можно полагать, что недостаточность активационного апоптоза, обусловленная низким уровнем экспрессии С 1)95, способствует активации пролиферативных процессов в ткани молочной железы у пациенток с РМЖ, мастопатией и доброкачественными опухолями. У пациенток с ФКМ и ФА нами выявлено повышение процента С025 положительных клеток по отношению к их уровню в контрольной выборке и группе больных РМЖ (табл.3). Поскольку мембранный антиген СП25 - это рецептор к ИЛ-2, ключевому регулятору созревания и дифференцировки Т-лимфоцитов, то возрастание количества клеток, несущих на своей мембране данную молекулу, свидетельствует об активации Т- клеточного звена иммунной системы.

Нами показано, что во всех исследуемых группах пациенток наблюдалось значимое увеличение спонтанной пролиферации лимфоцитов по сравнению со здоровыми женщинами. При этом отмечено выраженное снижение индекса стимуляции пролиферации в ответ на ФГА, который отражает соотношение между ФГА-стимулированной и спонтанной пролиферативной активностью лимфоцитов и характеризует их готовность адекватно отвечать на антигенный стимул (табл.4)

Таблица 4

Функциональная активность иммунокомпетентных клеток у больных РМЖ, ФА и ФКМ

Параметры контроль (п=53) РМЖ (п=139) ФКМ+ФА (п=107)

-Пролиферация лимфоцитов спонтанная, имп/мин 1193,3±174,04 3332,4±496,7 * 5528,7*659,4* **

Пролиферация лимфоцитов, стимулированная ФГА, имп/мин 40018,2±6575Д 27207,9ь1953,5 * 34567,9±2679,5 **

Индекс ФГА стимуляции 39,01:6,8 16,5±1,7 * 16,2±1,9 *

Индекс цнтотоксичности лимфоцитов,% 42,8±6,5 38,4±1,9 38,2±1,9

Примечание. * - значимые различия с группой контроля. р<0,05.

** - значимые различия с группой РМЖ, р<0,05

Нарушение способности лимфоцитов реагировать активацией пролиферации на антигенную нагрузку, вероятно, связано с истощением функциональных резервов Т-лимфоцитов за счет супрессорного воздействия клеток опухоли на иммунную систему больных РМЖ Реализация иммунносупрессорного действия белков опухолевых клеток может осуществляться как посредством прямого ингибирующего воздействия на процессы мигоген-индуцированной активации лимфоцитов, так и опосредованно, путем стимуляции клеток, функционально ориентированных на супрессию Показано, что в малигнизированных клетках активно функционируют механизмы сбрасывания компонентов рецепторов во внеклеточное пространство - процесс шеддинга. Удаляемыми компонентами рецепториых комплексов обычно оказываются ганглиозвды GM2, СМЗ и GDla. В микроокружении опухолевой клетки молекулы ганглиозкяов активно связываются с активированными иммуноцитами и оказывают угнетающее влияние на их функциональную активность [Chang et at., 1997; Nagai, 199S; CHshefski et al., 1996].

Оценка базапьной продукции ИЛ-If! и ФНО-а мононуклеарами крови показала, что во всех группах пациентов она существенно выше контрольного уровня (табл 5)

Таблица 5

Продукция цигокинов мононуклеарными клетками периферической крови больных РМЖ, ФА и ФКМ

Параметры Контроль(п=53) РМЖ (л=139) ФА+ФКМ (п=107)

Продукция ФНО-а базальная, пг/мл 187,0± 65,2 541Д±79,5 618,7±76,9*

Продукция ИЛ-lß, базальная, пг/мл 80,3±80,0 671,4±64,5* 1041,4± 100,0* **

Продукция ИЛ-4, базальная, пг/мл 19,0±2,4 27,6±8,1 23,9±6,5

Продукция ИЛ-2, базальная, пг/мл 47,1±2,6 17,3±2,9 36,6±4,3"

Примечание' * - значимые различия с группой контроля, р<0,05,

** - значимые различия с группой РМЖ, р<0,05

Цитокины ИЛ-Iß и ФНО-альфа относятся к разряду индуцибеяьных провоспалигельных факторов, и высокая спонтанная продукция их мононуклеарами крови у больных изучаемых групп свидетельствует о том, что эти клетки уже активированы in vivo. Причем высокий уровень базальной продукции ИЛ-lß коррелирует с высокой пролиферативной активностью лимфоцитов у больных РМЖ, ФА и ФКМ Индуцированная продукция ФНО-альфа может служить фактором, определяющим потенциальные возможности активации клеток-продуцентов (в частности, мононуклеаров, продуцирующих ФНО-альфа), которые в данном случае у больных с лредопухолевыми заболеваниями и РМЖ снижены. Рядом авторов показано, что высокий уровень про воспалительных цигокинов (ИЛ-lß, ИЛ-6) нередко сочетается с высокой распространенностью процесса при опухолях различной локализации [Oka et al., 19%; Tilg et al, 1994; Kai et al., 2005]. Считают, что индивидуальная генетическая предрасположенность к продукции высокого уровня провоспалительного цитокина ИЛ-6 и низкого уровня противовоспалительного ИЛ-10 может являться одним из факторов неблагоприятного клинического течения заболевания [Caruso et al, 2004] Известно, что ИЛ-lß способен активно ингибировэть экспрессию в опухолевых клетках антигенов гистасовмесгимости II класса, что нарушает реализацию противоопухолевого иммунного ответа. Однако в ряде случаев ИЛ-lß может снижать опухолевую пролиферацию, индуцируя такие цитокины, как ФНО-альфа, ИЛ-12, а также образование цитотоксических кислородных радикалов [Кадагидэе 3 Г". 2003] Shen W, et al.

