Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Закономерности и особенности ранозаживляющей активности новых фармацевтических композиций при термическом ожоге в эксперименте на животных

На правах рукописи

Алтухов Владимир Викторович

ЗАКОНОМЕРНОСТИ И ОСОБЕННОСТИ РАНОЗАЖИВЛЯЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ НОВЫХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ КОМПОЗИЦИЙ ПРИ ТЕРМИЧЕСКОМ ОЖОГЕ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ НА

ЖИВОТНЫХ

14.03.06- фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертация на соискание ученой степени кандидат медицинских наук

З ';ІА і і 1Ш

Челябинск - 2012

005016059

005016059

На правах рукописи

Алтухов Владимир Викторович

ЗАКОНОМЕРНОСТИ И ОСОБЕННОСТИ РАНОЗАЖИВЛЯЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ НОВЫХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ КОМПОЗИЦИЙ ПРИ ТЕРМИЧЕСКОМ ОЖОГЕ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ НА

ЖИВОТНЫХ

14.03.06- фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертация на соискание ученой степени кандидат медицинских наук

Челябинск-2012

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Уральская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации. Научный руководитель: доктор медицинских наук,

профессор Ларионов Леонид Петрович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор,

Заслуженный деятель науки РФ

ГБОУ ВПО «Челябинская государственная

медицинская академия»

Минздравсоцразвития России Волчегорский Илья Анатольевич доктор медицинских наук,

профессор, ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия»

Минздравсоцразвития России Юшков Владимир Викторович

Ведущая организация: Федеральное бюджетное государственное учреждение НИИ Фармакологии им. В. В. Закусова РАМН, Москва

Защита диссертации состоится «_»_2012 г. в_часов

на заседании Диссертационного Совета Д 208.117.03 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации. Автореферат разослан « »_2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук Латюшина Л.С.

ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Ожог (Combustio) - это повреждение тканей организма, возникающее в результате местного действия высокой температуры, а также химических веществ, электрического тока или ионизирующего излучения. Термические повреждения тканей являются не только частым, но и имеющим явную тенденцию к нарастанию бытовой, производственной и техногенной травмой.

События последних лет, на фоне природных аномальных явлений, прямо или косвенно привели к увеличению ожоговой травмы. Только за два последних года (2010- 2011) в России от ожогов погибло более 20000 человек, около 800000 человек получили ожоги различной степени тяжести, из них более 200000 нуждались в госпитализации [http://www.mchs.gov.ru]. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), ожоги занимают третье, а в некоторых странах даже второе место по частоте среди прочих травм.

На протяжении многих лет в нашей стране используется четырехстепенная классификация ожогов. Тяжесть ожога зависит не только от глубины, но и от площади ожога. При лечении ожогов II и Illa степени тяжести большей частью используют местное лечение [Кузин М. И., 1985;Алексеев А. А., 2011]. На сегодняшний день широкое распространение в лечении ожоговых ран получили мази на водорастворимой основе: левомеколь, левосин, левонорсин, диоксиколь, йодопироновая, диоксидиновая мази и другие. Среди зарубежных препаратов на водорастворимой основе широкое применение нашли сульфамилон и фламазин. Выраженное антимикробное, дегидратирующее, противовоспалительное, некролитическое и обезболивающее действие таких мазей делает их препаратами выбора для лечения ожоговых ран, в том числе при пограничных ожогах Illa степени тяжести [Крутиков М. Г., 2000]. Наряду с положительными действиями данных мазей, отдельные из них могут обладать аллергическими, тератогенными и эмбриотоксическими свойствами, оказывать мутагенное влияние. Данные препараты нельзя использовать в

период лактации и при недостаточности функции надпочечников [Машковский М. Д., 2005]. На сегодняшний день лечение пациентов с ожогами до конца еще не решено, поэтому поиск, разработка и создание новых мягких лекарственных средств и новых технологий их применения является актуальной проблемой.

Цель исследования Обосновать рецептуру новых фармацевтических композиций, создать опытные образцы мягких лекарственных форм и выявить у них возможные закономерности и особенности ранозаживляющей активности при термическом ожоге на животных. Задачи исследования

1. Обосновать выбор новых составляющих для создания новых фармацевтических композиций в мягкой лекарственной форме на основе кремнийорганического глицерогидрогеля с рабочим названием «Силативит».

