Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Экспериментальное изучение фармакокинетики и метаболизма нового фармакологического препарата дилепт

На правах рукописи

2 0 АВ Г 2009

Месонжннк Наталья Владимировна

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ФАРМАКОКИНЕТИКИ И МЕТАБОЛИЗМА НОВОГО ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА

ДИЛЕПТ

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА-2009

003475377

г

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте имени В.В. Закусова и в ФГУП «Антидопинговый центр» Минспортсуризма России

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор кандидат химических наук

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Жердев Владимир Павлович Родченков Григорий Михайлович

Воронина Татьяна Александровна

доктор биологических наук, профессор Фирсов Александр Алексеевич

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет».

Защита состоится «_»_2009 г. в «_» час на заседании диссертационного

совета Д 001.024.01 при НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН по адресу; 125315, г. Москва, ул. Балтийская, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в ученой части НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН по адресу: 125315, г. Москва, ул. Балтийская, д.8.

Автореферат разослан «_»_2009 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук Вальдман Е. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность.

Шизофрения - тяжелое психическое заболевание, распространенность которого, согласно статистическим данным, составляет от 0.1-1% (Смулевич А.Б. и др., 2004; Мосолов С.Н. и др., 2004). Повышение эффективности лечения больных шизофренией является одной из наиболее актуальных задач современной психиатрии. Это связанно с тяжёлыми последствиями самого заболевания, а также с осложнениями, которые часто сопутствуют терапии антипсихотическими средствами (Горобец Л.Н. и др., 2003; Мосолов С.Н. и др., 2003).

Актуальные представления о шизофрении как мультимедиаторной патологии привлекают внимание к эндогенным нейропептидам как веществам, оказывающим модулирующее влияние на медиаторные системы мозга. К настоящему времени установлена важная роль эндогенного нейропептида нейротензина (НТ) в патогенезе шизофрении (Саседа Я. ег. а!., 2006, ^тего!Г С.В. е1. а]., 1980,2006). Тот факт, что сам НТ имеет низкую энзиматическую устойчивость и проявляет пейротропную активность только при непосредственном введении в мозг, побудил к активному поиску и созданию его агонистов, эффективных при системном введении (ШсЬе^оп Е. с1 аЦ 2003).

Исходя из оригинальной гипотезы о возможности имитации биологических эффектов сложных эндогенных пептидов простейшими аналогами, воспроизводящими структуру их активного центра, и непептидного нейротропного препарата с соответствующей активностью, в НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН был создан пептидомиметик бета-поворотной структуры активного участка нейротензина (НТ8.1з) метиловый эфир ЛЧсапроил-£-пролил-1-тирозина, получивший название дилепт (Гудашева Т.А. и др., 1997, 1998; Середенин С.Б. и др., 1997). Дилепт продемонстрировал нейролептическую активность в диапазоне доз 0.4-4.0 мг/кг при внутрнбрюшинном введении и 4.0-8.0 мг/кг при пероральном (Ретюнская М.В. и др., 2003). Этот трипептоидный аналог нейротензина не уступает по выраженности антипсихотического действия упомянутым гексапептидным аналогам НТ и существенно превышает непептидный прототип, сульпирид. При этом даже в дозах, превосходящих нейролептические в 250-500 раз, он не проявляет каталептогенного и седативного эффектов. Важными чертами, отличающими дилепт от известных нейролептиков, является способность улучшать когнитивные функции и оказывать нейропротективное действие (Островская Р.У. и др., 2005).

Проведение исследований фармакокинетики и метаболизма на этапе разработки нового лекарственного препарата является обязательным этапом для его дальнейшего

продвижения в медицинскую практику. Проникновение лекарственного средства в ткани-мишени и поддержание там определенной концентрации зависит не только от введенной дозы, но и от определенных фармакокинетическпх закономерностей - степени и скорости всасывания, особенностей распределения, путей метаболизма и экскреции. При введении внутрь важное значение приобретает определение доли введенного препарата, поступающей в ткани-мишени или биологические жидкости, с которыми он в эти ткани транспортируется. При этом выясняется, какая часть препарата биотрансформируется, а какая попадает в системный кровоток в неизмененном виде. Изучение абсолютной и относительной биодоступности препаратов и их лекарственных форм помогает выбрать оптимальный путь введения препарата и оценить качество лекарственной формы. Кроме того, фармакокинетические исследования позволяют оценить возможность и интенсивность проникновения лекарственного средства в орган-мишень.

В связи с вышеизложенным для дальнейшего продвижения в медицинскую практику потенциального адтипсихотика нового поколения, необходимо провести изучение фармакокинетюси дилепта, а так же его основных метаболитов.

Диссертация выполнена в соответствии с плановой темой НИР НИИ фармакологии им. Закусова РАМН «Изучение механизмов эндо и экзогенной регуляции функций ЦНС, разработка новых оригинальных нейропсихотропных средств» (№ госрегистрации 01.2006. 06601).

Цель исследования - экспериментальное изучение фармакокинетики и биотрансформации дилепта.

Задачи исследования:

1. Разработать методики качественного и количественного определения дилепта в биологическом материале;

2. Изучить фармакокинетику дилепта после внутривенного и перорального введения у крыс;

3. Изучить пути биотрансформации дилепта после внутрисосудистого и перорального введения у крыс;

4. Оценить способность дилепта и его активного метаболита М1 к проникновению через гематоэнцефалический барьер;

5. Изучить фармакокинетику и определить относительную биологическую доступность таблетированной лекарственной формы дилепта в эксперименте;

6. Изучить пути экскреции дилепта из организма крыс после перорального введения.

Научная новизна работы. Разработаны подходы для определения нового оригинального антипсихотика дилепта и его предполагаемых метаболитов с использованием ГХ-МС и ВЭЖХ-МС/МС в биоматериале. Впервые получены ИЭР-МС/МС спектры дилепта и его основных метаболитов, а также масс-спектры ЭИ их ТМС-производных. Изучена фармакокинетика нового оригинального отечествешюго антипсихотика дипептидной структуры дилепта, созданного на основании эндогенного тридекапептида нейротснзина. Показано, что дилепт метаболизирует в организме экспериментальных животных значительно медленнее, чем нейротензин; идентифицированы основные метаболиты дилепта - Я-капроил-Х-пролил-^-тирозин (Ml) и А-капроил-Х-пролин (М2). Определены основные фармакокинетические параметры дилепта и его основных метаболитов при внутривенном и при пероральном способах введения. Показано, что при использовании таблеток дилепта имеет место увеличение относительной биодоступности дилепта и значительное уменьшение образования продуктов его превращения по сравнению с субстанцией. Установлено, что дилепт и в меньшей степени его активный метаболит - А'-капроил-1-пролил-/.-тирозин проникают через ГЭБ (гематоэнцефалический барьер).

Научно-практическое значение. Данные о фармакокинетике и биодоступности дилепта вошли в материалы, представленные в Министерство здравоохранения и социального развития РФ для получения разрешения на клинические испытания таблеток дилепта. Данные настоящего исследования могут быть полезны для оптимизации пути введения дилепта и выбора оптимальной лекарственной формы.

Личный вклад. Автором были самостоятельно выполнены все эксперименты по нижеизложенным методикам. Обработаны результаты и сформулированы выводы.

Апробация диссертации. Основные результаты работы доложены на XIV российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2007); III съезде фармакологов России «Фармакология - практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007); симпозиуме «Хроматография и хромато-масс-спектрометрия» (Москва, 2008); научно-практической конференции «Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины (Москва, 2008); международном симпозиуме по ВЭЖХ-МС (Montreux, Switzerland 2008), ежегодной конференции «Фармация и общественное здоровье» (Екатеринбург, 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ, из них 3 статьи в научных журналах, которые входят в перечень рекомендованных ВАК, и б тезисов.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 145 страницах, включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты

собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, список литературы -17 отечественных и 276 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 16 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Животные: исследования проводились на белых беспородных крысах (самцы массой 200±20 г.), полученных из питомника "Столбовая" РАМН. Животных содержали в стандартных условиях вивария НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН при 12-ти часовом световом режиме и свободном доступе к корму и воде. Исследования проводили на здоровых, бодрствующих животных. До проведения исследования животные находились в течение 12 часов на водной диете.

Вещества: в работе использовали фармацевтические субстанции метилового эфира Лг-капроил-£-пролил-£-тирозина (т.пл. 120-121 °С, [а]д - 60°(с 0.4; СНСЬ), А'-капроил-Z-пролил-Х-тирозина (т.пл. 44-52 °С, - 33° (с 0.4; СНС13), Аг-капроил-1-пролина, ([а]™ -50° (с 0.4; ДМФА) и таблеточную лекарственную форму, предоставленные отделом химии и опытно-технологическим отделом НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН.