(2004) показано, что ИЛ-ip способен ннгибировать экспрессию генов активации клеточного цикла, что приводит к задержке перехода клетки в фазу S и Go/Gi остановке клеточного цикла и, соответственно, к угнетению роста опухоли Эти данные свидетельствуют о способности ИЛ-1(5 в определенных условиях оказывать не только про- но и противоопухолевый эффект

Основной функцией ИЛ-2 в организме является обеспечение клеточной составляющей адаптивного иммунитета. Нами выявлен низкий уровень базальной продукции ИЛ-2 мононуклеарами крови у больных раком молочной железы по сравнению с пациентками ФА и ФКМ (табл.4) Показано, что снижение продукции ИЛ-2 лимфоцитами периферической крови нередко коррелирует со снижением активности киллерных клеток [Бережная Н М, Горецкий Б А., 1992]. Оказалось, что опухолевые клетки также способны продуцировать фактор роста Т-лимфоцитов и экспрессировать рецепторы к нему, при этом секреция ИЛ-2 опухолевыми клетками рака молочной железы сочетается с усилением их роста, а увеличение экспрессии CD25 на опухолевых клетках свидетельствует о высокой степени злокачественности РМЖ [Бережная Н М., Чехун В.Ф., 2000].

При изучении уровня продукции ИЛ-4 у больных с предопухолевымн заболеваниями и раком молочной железы мы не получили статистически значимых различий с показателями контрольной группы (табл 3). Анализ индивидуальных значений концентраций ИЛ-4 выявил высокую гетерогенность этого показателя в исследуемых группах В литературе есть сведения, что клетки большинства опухолей человека продуцируют IL-4 и экспрессируют рецепторы к нему, которые отличаются высокой аффинностью Связывание ИЛ-4 с соответствующим рецептором на опухолевых клетках приводит к подавлению роста опухоли. Механизм противоопухолевого действия ИЛ-4 недостаточно изучен. Полагают, что это может быть прямое антипролиферативное действие, обусловленное блокадой клеточного цикла, или способностью ИЛ-4 снижать экспрессию генов некоторых цитокинов Кроме того, предполагается, что повышение в опухолевых клетках экспрессии антигенов HLA под его влиянием способствует развитию противоопухолевого иммунного ответа [Кадагидзе З.Г, 2003]. С другой стороны, есть данные о возможности защитного действия 1L-4 на опухолевые клетки (при раке молочной железы, простаты и мочевого пузыря) от С095-индуцированного апоптоза через негативную регуляцию экспрессии проапоггготических белков [Conticello et al., 2004].

В настоящее время показано, что риск возникновения РМЖ многократно возрастает при наличии выраженной пролиферативной формы фиброзно-кистозной болезни [Чистяков С.С и соавт, 2004; Barclay et al., 2005]. Мы изучили иммунологические показатели у больных с дисгормональными заболеваниями в зависимости от выраженности процесса, степень которого определялась на основании данных клинического, инструментального обследования и результатов морфологического исследования с учетом пролиферативного потенциала клеток. При этом было выявлено, что при более тяжелой форме клинического течения ФКМ отмечается повышение продукции ИЛ-2 (48,1±13,2 пг/мл против 18,5±6,3 пг/мл у женщин с умеренными проявлениями, F=4,9; р<0,02) с одновременным усилением экспрессии рецептора к нему на лимфоцитах (0,6±0,3 Г/л и 0,32±0,1 Г/л соответственно при F=7,7, р<0,01) по сравнению с больными ФКМ с клиническими проявлениями умеренной степени тяжести, что можно трактовать как активацию иммунокомпетентных клеток (рис.4)

Однако результат такой активации может быть неоднозначным. С одной стороны, эти адаптационные изменения, очевидно, направлены на защиту организма при патологическом процессе, развивающемся на фоне гормонального дисбаланса, нарушения структурно-функционального гомеостаза, диспластических изменений эпителия молочной железы. С другой стороны, ИЛ-2 как ростовой фактор, может выступать стимулятором пролиферации диспластических клеток при наличии на них рецепторов к ИЛ-2 и способствовать тем самым развитию опухолевого процесса.

