Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Противоожоговое действие органических компонентов минеральной воды "Нукутская"

На правах рукописи

МАЛЫШКИНА Наталья Александровна

ПРОТИВООЖОГОВОЕ ДЕЙСТВИЕ ОРГАНИЧЕСКИХ КОМПОНЕНТОВ МИНЕРАЛЬНОЙ ВОДЫ "НУКУТСКАЯ"

14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

-1 АВГ 2013

Москва - 2013

005531860

005531860

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении высшего профессионального образования «Ангарская государственная техническая академия»

Научные руководители:

кандидат медицинских наук, доцент доктор медицинских наук, профессор

Юшков Ггннадий Георгиевич Расулов Максуд Мухамеджанович

Официальные оппоненты:

Заржецкий Юрий Витальевич — доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории патофизиологии критических состояний ФГБУ «Научно-исследовательский институт общей реаниматологии имени В.А. Неговского» Российской академии медицинских наук)

Демуров Евгений Аркадьевич - доктор медицинских наук, профессор, профессор кафедры патологической физиологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов»)

Ведущая организация:

Государственное учебно-научное учреждение «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова»

Защита состоится «_» ___2013 г. в 1400 часов на заседании

диссертационного совета Д 001.051.01 при ФГБУ «Научно-исследовательский институт общей реаниматологии имени В.А. Неговского» Российской академии медицинских наук по адресу: 107031, г. Москва, ул. Петровка, д. 25, строение 2. С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБУ «Научно-исследовательский институт общей реаниматологии имени В.А. Неговского» РАМН (107031, г. Москва, ул. Петровка, д. 25, строение 2).

Автореферат разослан » 'ЬЦб'ЛЛ 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук,

доцент Шульгина Наталия Мефодиевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность

С древнейших времён практически всем народам планеты известны полезные свойства различных минеральных вод для профилактики и коррекции ряда заболеваний. В подавляющем большинстве случаев минеральные воды эффективны, они легкодоступны, к ним нет патологического привыкания, большинство из них не обладает побочным действием, и в этом их огромное преимущество перед многими современными лекарственными средствами. Дешевизна же является их абсолютным конкурентным преимуществом. Именно эти факторы заставляют в последние годы обратить особое внимание на водолечение, но уже с современных позиций. В этом плане следует отметить, прежде всего, то, что под понятием «минеральная вода» подразумевается зависимость её основных лечебных свойств от соотношения неорганических солей. Однако уже известно, что зачастую лечебные свойства воды определяются, в основном, присутствующими в ней органическими соединениями. Тем не менее, вопрос о влиянии органических веществ из минеральных вод на организм изучен явно недостаточно. Особую актуальность этот вопрос приобретает в связи с новыми технологиями производства, транспортировки, разлива и продажи минеральной воды в отдалённые от источников регионы, а также в связи с широтой контакта человека с минеральными водами и их производными.

В литературе сообщается об исследованиях, связанных с технологией выделения органических веществ из минеральных вод (в виде экстрактов) [Бехтерев В.Н., 2008; Шпейзер Г.М. с соавт., 2009; Raynie D.E., 2006 и др.], однако их токсикологическая оценка не проводилась, что подчёркивает актуальность исследований.

В Иркутской области органические вещества выделены из минеральной воды «Нукутская». Эту воду местные жители используют для лечения различных заболеваний с 1964 г. Оздоровительный эффект «Нукутской» связывают с наличием в ней сероорганических веществ, на основе которых получают 32% этанольный экстракт органических веществ (в дальнейшем по тексту обозначено непатентованным названием экстрамин), используемый в качестве средства для наружного применения. Тем не менее, научного обоснования использования этой воды и оценки ее профилактического, возможного токсического и оздоровительного действия не проводилось. Это и определило цель настоящего исследования.

Цель исследования

Оценить лечебные свойства экстракта органических веществ из минеральной воды «Нукутская» при развитии ожоговых поражений кожи и дать ему токсикологическую характеристику.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать модель раневого процесса на основе химического ожога кожи.

2. Оценить эффективность экстрамина при лечении ожога кожи.

3. Обосновать механизм противоожогового действия экстракта минеральной воды «Нукутская».

4. Выявить токсичность и особенности ответной реакции организма на воздействие экстрамина.

Научная новизна

В результате проведенных исследований впервые:

- выявлена ранозаживляющая эффективность экстрамина, которая заключается в ускорении эпителизации, заживлении ожога без образования грубого рубца;

- выявлено, что один из механизмов лечебного действия экстрамина при ожоговом поражении обусловлен усилением активности лейкоцитов через увеличение активности кислой фосфатазы, что свидетельствует о возрастании активности лизосом, способствующей антибактериальной защите, очищению раневой поверхности от поврежденных тканей;

- установлены основные токсикометрические параметры экстракта органических веществ - экстрамин, по которым он относится к IV классу - малоопасных веществ, согласно «Классификации химических веществ по степени токсичности».

Практическая значимость

Материалы исследований внедрены в практику Регионального управления № 28 ФМБА России при контроле соответствующих производств (акт внедрения от 22.02.2010 г.); в научно-исследовательский процесс как модель создания раневой болезни и её лечения в условиях эксперимента в НИИ травматологии и ортопедии (акт внедрения от 01.03.2010 г.). Материалы исследования используются в учебном процессе кафедры «Охрана окружающей среды и рациональное использование природных ресурсов» ФГБОУ ВПО «АГТА» при изучении курса «Основы токсикологии» (акт внедрения от 10.02.2010 г.). Полученные данные используются для развития методологии экспериментального изучения новых фармакологических веществ в отделе токсикологии НИИ биофизики ФГБОУ ВПО «АГТА» (акт внедрения от 31.01.2010 г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Экстрамин эффективен при лечении химического ожога кожи.

2. Один из механизмов лечебного действия экстрамина при ожоговом поражении обусловлен усилением активности лейкоцитов.