2.Изучить возможную острую и хроническую токсичность новых фармацевтических композиций на различных видах экспериментальных животных при различных путях введения.

3.Изучить ингибирующее влияние фармацевтических композиций на микроорганизмы, выделенные с ожоговых ран и на госпитальные штаммы в условиях in vitro и in vivo.

4.Изучить закономерности и особенности ранозаживляющей активности новых фармацевтических композиций в мягкой лекарственной форме при термическом ожоге II и Ша степени тяжести на крысах в возрасте 2-4-х месяцев.

Научная новизна

В процессе экспериментальных исследований впервые разработана рецептура трех новых фармацевтических композиций в мягкой лекарственной форме на основе Силативита, для местного применения, которым определены рабочие названия опытных образцов:

-«Силат-1»: пефлоксацин- 1%, хлоргексидин биглюконат 0,05%, лидокаина гидрохлорид- 1% и до 100,0 г основа. -«Силат-2-M»: пефлоксацин- 1%, хлоргексидин биглюконат

0,05%, метилурацил-1%, лидокаина гидрохлорид- 1% и до 100,0 г основа.

-«Силат-3- НК»: пефлоксацин- 1%, хлоргексидин биглюконат 0,05%, лидокаина гидрохлорид- 1%, никотиновая кислота- 1 % и до 100,0 г основа.

В условиях эксперимента in vitro установили химическую совместимость лекарственных компонентов и Силативита, a in vivo на 4-х видах животных показана безопасность применения изучаемых фармацевтических композиций. В сравнительном аспекте на модели термического ожога у крыс доказана ранозаживляющая и противомикробная активность изучаемых препаратов (у опытных крыс с ожоговых поверхностей ран выделены «условно-патогенные», а в контрольной группе «патогенные» микроорганизмы). Кроме того, впервые выявлены особенности и закономерности поведенческих реакций крыс различных возрастных групп на фоне применения разработанных фармацевтических композиций в процессе лечения термических ожогов (уход с центрального круга, их вертикальная и горизонтальная активность, обследование «нор» чистка). При этом так же выявлены некоторые закономерности и особенности интегральных показателей общего и биохимического анализа крови при использовании изучаемых новых фармацевтических композиций (эритроциты и их маркеры, гемоглобин, гематокрит, лейкоциты, лимфоциты, общий белок, АлАТ, АсАТ, глюкоза и другие). В целом, сроки заживления ран при аппликациях фармацевтическими композициями по сравнению с нелечеными животными сократились на 3-6 дней с более благоприятным рубцеванием.

Практическая значимость работы

В результате проведенных доклинических исследований и полученного экспериментального материала по выявлению не токсичности, безопасности применения и высокого уровня ранозаживляющего действия новых фармацевтических композиций дают основание просить у Фармакологического совета Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации разрешения на клиническую апробацию

указанных мягких лекарственных форм при местном лечении

ожогов II- Illa степеней тяжести.

Основные положения, выносимые на защиту

1.Разработаны новые фармацевтические композиции на основе Силативита для местного применения их при термическом ожоге в эксперименте на крысах.

2.Выявлена безопасность применения новых фармацевтических композиций на 4-х видах лабораторных животных при различных путях и длительности их введения, которая подтверждена отсутствием острой и хронической токсичности.

З.Определены закономерности и особенности проявления фармакологического действия с высоким уровнем ранозаживляющего эффекта разработанных фармацевтических композиций при использовании модели термического ожога.

4.При изучении ранозаживляющего действия новых лекарственных композиций на модели термического ожога II-111а степеней у экспериментальных животных выявлены некоторые особенности в поведенческих реакциях, интегральных показателях крови и микробиологической обсемененности ожоговых ран.

Связь темы диссертации с планом основных научных работ

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Уральская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, регистрационный номер: 01201253300.