РМоГМмааШС«К кМУак (95 00%)

----- __т -I

г-

-О- ИЛ-4 -о ИЛ-2 о С025%

Рис.4. Абсолютное количество СЭ25+ - лимфоцитов и уровень продукции ИЛ-2 и ИЛ-4 у больных ФКМ с клиническими проявлениями разной степени выраженности.

Одновременно выявленное нами снижение продукции ИЛ-4 у больных ФКМ с выраженными клиническими проявлениями также может быть фактором, способствующим развитию опухоли, поскольку, как уже упоминалось выше, он обладает способностью ингибировэть опухолевый рост при наличии соответствующих рецепторов на опухолевых клетках [Т«агоуа е!а1,1998; Бережная Н.М., Чехун В.Ф., 2001, Кадагидзе 3.г.,2003].

Поскольку фиброаденомы могут развиваться как в нормальной ткани молочной железы, так и на фоне мастопатии, мы оценивали иммунологические параметры у больных ФА как в зависимости от выраженности процессов пролиферации в опухолевом узле, так и наличия фоновой патологии - мастопатии. В соответствии с данными критериями все пациентки с ФА были разделены на подгруппы: с умеренной степенью пролиферации эпителия и без пролиферативных изменений в ткани молочной железы, а также с проявлениями фиброзно-кистозной мастопатии, на фоне которых возникла доброкачественная опухоль, и без фоновых изменений в тканях, окружающих новообразование У пациенток с фиброаденомами, имеющих умеренную степень пролиферации эпителия опухоли, наблюдалось значимое увеличение всех сублопуляций Т-лимфоцкгов, а также СО 16+ и С022+-лимфощгтов но сравнению с группой контроля (р< 0,05) У больных ФА без фоновых изменений не отмечено существенных изменений изучаемых показателей.

Результаты однофакторного дисперсионного анализа по Крускалю - Уоллису позволили выявить, что наличие фоновой патологии достоверно влияло на целый ряд иммунологических параметров у больных ФА, а именно уровень продукции ИЛ-4 (58,3±22,8 пг/мл у больных в сочетании с масгонагией и 4,46±2,9 пг/мл у пациенток без фоновых изменений, Р=5,6, р<0,03; рис 7), общее количество лейкоцитов (5,6±0,29 Г/л и 4,6±0,3 Г/л соответственно при Р=4,1, р<0,04, рис.8), абсолютное количество С022+-лимфоцитов (0,44± 0,04 Г/л и 0,28± 0,03 Г/л при Р=5,9, р<0,01, рис 9) и относительное количество СР95+ -клеток (26,6± 2,54% и 33,8± 3,9% соответственно при Р=4,4, р<0,03 Таким обратом, мы обнаружили, что именно ФКМ как фоновая патология, обусловливает изменения целого ряда показателей иммунной системы у больных с ФА

Опухолевая прогрессия - это процесс возникновения и отбора более злокачественных клонов опухолевых клеток. Злокачественность опухоли выражается в разных формах, которые имеют соответствующие клинико-морфологические проявления, такие, как лимфогенное или гематогенное метастазирование. мультифокусный характер роста опухоли, рсиидивирование Манифестация различных форм прогрессии у разных больных предполагает и различие обеспечивающих и\ механизмов Принимая во внимание широкий

регуляторный потенциал ССЯ5 как на уровне клеточно-опосредованного иммунного ответа, так и прямого модулирующего влияния на поведение опухоли, мы оценили взаимосвязь полиморфизма гена СС/?5 с прогрессией РМЖ Одним из вариантов опухолевой прогрессии и одновременно фактором, связанным с плохим прогнозом, является метасгазирование в регионарные лимфатические узлы. Согласно полученным нами данным, частота гетерозиготного генотипа ССЯ5/ССЯ5йе132 в группе больных РМЖ, не имеющих лимфогенного метастазирования, статистически значимо превышала популяционный показатель (25,7% и 12,5%, при х2=4,88; р<0,02; ОР=2,43; С195%=1,02-5,84), что указывает на ассоциацию этого генотипа с более благоприятным клиническим течением заболевания

Подтверждением этому являются и наши данные о повышении частоты встречаемости гетерозигот среди больных РМЖ, у которых морфологически подтверждена умеренная степень дифференцировки опухолевых клеток - достаточно благоприятный в прогностическом плане критерий злокачественности опухоли.

Интегральным показателем эффективности лечения является продолжительность жизни больного без признаков заболевания (благоприятный или неблагоприятный исход) Несомненно, важную роль при этом играет характер терапевтических воздействий, однако часто при сходных показаниях к лечению и использовании стандартных методов терапии у разных больных наблюдается совершенно разный исход Очевидно, что при стандартных терапевтических подходах эффективность лечения больного, (по сути, определяющая исход заболевания), является результирующей целого ряда составляющих, среди которых большое значение имеет чувствительность опухоли к цитодеструктивным воздействиям, ее морфофункциональное состояние и генетически детерминированные особенности организма больного, определяющие взаимоотношения с опухолью и реакцию на терапевтические воздействия. Наши данные показали существенное статистически значимое повышение частоты встречаемости индивидуумов с гетерозиготным генотипом гена ССЯ5 среди больных РМЖ с благоприятным исходом, который определялся на основании отсутствия гематогенного метастазирования или рецндивирования заболевания в период наблюдения от 2 до 5 лет. Различия с группой больных РМЖ с неблагоприятным исходом, у которых наблюдалось прогрессирование опухолевого процесса в виде рецидивов, отдаленных метастазов или летального исхода, были также значимы (табл.6).