3. Химические вещества, содержащиеся в экстракте, обладают протекторным действием, снижая отрицательные эффекты острого и хронического отравления этанолом, уменьшая нагрузку на печень.

4. Экстрамин по степени опасности относится к IV классу - малоопасных веществ.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на: XI международной научной школе-конференции студентов и молодых ученых (Абакан, 2007); международной научно-практической конференции в области экологии и безопасности жизнедеятельности (Комсомольск-на-Амуре, 2008); III съезде токсикологов России (Москва, 2008); научно-практической конференции (Томск, 2009); международной научно-практической конференции (Улан-Удэ, 2009); ежегодной конференции «Современные технологии и научно-технический прогресс» (Ангарск, 2010); 9-й международной научно-практической конференции (Санкт-Петербург, 2010).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 22 печатные работы, в том числе 7 статей в изданиях, рекомендованных ВАК РФ. Получен патент на изобретение RU № 2357740 от 10.06.2009 г.

Объём и структура диссертации

Диссертация изложена на 143 страницах машинописного текста, иллюстрирована 32 таблицами и 33 рисунками. Включает список используемых сокращений, введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, а также обсуждение полученных результатов, выводы, список используемой литературы и приложения. Список литературы включает 167 источников, из которых 142 отечественных и 25 - зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования являлся экстрамин - 32% этанольный экстракт растворенных органических веществ из минеральной воды «Нукутская». Исследуемый экстракт разработан совместно с ФГБОУ ВПО «Иркутский государственный университет». В основе способа получения препарата лежит выделение из исходной минеральной воды органических компонентов путём спиртовой экстракции. На этот способ получен патент РФ. По данным Г.М. Шпейзера с соавт. (2006, 2010 г.), в пробах экстракта обнаружены полисульфиды (диэтилдисульфид, диэтилтрисульфид, 3,5-диметил-1,2,4-тритиолан) и соединения серы в модификации S6, S7, Sg Содержание органических веществ в экстракте — 17,6 мг/дм3 (по перманганатной окисляемости).

Исследование исходной минеральной воды по физико-химическому и радионуклидному составу на основе результатов анализа протоколов и заключений исследования минеральной воды «Нукутская» за 10 лет (1996-2006 гг.) показало, что минеральная вода имеет следующий состав (табл. 1).

Таблица 1

Физико-химический состав минеральной воды «Нукутская»

Наименование группы минеральной воды Показатели Содержание основных ионов (г/дм3)

С1- 28,4 ± 0,57

Э042- 4,2 ± 0,29

А НСОз" 0,54 ±0,01

О нэ- 0,32 ± 0,05

Л X Вг 0,026 ±0,01

Крепко сероводородная О X 21,0 ±2,94

бромная хлор ид на я натриевая О К* 0,12 ±0,02

Са2+ 1,48 ±0,03

Мд2* 0,50 ±0,01

Минерализация (г/дм3) 56,5

рН 8,5 ±0,1

Температура (°С) 7

Содержание радионуклидов в пробах минеральной воды не превышает пределов, установленных НРБ-99/2009 (табл. 2).

Таблица 2

Содержание радионуклидов в минеральной воде «Нукутская»

Естественные радионуклиды

Наименование радионуклида Содержание в пробе (Бк/кг) Норматив по НРБ-99/2009 [108] (Бк/кг) не более

Уран-238 1,8 8,8*

Торий-232 < 1,0 65*

Радий-226 2,9 54*

Техногенные радионуклиды

Наименование радионуклида Содержание в пробе (Бк/кг) Норматив по СанПиН 2.3.3.1078-01 (Бк/кг) не более

Цезий-137 <0,5 8,0

Стронций-90 <0,5 8,0

Примечание: * - по НРБ-99/2009, исходя из предельного годового поступления.

Погрешность на нижней границе диапазона измерений - 20 %.

В соответствии с критериями оценки минеральных вод, установленными МЗ РФ (МУ № 2000/34 «Классификация минеральных вод и лечебных грязей для целей их сертификации»), минеральная вода «Нукутская» является крепко сероводородной бромной лечебной водой для наружного применения.

Для исследования лечебного действия экстрамина была создана модель химического ожога у кроликов 50% раствором серной кислоты. Ожоговую рану производили по методике И.О. Убашеева с соавт. (1990). В эксперимент взято 40 кроликов массой 3,3-3,5 кг (4 группы по 10 животных). Лечение начиналось с первых суток открытым способом с нанесением экстрамина на всю поверхность выстриженного участка. Нанесение ежедневное до полного заживления с периодическим обследованием (2-е, 4-е, 5-е, 7-е, 10-е, 12-е, 14-е, 19-е, 21-е, 25-е сутки) для оценки динамики раневой болезни и ее местных проявлений. В качестве препарата сравнения был выбран феракрил (ФС 42-2770-98), обладающий также и ранозаживляющими свойствами. Были сформированы следующие группы по 10 животных в каждой: а) нелеченные кролики с ожогом - контроль; б) кролики с ожогом, леченные 32% раствором этанола; в) кролики с ожогом, леченные феракрилом; г) кролики с ожогом, леченные экстрамином. Состояние организма животных оценивалось по показателям, представленным в таблице 3.