Хромато-масс-спектрометрия.

ГХ-МС. Дилепт и его метаболиты определяли методом ГХ-МС в виде ТМС-производных, которые анализировали на газовом хроматхлрафе Trace GC Ultra с автоматическим вводом проб TriPlusAS, в сочетании с квадрупольным масс-спектрометром модели DSQ II (Thermo Finnigan, США). Газохроматографическое разделение соединений проводили на капиллярной колонке Restek RTX-lms (12 м х 0.2 мм х 0.33 мкм) с использованием температурного градиента: начальная температура 120 °С, 2 мин изотерма, далее подъем температуры со скоростью 20 °С/мин до 310 °С, изотерма 5.5 мин. Гелий подавали со скоростью 0.6 мл/мин, температура источника ионизации составляла 230 °С. Аналиты детектировали в двух режимах - сканирование полного ионного тока (диапазон масс - 50-500 а.е.м., скорость сканирования - 4.5 скан/сек) и селективный ионный мониторинг (СИМ).

ВЭЖХ-МС. В биологических образцах дилепт и его метаболиты определяли методом ВЭЖХ-МС с использованием системы Agilent 1100 Series LC-MSD Trap "SL" (Agilent Technologies, США) с автоматическим вводом проб. Хроматографическое разделение было проведено на аналитической колонке Zorbax SB-C18 (2.1 мм х 150 мм, I.D. 5 мкм) (Agilent Technologies, США). Напряжение на капилляре составляло 3500 В. В качестве осушающего и распыляющего газа использовали азот, со скоростью 9 л/мин, при

давлении 2.07 бар, температура в источнике конов (ИЭР) составляла 350 °С. Градуировочяая зависимость для дилепта, ДГ-капроил-£-пролил-2,-тирозина и JV-капроил-¿-пролина получена для пяти концентраций (п=10) методом добавок стандартных растворов этих веществ в биологические образцы; количества исследуемых веществ определяли по методу внутреннего стандарта (Ы-валерип-Ь-пролил-Ь-тирозина). Предел количественного определения (S/N=10) дилепта, Ml и М2 составил 1, 1 и 40 нг/мл соответственно. Относительная погрешность измерений при этом не превышала 10 %.

Фармакокипетику и метаболизм дилепта изучали после в/в или п/о введения в дозах 10 мг/кг и 200 мг/кг соответственно. Препарат вводили внутрь в виде водной суспензии субстанции дилепта и таблеточной массы с твином-80 с помощью зонда, в объеме до 2-х мл. Крыс декапитировали через дискретные интервалы времени. Для исследования брали кровь опытных животных после введения дилепта, а также контрольных животных, после введения физиологического раствора натрия хлорида. Кровь отбирали в предварительно охлажденные гепаринизированные пробирки. Плазму получали центрифугированием (4000 об/мин, 10 мин, Т = -4°С). Белки осаждали ех tempore ацетонитрилом (1:2) и повторно центрифугировали. Очистку плазмы от сопутствующих соединений проводили экстракцией гексаном в соотношении 1:2 (vortex, 5 мин), центрифугировали для разделения слоев и гексановый слой отбрасывали. Экстракцию дилепта и его основных метаболитов осуществляли хлороформом в присутствии 0.7 % уксусной кислоты. После центрифугирования (2500 об./мин, 5 мин, 20 °С) органический слой отбирали и высушивали в токе азота. Сухой остаток перерастворяли в 100 мкл метанола и анализировали методом ВЭЖХ-МС/МС.

Проникновение дилепта и его активного метаболита Ml через ГЭБ исследовали после п/о введения крысам таблеточной массы в дозах 40 и 200 мг/кг. Контрольным животным вводили внутрь водную нагрузку в объеме 2 мл дистиллированной воды. Декапитацшо контрольных и опытных крыс проводили через 15 мин и 4 часа после введения. Мозг промывали охлажденной дистиллированной водой, просушивали фильтровальной бумагой, взвешивали и гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе в течение 1 мин в дистиллированной воде в отношении 1:3. Белки осаждали ex tempore добавлением 1-кратного объема ацетонитрила и центрифугировали (4000 об/мин, 10 мин, Т = 20 °С). Дальнейшие процедуры проводились аналогично тому, как указано для плазмы крови.

Для изучения экскреции контрольным крысам вводили водную нагрузку два раза в день в объеме 2 мл дистиллированной воды, опытным крысам в таком же объеме вводили водный раствор субстанции дилепта в дозе 200 мг/кг однократно. Животных

помещали в индивидуальные метаболические клетки и собирали суточную мочу. После измерения общего объема мочи, ее отфильтровывали через бумажный фильтр и 2.5 мл мочи отбирали для проведения анализа. Для оценки возможности связывания дилепта и его метаболитов с эндогенными субстратами биологических образцов к другой порции мочи (2.5 мл) добавляли фермент ß-глюкуронидазу в количестве 3000 ед. на 1.0 мл. Контрольные и опытные образцы мочи инкубировали в течение 12 часов при Т = 37 °С. Для проведения анализа методом ВЭЖХ-МС брали 2.5 мл суточной мочи крыс. Дальнейшую подготовку биологических проб проводили как указано для плазмы крови.

Изучение биологической стабильности дилепта проводилось в опытах in vitro с плазмой крови крыс и человека. Устойчивость дилепта к ферментам плазмы крови крыс изучали по образованию продукта его биотрансформации после добавления различных доз дилепта к плазме контрольных животных. Образцы крови человека получали от здоровых добровольцев, которые были проинформированы о целях эксперимента. Для определения устойчивости дилепта к деградации ферментами плазмы крови человека в физиологических условиях образцы плазмы с добавкой дилепта инкубировали при Т = 37 'С в течение 0, 15, 45 и 60 мин. Обработку биологических образцов проводили, как указано ранее для плазмы крови крыс.

Статистический анализ полученных результатов. Полученные экспериментальные данные были подвергнуты математической и статистической обработки с помощью программы Excel v.7. Поскольку на каждую временную точку использовали по 6-9 животных, результирующая фармакокинетическая кривая была построена по усредненным концентрациям, поэтому при расчете фармакокинетических параметров отсутствует статистическая обработка результатов. На рисунках представлены средние значения хср ±SD.

Расчет основных фармакокинетических параметров дилепта и его метаболитов проводили на основапии полученных экспериментальных данных модельно-независимым методом статистических моментов (Агафонов A.A. и др., 1991). Были рассчитаны следующие фармакокинетические параметры дилепта и его основных идентифицированных метаболитов:

Со (нг/мл, мкг/мл) - концентрация лекарственного вещества в плазме крови после внутривенного введения в нулевой момент времени;

Смаке (нг/мл, мкг/мл) - максимальная концентрация лекарственного вещества в плазме крови после перорального введения;

Тмакс (ч, мин) - время достижения максимальной концентрации лекарственного соединения после перорального введения;

Скис/AUС (ч1)- параметр, характеризующий скорость всасывания в системный кровоток; Kei (ч"1) - константа элиминации, параметр, характеризующий скорость выведения лекарственного вещества из организма;

Tmei (ч) - период, за который выводится половина введенной и всосавшейся дозы лекарственного вещества;

CLP (л/ч) - клиренс плазменный, показатель скорости очищения плазмы крови от лекарственного соединения;

MRT (ч) - среднее время пребывания лекарственного вещества в организме; Vd (л) - объем распределения жидкостей организма, необходимый для равномерного распределения всего количества данного вещества в концентрации, равной его концентрации в плазме крови;

МАТ (мин, ч) - среднее время всасывания лекарственного соединения в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) после перорального введения.

Расчет среднего времени всасывания проводили по формуле: МАТ = MRTp. о. - M RTL v. AUCo^, - нг/мл x ч, мкг/мл х ч - площадь под фармакокинетической кривой (площадь под кривой «концентрация лекарственного вещества - время») после внутривенного и перорального введения. AUC о-» рассчитывается от момента введения до бесконечности времени;

AUCi.v.,0-1» - площадь под фармакокинетической кривой после внутривенного введения субстанции лекарственного вещества;

Fa6c(%) - абсолютная биодоступность лекарственного вещества (субстанции), расчет

, AUC р.о.х Dose t. v. .. -л~„,

проводили по формуле:——т-х 100%,

г AUC i.V. х Dose р.о.