Таблица 6

Частота распределения генотипов гена ССИ5 у больных РМЖ в зависимости от исхода

заболевания

Группы Генотипы СС115

ССК5/ССЯ5 ССЯ5/ССК5сШ2 СОШе132/ССЯ5<1е132

Контроль(п=104) 86/104 13/104 5/104

82,6% 12,5% 4,8%

Благоприятный 65/89 24/89 -

исход (п=89) 73,0% 26,9%*

Х^.88 Р<0,02

Неблагоприятный 22/26 3/26 1/26

исход (п=26) 84,6% 11,5%** 3,8%

Примечание: *- значимые различия с группой контроля (р<0,05)

** - различия значимы по сравнению с группой «благоприятный исход»

Мы не выявили значимых различий продукции цитокинов или других факторов системы иммунитета в зависимости от исхода заболевания, однако следует отметить, что у больных РМЖ с лимфогенными метастазами, наличие которых рассматривается как фактор неблагоприятного прогноза течения заболевания, отмечен более низкий уровень

продукции ИЛ-4 наряду с тенденцией к снижению стимулированной митогеиом продукции ФНО-альфа.

Поскольку делеционный аллель CCR5del32 может вносить свой вклад в повышение риска РМЖ, и, принимая во внимание данные о вовлечении хемокинов и хсмокинового рецептора CCRS в формирование ТЫ- зависимого противоопухолевого иммунного ответа, мы сочли целесообразным оценить функциональную активность иммунокомпетентных клеток у пациенток с предопухолевыми заболеваниями в зависимости от наличия вариантного аллеля. Согласно полученным данным, пациенты с нормальным генотипом, который ассоциирован с более низким риском РМЖ, обладают способностью отвечать более высокой продукцией ФНО-альфа лимфоцитами крови на адекватный стимул, чем здоровые доноры (табл.7) При этом у них также выявлена повышенная спонтанная пролиферация лимфоцитов и доля активированных - несущих на своей мембране рецептор к ИЛ-2 -клеток (рис 7). Лимфоциты пациентов, несущих гетерозиготный генотип, не обладают способностью к повышенной продукции ФНО-альфа в ответ на стимул. Эта данные можно трактовэть как свидетельство вовлечения иммунной системы в защитную реакцию при дисгормональных доброкачественных процессах, при этом изученные факторы могут способствовать снижению риска злокачественных новообразований молочной железы у индивидуумов с нормальным генотипом гена CCR5.

Таблица 7

Функциональная активность иммунокомпетентных клеток у больных ФКМ и ФА с разными

генотипами гена CCR5

Параметры Контроль ФКМ+ФА

CCR5+/+ CCR5+/del

Продукция ФНО-а базальная, пг/мл 187,0±65Д (8) 798,6± 126,9 (32)" 617,1±121,1 (12)**

Продукция ФНО-а, стимулированная ЛПС, пг/мл 300,1±169,1 (8) 877,6± 119,2 (31)" 494,1±100,5 (И)

Пролиферация лимфоцитов спонтанная, имп/мин 1193,3± 174,1 (13) 5574,35±877,3 (57) ** 3310,7+1125,7 (17)

Пролиферация лимфоцитов, стимулированная ФГА, имп/мин 40018Д± 6575,2(13) 31190,47±3256,5 (57) 25689,85±6357,9 (17)

Примечание: ** - значимые различия с группой контроля (р<0,05); в скобках - число наблюдений.

Для оценки возможной роли иммунологических факторов в прогрессии РМЖ у пациентов с разными генотипами гена хемокинового рецептора ССИ5 мы изучили у них активность иммунокомпетентных клеток При носительстве делеционною аллеля ССК5<1е132 (гетерозиготный генотип, связанный с более благоприятным клиническим течением заболевания) отмечена более низкая продукция ИЛ-4 и более высокий пролиферативный ответ лимфоцитов на ФГА по сравнению с соответствующими показателями у пациентов с нормальным генотипом (табл.8)

□ контроль

■ CCR5+/+

■ CCR5+/de)

СОЯ+,% С026+Л С096+,%

Рис.7 Субпопуляционный состав иммунокоипетентных клеток у больных ФА и ФКМ в зависимости от генотипа ССЯ5 *- значимые различия с группой контроля

Таблица 8

Функциональная активность иммунокоипетентных клеток у больных РМЖ с разными

генотипами гена ССА5

Параметры контроль РМЖ

CCR5+/+ CCR5+/del

Продукция ФНО-а базальная, пг/мл 187,0*65,2(8) 787,2±150,8(21)** 579,1±270,1(6)**