Таблица 3

Методы определения показателей состояния животных в эксперименте по установлению ранозаз/сивляющей способности

экстрамина

Физиометрические показатели

Масса тела, температура тела, температура кожи в области раны, площадь раны (тест Л.Н. Поповой), толщина кожной складки в области раны (толщинометр ТР-1-10), модуль комплексного сопротивления кожи (прибор КТД-8)_

Периферическая кровь Гематологические показатели Цитохимические показатели

Активность фермента в нейтрофилах: Содержание: гемоглобина, эритроцитов, миелопероксидазы (МПО), катионный лейкоцитов (гемоанализатор Нето1их-19, белок, ЩФ и КФ (НауЬое Р., 1983). Китай), ретикулоцитов, СОЭ. Активность фермента в лейкоцитах: КФ,

_а-ГФДГ, СДГ (НауЬое Р., 1983)._

Морфологическое исследование: проводили макро- и микроскопическое исследование раневой поверхности. Микропрепараты фиксировали в 10% нейтральном формалине, осуществляли проводку и заливку в парафин + воск. С каждого блока получали серийные срезы (7 мкм) и окрашивали их по Ван-Гизону и гематоксилин-эозином (Меркулов Г.А, 1969)._

Цитохимические данные обрабатывались с помощью полуколичественной оценки результатов с использованием принципа Астальди. Результат (миелопероксидаза, катионный белок, щелочная фосфатаза (нейтрофилы))

выражали в виде среднего цитохимического показателя по Ь. Кар1о\у (1955) или среднего цитохимического коэффициента (СЦК, формула 1) (Кар1о\у Ь.Б., 1955; Вго\уп1ее М., 2001).

100 (

где: К0, К1г К2, Ку К4 - процент клеток в группе.

У остальных цитохимических показателей (кислая фосфатаза (лейкоциты, нейтрофилы), а-ГФДГ, СДГ) в эксперименте на ранозаживление единицами измерения были количество гранул на клетку (всего исследовали 50 клеток).

Для установления параметров острой токсичности экстрамина использовались белые мыши массой 18-20 г и белые нелинейные крысы-самцы (« = 72). Экстрамин и 32% этиловый спирт в дозах 300 мг/кг или 3000 мг/кг вводили перорально через атравматический зонд. Так как экстрамин представляет собой этанольный экстракт, параллельно с его изучением проверялось возможное негативное влияние водного раствора этанола (32 об.%) на организм животных. Расчет среднесмертельных доз вели по методу Кербера [Лойт А.О. с соавт., 1996].

Определяли раздражающее действие экстрамина на кожу (аппликация на кожу уха крысам (и = 10), оценивали по наличию эффекта) и слизистые оболочки глаз кроликов (и = 10) [Лойт А.О. с соавт., 1996].

Кумулятивный эффект препарата оценивали по методу Ю.С. Кагана [Лойт А.О. с соавт., 1996] в условиях ежедневного (5 и 10 дней) перорального введения в дозах 1/5 и 1/10 ОЦ0 с оценкой общего состояния животных (крысы, п = 20), регистрацией случаев гибели и измерением массы тела. Оценку эффекта кумуляции проводили по классификации Л.И. Медведя (1968). При многократном введении токсичность экстрамина изучали в 30-дневном эксперименте на 120 белых нелинейных крысах-самцах, которые были разделены на 4 группы по 10 животных в каждой. 1-й и 2-й группе животных вводили экстрамин в дозах 3000 и 300 мг/кг соответственно, перорально 1 раз в сутки. 3-я группа служила контролем и получала 32% этиловый спирт в дозе 3000 мг/ кг. 4-я группа - интактные животные. Доза 300 мг/кг этанола (30^0 %) - минимальная (для крыс), которая вызывает ряд физиологических сдвигов, а доза 3000 мг/кг - максимально переносимая, не приводящая к гибели животного [Бонитенко Ю.Ю., 2005].

Состояние организма животных оценивали по показателям, представленным в таблице 4.

Состояние животных и методы определения показателей в хроническач эксперименте

Физиологические показатели

Масса тела. Для оценки функционирования ЦНС животных использовали тесты: норковый рефлекс (НР), спонтанную двигательную активность (СДА), статическое мышечное напряжение.

Периферическая кровь Сыворотка крови

Гематологические показатели Биохимические показатели

Цитохими ческие Общий белок, у-ПГП, АлАТ (биохимический анализатор FP-901M, Финляндия), GHS (Sedlak J„ 1968), фибриноген (Портяная Н.И., 1990).

Содержание: гемоглобина, лейкоцитов, эритроцитов (анализатор Нето1их-19, Китай). Активность ферментов в нейтрофилах: МПО, ЩФ и КФ (Hayhoe F., 1983).

Все исследования выполнены в соответствии с этическими требованиями по работе с экспериментальными животными, изложенными в следующих нормативно-правовых документах: «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приложение к приказу МЗ СССР № 755 от 12.08.1977 г.), «Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2005), «Правила лабораторной практики» (приложение к приказу МЗ РФ № 708н от 23.08.2010 г.).

Статистическую обработку данных проводили с помощью программ Microsoft Office Excel 2007 и «Biostat». Вычисляли среднее арифметическое (М) и его ошибку (т). Сравнение между группами по количественным признакам в условиях подчинения закону нормального распределения проводили с применением t-критерия. Достоверность различий между показателями (р) считалась значимой прир < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Ретроспективное исследование показало, что у людей принятие ванн с минеральной водой «Нукутская» способствует заживлению ожогов. Поэтому для изучения лечебных свойств экстракта органических соединений воды «Нукутская» была выбрана модель химического ожога кожи.

При лечении ран кожи мы руководствовались тем, что независимо от локализации ожога, заживление протекает в виде последовательных фаз воспаления [Кузин М.И., 1991; Назаров А.А. с соавт., 2007]. Это позволило заключить, что адекватной моделью ожога в эксперименте с учетом особенностей анатомии кожи животных может быть химический ожог [Убашеев И.О. с соавт., 1990]. Полученный ожог по своим признакам сравним с ожогом III—IV

степени у человека, так как при этом образовывался некротический струп специфической окраски, интенсивность которой нарастала в течение первых суток после повреждения. На фоне окружающего отека сухой некротический струп выглядел запавшим, спаянным с подлежащими тканями, его невозможно было взять в складку.