где AUCP.0. - площадь под фармакокинетической кривой после перорального введения субстанции лекарственного вещества;

Dose р,0 - доза дилепта при пероральном введении субстанции; Dose ¡.v. - доза дилепта при в/в введении субстанции;

Fcm,.(%) - относительная биодоступность (таблеток) лекарственного вещества

„ . AUCp.o.(tabl) х Dose p.o.(tabl)

рассчитывалась по формуле : ———-—-——-г—— х 100%, где

AUCp.0(tabi) и AUCp.o.(subst) - площади под фармакокинетическими кривыми после перорального введения таблеток и субстанции дилепта соответственно; Dose р.о.(аы)- доза дилепта после перорального введения таблеток; Dose р.о. (¡¡цып доза дилепта после перорального введения субстанции.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Методы хромато-масс-спектрометрического анализа

Исходя из струпуры дилепта и опираясь на литературные данные по метаболизму алкиловых эфиров замещенных пептидов (Lee V. et. al., 2004; Zhang K.E. et. al., 2001), в качестве основных возможных метаболитов были предположены Л'-капроил-Л-пролил-£-тирозин (Ml) и Лг-капроил-Х-пролин (М2).

Капроновая кислота (МЗ)

Ы-капроил-Ь-пролин (М2) О

^-у^ОК Пролин (M4J

Тидрокаииро8ание алифатической цепи и бензольного калщл

CHj

Н-капроил-Ь-пралил-Ъ-тирозина мепаиодый эфир (Дилепт)

СНг

N'KanpoUA-L-ttpOMU-L-mt{p03UH (Ml)

тт

rV-NH-^"3 СУ-т-г&н

" V"> U CHj

Ъ'Пралил-Ъ-тирозина метиловый эфир (МЗ)

и .CHl HjN-pJLo

CH,

Ь'Пролил-1-тирозин Шб)

HjN-J-Ü-OI CH¡

L'тирозина метиловый эфир (М7) ¿н ¿н L-mwpMim (MS)

Рисунок 1. Предполагаемый метаболизм дилепта.

Основополагающим этапом успешного проведения исследований фармакокинетики пептидных препаратов является разработка высокочувствительного и специфичного аналитического метода для определения пептида и продуктов его метаболизма в связи с их невысокими концентрациями в крови, вследствие их быстрого метаболизма и превращения в эндогенные продукты. Для этих целей нами были разработаны два подхода к определению дилепта и его основных метаболитов методами хромато-масс-спектрометрии с использованием ГХ-МС и ВЭЖХ-МС методов.

Дилепт и его биопроизводные представляют собой нестабильные нелетучие соединения, их определение методом ГХ-МС целесообразно проводить в виде ТМС-производных. Аналиты детектировали в двух режимах - сканирование полного ионного тока и селективный ионный мониторинг, который осуществлялся по характеристичным

ионам, представляющим собой основные фрагменты молекул ТМС-производных дилепта и его метаболитов (табл. 1). Предел детектирования определяемых соединений данным методом был неудовлетворительным. Кроме того, введение дополнительной стадии дериватизации может привносить систематические и несистематические погрешности в анализ, что затруднит как интерпретацию полученных масс-спектральных данных, так и их количественную обработку.

ВЭЖХ-МС/МС в режиме регистрации отрицательных ионов (-)-ИЭР показал наилучшую чувствительность для дилепта и его метаболитов, предел детектирования метода находился на уровне 0.5-10.0 нг/мл. Переход в режим регистрации положительного ионного тока (+)-ИЭР приводил к значительному падению чувствительности метода. Более того, МС/МС спектры дилепта и его метаболита М1, полученные в режиме (+)-ИЭР, являются идентичными и не представляется возможным выделить специфичные характеристичные ионы для идентификации этих соединений (табл. 1).

Таблица 1. Времена удерживания (ЯТ), характеристичные ионы и пределы обнаружения дилепта и его метаболитов, полученные различными методами.

Высокоэффективная жидкостная хроматография - масс-спектрометрия

C5HnC(0)Pro-Tyr-ОСНз. дилепт CsHцС(0)Рго- Туг-СООН, метаболит М1 С5НцС(0)Рго, метаболит М2

Mw 390 пд, 376 ПД нг/мл 213 ПД нг/мл

RT 10.4 иг/мл 9.8 9.9

ИЭР (-) MC 389,435 7.5 375 5 212 100

MC2 283,251, 185,153 : 0.5 331,277,233, 225,113 0.5 168, 114 10

ИЭР (+) MC 391,196 1500 377,196 1200 214,196 4000

MC2 359,331, 196,168 100 359,331, 196, 168 100 196,168, 158, 141, 116, 70 400

Газовая хроматография - масс-спектрометрия

Дилепт, ОТМС М1, бис-ОТМС М2, ОТМС

RT 11.4 ИД нг/мл 11.6 ИД нг/мл 6.4 11Д нг/мл

М+ 462 520 285

[М-15Г 447 505 270

MC 250,179,285, 196,168,70 50 308, 179,293,2 85, 75 70, 168,270 500

СИМ 25 196,168,70 50 120

Таким образом, было показано, что метод ВЭЖХ-МС/МС в режиме регистрации отрицательных ионов является оптимальным для анализа дилепта и его метаболитов.

Данный метод был применен к исследованию метаболизма и экспериментальной фармакокинетики потенциального нейролептика.

Изучение биологической стабильности дилепта в модельных опытах.

В связи с тем, что дилепт по своей структуре близок к эндогенным соединениям, необходимо было изучить его устойчивость в плазме крови экспериментальных животных и человека. Обнаружено, что дилепт при добавлении к плазме крови крыс образует метаболит - Л'-капроил-/,-иролил-£-тирозин (М1), который является следствием ферментативного гидролиза эфирной связи. Изучение зависимости образования деметилированного метаболита дилепта Л'-капроил-1-пролил-Х-тирозина от добавленной дозы дилепта в плазму крови крыс показало, что после добавления дилепта в дозе 50 мкг/мл и выше кривая, отражающая эту зависимость, образует плато, что может свидетельствовать о процессе насыщения ферментов, гидролизующих метальную группу дилепта. В этой дозе детектируется и неизмененный дилепт, количество которого затем увеличивается (рис.2).

С,НН7МП

100

10

Рисунок 2. Зависимость образования метаболита дилепта Ml (по оси ординат) от дозы дилепта (по оси абсцисс), добавленного in vitro к плазме крови крысы (n=8, Xcp±SD).

20 40

60

С, нг/ыл a) moo

80 100 Доза, мкг

Дилепт

С,нг/мл

б) 100

МетзболитМ!

40 50

Время, мин

40 50 60 Время, ыин

Рисунок 3. Изменение скорости деградации дилепта (а) и образования метаболита дилепта - М-калроил-Ь-пролил-Ь-тирозина (б) в плазме крови человека в зависимости от времени инкубации (Т=37°С). На рисунке представлены средние значения Хср±80, п=8. По оси абсцисс - время инкубации, мин. По оси ординат - концентрация дилепта и метаболита М1 в плазме крови крыс, нг/мл.

При добавлении дилепта к плазме крови человека «ex tempore» образования деметилированного метаболита дилепта не наблюдалось. В физиологических условиях при инкубации (Т=37°С) образование деметилированного метаболита происходит гораздо менее интенсивно по сравнению с плазмой крови крыс. Через 1 час после инкубации доля метаболита относительно исходного соединения составляла менее 10%. Быстрая деградация дипептида у крыс объясняется высокой активностью ферментных систем плазмы крови грызунов. Из литературных источников известно, что степень гидролиза алифатических эфиров уменьшается в ряду крыса > кролик > собака > человек. Плазма крови грызунов содержит некоторые алифатические эстеразы, которые не являются характерными для плазмы крови человека (Hu L., 2004).

Изучение биологической стабильности дилепта в опытах in vivo.

Метод ВЭЖХ-(-)ИЭР-МС/МС был применен для анализа экстрактов плазмы крови крыс, полученной через 15 минут после различных способов введения субстанции. На рис. 4 представлены МС/МС-хроматограммы плазмы крови крыс, полученные после перорального введения субстанции в дозе 200 мг/кг, прописанные по характеристичным ионам дилепта и его метаболитов. Идентификация метаболитов дилепта основывалась на анализе их времен удерживания и (-)ИЭР-МС и (-)ИЭР-МС/МС спектров (рис. 4). Пик неизмененного дилепта (m/z 389) имеегт время удерживания 10.4 мин, пики деметилированного метаболита с m/z 375 (Л'-капроил-Х-пролил-Х-тирозин, Ml) и метаболита, образующегося в результате гидролиза дилепта по пептидной связи с т/г 212 (А'-калроил-Х-пролин, М2), имеют близкие времена удерживания - 9.8 мин и 9.9 мин. В результате фрагментации депротонировапной молекулы Ml образуется серия ионов, которые отличаются на 14 а.е.м. от соответствующих пиков в МС/МС спектре дилепта (283—>269, 291—»277, 185->171). (-)-ИЭР МС/МС-спектр А'-капроил-Х-пролина, содержащегося в образце плазмы крови крысы, представлен только одним фрагментным ионом с m/z 114. Структуры дилепта и его метаболитов были подтверждены сопоставлением времен удерживания и характерных МС/МС-спектров со стандартами-свидетелями, полученными методом встречного синтеза в отделе химии НИИ фармакологии им В.В. Закусова РАМН (табл. 1).