Продукция ФНО-а стимулированная ЛПС, пг/мл 300,1±169,(8) 793,5± 117,6 (17)** 551Д± 292,4 (4)

Продукция ИЛ-4, базальная, пг/мл 19,0*2,4(8) 45,0± 19,2(43) 9,4±3,9(10)* »*

Пролиферация лимфоцитов спонтанная, имп/мин 1193,3±174,1 (13) 3534,3*1288,2 (47) 4395,0 ±1442,6 (14)**

Пролиферация лимфоцитов, стимулированная ФГА, имп/мин 40018,2±6575,2 (13) 20729,4±2370,6* (47)** 33150,1±7239,1 (14)

Примечание: *- различия с группой CCR5+/+; ** - различия с группой контроля (р<0,05), в скобках - число наблюдений

У больных РМЖ с диким генотипом, который ассоциирован с более высоким риском прогрессии, отмечается повышение продукции ФНО-альфа лимфоцитами в ответ на стимул при снижении доли Т-хелперов и естественных киллерных клеток по сравнению с уровнем здорового контроля (рис 8) Эти результаты дакп основания полагать, что факторы иммунной системы могут вовлекаться в механизмы прогрессии РМЖ В частности, есть сведения о неблагоприятной прогностической значимости высокого уровня продукции ФНО-альфа при злокачественных новообразованиях [Белецкий И П. и соавт, 2002, Bozcuk el al., 2004, Estevam et al.,2005] На уровне опухолевого микроокружения ФНО-альфа обеспечивает ингибицию дифференцировки фибробластов стромы и развитие десмопластической реакции, обеспечивающей структурное и функциональное поддержание роста опухоли [Deb S , et al, 2004]

10

30

20

0

В контроль ■ CCR5+/+ □ CCR5+/del

CD4+,% COI 6+,% CD95+,%

Рис 8 Субпопуляционный состав иммунокомпетентных клеток у больных РМЖ в зависимости от генотипа CCR5 *- значимые различия с группой контроля

Примечательно, что ИЛ-4 оказался достаточно информативным показателем, ассоциированным с выраженностью клинического течения доброкачественных днсгормональных заболеваний и РМЖ как при оценке групп больных независимо от статуса гена CCR5, так и при учете наличия вариантного аллеля

Таким образом, согласно полученным нами данным, гетерозиготный генотип гена хемокннового рецептора CCRS ассоциируется с повышенным риском возникновения РМЖ, но при этом связан с благоприятным прогнозом течения заболевания Неоднозначная роль гена CCR5 на этапах злокачественной трансформации и при опухолевой прогрессии, видимо, связана с различными механизмами, обеспечивающими малигнизацию и формирование опухоли с одной стороны, и развитие разных форм опухолевой прогрессии -с другой.

Вовлечение хемокинового рецептора CCRS в формирование опухоли (т.е на этапах инициации и промоции) может быть опосредовано двумя основными путями, а именно влиянием его на становление специфического противоопухолевого ответа по Thl механизму [Azenshtein et al., 2002] и способностью регулировать апоптоз модифицированных клеток р53-зависимым путем [Manes et al., 2003] В этой связи у индивидуумов, несущих вариантный аллель CCR5del32, вероятна ингибиция иммунного ответа в связи со сниженной экспрессией CCR5 на иммунокомпетентных клетках. Косвенно это подтверждается нашими данными о том, что функциональная активность лимфоцитов повышается у больных с предопухолевой патологией, имеющих только нормальные аллели CCR5, при этом у пациентов с наличием делеционного аллсля такой активации не наблюдается. Более низкая экспрессия CCRS также может отрицательно сказаться на реализации р53- зависимого апоптоза трансформированных клеток.

CCR5 может участвовать в опухолевой прогрессии через регуляцию пролиферации опухолевых клеток, которая осуществляется по аутокринному механизму соответствующими хемокинами, продуцируемыми опухолью Источником провоспалительных цитокинов (хемокинов) могут выступать и клетки системы иммунитета, инфильтрирующие опухоль Можно ожидать, что у лиц - носителей делеционного аллеля CCR5del32 за счет снижения экспрессии CCRS на иммунокомпетентных клетках инфильтрация воспалительными клетками ниже, чем при нормальном генотипе Кроме этого, вклад в благоприятный прогноз может вносить и тот факт, что более низкая экспрессия CCR5 на клетках опухоли в определенной степени предотвращает стимуляцию опухолевого роста воспалительными цитокинами.