Противоожоговые свойства экстрамина

Результаты измерения площади раны показали, что к 3-м суткам после нанесения ожога и в последующие периоды наблюдения этот показатель у кроликов, леченных экстрамином, был существенно ниже, чем у животных контрольной группы и кроликов, леченных этанолом. Начиная с 10-х суток послеожогового периода, аналогичные различия наблюдались между группами животных, леченных экстрамином и феракрилом (табл. 5). Следовательно, во-первых, экстрамин обладает более выраженным противоожоговым действием, по сравнению с остальными сравниваемыми группами; во-вторых, различия по этому показателю между группами кроликов, леченных экстрамином и этанолом, свидетельствуют о том, что лечебный эффект экстрамина обусловлен органическими соединениями, входящими в его состав. Эти результаты нашли подтверждение при оценке толщины кожной складки и электрического сопротивления кожи.

Таблица 5

Динамика площади раны (М± т; кролики (п = 10))

Вещество Сутки

1-е 3-й 5-е 10-е 12-е 14-е 21-е

Площадь раны (мм2)

Контроль 4200 3957 ± 49,1 3433,3 ± 104,1 2693,8 ± 110,1 2087,5 ± 31,5 1812,5 ± 26,5 250 ±48,7

Экстрамин 4200 3312,5 ± 7,9* 2360 ± 41,1* 1611± 79,3* 856,3 ± 132,03* 675 ± 210,9* 75 ± 14,4*

Феракрил 4200 3350 ± 13,2* 3041,7 ± 136,1 2280 ± 94,7** 1595 ± 107,7*'** 1318,8 ± 212*** 133,3 ± 11,8*;"

Этанол 4200 3883 ± 40,1*** 3425 ± 125*** 2488,3 ± 24,9"* 2410 ± 20,8*: *** 2278 ± 111,7*'*** 197,3 ± 45,6***

Примечание: * - различия с контролем достоверны (р < 0,05); ** - различия между группами леченных экстрамином и феракрилом (р < 0,05); *** - различия между группами леченных экстрамином и этанолом (р ^ 0,05).

Выявлено, что модуль комплексного сопротивления кожи был заметно ниже в группах леченных животных, особенно экстрамином, что, по-видимому, связано с постепенным снижением отечности тканей и более упорядоченным ростом клеток соединительной ткани кожи (табл. 6).

Динамика модуля комплексного сопротивления (кОм) (М ± т; кролики (п = 10))

Модуль комплексного сопротивления, в норме -2,77 ± 0,1 ком) Вещество Срок наблюдения (сутки)

7-е 12-е 14-е 19-е 21-е

Контроль 5,7 ±0,3" 4,7 ±0,09" 4,6 ± 0,1" 4,7 ±0,1" 3,6 ± 0,2"

Экстрамин 3,9 ± 0,1 *; **; *** 3,8 ± 0,1 3,8 ±0,1 3,2 ± 0,1 **; *** 2,8 ±0,1 *; »**

Феракрил 4,7 ± 0,2 3,8 ± 0,19 3,7 ±0,1" 3,7 ± 0,09 3,6 ± 0,12

Этанол 4,5 ±0,21 4,1 ± 0,1 *; «*: # 4,4 ±0,1 **; # 3,9 ±0,1 3,5 ±0,2

Примечание: * - различия с контролем достоверны; **-р < 0,05, по сравнению с интактными животными; *** - различия между группами, получавшими экстрамин и феракрил (р < 0,05); # - р < 0,05, по сравнению с группой животных, леченных экстрамином.

При лечении экстрамином тоньше была и кожная складка.

Известно, что уменьшение толщины кожной складки прилегающих к ожогу тканей свидетельствует о благоприятном течении ожоговой болезни. Если в процессе заживления преобладает механизм раневой контракции -равномерного концентрического сокращения раны, то к исходу заживления электрическое сопротивление кожи снижается. Оказалось, что с 5-х по 10-е сутки толщина кожной складки у кроликов, леченных экстрамином меньше, чем в остальных группах (табл. 7).

Таблица 7

Динамика толщины (мм) кожной складки (М ±т; кролики (п = 10))

Вещество Сутки

1-е 3-й 5-е 7-е 10-е 12-е 14-е 19-е 21-е

Толщина кожной складки (у интактных животных - 3,05 ±0,06 мм)

Контроль 7,3 ± 0,1" 8,3 ± 0,2" 7,1 ± 0,2" 7,6 ± 0,06" 6,5 ± 0,1" 4,6 ± 0,3" 4,3 ± 0,04" 3,9 ± 0,1 4,0 ± 0,2"

Экстрамин 6,5 ± 0,2" 7,5 ± 0,1":* 4,8 ± 0,3*:":* 5,0 ± 0,19*^* 5,2 ± 0,2*:";* 3,9 ± 0,1" 3,3 ± 0,1*;** 3,4 ± 0,1*" 2,8 ± 0,1*

Феракрил 6,6 ± 0,2" 8,03 ± 0,5" 6,8 ± 0,35" 6,1 ± 0,1*^" 6,1 ± 0,1" 4,2 ± 0,2" 3,2 ± 0,1* 3,3 ± 0,1* 3,0 ± 0,2*

Этанол 6,7 ± 0,1" 7,9 ± 0,5" 6,2 ± 0,12" 5,9 ± 0,16*;" 6,2 ± 0,1" 4,2 ± 0,2" 3,4 ± 0,1*:" 3,3 ± 0,1*** 3,0 ± 0,07

Примечание: * - различия с контролем достоверны (р < 0,05); ** - р < 0,05, по сравнению с интактными животными; *** -р< 0,05, по сравнению с остальными группами.

Таким образом, совокупность приведенных выше результатов измерения площади раны, толщины кожной складки, модуля комплексного сопротивления

11

ткани в области раны позволяют сделать выводы о том, что: а) применение экстрамина при лечении химического ожога более эффективно, по сравнению с остальными используемыми способами лечения; б) противоожоговое действие экстрамина обусловлено органическими химическими соединениями, входящих в состав экстракта.