Таким образом установлено, что после системного введения дилепта в организм крыс независимо от способа введения - внутривенного либо перорального, основными метаболитами дилепта являются А'-капроил-Х-пролил-Х-тирозин и А-капроил-Х-пролин. Как и в модельных опытах с плазмой крови крыс дилепт быстро деградирует с образованием деметилированного метаболита под влиянием эстераз крови грызунов, что находится в соответствии с литературными данными о высокой активности этих

ферментов у крыс. В отличие от опытов, проведенных in vitro, in vivo образуется также и второй метаболит, который является следствием гидролитического расщеплепия пептидной связи дилепта. Полученные результаты исследования могут иметь важное значение при переносе данных по метаболизму дилепта с животных на человека.

Экспериментальная фармакокинетика дилепта после внутривенного введепия. На рисунке 5 представлена фармакокинетическая кривая дилепта в плазме крови крыс после внутривенного введения водной суспензии субстанции дилепта с твином-80 в дозе 10мг/кг.

Дилепт, Ы-капроил-1.-пралил-1.-тирозина метиловый эфир

NL5.75E3

'•*100 RT: 10.33 m/z=282.50-283.50

5t> 0

ТП Г 12 14 Tims (min)

М2, Ы-капрочл-1-пролин

100 5Í 0 £

NL3.07E6 RT: 9.89 miz- 113.50-114.50

L

10 12

MI

14 Time (min)

;

С : 124 153 185 I i 251 I, 345

100 50. 0

I65

212

100 200 300

M1, N-Kanpoün-Lsnponun-L-mupo3UH

400 m/2 100 150 200

ВС, N~eanepun-L-nponun-L-mupQ3UH

I ! I I I I 250 300 m/z

l,%

100, 50:

o:

RT: 9.80

NL5.05E5 fll/z=276.50-277.50

100 50; 0 :

I I I ¡ I I I . 6 8

J13163

"'11)11 10 12

14 Time (mln)

100

331 ,7.

300

10СЦ

50. 0

100. 50j

0:

400 m/z

NL3.76E3 m/z= 276.50-277.50

*r-r I . I-I I n 10 12 14 Time(min)

277

233 163 211 |

317 I 361

300

400 m/z

Рисунок 4. Масс-хроматограмма по выделенным ионам дилепта (m/z 389), Ml (m/z 375) и М2 (m/z 212) образца плазмы крови крыс, полученной через 15 минут после пероралыюго введения дилепта в дозе 200 мг/кг.

После внутривенного введения дилепт относительно быстро элиминирует из плазмы крови крыс: через полчаса концентрация дилепта в плазме крови крыс составляет

73 нг/мл. Снижение концентрации потенциального антипсихотика носит выраженный

двухфазный характер (рис. 5). На основании полученных экспериментальных данных

рассчитаны основные фармакокинетические параметры дилепта, которые представлены в

табл. 2.

С. нг/мч 1000

Рисунок 5. Фармакокинетическая кривая дилепта в плазме крови крыс после однократного внутривенного введения в дозе 10 мг/кг (п=б; Хср±8Б).

ю ---—...................

з 10 15 10 25 ¡о

Время, кош

Таблица 2. Основные фармакокинетические параметры дилепта в плазме крови крыс после внутривенного введения в дозе 10 мг/кг

Параметры, размерность

Со, нг/мл АиС, нг/мл X ч СЬР, л/ч К«1, ч"1 Т 'Л, ч МКТ, ч Ус, л/кг

1051 121.720 82.160 4.147 0.167 0.217 8.942

После внутривенного введения дилепта период полувыведения имеет невысокое значение и равен 10 мин. Однако, этот параметр существенно превышает зарегистрированный для самого нейротензина (период полужизни 30 сек) (Агогшг N. е1. а1., 1982) и близок определенному для его гексапептидных дериватов (МасЫёа Я. е1. а1., 1993; Оагаа-Оагауоа Е. е1. а1., 2002). Относительно быстрый метаболизм дилепта подтверждают также высокое значение величины СЬР - 82.16 л. Величина кажущегося объема распределения - 8.94 л/кг значительно превосходит реальный объем жидкости в организме крысы - 0.67 л/кг, что свидетельствует либо об его возможном распределении во внутренних органах и тканях, либо также указывает на выраженный метаболизм дилепта. Быстрое исчезновение дипептидного антипсихотика из организма крыс характеризуется также и другими величинами фармакокинетических параметров: константа элиминации (Ке!) составляет 4.147 ч"1, а среднее время удерживания дилепта в организме (МЯТ) составляет 0.22 ч.

Фармакокннетика дплепта после перорального введения субстанции и таблеток.

На рис. 6 представлены кинетические кривые неизмененного дилепта в плазме крови крыс после перорального введения водной суспензии субстанции и таблеточной массы дилепта в дозе 200 мг/кг. После перорального введения субстанции дилепта его максимальная концентрация определяется через 15 мин и составляет 8.0 нг/мл. Благодаря высокой чувствительности метода ВЭЖХ-МС/МС удалось провести исследование кинетики дилепта в течение 2 часов. Такие низкие концентрации дилепта в плазме при пероральном способе введения могут зависеть от нескольких факторов. Во-первых, дилепт подвергается системной биотрансформации при попадании в кровоток грызунов, во-вторых, вследствие ограниченного всасывания большинства пептидов в желудочно-кишечном тракте крыс, и, в-третьих, от его интенсивного метаболизма в результате «эффекта первого прохождения через печень». Однако, исходя из литературных данных о том, что дипептиды хорошо всасываются в ЖКТ (Daniel Н., 2005) можно полагать, что низкие концентрации дилепта в данном случае связаны с интенсивной элиминацией дилепта в результате «first-pass» метаболизма.

Рисунок 6. Фармакокинетические кривые дилепта в плазме крови крыс после введения суспензии с твином-80 субстанции и таблеточной массы дилепта в дозе 200 мг/кг (п=6; Хср±80).

Время, мин

Таблица 3. Основные фармакокинетические параметры дилепта в плазме крови крыс после введения субстанции и таблеточной массы дилепта в дозе 200 мг/кг.

Параметр, размерность

Дилепт Смаке, нг/мл Тмак, мин AUC о-«, CI ро, Kci, Т Vi нг/мл х ч л/ч ч"1 мин МКТро.ч Vz„ji F, %

субстанция 8.5 15 2.5 80502 1.5 27 0.7 52968 0.1 (абс)

таблетки 20 10 3.0 65786 5.4 8 0.3 12231 122 (отн)

При сравнении экспериментальных данных по кинетике субстанции и таблеточной массы дилепта различия установлены в основном на фазе всасывания: при введении таблеточной массы увеличивается значение максимальной концентрации (Смаке) и уменьшается величина времени её достижения (Тмакс). На основании полученных данных рассчитаны основные фармакокинетические параметры субстанции и таблеточной массы дилепта в плазме крови крыс (табл. 3).

Сопоставление фармакокинетических параметров дилепта после его внутривенного и перорального введения (табл. 2 и 3) показывает, что при введении субстанции внутрь величина AUC значительно уменьшается. Для характеристики фазы абсорбции субстанции дилепта рассчитана величина МАТ - среднее время абсорбции, составившая 0.52 ч, свидетельствующая о достаточно быстрой абсорбции субстанции дилепта в ЖКТ. Однако, степень всасывания препарата, оцениваемая по величине AUC, невелика и составляет 2.48 нг /мл х ч.

Рассчитанная по соотношению AUC после перорального и внутривенного введения, при приведении к одной дозе, величина абсолютной биодоступности субстанции составила 0.1%. Столь низкое значение величины абсолютной биодоступности связано, по-видимому, в большей степени с интенсивным процессом биотрансформации препарата после его перорального введения и образованием при этом активного метаболита М1 и метаболита М2. Именно образование значительных количеств активного метаболита дилепта М1 при его пероральном введении позволяет рекомендовать этот «нетрадиционный» для пептидов путь введения применительно к дилепту.

После введения таблеточной массы дилепта (табл. 3) фармакокинетические параметры изменяются: так, на 19% снижается величина клиренса, уменьшаются величины Ti/2, MRT и объема распределения; при этом величина AUC увеличивается на 22%. Рассчитанная величина относительной биодоступности таблеток составляет 122%. После введения таблеточной массы дилепта увеличиваются величины CNa« и AUC, что связано с лучшей и более полной его абсорбцией из таблеток в ЖКТ. Дилепт при пероральном введении в виде таблетоточной массы поступает в большей концентрации в системный кровоток, что обусловливает увеличение его биодоступности.