Таким образом, полученные нами результаты указывают на увеличение частоты встречаемости CCR5/CCR5del32 генотипа у больных РМЖ, в большей степени у пациенток до 50 лет, по сравнению со среднепопуляционной нормой, и позволяют связать этот

генотип с повышением риска развития РМЖ у женщин репродуктивного возраста Однонаправленность изменений продукции щггокинов и иммунологических показателей у больных с дисгормональными доброкачественными заболеваниями и злокачественными новобразованиями свидетельствует о вовлечении иммунной системы в формирование риска развития рака Четкая ассоциация вариантного гена ССИ5 и продукции ИЛ-4 с клинико-морфологическими признаками, характеризующими благоприятное клиническое течение РМЖ (отсутствие лимфогенного метастазирования, умеренная степень дифференцировки опухолевых клеток, благоприятный исход), свидетельствуют о возможности считать их защитными факторами в плане прогрессии заболевания Выявленные различия продукции щггокинов и параметров иммунитета у больных с предопухолевыми заболеваниями и РМЖ в зависимости от генотипа гена ССЯ5 свидетельствуют об определенном вкладе иммунологической компоненты в риск возникновения и прогрессию РМЖ

Выводы

1. Частота встречаемости генотипа ССЯ5/ССК5де132 у больных РМЖ составила 23,9%, что статистически значимо выше, чем в группе популяционного контроля (12,5%, р<0,02). У пациенток с предраковой патологией молочной железы выявлено значимое двукратное увеличение частоты генотипа ССИ5/ССЯ5<1е132 по сравнению с популяционной нормой (24Д р<0,03).

2. В группе больных РМЖ, имеющих генотип ССЯ5/СС115, относительное количество ССЯ5 положительных мононуклеарных клеток крови составило 21,5%, у пациенток с ССЯ5/СС115(1е132 генотипом - 19,4% (р>0,05) Выявлено несоответствие между уровнем экспрессии мРНК в лимфоцитах и экспрессией белка СС115 на мембранах клеток периферической крови.

3. В группе больных ФА и ФКМ выявлено увеличение уровня продукции провоспалительиых цитокинов ФНО-а и ИЛ-1р, спонтанной пролиферации лимфоцитов, снижение индекса стимуляции пролиферации в ответ на митогенный стимул, активности нейтрофилов крови по сравнению со здоровыми женщинами (р<0,05).

4. Для пациенток с РМЖ характерны следующие функциональные изменения в системе иммунитета' высокий уровень продукции ИЛ-1р, увеличение спонтанной пролиферации лимфоцитов, снижение митоген-ицдуцированного пролиферагивного ответа Т-лимфоцитов, функциональной активности нейтрофилов, значимое повышение уровня СИ8+ - лимфоцитов, уменьшение числа С016+- и СГ)95+ - лимфоцитов по сравнению с контрольной группой <Р<0,05).

5. У пациенток с ФКМ с выраженными клиническими проявлениями заболевания выявлен более высокий уровень продукции ИЛ-2 (р<0,02), более низкий уровень продукции ИЛ-4 (р<0,03) и повышение абсолютного количества С025+ (несущих рецептор к ИЛ-2) -лимфоцитов (р<0,01) по сравнению с больными ФКМ, имеющими клинические проявления умеренной степени выраженности ФКМ как фоновая патология определяет изменения показателей иммунитета у больных с ФА.

6. У больных РМЖ лимфогенное мегастазирование статистически значимо ассоциировано с более низким уровнем продукции ИЛ-4 лимфоцитами крови (8,9 ±6,5 пг/мл у больных с метастазами против 41,4±13,5 пг/мл у пациенток с локализованным процессом, р<0,04).

7 Среди больных РМЖ с благоприятным исходом заболевания выявлен более высокий процент лиц с генотипом ССЯ5/СС1*5<1е132 по сравнению с группой пациенток с неблагоприятным исходом (26,9% и 11,5% соответственно, р<0,02) У больных РМЖ с локализованным процессом в ткани молочной железы наблюдается увеличение частоты встречаемости вариантного генотипа гена ССЯ5 по сравнению с популяционным контролем (25,7% и 12,5% соответственно, р<0,01)

8. У больных с предопухолевыми заболеваниями молочной железы с нормальным генотипом ССЯ5 отмечено повышение числа активированных (С025+)- клеток, спонтанной

пролиферации лимфоцитов, их способности продуцировать ФНО-альфа в ответ на стимул по сравнению с показателями здоровых лиц.

9 У больных РМЖ с нормальным генотипом ССИ5 отмечено снижение уровня Т-хелперов (С04+), естественных киллерных (СО 16+) клеток крови, повышение способности лимфоцитов к стимулированной продукции ФНО-альфа по сравнению со здоровым контролем. При этом выявлено снижение ФГА-стимулированной пролиферации и повышение продукции ИЛ-4 по сравнению с больными РМЖ, несущими вариантный аллель ССЯ5<Ш2.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Функциональная активность клеток иммунной системы у больных с патологией молочной железы // Проблемы современной онкологии Материалы юбилейной конференции Томск -1999- С. 126 (в соавт. со Слонимской F.M, Чердынцевой Н.В, Гарбуковым FIO, Афримзон Е.А).

2 Сравнительная оценка продукции цигокинов мононуклеарными клетками крови у больных с пролифератнвнымн заболеваниями молочной железы // Материалы 8-й Международной конференции «СПИД, рак и родственные проблемы» - Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы -2000 -Т4, №1 -С 118. (в соавт. со Слонимской Е М , Чердынцевой Н В., Гарбуковым Е.Ю , Афримзон Е.А, Стахеевой М.Н ).