Внедрение результатов исследования

Результаты диссертационного исследования используются в учебном и научном процессе на кафедре фармакологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Уральская государственная медицинская академия» Министерства

здравоохранения и социального развития Российской Федерации, в лекционных материалах по фармакологии Государственного бюджетного образовательного учреждения среднего профессионального образования «Свердловский областной медицинский колледж» и в научно-исследовательской работе ООО «Силафарм». Апробация работы Основные результаты исследования обсуждались и докладывались на Всероссийской конференции «Химия и медицина, Орхимед- 2009», Уфа, 2009; на конференции с международным участием «Достижения клинической фармакологии в России», Москва, 2009; на IV съезде физиологов Урала с международным участием, Екатеринбург, 2009; на 5-й Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» Москва, 2010; на II Конгрессе Международного общества клинических фармакологов и фармацевтов стран СНГ.- Москва, 2010; на конференции с международным участием «Формация и общественное здоровье», Екатеринбург, 2011. Публикации

По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе 4 в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 136 страницах компьютерного текста, содержит 20 таблиц и 87 рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, главы описания материалов и методов исследования, собственных исследований, заключения, выводов, списка используемой литературы. Библиографический список содержит 168 источников, из них 120- на русском и 48- на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Материалы. Кремнийорганический глицерогидрогель «Силативит», пефлоксацин, хлоргексидин биглюконат, метилурацил, лидокаина гидрохлорид и никотиновая кислота.

«Силативит»- это синтезированный водорастворимый гель, содержащий органический эссенциальный микроэлемент кремний и обладающий хорошей транскутанной активностью. На его основе созданы рабочие фармацевтические композиции: «Силат-1», «Силат-2- М» и «Силат-З-НК».

Общая характеристика экспериментальных животных. Общее количество животных использованных в эксперименте 1033 особи. Из них: белые мыши с массой (18-24 г)-140 особей, белые крысы подтипа популяции Wistar обоего пола, разного возраста и массы - 866 особей, кролики породы Шиншилла-18 особей с массой (2,5-3,6 кг) и 9 морских свинок с массой 340- 360 г. Организация работы соответствовала международным этическим нормам, регламентирующим эксперименты на животных: приказ МЗ СССР № 775 от 12.08.1977 г., приказ МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г.

Методы исследования. В процессе экспериментальных исследований были использованы методы рекомендуемые Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ (М. 2005 г) и XII Государственной Фармакопеи РФ (М. 2007 г). Для выявления острой ' и хронической токсичности фармацевтические композиции в виде 50 % суспензий вводили внутрижелудочно и внутрибрюшинно. Для изучения местнораздражающего, сенсибилизирующего действия производили аппликации фармацевтическими композициями на депелированные участки кожи и путем закладывания их в форме мази за веко глаза животных. При изучении влияния фармацевтических композиций на течение заживления ожоговых ран у крыс использовали методику «открытое поле», позволяющую косвенно оценить качество жизни животных (стр. 11). Кроме того, ранозаживляющее действие лекарственных композиций в модели термического ожога оценивали с использованием тепловизора (Testo 880, табл. 3). Тяжесть течения ожоговой травмы оценивали на основании исследований показателей общеклинического (Advia 60, рис.3-4), биохимического анализов (BioSistems А25, табл. 5) крови и изучения

микробиологичекой флоры, выделенной с ожоговых ран (табл.69). На заключительном этапе были проведены гисто-морфологические исследования биологических тканей кожных покровов и отдельных висцеральных органов (головной мозг, легко«:, миокард, печень и другие) с использованием окраски препаратов по ван- Гизону и Вейгерту, гематоксилином и эозином. Статистическую обработку проводили с помощью пакетов компьютерных программ Microsoft Office Excel и Microsoft Excel «Biostatistica». Полученные данные были обработаны методами дескриптивной статистики и представлены в виде средней арифметической и ее стандартной ошибки (М±ш). О достоверности межгрупповых различий судили с помощью критерия Манна-Уитни и критерия точности Фишера (односторонний вариант). Проверка статистических гипотез осуществлялась при критическом уровне значимости Р= 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ

ОБСУЖДЕНИЕ Доклиническая оценка действия фармацевтических композиций на основе Силативита Оценка острой токсичности. Исследование острой токсичности было проведено на беспородистых белых мышах (массой 18- 24 г) и белых крысах подтипа популяции Wistar обоего пола разного возраста и массы. Рабочие композиции использовали в виде 50 % суспензий в объемах для мышей 0,5 мл/10 г, для крыс с массой 70-80 г, с массой 180-210 г, с массой 280-350 г - 1,5 мл/ 100 г животного. На каждую композицию было определено по 20 мышей и крыс (6 опытных и 2 контрольные группы). В результате проведенных исследований острую токсичность со стороны трех рабочих фармацевтических композиций выявить не удалось.