Изучение фармакокинетикп метаболитов дилепта, обнаруженных в плазме крови крыс, после введения субстанции и таблеточной массы дилепта.

На рисунке 7 представлены фармакокинетические кривые М1 в плазме крови крыс после однократного перорального введения субстанции и таблеточной массы дилепта в дозе 200 мг/кг. Показано, метаболит быстро обнаруживается в плазме крови крыс: уже

через 5 мин после введения субстанции его концентрация составляет 98.9 нг/мл. Максимальная концентрация метаболита - 139.3 нг/мл определяется через 10 мин после введения дилепта.

Концентрации Лг-капроил-£-пролил-1-тирозяна значительно превосходят концентрации неизмененного дилепта, что подтверждает предположение о интенсивном метаболизме дилепта в процессе всасывания в ЖКТ. Метаболит медленнее элиминирует из плазмы крови крыс, чем исходное соединение, и его наличие в плазме прослеживается до 4 часов. После введения дилепта в виде таблеточной массы Смакс и концентрация № капроил-Л-пролил-1-тирозина во все последующие интервалы времени меньше по сравнению с его количественным содержанием после введения субстанции. Этот факт свидетельствует о том, что входящие в состав таблеточной массы вспомогательные вещества в определенной степени защищают дилепт от ферментативной деградации.

В табл. 4 представлены основные фармакокииетические параметры М1 после пероралыюго введения дилепта в виде суспензии с твином-80 субстанции и таблеток. После введения таблеточной массы степень образования метаболита М1, рассчитанная по соотношению величин АИС неизмененного дилепта и АиС М1, уменьшается в 5.45 раза.

Второй метаболит, идентифицированный методом ВЭЖХ-МС/МС, это А'-капрошт-¿-пролин (М2); его фармакокииетические параметры представлены на рис. 7 и в табл. 4. Метаболит М2 быстро появляется в плазме крови крыс в концентрациях, превосходящих таковые для М1 при введении дилепта как в виде субстанции, так и таблеточной массы. Максимальная концентрация М2 достигается в обоих случаях через 1 час после введения; М2 медленнее элиминирует из плазмы крови, чем М1. После введения таблеточной массы дилепта значения концентрации метаболита М2 во все исследуемые интервалы времени были ниже, чем при введении субстанции.

С, нг/мл

10000 ■ 1 -| М2

«_ Д ^ 1 М21аы

1000 • Гу

—________

М1

10 -I-,-,-,-- . , М1,"Ы

0 50 100 150 200 250 300 Время, мнн

Рисунок 7. Фармакокииетические кривые метаболитов М1 и М2 в плазме крови крыс после пероралыюго введения суспензии с твином-80 субстанции и таблеточной массы дилепта в дозе 200 мг/кг (п=8; Хср±30).

Mljubsr - MI после пероралыюго введения субстации дилепта в дозе 200 мг/кг

М1!аы - MI после пероралыюго введения таблеточной массы в дозе 200 мг/кг

М2яья - М2 после перорального введения субстации дилепта в дозе 200 мг/кг

M2Bbi - М2 после перорального введения таблеточной массы в дозе 200 мг/кг

Таблица 4. Основные фармакокииетические параметры основных метаболитов дилепта в плазме крови крыс после введения субстанции и таблеточной массы дилепта в дозе 200 мг/кг дилепта.

Параметр, размерность

Смаке, нг/млхч Тмакс, мин АиОкмо, нг/млхч Ке1, ч-1 Т'/2, ч (мин)

А-капроил-Л-пролил-!-тирозин, метаболит М1

Субстанция 506.6 20 1047.316 0.33 2.089

Таблетки 188.0 10 191.905 0.54 1.284

А-кап роил-£-пролпн, метаболит М2

Субстанция 22.77 60 61.168 0.0966 7.176

Таблетки 7.046 60 13.438 0.2411 2.875

После введения таблеточной массы в сравнении с субстанцией величина Смаке метаболита М2 в плазме крови уменьшается в 3 раза. Увеличивается К^ и соответственно значительно уменьшается Т]д. Степень образования метаболита М2, рассчитанная по соотношению величин А11С неизмененного дилепта и АЬ'С М2, уменьшается после введения таблеток в 4.17 раза.

В целом изучение метаболизма дилепта при пероральном введении субстанции и лекарственной формы дилепта дают основания полагать, что вспомогательные вещества, использованные при приготовлении таблеток, замедляют метаболизм дилепта. Данные фармакокинетических исследований согласуются с результатами фармакологического изучения дилепта на модели препульсового торможения. В условиях перорального введения показано не только сохранение эффектов дилепта, но и его более высокая эффективность в таблетках (Островская Р.У. и др., 2009). В экспериментальных тестах на выявление антипсихотической активности эффективными оказались дилепт и деметилированный метаболит М1 (Гузеватых Л.С. и др., 2002), поэтому нами была изучена пособность проникать в мозг не только самого замещенного дипептида, но и его активного метаболита М1.

Изучение проникновения дилепта и его активного метаболита - ГЧ-капроил-Ь-нролил-Ь-тирозина через гематоэнцефалическнп барьер.

На рис. 8 представлены результаты количественного определения содержания дилепта и его активного метаболита М1 в мозге и плазме крови крыс через 15 мин после введения таблеточной массы дилепта в дозе 200 мг/кг. Коэффициент распределения мозг/плазма (КМОзг/шшма) составляет в среднем 2.0 для дилепта и 0.5 для метаболита М1.

Эксперименты, проведенные с различными дозами дилепта, показали, что содержание дипептидного антипсихотика и его активного метаболита М1 не зависят от введенной дозы дилепта. Отсутствие дозовой зависимости может быть связано с наличием специфических переносчиков через ГЭБ, связывание которых с субстратом ограничено (УатавЫга Т., 1997). С. другой стороны, большое значение коэффициента распределения может так же указывать на то, что транспорт дилепта через ГЭБ может быть так же реализован по механизму свободной диффузии.

С, нг/мл 100,0 1

я Содержание дилепта и его активного метаболита М1 в мозге крыс

к Содержание дилепта и его активного метаболита М1 в плазме крыс

Дилепт Метаболит М1

Рисунок 8. Проникновение дилепта и его активного метаболита - ЛР- капроил-1-пролил-1-тирозина через ГЭБ. Образцы получены через 15 мин после перорального введения таблеточной массы дилепта в дозе 200 мг/кг.

Изучение экскреции дилепта и его метаболитов с мочой крыс.

При изучении экскреции дилепта было показано, что он экскретируется с мочой крыс в виде основных метаболитов. Методом ВЭЖХ-МС/МС были идентифицированы продукты его биотрансформации: М-капроил-1-пролин-1-тирозин и АГ-капроил-1-пролин. Другие продукты биотрансформации дилепта разработанным методом нами обнаружены не были. Метаболит М2, Л^-капроил-1-пролин, определяется в количестве 0.04 ± 0.0072 % от введенной дозы дилепта. После ферментативного гидролиза с р-глюкуронидазой количество метаболита М2 в моче составило 0.1% от введенной дозы. Содержание метаболита М1 Л^-капроил-Х-прояил-Х-тирозина в суточной моче крыс составляет менее 0.005 % от дозы. В неизмененном виде дилепт в моче крыс не обнаруживался. Чрезвычайно низкое содержание основных метаболитов дилепта относительно исходной дозы дилепта, отсутствие самого неизмененного соединения, а также другие результаты по изучению фармакокинетики и биотрансформации дилепта дают основания полагать, что основное количество введенной дозы препарата экскретируется в виде эндогенных соединений - амино- и карбоксикислот.

Анализ полученных результатов изучения фармакокинетики и биотрансформации дилепта и их сопоставление с имеющимися литературными данными о уже внедренных препаратах-олигопептидах показывает, что необходимым и основополагающим этапом успешного проведения этих исследований является разработка высокочувствительного и специфичного метода количественного определения пептида и продуктов его метаболизма в связи с их невысокими концентрациями в крови вследствие быстрого метаболизма и превращения в эндогенные продукты после системного введения. Применение высокочувствительного хромато-масс-спектрометрического анализа позволило провести исследование фармакокинетики дилепта после перорального введения и с высокой степенью достоверности идентифицировать структуру метаболитов дилепта.

Анализируя результаты в целом, можно заключить, что дилепт, дипептидное производное нейротензина, характеризуется низкими значениями абсолютной биодоступности вследствие интенсивной системной биотрансформации. В тоже время дилепт характеризуется значительно более высокой стабильностью, чем исходный тридекапептид. Если сам НТ проявляет эффекты лишь при внутримозговом введении, то дилепт эффективен в условиях внутрибрюшинного и, что наиболее важно, перорального введения.