Полученные данные подтверждаются материалами морфологического исследования. Установлено что при действии экстрамина ускоряется процесс заживления раны как по сравнению с нелеченными животными, гак и по сравнению с кроликами, леченными феракрилом и 32% этанолом.

В группе нелеченных животных на 15-28-е сутки раневая поверхность значительно уменьшена и в большинстве случаев покрыта струпом (1) (рис. 1Б). Эпидермис местами активно пролиферирует и формирует «гребешки» (1), глубоко внедряющиеся в дерму (рис. 1А).

исследуемых веществ, 28-е сутки (окраска гематоксилин-эозином, ув. х 250, описание в тексте). Б-макропрепарат. Поверхность кожи кроликов после химического ожога на 28-е сутки (контроль без применения исследуемых веществ).

В группе животных, леченных экстрамином, на 15-25-е сутки макроскопически отмечали практически полное удаление струпа, под которым находили нежную поверхность эпидермиса, покрывающего поверхность раны (рис. 2Б). Микроскопически наблюдаются небольшие участки, освобожденные от струпа, с хорошо выраженной грануляционной тканью и «наползающим» на этот участок эпидермисом (рис. 2А).

В группе животных, леченных феракрилом, на 14-21-е сутки от начала обработки раны наблюдался активный процесс эпителизации раневой поверхности с образованием эпителиальных «гребешков» (1) и «сосочков» (2) дермы (рис. ЗА), а на поверхности раны выявлялись островки струпа (1) (рис. ЗБ).

Рис. 2. А - препарат кожи кролика. Химический ожог, экстрамин, 15-е сутки (гематоксилин-эозин, ув. х 120, описание в тексте). Б - макропрепарат. Поверхность кожи кролика после химического ожога на 15-е сутки (экстрамин)

Рис. 3. А - микропрепарат кожи кролика. Химический ожог, феракрил, 7-е сутки (гематоксилин-эозин, ув. х 120, описание в тексте). Б - макропрепарат. Поверхность кожи кроликов на 21-е сутки после химического ожога (феракрил).

. М — І іреї ш ра I ШЖИ криликсі. люмичеоїчі'іи илчиї, і-г-с ^у І гчп

(гематоксилин-эозин, ув. х 120, описание в тексте). Б - макропрепарат.

Поверхность кожи кроликов на 28-е сутки после химического ожога (этанол (32% об.)).

При обработке раневой поверхности у кроликов 32% раствором этанола заживление протекало, как и у нелеченных кроликов, но с меньшим проявлением отечности дермы и без выраженных очагов воспалительной инфильтрации (рис. 4А). В конце наблюдений (21-28-е сутки) раневая поверхность не была полностью закрыта и, наряду с участками рубцовой ткани (1), отмечались очаги с незакрытой кожей, отчетливо видимой грануляционной тканью (2) (рис. 4Б).

Сравнительный анализ морфологических данных указывает на то, что экстрамин более эффективно улучшал репаративные процессы при ожоге, что ускорило заживление и исключило образование грубого рубца.

Проведенные биохимические исследования показали, что в течение первых 3 суток после нанесения травмы во всех группах наблюдается активация КФ в нейтрофилах и лимфоцитах, однако у животных, леченных экстрамином, этот показатель был выше, чем в остальных сравниваемых группах (табл. 8, 9).

Таблица 8

Активность кислой фосфатази в нейтрофилах (М ± т; кролики (п = 10))

Вещество Сутки

1-е 3-й 7-е 14-е 21-е 30-е

Кислая фосфатаза (нейтрофилы), СЦК (норма - 9,0 ± 0,03)

Контроль 14,9 ± 0,2 **; # 12,6 ±0,4 10,0 + 0,1** 9,4 ± 0,1** 9,1± 0,5 9,3±0,2

Экстрамин 16,78 ± 0,4 *; ** 15,5 ± 0,4 9.2 ±0,1* 6,8 ±0,2*; ** 8,8 ±0,3 9,0± 0,4

Феракрил 14,65 ± 0,14 **; # 12,9 ± 0,4 9,3 + 0,1*:** 7,1 ± 0,1*:** 9,5 +0,1" 9,1 ±0,5

Этанол 14,9 ± 0,2# 13,1+0,3* 9,2 ± 0,1* 7,0 + 0,2** 9,2 ± 0,4 9,0 ±0,4

Примечание: * - различия с контролем достоверны (р < 0,05); ** - по сравнению с нормой (р < 0,05); # - различия с группой животных, леченных экстрамином, достоверны (р < 0,05); СЦК - относительная, безразмерная величина.

Таблица 9

Активность кислой фосфатазы в лимфоцитах (М ± т; кролики (п = 10))

Вещество Сутки

1-е 3-й 7-е 14-е 21-е

Кислая фосфатаза (лимфоциты), СЦК (норма - 4,5 ± 0,1)

Контроль 5,5 + 0,2** 6,6 ± 0,9** 4,85 ± 0,1 4,05 ±0,1** 4,47 ±0,1

Экстрамин 6,88 ± 0,12*; ** 8,21 ± 0,04*: ** 5,08 ± 0,1** 4,25 ±0,1 4,56 ±0,1

Феракрил 6,06 ±0,08** 6,23 ± 0,2** 4,41 ± 0,1* 3,73 ± 0,1*: ** 3,96 ± 0,13*:**

Этанол 6,01+ 0,07** 6,3 ± 0,03** 4,6 ± 0,08* 4,1 ±0,1** 4,2 ± 0,1*;**

Примечание: * - различия с контролем достоверны (р < 0,05); ** - по сравнению с нормой (р < 0,05).

Подъем активности по времени совпадал с формированием некротического струпа, развитием воспалительной реакции. Поэтому можно полагать, что одно из лечебных свойств органической составляющей экстрамина связано с влиянием на интоксикацию, активность лизосомальных ферментов лейкоцитов, способствующую усилению антибактериальной защиты, очищению поверхности раны от поврежденной ткани.