Оценка хронической токсичности. Изучение

сенсибилизирующих свойств композиций было проведено на 9 кроликах (3 группы по 3 особи) породы Шиншилла обоего пола с массой 2,5- 3,6 кг. На подготовленные участки кожи (4х 4 см) справа в виде аппликаций наносили ежедневно опытные

образцы композиций по 1 г в течение 28 дней. На подобных участках слева на 7, 14 и 28 день была проведена разрешающая проба путем нанесения тех же самых композиций. Реакций в виде гиперемии, отека со стороны кожных покровов на фоне аппликаций композициями «Силат-1» и «Силат-2-М» не отмечалась. Однако, легкая гиперемия проявлялась при использовании композиции «Силат-З-НК», которая исчезала через 15-20 мин. На 29-й день было проведено электрокардиографическое обследование кроликов. Результаты исследования ЭКГ кроликов представлены в таблице 1.

Таблица 1

Основные показатели ЭКГ кроликов на фоне разрешающих проб на 29 день

Композиции Показатели основных чсс Дыхание

п комплексов ЭКГ в мин в мин

Р(3 с. (ЗЯБ с. ОТ с. (140-150) (50- 100)

Силат-1 3 0,07± 0,035± 0,135± 149,00± 76,50±

0,009 0,009 0,009 1,95 2,93

Силат-2-М 3 0,078± 0,04± 0,14± 146,0± 73,0±

0,01 0,0005 0,01 0,01 1,13

Силат-3- НК 3 0,08± 0,03± 0,15± 147,3± 72,0±

0,01 0,0005 0,01 0,01 2,26

Примечание: результаты ЭКГ через 15, 30 и 60 мин после разрешающей пробы в группах, соответствовали исходным показателям ЭКГ после 28-и дневной аппликации композициями, (п=9)

На представленных ЭКГ кроликов: синусовый ритм, правильный. Желудочковые комплексы не изменены. Вольтаж зубцов и интервалы между зубцами соответствуют норме. Признаков патологических изменений не выявлено.

Оценка местного раздражающего действия композиций на кожу и слизистые

Эксперимент был проведен на 9 кроликах, по 3 особи в каждой группе, обоего пола. На подготовленные участки кожи от шерсти 4x4 см справа наносили испытуемые рабочие композиции по 100 мг в течение 30 дней. На подготовленные участки кожи слева, который служил контролем, наносили детский крем в подобной дозе. За весь период на фоне применения композиций №1 и №2 проявлений эритемы и отека со стороны кожи не наблюдали. При исследовании композиции

№3 (с никотиновой кислотой) отмечалась легкая гиперемия кожных покровов, которая через 15- 20 мин исчезала. При внесении изучаемых композиций за ве ко правого глаза в дозе 50 мг (левый контроль- вода для инъекций) на фоне композиций № 1 и № 2- реакции выявлено не было. После внесения композиции № 3 отмечалась гиперемия конъюнктивы века глаза., которая исчезала на 25-30 мин. Результаты исследований представлены в таблице 2.

Таблица 2

Результаты исследования раздражающего действия композиций __на слизистые глаза у кроликов (п=9)__

На фоне внесения композиций (50 мг) п Время проявления я исчезновения гиперемии со стороны слизистых глаза у кроликов в мин

до 5 5-10 10-15 15- 20 20- 25 25- 30

«Силат-1» 3 нет* нет* нет* нет* нет* нет*

«Силат-2-М» 3 нет* нет* нет* нет* нет* нет*

«Силат-З-НК» 3 да да да да да нет

Примечание: при закладывании за веко композиций «Силат-1» и «Силат-2-М» за весь период времени эксперимента гиперемии не выявлено. На фоне «Силат-З-НК» с первых минут отмечена гиперемия, которая исчезла на 25-30 минуте. Термин «нет» говорит об отсутствии, «да» о присутствии гиперемии в 100 % случаев. Результат статистически значим в «Силат-1» и «Силат-2-М» по отношению к «Сштат-З-НК», * р< 0,05