Дилепт метаболизирует в организме с образованием метаболитов: активного метаболита Л'-капроил-Х-пролил-Х-тирозина (М1) и //-капроил-Х-пролииа (М2), которые определяются в плазме крови более 4-х часов. Важно подчеркнуть, что предложенная для приготовления таблеток комбинация вспомогательных средств существенно замедляет метаболизм дилепта, при этом его фармакологическая активность увеличивается (Островская Р.У. и др., 2009).

Дилепт и его метаболит М1 проникают через гематоэнцефалический барьер и характеризуются близкими значениями антипсихотической активности. Этот факт делает очевидным перспективу фармакологических и фармакокинетических исследований ЛГ-капроил-Х-пролил-Х-тирозина. Кроме того, образование значительных количеств активного метаболита дилепта М1 при его пероральном введении позволило рекомендовать этот «нетрадиционный» путь введения для пептидов применительно к дилепту. Вместе с тем для улучшения системной доставки дилепта в мозг перспективным направлением является разработка лекарственных форм для альтернативных способов введения, минуя печень.

Полученные результаты исследования экспериментальной фармакокинетики и основных направлений биотрансформации дилепта будут в дальнейшем способствовать созданию оптимальной лекарственной формы. Кроме того, эти данные будут иметь практическую значимость при переносе полученных результатов с животных на человека на этапе клинических испытаний при расчете тестовой дозы препарата и разработке рациональной и эффективной схемы его практического применения.

Выводы:

1. Разработана высокочувствительная и селективная методика определения дилепта и его предполагаемых метаболитов в биологическом материале с использованием метода ВЭЖХ в сочетании с тандемной масс-спектрометрией.

2. В модельных опытах выявлены различия в активности эстераз крысы и человека. Дилепт не устойчив в плазме крови крыс и устойчив в плазме крови человека.

3. Основным путем элиминации дилепта является биотрансформация, в результате которой образуются два метаболита - А'-капроил-Х-пролил-Х-тирозии (М1) и № капроил-1-пролин (М2).

4. Фармакокинетика дилепта и его метаболитов различна для таблеток и субстанции фармакологического препарата. После перорального введения таблеток дилепта в значительной степени снижается интенсивность образования его метаболитов и увеличивается содержание неизмененного дилепта. Величина относительной биодоступности таблеточной лекарственной формы дилепта составила 122%.

5. Дилепт и его активный метаболит М1 обнаруживаются в тканях мозга. Коэффициент мозг/плазма составил 2.0 для дилепта и 0.5 для активного метаболита М-капроил-Ь-пролил-Ь-тирозина.

Список сокращений:

НТ - нейротснзин, ДА - допамин,

ЖКТ - желудочно - кишечный тракт, ГЭБ - гсматоэнцефалический барьер, ГХ-МС - газовая хроматография - масс-спектрометрия;

ВЭЖХ-МС/МС - высокоэффективная хроматография - тандемная масс-спектрометрия;

ИЭР - иониизация электрораспылением - тандемная масс-спектрометрия;

ТМС-триметилсилил,

ЭИ-электронная ионизация;

СИМ-селективный ионный мониторинг,

ГЩ - предел детектирования метода,

М1 - Л-капроил-1-пролил-1-тирозин;

М2 - Л'-капрэил-1-пролин.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Ус К.С., Снижение высвобождения глутамата - возможный механизм нейропротекторного действия оригинального антипсихотического средства дилепта [Текст] / Ус К.С., Клодт П.М., Кудрин B.C., Архипенко Н.В. (Месонжник), Т.А. Гудашева, Р.У. Островская // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2007. - Т. 70, № 3. - С. 3.

2. Бойко С.С., Применение метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимическим детектором для количественного определения нового нейролептика дилепта [Текст] / Бойко С.С., Архипенко Н.В. (Месонжник), Колыванов Г.Б., Жердев В.П., Островская Р.У. // Сборник материалов XIV российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 16-20 апреля 2007. - М., 2007. - С.801.

3. Архипенко Н.В. (Месонжник), Экспериментальная фармакокинетика нового оригинального дипептидного антипсихотика дилепта [Текст] / Архипенко Н.В. (Месонжник), Бойко С.С., Островская Р.У., Жердев В.П. // Сборник материалов III съезда фармакологов России «Фармакология - практическому здравоохранению», Санкт-Петербург, 23-27 сентября 2007. - С.-Пб., 2007. - С. 1591.

4. Архипенко Н.В. (Месонжник), Определение метаболитов нового оригинального дипептидного нейролептика дилепта в плазме крови крыс методом ВЭЖХ-МС/МС

[Текст] / Архипенко H.B. (Месонжник), Апполонова С.А., Бойко С.С., Колыванов Г.Б., Гудашева Т.А., Островская Р.У., Родченков Г.М., Середенин С.Б., Жердев В.Г1. // Сборник материалов симпозиума «Хроматография и хромато-масс-спектрометрия», Москва, 14-18 апреля, 2008. - М., 2008. - С. 98.

5. Месонжник Н.В., Абсолютная и относительная биодоступность антипсихотика дипептидной структуры дилепта [Текст] / Месонжник Н.В., Апполонова С.А., Бойко С.С., Родченков Г.М., Жердев В.П. // Сборник тезисов научно-практической конференции «Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины»,Москва, 27 - 28 ноября, 2008. - М., 2008. - С. 76.

6. Mcsonzhnik N.V., Investigation of pharmacokinetics and metabolism of a novel original neuroleptic dilept by Chromatography-Mass Spectrometry techniques. [Текст] / Mesonzhnik N.V., Appolonova S.A., Rodchenkov G.M., Boyko S.S., Grushevskaya L.N., Piatin B.M., Zherdev V.P. // Abstr. of 25th LC-MS Symposium, Montreux, Switzerland, 12-14 nov. -2008. - P. 4.

7. Архипенко H.B., (Месонжник). Разработка методов хромато-масс-спектрометрического определения нового оригинального антипсихотика дилепта [Текст] / Архипенко Н.В. (Месонжник), Апполонова С.А., Соболевский Т.Г., Родченков Г.М., Бойко С.С., Колыванов Г.Б., Бастрыгин Д.В., Жердев В.П. // Хим. - фарм. журн. - 2009. - Т. 43. - №5. - С.53.

8. Месонжник Н.В., Особенности фармакокинетики нового фармакологического препарата дипептидной структуры дилепта [Текст] / Месонжник Н.В., Бойко С.С., Апполонова С.А., Родченков Г.М., Жердев В.П. // Материалы ежегодной конференции «Фармация и общественное здоровье». - Екатеринбург, 2009. - С.63.

9. Жердев В.П., Экспериментальная фармакокинетика фармакологического препарата дилепт [Текст] / Жердев В.П., Бойко С.С., Месонжник Н.В., Апполонова С.А., Родченков Г.М., Островская Р.У., Гудашева Т.А., Середенин С.Б. // Экспер. и клин, фармакол. - 2009. - Т. 72., №3 - С.16.

Подписано в печать 23.06.2009 г.

Заказ № 18 Типография ООО "Медлайн-С" 125315, г. Москва, Ленинградский пр-т, д.78, Тел.(499)152-00-16 Тираж 100 шт.

Шизофрения - тяжелое психическое заболевание, распространенность которого, согласно различным статистическим данным, составляет от 0,1-1%. Проблема лечения шизофрении является одной из важнейших задач современной психиатрии.

Несмотря на достижения последних десятилетий, препараты, применяемые для лечения больных шизофренией, имеют ряд недостатков. Типичные нейролептики, блокирующие допаминовые (ДА) рецепторы, высоко эффективны в отношении продуктивной симптоматики, не эффективны в отношении негативной и к тому же вызывают экстрапирамидные нарушения. Атипичные нейролептики, блокирующие так же и 5НТ2а рецепторы, лишены-этих побочных эффектов, но имеют другие недостатки, в частности, они вызывают повышение артериального давления, ожирение, половые дисфункции, гематологические нарушения. Кроме того, значительная часть больных (до 25%) резистентна к действию известных нейролептиков. Указанные факты определяют продолжающиеся поиски высокоэффективных препаратов, лишенных побочных эффектов. Современные представления о шизофрении как мультимедиаторной патологии привлекают внимание к эндогенным нейропептидам как веществам, оказывающим модулирующее влияние на все медиаторные системы мозга. К настоящему времени установлена важная роль эндогенного нейропептида нейротензина (НТ) в патогенезе шизофрении. Тесная взаимосвязь НТ- и ДА-ергической систем, сходство профиля фармакологической активности НТ и антипсихотиков, дефицит НТ-системы у больных шизофренией и восстановление её основных параметров под влиянием терапии антипсихотиками позволили сформулировать гипотезу о роли этого тридекапептида как эндогенного нейролептика [1,2,3]. Тот факт, что сам НТ имеет низкую энзиматическую устойчивость и проявляет нейротропную активность только при непосредственном введении в мозг, побудил к активному поиску его агонистов, эффективных при системном введении. Этот поиск, ведущийся на основании модификации структуры активной части тридекапептида HTs-i3 , привел к созданию ряда гексапептидов [4].