В следующих экспериментах нами впервые установлены токсикологические характеристики экстрамина. Изучение местного раздражающего действия выявило, что экстрамин обладает слабым раздражающим действием на слизистые оболочки глаз (отечность века — 1 балл) и кожные покровы (умеренная эритема).

Параметры острой токсичности экстрамина и этанола установили при однократном воздействии в диапазоне доз от 2000 до 14000 мг/кг (для экстрамина) и от 4000 до 11000 мг/кг (для этанола): ОЦ0 у крыс для экстрамина составила 10750 ± 751 мг/кг, в то время как для этанола - 8127 ± 481 мг/кг (р < 0,02). Более высокая величина этого показателя для этанола, по сравнению с экстра-мином, свидетельствовала о защитном действии органической составляющей экстрамина при остром алкогольном отравлении животных.

По установленной ОЬ50 были рассчитаны вводимые дозы для подо-строго эксперимента (эффект кумуляции), так, 1/5 ОЦ0 = 2150 мг/кг, 1/10 БЦ0= 1075 мг/кг. По критерию смертности (классификация Л.И. Медведя) экстрамин относится к веществам со слабыми кумулятивными свойствами (К > 5). Исходя из параметров токсичности при пероральном воздействии и руководствуясь «Классификацией химических веществ по степени токсичности», экстрамин следует отнести к IV классу - малоопасных веществ.

Для установления возможной связи наблюдаемых эффектов с действием этанола, входящего в состав экстрамина, мы провели эксперименты с многократным ежедневным введением экстрамина и этанола. При этом полученные данные сопоставлялись с известными из литературы эффектами, наблюдаемыми при хроническом действии этилового спирта (30^10 %).

В первой серии наблюдений установлено, что на протяжении всего эксперимента в группах крыс, получавших экстрамин и этанол в дозе 300 мг/кг, отличий от контроля не существует.

Результаты экспериментов с длительным пероральным введением экстрамина и этанола в ежедневной дозе 3000 мг/кг показали, что химические вещества, входящие в состав препарата, обладают защитным эффектом не только при остром, но и при хроническом алкогольном отравлении. Так, у животных, получавших экстрамин на протяжении всего времени исследования, масса тела не отличалась от контроля, в то время как крысы, получавшие этанол, начиная с 14-х суток, характеризовались более низкими значениями этого показателя, по сравнению с животными сравниваемых групп (табл. 10).

Динамика массы тела животных при введении экстрамина и раствора этанола в дозе 3000 мг/кг в хроническом эксперименте (М ± т; крысы (п =10))

Группа Сутки

1-е 7-е 14-е 30-е

Контроль 189,7 ±0,2 192,5 ±1,1 210,7 ± 0,5 214,2 ±0,3

Экстрамин 189,0 ± 0,7 196,7 ±0,92 211,7 ±0,3" 215,3 ± 0,6**

Этанол 190,7 ± 0,3 197,5 ±0,7 207,3 ± 0,7* 210,3 ±0,6*

Примечание: * - различия с контролем достоверны (р < 0,05); ** - различия между группами крыс, получавших экстрамин и этанол, достоверны (р < 0,05).

Экстрамин оказал положительное влияние и на исследовательскую активность животных. Так, за все время наблюдения исследовательская активность (число заглядываний в норки) у крыс с введением препарата снизилась в 1,7 раза, в то время как у крыс, принимавших этанол, этот показатель уменьшился в 3,9 раза (р < 0,05). Для выяснения причин положительного влияния органических соединений экстрамина на общее состояние и поведенческую активность животных были проведены исследования по изучению влияния экстрамина на биохимические показатели.

90

7 14 30 Сутки

□ Контроль В Экстрамин (3000 мг/кг) 13 Этанол (3000 мг/кг)

Рис. 5. Изменение активности АлАТ в сыворотке крови: * - различия с контролем достоверны (р<0,05); ** - различия между группами, получавшими экстрамин и этанол, достоверны (р < 0,05).

Известно, что основным органом, участвующим в биотрансформации этанола, является печень. Воздействие экстрамина и этанола вызвало био-16

химические сдвиги на 30-е сутки наблюдений. Так, в контроле, к 30-м суткам наблюдения уровень АлАТ имел тенденцию к понижению, по сравнению с уровнем фермента на 7-е сутки, в то время как при лечении экстрамином и, в особенности, этанолом выявлено повышение активности АлАТ в сыворотке крови, по сравнению с контролем, в 1,2 и 1,5 раза соответственно, что свидетельствует о нарушении проницаемости мембран гепатоцитов [Бородин Е.А., 1991 ], которое было более выражено у крыс с введением этанола, по сравнению с животными, принимавшими экстрамин, что указывало на защитное действие химических веществ, входящих в состав экстрамина, на клетки печени (рис. 5). Эти результаты нашли подтверждение при исследовании активности кислой и щелочной фосфатаз в нейтрофилах.

Группы с применением этанола и экстрамина характеризовались более высокой активностью активность щелочной и, в особенности, кислой фосфатаз нейтрофилов, по сравнению с контролем, на 14-е и 30-е сутки наблюдения. Эти результаты свидетельствовали о развитии интоксикации у животных, принимавших спиртсодержащие препараты, причем при приеме этанола в большей степени, чем при приеме экстрамина, на что указывают более высокие значения этих показателей в группе животных с введением этанола, по сравнению с экстрамином (рис. 6). Можно полагать, что органические химические компоненты экстрамина тормозят развитие алкогольной интоксикации.