Особенности этологических показателей крыс на фоне термического ожога и применяемых фармацевтических композиций. Эксперимент был проведен на белых крысах обоего пола с возрастом 2-4 месяца, с массой соответственно (160± 20 г) и (210 ± 30 г), которые были распределены на 4 группы по двадцать особей обоего пола в каждой. Три группы были опытными и одна контрольная. Основными критериями ориентировочно-исследовательских реакций служили: уход с центрального круга в секундах, количество пересеченных квадратов (горизонтальная активность), количество вставаний на задние лапы (вертикальная активность), обследование нор (отверстий) и груминг (чистка) за 3 минуты эксперимента, повторяющего через 30, 60 и 90 мин. Регистрацию

осуществляли до ожога, через сутки и на 15~ые сутки после него в ходе эксперимента. Через сутки после ожога крысам опытных групп наносили на пораженные участки кожи разработанные фармацевтические композиции в дозе 250 мг соответственно: первой группе - «Силат-1», второй- «Силат-2-М» и третьей-«Силат-3- НК». Контрольная группа животных лечения не получала. Так как показатели исходной регистрации этологических реакций опытных и контрольных групп крыс оказались неоднозначными, поэтому они были переведены в единую единицу измерения- проценты. Для этой цели мы суммировали показатели поведенческих реакций 4-х измерений эксперимента (исходные, через 30, 60 и 90 мин), и получив из них средние величины, которые и взяли за 100 %. Результаты представлены на рисунках 1 и 2.

Рис. 1. Горизонтальная активность крыс Рис.2. Вертикальная активность крыс в динамике, в %. (п=20), * р< 0,05 в динамике, в % (п=20), * р< 0,05

Через сутки после ожога горизонтальная и вертикальная активность опытных групп крыс достоверно изменилась (снизилась) по отношению к исходным значениям (рис. 1,2). В контрольной группе так же отмечается снижение данных показателей. На 15~Ь|е сутки на фоне лечения композициями активность опытных групп значительно возросла по отношению к контрольной, что свидетельствуют о более благоприятном течении ожоговой болезни.

Оценка влияния фармацевтических композиций на температуру кожи ожоговых ран и их заживляющую способность с использованием метода тепловидения. В данном разделе с использованием тепловизора проведено

исследование температуры кожных покровов ожоговых ран и их ранозаживляющая способность на фоне аппликаций фармацевтическими композициями в сравнении с контрольной группой животных. Результаты полученных данных термограмм представлены в таблице 3.

Таблица 3

Площадь ожоговых ран кожи крыс на фоне аппликаций

композициями, в динамике (п=40)

Композиции п 8- площадь ожоговых ран в см 2 (с температурой кожи 33,5- 35,5 'С)

через сутки п/ожога на 5"ые сутки п/ожога на 15"ые сутки п/ожога

«Силат-1» 10 4,45± 0,08 3,12± 0,08 * 0,76± 0,16 *

«Силат-2-М» 10 4,52± 0,07 2,96± 0,09 * 0,88± 0,07 *

«Силат-3 НК» 10 4,50± 0,07 2,76± 0,21 * 0,78± 0,06 *

Контрольная группа 10 4,52± 0,07 3,98± 0,12 * 2,96± 0,14 *

Примечание: результат статистически значим в динамике по отношению к исходным данным в группе, * р< 0,05

На основании проведенных исследований можно сделать вывод о том, что на фоне аппликации фармацевтическими композициями площадь ожоговой раны с высокой

температурой кожи у опытных крыс значительно меньше, чем у крыс контрольной группы, что еще раз свидетельствует о достоверности ранозаживляющей активности изучаемых композиций.

Изучение особенностей и закономерностей интегральных показателей общего анализа крови у крыс в зависимости от возраста. Нами были сформированы четыре возрастные группы животных обоего пола по 10 крыс в каждой группе. В первую группу были включены крысы в возрасте месяц (массой 90 ± 10 г), во вторую в возрасте 2- 3 месяца (масса 160 ± 30 г), в третью -5- 6 месяцев (300± 50 г) и в четвертую -19- 22 месяцев (масса 400±100). У всех групп животных из сосудов хвоста после частичной резекции (ампутация) была взята кровь в объеме 0,5-1 мл для гематологических исследований. Предварительно кончик хвоста животного согревали в теплой воде, что улучшало

кровоток. Результаты полученных исследований представлены в таблице 4.