Исходя из оригинальной гипотезы о возможности имитации биологических эффектов сложных эндогенных пептидов простейшими аналогами, воспроизводящими структуру их активного центра, и непептидного нейротропного препарата с соответствующей активностью, Т.А. Гудашева с сотрудниками (1998) создали ряд соединений, являющихся пептидомиметиками бета-поворотной структуры активного участка нейротензина (HTg-n)- В связи с тем, что последовательность Рго-Туг, составляет «головку» бета-поворотного фрагмента HT8i3, а так же имеет сходство со структурой атипичного нейролептика сульпирида, этот дипептид был взят за основу моделирования активных аналогов НТ [5,6,7]. Из серии N-ацил-пролил-тирозинов на основании наиболее выраженной активности и технологичности отобран для более детального изучения метиловый эфир N-капроил-£-пролил-£-тирозина (ГЗР-123, дилепт), продемонстрировавший нейролептическую активность в диапазоне доз 0.4-4.0 мг/кг при внутрибрюшинном введении и 4.0-8.0 мг/кг при перпероральном [8]. Этот трипептоидный аналог нейротензина не уступает по выраженности антипсихотического действия упомянутым гексапептидным аналогам НТ и существенно превышает непептидный прототип, сульпирид. При этом даже в дозах, превосходящих нейролептические в 250-500 раз, он не проявляет каталептогенного и седативного эффектов, что позволяет прогнозировать отсутствие экстрапирамидной симптоматики. Важными чертами, отличающими Дилепт от известных нейролептиков, является способность улучшать когнитивные функции и оказывать кейропротективное действие [9].

Проведение исследований фармакокинетики и метаболизма на экспериментальном этапе разработки нового лекарственного препарата является обязательным этапом для его дальнейшего продвижения в медицинскую практику. Проникновение лекарственного средства в ткани-мишени и поддержание там определенной концентрации зависит не только от введенной дозы, но и от определенных фармакокинетических закономерностей - степени и скорости всасывания, особенностей распределения, путей метаболизма и экскреции. При введении внутрь важное значение приобретает определение доли введенного препарата, поступающей в ткани-мишени или биологические жидкости, с которыми он в эти ткани транспортируется. При этом выясняется, какая часть препарата биотрансформируется, а какая попадает в системный кровоток в неизмененном виде. Изучение основных путей метаболизма исследуемого соединения позволяет идентифицировать и изучить фармакологическую активность метаболитов. Изучение абсолютной и относительной биодоступности препаратов и их лекарственных форм помогает выбрать оптимальный путь введения препарата и оценить качество лекарственной формы. Кроме того, фармако кинетические исследования позволяют оценить возможность и интенсивность проникновения лекарственного средства в орган-мишень.

Актуальность темы.

Изучение фармакокинетики и путей биотрансформации является необходимым этапом развития дилепта в качестве лекарственного препарата. Разработка аналитических методик для опредечения дилепта в биологическом материале сопряжена с изучением его физико-химических свойств. Все это является актуальным в связи с предполагаемым внедрением дилепта в клиническую практику.

Целью настоящего исследования является изучение фармакокинетики и биотрансформации дилепта в эксперименте.

Задачи исследования.

1. Разработать методики качественного и количественного определения дилепта в биологическом материале;

2. Изучить фармакокинетику дилепта после внутривенного и перперорального введения у крыс;

3. Изучить пути биотрансформации дилепта после внутрисосудистого и перперорального введения у крыс;

4. Оценить способность дилепта и его активного метаболита Ml к проникновению через гематоэнцефалический барьер;

5. Изучить фармакокинетику и определить относительную биологическую доступность таблетированной лекарственной формы дилепта в эксперименте;

6. Изучить пути экскреции дилепта из организма крыс после перорального введения.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработаны подходы для определения нового оригинального антипсихотика дилепта и его предполагаемых метаболитов с использованием ГХ-МС и ВЭЖХ-МС/МС в биоматериале. Показано, что оптимальным методом количественного анализа дилепта и его метаболитов является метод ВЭЖХ-МС/МС.

2. Установлены два пути биотрансформации дилепта: гидролиз эфирной и пептидной связи с образованием - ТУ-капроил-^-пролил-^-тирозина и N-капроил-£-пролина.

3. Выявлены различия в устойчивости дилепта к деградации эстеразами плазмы крови крысы и человека.

4. Дилепт и его активный метаболит Ml обнаруживаются в тканях мозга' после его перперорального введения. Коэффициент мозг/плазма составил 2.0 для дилепта и 0.5 для активного метаболита М-капроил-Ь-пролил-Ь-тирозина.

5. Выявлены различия во времени всасывания в системный кровоток после введения крысам таблеток и субстанции дилепта. Вспомогательные вещества, вводимые в таблетированную лекарственную форму, влияют на скорость и степень всасывания дилепта. Относительная биодоступность таблеток дилепта составила 120%.

Научная новизна работы.

Разработаны подходы для определения нового оригинального антипсихотика дилепта и его предполагаемых метаболитов с использованием ГХ-МС и ВЭЖХ-МС/МС в биоматериале. Впервые получены ИЭР-МС/МС спектры дилепта и его основных метаболитов, а также масс-спектры ЭИ их ТМС-производных. Изучена фармакокинетика нового оригинального отечественного антипсихотика дипептидной структуры дилепта, созданного на основании эндогенного тридекапептида нейротензина. Показано, что дилепт метаболизирует в организме экспериментальных животных значительно медленнее, чем нейротензин; идентифицированы основные метаболиты дилепта - Л^-капроил-Х-пролил-Х-тирозин (Ml) и 7У-капроил-£-пролин (М2). Определены основные фармакокинетические параметры дилепта и его основных метаболитов при внутривенном и при перпероральном способах введения. Показано, что при использовании таблеток дилепта имеет место увеличение относительной биодоступности дилепта и значительное уменьшение образования продуктов его превращения по сравнению с субстанцией. Установлено, что дилепт и в меньшей степени его активный метаболит - Л^-капроил-£-пролил-£-тирозин проникают через ГЭБ (гематоэнцефалический барьер). t\ г

Практическая значимость работы.

Данные о фармакокинетике и биодоступности дилепта вошли в материалы, ; представленные в Министерство здравоохранения и социального развития РФ для получения разрешения на клинические испытания таблеток дилепта. Данные настоящего исследования могут быть полезны для оптимизации пути введения дилепта и выбора оптимальной лекарственной формы. Апробация работы.

Основные результаты работы доложены на XIV российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2007); III съезде фармакологов России «Фармакология - практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург,

2007); симпозиуме «Хроматография и хромато-масс-спектрометрия» (Москва,

2008); научно-практической конференции «Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины (Москва, 2008); международном симпозиуме по ВЭЖХ-МС (Montreux, Switzerland 2008), ежегодной конференции «Фармация и общественное здоровье» (Екатеринбург, 2009). Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 145 страницах, включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, список литературы - 17 отечественных и 276 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 16 рисунками. Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ, из них 3 статьи в научных журналах, которые входят в перечень рекомендованных ВАК, и 6 тезисов.

Выводы:

1. Разработана высокочувствительная и селективная методика определения дилепта и его предполагаемых метаболитов в биологическом материале с использованием метода ВЭЖХ в сочетании с тандемной масс-спектром етрией.

2. В модельных опытах выявлены различия в активности эстераз крысы и человека. Дилепт не устойчив в плазме крови крыс и устойчив в плазме крови человека.

3. Основным путем элиминации дилепта является биотрансформация, в результате которой образуются два метаболита - Л^-капроил-1,-пролил-1,-тирозин (Ml) и 7У-капроил-1/-пролин (М2).

4. Фармакокинетика дилепта и его метаболитов различна для таблеток и субстанции фармакологического препарата. После перорального введения таблеток дилепта в значительной степени снижается интенсивность образования его метаболитов и увеличивается содержание неизмененного дилепта. Величина относительной биодоступности таблеточной лекарственной формы дилепта составила 122%.

5. Дилепт и его активный метаболит Ml обнаруживаются в тканях мозга. Коэффициент мозг/плазма составил 2.0 для дилепта и 0.5 для активного метаболита М-капроил-Ь-пролил-ъ-тирозина.