3,2

* 2,7

й 2,2

2,53

■&

и

о ■&

1,7

1,2

0,7

0,2

□ Контроль

НЭкстрамин (3000 мг/кг)

□ Этанол (3000 мг/кг)

0,73

Сутки

Сутки

Рис. 6. Активность ЩФ и КФ в нейтрофилах периферической крови: * - достоверные различия с контролем (р< 0,05); ** - достоверные различия между группами экстрамина и этанола (р < 0,05).

Таким образом, динамика биохимических показателей и поведенческих реакций животных свидетельствуют о том, что этанол и экстрамин в дозе 3000 мг/кг вызывают хроническую интоксикацию, причем неблагоприятное воздей-

17

ствие спиртового экстракта на организм обусловлено этанолом, в то время как химические вещества, входящие в состав экстрамина, обладают протекторным действием. Наличие в пробах исходной минеральной воды серосодержащих полиядерных соединений с различным соотношением серы (4Б и 1СН2; 58 и 1СН2; 5Б и 2СН2; 68 и 1СН2) и метиленовых групп, полисульфидов (диэтил-дисульфид, диэтилтрисульфид, 3,5-диметил-1,2,4-тритиолан) и соединений серы в модификации 86, 8?, Б8 позволяет предположить, что они являются исходными активными веществами либо интермедиатами, участвующими в процессе образования биологически активных веществ, определяющих бальнеологические свойства как самой воды, так и экстрактов из неё (Шпей-зер Г.М. с соавг., 2010). При этом сульфатный раствор, добываемый из недр земли, отличается особой концентрированностыо. При действии сероводорода на организм повышается энергетический потенциал клетки. Нукутская вода является аналогом «Мацесты» (г. Сочи).

ВЫВОДЫ

1. Уменьшение площади поверхности раны при химическом ожоге под действием экстрамина происходит быстрее, по сравнению с контролем, этанолом и феракрилом, а процесс грануляции соединительнотканных элементов становится эффективней, улучшаются пролиферативно-репаративные процессы. Лечение экстрамином, в отличие от лечения этанолом и феракрилом, приводит к восстановлению эпителиального слоя без образования грубого рубца.

2. Лечение ожога экстрамином сопровождается более выраженным увеличением активности кислой фосфатазы в нейтрофилах, по сравнению с контролем и другими используемыми препаратами. Этот факт свидетельствует о возрастании активности лизосом, способствующей антибактериальной защите, очищению раневой поверхности от поврежденных тканей, и представляет собой один из механизмов лечебного действия экстрамина.

3. Химические вещества, содержащиеся в экстракте, обладают протекторным действием, снижая отрицательные эффекты острого и хронического отравления этанолом.

4. Экстрамин по степени опасности при пероральном введении относится к IV классу — малоопасных веществ.

5. Экстрамин обладает слабым раздражающим действием на слизистые глаз и кожные покровы и не обладает кумулятивным действием (Ксшп > 5).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Результаты токсикологических исследований, полученные для «Экстрамина», рекомендуется использовать при изучении аналогов.

2. Рекомендуется продолжить исследование влияния на пролиферативно-репаративные процессы группы органических веществ из минеральных вод с целью создания новых ранозаживляющих препаратов.

СПИСОК НАУЧНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

В изданиях списка ВАК РФ:

1. Малышкина H.A., Юшков Г.Г., Игуменьщева В.В. и др. Токсикологическая характеристика этанола в условиях экспериментально-биологического моделирования // Известия Самарского НЦ РАН. - 2007. - Т. 1 - С. 65-68.

2. Малышкина H.A., Долгушин М.В., Юшков Г.Г. Цитохимия лейкоцитов периферической крови в оценке динамики ожоговой болезни при экспериментально-биологическом моделировании // Известия Самарского НЦ РАН. -2008. - Т. 2 - С. 239-242.

3. Малышкина H.A., Юшков Г.Г., Игуменьщева В.В. и др. Динамика биохимических показателей у лабораторных животных при исследовании нового фармакологического вещества из природного сырья в условиях «субхронического» воздействия // Вестн. Российской военно-медицинской академии. -2008. - Ч. 2. - № 3 (23) - С. 331-332.

4. Машанов A.B., Малышкина H.A., Юшков Г.Г. и др. К проблеме механизма действия цинксодержащего фармакологического вещества в условиях экспериментально-биологического моделирования // Вестн. Бурят, гос. с.-х. акад. им. В.Р. Филиппова. -2008. -№ 4 (13). - С. 9-13.

5. Малышкина H.A., Юшков Г.Г. Изменение некоторых показателей состояния лабораторных животных при исследовании ранозаживляющего действия фармакологического вещества из природного сырья // Вестн. Российской военно-медицинской академии. - 2009. - Ч. 2. - № 1 (25). - С. 889-890.

6. Малышкина H.A., Юшков Г.Г., Шпейзер Г.М. и др. Влияние экстракта минеральной воды Новонукутская на течение раневой болезни и заживление ран в эксперименте // Вопросы курортологии, физиотерапии и ЛФК. — 2010. — № 6. - С. 36-37.

7. Шпейзер Г.М., Хуторянский В.А., Смирнов А.И., Родионова В.А., Минеева Л.А., Юшков Г.Г., Малышкина H.A. и др. Современные технологии выделения бальнеологических препаратов из минеральных вод // Вопросы курортологии, физиотерапии и ЛФК. - 2010. - № 4. - С. 41-42.

В иных изданиях:

8. Малышкина H.A., Юшков Г.Г. Социально-экологические аспекты доклинического исследования фармакологических веществ из природного сырья // Сборник научных трудов Ангар, гос. техн. акад. - 2006. - Т. 2 - С. 15-19.

9. Малышкина H.A., Щукина О.Г., Игуменыцева B.B. Исследование нового фармакологического вещества из природного сырья в условиях однократного и субхронического воздействия // Экология Южной Сибири и сопредельных территорий: Матер. XI Междунар. науч.-практ. конф. - Абакан, 2007. - Вып. 11, Т. 2.-С. 136-137.