3. Функциональная активность иммунокомпетентных клеток у больных с мастопатией, фиброаденомой и раком молочной железы Н БЭБиМ. - 2000 - Т 129 - Прил.1 - с 71-74 (в соавт со Слонимской Е М, Чердынцевой Н В , Гарбуковым Е Ю , Афримзон Е.А., Стахеевой М Н.).

4 Структура адаптационных реакций и показателей системы иммунитета у больных предопухолевыми заболеваниями и раком молочной железы // Физиология организмов в нормальном и экстремальном состояниях' материалы Всероссийской конференции -Томск -

2001 -С. 116. (в соавт со Стахеевой МН, Гарбуковым ЕЮ, Слонимской Е.М, Чердынцевой Н.В., Афримзон Е.А.)

5 Функциональная активность иммунокомпетентных клеток у больных с патологией молочной железы с редким аллелем гена рецептора хемокина CCR5del32 // Науки о человеке' сборник статей молодых ученых и специалистов. - Томск - 2001 -С. 142

6 Продукция цитокинов иммунокомпетенгными клетками у больных с раком молочной железы // Материалы региональной научно-практической конференции «Рак репродуктивных органов профилактика, диагностика, лечение» - Томск -2002 - С 20 (в соавт. со Слонимской Е М , Чердынцевой Н В., Стахеевой М Н , Гарбуковым F Ю, Афримзон Е А)

7 Функциональная активность иммунокомпетентных клеток у больных с патологией молочной железы с редким аллелем гена рецептора хемокина CCR5del32 //Материалы VI ежегодной Российской онкологической конференции,- Москва -2002 - С 176 (в соавт со Слонимской Е М., Чердынцевой Н.В , Стахеевой М Н )

8 Структура адаптационных реакций у больных с опухолевой патологией молочной железы //Материалы региональной научно-практической конференции «Рак репродуктивных органов профилактика, диагностика, лечение» - Томск -2002 - С 125 (в соавт со Стахеевой М Н , Гарбуковым Е.Ю, Слонимской Е М , Чердынцевой Н В.)

9 Структура адаптационных реакций у больных раком молочной железы при включении в схему лечения беталейкина // 4 Съезд физиологов Сибири тезисы докладов -Новосибирск -

2002 -С 268 (в соавт со Стахеевой М Н , Слонимской Е М, Чердынцевой Н В, Симбирцевым А С, Кладиевым А А )

10 Структура адаптационных реакций и показатели системы иммунитета у больных предопухолевыми заболеваниями и раком молочной железы // Сборник материалов конференции "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" -2002 - Т.4, №2 - С 310-311 (в соавт. со Стахеевой М.Н , Гарбуковым Е.Ю., Слонимской Е М, Чердынцевой Н.В.). И Показатели системы иммунитета у больных с пролиферативными заболеваниями молочной железы в зависимости от выраженности патологического процесса. //Сборник научных трудов научно-практической конференции «Актуальные прблемы рака молочной железы»- Кемерово. -2003 - С8-10. (в соавт со Стахеевой МН, Гарбуковым Е.Ю., Слонимской Е М., Чердынцевой Н.В., Афримзон Е.А).

12. Роль цитокинов в патогенезе рака молочной железы. //Материалы VI Всероссийского научного Форума с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» - 2003 -Т 5 № 3-4, - С.445. (в соавт Чердынцевой Н В, Стахеевой М Н, Юдиным Н С, Белявской В А, Слонимской Е М, Исаевой Т М, Севостьяновой Н В, Уразовой Л Н, Ромащенко А Г, Воевода М И )

13 Цитокины и злокачественный рост// Сибирский онкологический журнал -2003 - №2 -С 79. (в соавт Со Стахеевой М.Н, Чердынцевой Н В )

14. Продукция цитокинов иммуиокомпетентными клетками у больных раком молочной железы // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической онкологии (материалы VI конференции молодых онкологов Украины) - Киев, 2003 - С 4. (в соавт со Слонимской Е М , Н В. Чердынцевой Н.В., Гарбуковым Е Ю, Стахеевой М П., Афримзон. Е.А )

15 Оценка взаимосвязи полиморфизма гена CCR5 с клиническим течением и иммунологическими параметрами у больных раком молочной железы // Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины (материалы V молодежной научной конференции) - Новосибирск, 2004 - С.43-44 (в соавт. с Гервас П.А )

16 Иммунологические параметры у больных фиброзно-кисгозной мастопатией и раком молочной железы с редким аплелем гена хемокинового рецептора CCR5 // Теоретические и прикладные проблемы медицинской генетики (материалы конкурса молодых ученых СО РАМН) - Новосибирск, 2004.- С.58-68