IV. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализ полученных результатов изучения фармакокинетики и биотрансформации дилепта и их сопоставление с имеющимися литературными данными о уже внедренных препаратах - олигопептидах показывает, что необходимым и основополагающим этапом успешного проведения этих исследований является разработка' высокочувствительного и специфичного метода количественного определения пептида и продуктов его метаболизма в связи с их невысокими концентрациями в крови из-за быстрого метаболизма и превращения в эндогенные продукты, в частности аминокислоты, особенно после перперорального введения. Для этих целей нами были разработаны два подхода к определению дилепта и его основных метаболитов методами хромато-масс-спектрометрии, а именно: высокоэффективной жидкостной хроматографии - масс-спектрометрии и газовой хроматографии - масс-спектрометрии. Приоритет хромато-масс-спектрометрических методов в исследованиях фармакокинетических свойств пептида, обосновывается не только его низкой биологической доступностью, но и специфичностью поиска его метаболитов, являющихся эндогенными либо близкими к ним по структуре соединениями. Современный анализ пептидов в большинстве случаев основан на получении «отпечатков пальцев» конкретного пептида методами ВЭЖХ в сочетании с тандемной масс-спектрометрией. Таким образом, снижается вероятность интерференции со стороны эндогенных молекул, и, соответственно, повышается достоверность идентификации фармацевтического пептида.

В результате сравнительного анализа было установлено, что оптимальные условия для детектирования пептоидов создавались при использовании метода ВЭЖХ в сочетании с тандемной масс-спектрометрией. Применение оптимизированной методики позволило провести исследование фармакокинетики дилепта после перперорального введения. Кроме того, применение ВЭЖХ-МС/МС позволило с высокой степенью достоверности идентифицировать структуру метаболитов дилепта. Следует отметить, что не для всех внедренных и применяемых в настоящее время в клинике препаратов (тимоген, иммунофан, тимодепрессин) имеются данные об их фармакокинетике из-за пептидной структуры, причиной чего явилось именно отсутствие метода, обладающего достаточной чувствительностью и селективностью. В то же время f для ряда более устойчивых олигопептидов имеются литературные данные об их фармакокинетике и метаболизме, которые получены методом ВЭЖХ и радиоизотопным методом (ноопепт, селанк, семакс).

Вопытах на животных in vivo и in vitro показано, что дилепт является биологически нестабильным соединением, быстро и интенсивно метаболизируется в присутствии ферментов плазмы крови крыс. Идентифицированы его основные метаболиты — Лг-капроил-/,-пролил-/,-тирозин и ТУ-капроил-Х-пролин. Установлены существенные межвидовые различия-активности эстераз у крыс и человека в модельных опытах с плазмой крови крыс и человека, а также в опытах in vivo: подтверждена высокая активность ферментов этого класса в организме животных в отличие от человека, что совпадает с литературными данными для других олигопептидов и родственных соединений. Для большинства лекарственных препаратов известны межвидовые различия в профилях энзиматической стабильности in vitro и in vivo [284 - 288]. Причем наибольшая степень биоконверсии препаратов выражена у грызунов, например крыс [289, 290]. Неадекватное применение данных о стабильности будущего лекарственного средства, полученных от этих видов животных, может привести к недооценке его устойчивости у человека, и может привести к крайне нежелательным последствиям при переносе дозирования от экспериментального'животного на человека.

Существуют несколько типов эстераз с соответстующей специфической активностью, что может объяснить различия, наблюдаемые между видами экспериментальных животных. Например, производное оксиметил-кумариновой кислоты и опиоидного пептида [D-Ala2,Leu5]- энкефалина образуют циклическое про-активное соединение. Это вещество относительно стабильно в плазме человека и лошади (\Уг более 2-х часов) и гораздо менее стабильно (tV2 - 23 мин) в плазме четырех других видов животных - мышей, свиней, крыс и хомяков [291]. Кроме того, ОМСА-[Б-А1а2,Ьеи5]-энкефалин является лучшим субстратом для эстеразы типа В, чем для эстеразы типа А/С, в то время как именно эстераза А/С является преобладающим типом в плазме человека и лошади. Вопрос энзиматической стабильности осложняется также и тем, что различные типы эстераз могут быть локализованы в различных участках организма. К примеру, если у грызунов алифатические эстеразы присутствуют в плазме крови, то у человека такие ферменты локализованы в основном в печени. Различия в местонахождении эстераз могут быть даже на уровне одного и того же органа - и мозг человека и мозг крысы содержат карбоксилэстеразы, однако у человека данный тип располагается на уровне ГЭБ, что имеет существенную физиологическую значимость, выраженную в усилении барьерной функции мозга [292, 293].

Принимая во внимание то, что деметилированный метаболит дилепта Ml является психоактивным соединением, целесообразно полагать, что фармакологические действие дилепта у грызунов реализуется в большей степени за счет Л^-капроил-£-пролил-£-тирозина. Собственная активность этого соединения в тесте «апоморфиновая вертикализация» несколько уступает неизмененному дилепту: в суспензии на твине-80 вертикальная активность в % от контрольной группы, принятой за 100% в дозе 16 мг/кг, введенной перорально составляет 57% для дилепта и 67% для ГЗР-125 (Ml). По-видимому, это связано с преимуществом дилепта, обладающим более

1 i липофильными свойствами, а, следовательно, лучшим проникновением через интестинальный эпителий энтероцитов щеточной каемки кишечника.

Необходимым условием для успешного нейрофармацевтического препарата является его способность проникать через клеточные мембраны. Большинство пептидов являются гидрофильными соединениями и неспособны проникать через важнейшие биомембраны самостоятельно. Поэтому определяющим моментом для дальнейшей разработки пептида является факт его проникновения через слизистую кишечника. Поскольку дилепт подвергается выраженной биотрансформации,уже системно, при попадании в кровоток, после перперорального введения его концентрации в плазме находились на уровне нг/мл. Таким образом, дилепт абсорбируется в ЖКТ и подвергается выраженному эффекту первого прохождения через печень с образованием двух метаболитов, что обуславливает низкое значение абсолютной биодоступности его субстанции у грызунов. Обнаружение малых количеств неизмененного дилепта, а также его активного метаболита Ml подтверждается литературными данными, которые свидетельствуют о возможной абсорбции ди- и трипептидов в ЖКТ благодаря наличию системы интестинальных переносчиков, обеспечивающих их активный транспорт через мембраны желудочно-кишечного тракта и гистогематические мембраны других органов, в том числе мембраны гематоэнцефалического барьера [240-245, 269].

Установлено, что дилепт и в несколько меньшей степени его активный метаболит ]У-капроил-£-пролил-£-тирозин, проникают через ГЭБ. При этом дозовой зависимости не наблюдалось, что может свидетельствовать о наличии активного транспорта для этих соединений через гематоэнцефалический барьер. В настоящее время вопрос о возможности активного транспорта для коротких ди- и трипептидов активно обсуждается [265-272]. Считается, что большинство известных систем переносчиков, как правило, переносят пептиды в направлении от мозга к крови. Лишь небольшое количество* интактных

Ill пептидов способно проникать через ГЭБ, поэтому основные исследования в данной области проводятся относительно эндогенных психоактивных пептидов, вырабатываемых в различных регионах мозга. В связи с популяризацией пептидов, как фармацевтических агентов, в настоящее время наблюдается повышенный интерес к изучению механизмов их транспорта от крови к мозгу, сконцентрированный в основном на поиске новых транспортных систем и способов их регулирования [263, 265].

Принимая во внимание низкое значение биодоступности дилепта, вследствие выраженного метаболизма необходимо подчеркнуть, что увеличение биодоступности оригинального антипсихотика возможно с помощью биофармацевтических подходов. Одной из задач настоящего исследования являлась оценка отностительной биодоступности таблетированной лекарственной формы, разработанной в опытно-технологическом отделе НИИ фармакологии им. В. В. Закусова РАМН. Показано, что результатом разработанной новой технологии таблеточной лекарственной формы дилепта, явилось значительное увеличение относительной биодоступности дилепта на фоне существенного уменьшения образования продуктов его метаболизма. Выявлены различия на фазе абсорбции - увеличивается скорость и степень всасывания. Полученный результат является следствием позитивного влияния фармацевтических добавок, входящих в состав таблетированной лекарственной формы, на фармакокинетические свойства дилепта.

Полученные результаты исследования экспериментальной фармакокинетики и основных направлений биотрансформации дилепта будут способствовать выбору пути введения препарата и созданию оптимальной лекарственной формы на стадии доклинического изучения фармакокинетики дилепта. Возможно, применение других биофармацевтических подходов, реализуемых в настоящее время при создании пептидных препаратов, позволит улучшить фармакокинетические характеристики дилепта. Кроме того, эти данные будут иметь практическую значимость при переносе полученных результатов с животных на человека на этапе клинических испытаний при расчете тестовой дозы препарата и разработке рациональной и эффективной схемы его практического применения.