10. Малышкина H.A., Юшков Г.Г., Щукина О.В. и др. Динамика некоторых показателей состояния животных при исследовании ранозаживляющего действия нового фармакологического вещества из природного сырья // Экология и безопасность жизнедеятельности: Сб. статей VII Междунар. науч.-практ. конф. - Пенза, 2007. - С. 132-133.

11. Шпейзер Г.М., Смирнов А.И., Хуторянский В.А., Минеева Л.А., Радионова В.А., Малышкина H.A. и др. Перспективы расширения диапазона использования минеральных вод различной минерализации // Российско-монгольские совместные предприятия: Сб. IV междунар. науч.-практ. конф. -Иркутск, 2007. - С. 49-56.

12. Малышкина H.A., Юшков Г.Г. Динамика некоторых показателей состояния животных при исследовании ранозаживляющего действия нового фармакологического вещества из природного сырья // «Дальневосточная весна - 2008»: Матер. Междунар. науч.-практ. конф. в области экологии и безопасности жизнедеятельности. - Комсомольск-на-Амуре, 2008. -С. 445-447.

13. Малышкина H.A., Юшков Г.Г. Изменение некоторых показателей состояния лабораторных животных в токсикологическом эксперименте при исследовании фармакологического вещества из природного сырья 3-й съезд токсикологов России: Тез. докл. / под ред. акад. РАМН, проф. Г.Г. Онищенко, чл.-корр. РАМН, проф. Б.А. Курляндского. - М., 2008. - С. 421^123.

14. Малышкина H.A., Юшков Г.Г., Щукина О.В. и др. Исследование ранозаживляющего действия (при неинфицированной ране) нового фармакологического вещества из природного сырья // Вестн. Ангар, гос. техн. акад.: научный журнал № 1. - 2008. - Т. 2. - С. 87-89.

15. Малышкина H.A., Долгушин М.В., Юшков Г.Г. и др. К возможности использования цитохимических показателей нейтрофилов периферической крови крыс в оценке токсического действия этанола и фармакологического вещества на его основе // Актуальные вопросы электрофизиологии и незаразной патологии животных: Матер. Междунар. науч.-практ. конф., поев. 70-летию заведующего кафедрой терапии и клинической диагностики проф. Ю. А. Тарнуева: в 2-х ч. - Улан-Удэ: Изд-во БГСХА им. В.Р. Филиппова, 2009. -Ч. 2. - С. 56-62.

16. Малышкина H.A., Юшков Г.Г. Лабораторные животные в изучении ранозаживляющих свойств фармакологического вещества из природного сырья // Лабораторные животные как основа экспериментальной медицины: Матер.

науч.-практ. конф., поев. 25-летию создания службы экспериментального биомедицинского моделирования. - Томск, 2009. - С. 55-58.

17. Способ получения средства, обладающего ранозаживляющей активностью: Пат. 2357740 РФ: МПК А61К 35/08, А61Р 17/02 / Шпейзер Г.М., Хуторянский В .А., Минеева JI.A., Радионова В.А., Смирнов А.И., Глебец В.И., Малышкина H.A. и др.; заявители и патентообладатели Шпейзер Г.М., Хуторянский В.А. -2007130016/15; заявл. 06.08.2007; опубл. 10.06.2009. -Бюл. № 16.

18. Шпейзер Г.М., Смирнов А.И., Хуторянский В.А., Минеева JI.A., Радионова В.А., Малышкина H.A. и др. Использование минеральных вод в некурортной практике // Вестник Бурятского государственного университета. Химия. - 2009. - № 3. - С. 3-7.

19. Малышкина H.A., Юшков Г.Г. Токсиколого-гигиеническая оценка производства спиртового экстракта органической составляющей из минеральной воды «Нукутская» // Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности: Сб. трудов 9-ой междунар. науч.-практ. конф. - СПб., 2010.-Т. 2. -С. 23-25.

20. Расулов М.М., Малышкина H.A., Юшков Г.Г. Поведенческие реакции животных в оценке биологического действия 32% этанольного экстракта минеральной воды «Нукутская» // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: Сб. науч. трудов. - Пятигорск, 2011. -Вып. 66.-С. 572-573.

21. Малышкина H.A., Юшков Г.Г., Щукина О.Г. Поведенческие реакции животных в оценке биологического действия органических компонентов минеральной воды «Нукутская» // Современные технологии и научно-технический прогресс: Тез. докл. науч.-технич. конф. - Ангарск, 2013. - С. 52.

22. Speizer G.M., Hutorjansky V.A., Smirnov А.I., Mineeva L.A., Rodiono-va V.A., Yushkov G.G., Malyshkina N.A. Badanie wÖd mineralnych w praktyce nieuzdrowiskowej // Balneologia. - Poland, 2009. - Vol. 53, N 3 (117). - P. 201-204.

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АлАТ - аланинаминотрансфераза

КФ - кислая фосфатаза

МПО - миелопероксидаза

НР - норковый рефлекс

ОГУЗ РЦС ~~ окРУжное государственное учреждение здравоохранения

«Реабилитационный центр-санаторий»

ПОЛ - перекисное окисление липидов

СДА - спонтанная двигательная активность

СДГ - сукцинатдегидрогеназа

СОЭ - скорость оседания эритроцитов

СЦК - средний цитохимический коэффициент

ЩФ - щелочная фосфатаза

а-ГФДГ - а-глицерофосфатдегидрогеназа

у-ГТП - у-глутамилтранспептидаза

ЄБН - восстановленный глутатион

01_$о - доза вещества, вызывающая гибель 50 % животных

Подписано в печать 1.08.2013. Бумага офсетная. Формат 60х841/,6. Гарнитура Тайме. Усл. пен. л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ № 047-13.

РИО НЦРВХ СО РАМН (Иркутск, ул. Борцов Революции, 1. Тел 29-03-37. E-mail: arleon58@gmail.com)