17 Иммунологические показатели у больных раком молочной железы при включении беталейкина в схему комбинированного противоопухолевого лечения И Russian Journal of Immunology - Екатеринбург, 2004-V9, Sup.I-C291. (в соавт со Стахеевой М.Н, Слонимской Е М, Чердынцевой Н В., Симбирцевым А.С., Кладиевым А.А )

18 Уровень продукции цитокинов у больных с пролиферативными заболеваниями молочной железы в зависимости от выраженности патологического процесса // Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии (материалы научно-практической конференции, посвященной 25-летию НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН).-Томск, 2004.-С 44. (в соавт со Стахеевой М Н., Гарбуковым Е.Ю, Слонимской Е М , Чердынцевой Н В, Афримзон Е А )

19 Влияние беталейкина на адаптационный и иммунологический статус больных РМЖ при включении его в схему противоопухолевого лечения // Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии (материалы научно-практической конференции, посвященной 25-летию НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН) -Томск, 2004 -С 244 (в соавт со Стахеевой М Н , Слонимской F М , Чердынцевой Н В , Симбирцевым А С, Кладиевым А А )

20 Влияние беталейкина на иммунологические показатели и эффективность противоопухолевого лечения у больных РМЖ в зависимости от распространенности метастатического процесса // Медицинская иммунология (материалы VIII Всероссийского научного форума) - 2004 - Т 6, № 3-5. - С. 465 (в соавт со Стахеевой М Н , Слонимской Е М., Чердынцевой Н В , Симбирцевым А С, Кладиевым А А ).

21 Распределение генотипов онкосупрессорного белка р53 и хемокинового рецептора CCR5 у больных с доброкачественными опухолями и раком молочной железы // Материалы VIII

Российского онкологического конгресса - М„ 2004.- С 192. (в соавт. с Гервас П А, Стахеевой М Н„ Черлынцевой Н В, Слонимской Е М , Белявской В А)

22. Функциональная активность лимфоцитов и продукция цитокинов у больных с предопухолевой и опухолевой патологией молочной железы в зависимости от аллелыюго полиморфизма гена хемокинового рецептора CCR5// Цигокины и воспаление - 2005,- Т.4., № 2. - С.78. (в соавт с Гервас П.А, Денисовым Е В., Стахеевой М.Н, Чердынцевой Н.В., Слонимской Е.М.).

23. Уровень алоптоза мононуклеарных клеток периферической крови у больных раком молочной железы при проведении неоадъювантной химиотерапии II Медицинская иммунология (материалы VIII Всероссийского научного форума) - 2005.- Т 7, № 2-3. - С 210-211. (в соавт. со Стахеевой М Н., Чердынцевой Н В, Слонимской Е.М ).

24 Уровень апогггоза мононуклеарных клеток периферической крови у больных раком молочной железы при проведении неоадъювантной химиотерапии в зависимости от степени регионарного метастазирования // Материалы II международной ежегодной онкологической конференции. - С -Пб; 2005.- С 138. (в соавт со Стахеевой М.Н., Слонимской Е.М., Чердынцевой Н.В.).

25. Иммунологические показатели у больных раком молочной железы при включении в схему комбинированного лечения беталейкина // Медицинская иммунология - 2005 - Т 7., №1. - С. 63-72 (в соавт со Стахеевой М.Н., Слонимской ЕМ, Чердынцевой Н.В., Симбирцевьш A.C., Кладиевым A.A.).

Автор выражает глубокую признательность д м и., профессору Е М Слонимской, к.м.н. М.Н. Стахеевой, к.м.н. Н В. Литвякову, к.б.н Н.С. Юдину, П.А. Гервас, Л.В. Гердт за помощь при проведении исследований и обсуждении результатов.

СЛИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

РМЖ - рак молочной железы

ФА - фиброаденома

ФКМ - фиброзно-кисгозная мастопатия

ФКБ - фиброзно-кисгозная болезнь

CCR5 - хемокиновый рецептор семейства СС

ОТ ПЦР- обратно транскриттгазная полимеразная цепная реакция

ИЛ-1 - бега - интерлейкин-1 бета

ИЛ-2 - интерлейкин- 2

ИЛ-4 - интерлейкин- 4

ИЛ-6 - интерлейкин 6

ТФР-бета - трансформирующий фактор роста

ФНО-альфа - фактор некроза опухоли

Th-1 - Т-лимфоциты хелперы 1 типа

РБТЛ- реакция бластной трансформации

ФГА - фитогемагглютинин

NK - натуральные киллерные клетки

MIP-la,ß- monocyte inflammatory protein la,ß

RANTES - regulated on activation normal T-cell expressed and secreted

Р25 557

РНБ Русский фонд

2006-4 28373

Подписано к печати 18.11.2005 г. Тираж 100 экз. Заказ № 119. Бумага офсетная. Формат 60X 84/16.23 стр. Печать RISO. Отпечатано в типографии ООО «РауШ мбХ»

Лицензия Серия ПД № 12-0092 от 03.05.2001 г. 634034, г. Томск, ул. Усова 7, ком. 052. тел. (3822) 56-44-54