Таблица 4

Отдельные гематологические показатели у крыс

разного возраста и массы тела

Показатели крови 1- группа крыс 2- группа крыс 3- группа крыс 4- группа крыс

лейкоциты (Ю9/л) 8,29 ±0,24 9,16 ±0,16* 10,11 ±0,23* 11,25 ±0,51*

эритроциты (1012/л) 6,82 ± 0,36 7,09 ±0,28 7,3 ± 0,32 8,11 ±0,13*

гемоглобин (Г/Л) 122,3 ±2,08 130,3 ±3.87* 136,0 ±3,69* 142,25 ±5,81*

гематокрит (%) 38,19 ± 1,26 42,00 ±1,75* 48,00 ±1,45* 50,9 ±2,68*

ср. объем эр. (Я) 67,8 ± 0,75 65,0 ±1,27* 62,16 ±1,06* 58,75 ±0,30*

ср.содержание. гем. в эр.(рй) 21,18±0,83 19,88 ±0,45* 17,61 ±0,35* 16,50 ±0,39*

ср. концентр, гем. в эр. (¿1) 312,60 ±10,53 309,30 ±4,03 283,66 ±3,89* 279,50 ±5,50*

анизоцитоз (%) 14,36 ±2,50 15,82 ±0,47 11,36 ± 0,27* 11,55 ±0,11*

лимфоциты (%) 86,00 ± 2,03 77,23 ± 3,84* 72,99 ±5,15* 68,67 ± 4,96*

моноциты (%) 3,03 ± 0,42 2,72 ±0,37 3,40 ±0,57 3,90 ±0,14*

гранулоциты (%) 9,77 ± 0,29 14,40 ±1,14* 12,20 ±2,28 16,67 ±6,67*

Примечание: результат статистически значим по отношению к первой группе, р< 0,05 (п=Ю)

В ходе исследования установлено, что с возрастом у крыс в показателях красной крови отмечается увеличения количества эритроцитов, на фоне снижение показателей в их основных маркерах. Отмечается увеличение концентрации гемоглобина. Со стороны белой крови отмечается увеличение количества лейкоцитов и моноцитов, на фоне снижения лимфоцитов.

Влияние лекарственных композиций на отдельные показатели общего анализа крови у крыс в динамике при использованной модели термического ожога. Для решения этой задачи было так же сформировано 4 группы крыс разного

пола в возрасте 2-4 месяцев. Взятие крови на исследования проводили из сосудов хвоста после частичной его резекции (11,5 см) до создания ожога, а так же на 5- ые сутки у всех групп животных, после ожога. Опытные группы, через сутки после ожога, получали лечение. Схема назначения препаратов была подобной предыдущему эксперименту. На 15-ые сутки после ожога кровь для OAK отбирали из сердца животного (методика описана в следующем разделе). Результаты исследований представлены на рисунках 3-4.

ш

ВНЕ

До ожога На 5-ые На 15-ые сутки сутки п/ожога п/ожога

0 Силат-1 ■ Силат-2-M а Силат-З-НК □ Контр. Гр

Рис.3. Показатель эритроцитов в абс. н. Рис. 4. Показатель гемоглобина в г/л,

(10,2/л) в динамике (п=10), * р<0,05 в динамике (п= 10), * р<0,05

Со стороны показателей красной крови, на 5"ые сутки после ожога во всех группах животных отмечается статистически значимое снижение количества эритроцитов (рис. 3) с более выраженной тенденцией в контрольной крупе и на фоне аппликации «Силат-1». На 15"ые сутки зафиксировано увеличение количества эритроцитов у всех групп животных, хотя по-прежнему данный показатель оставался несколько ниже исходных значений. Концентрация гемоглобина на 5"ые сутки после ожога достоверно увеличилась на фоне аппликации композициями «Силат-1» и «Силат-2-М» (рис.4). На 15"ые сутки в контрольной группе концентрация гемоглобина соответствовала исходным значениям до ожога, в то время как в опытных группах данный показатель остался несколько повышенным.

Влияние лекарственных композиций на биохимические показатели крови крыс при термическом ожоге.

Исследование биохимических показателей крови (сыворотки)

крыс при термическом ожоге в контрольной и опытных группах на фоне лечения их изучаемыми композициями провели на 15" ь1е сутки после ожога. У 50-ти % крыс контрольной и опытных групп под эфирным наркозом с последующей эвтаназией осуществлен отбор крови для биохимических исследований (и OAK) непосредственно из полостей сердца животного. Объем крови составлял в среднем 6-8 мл. За оставшейся частью крыс (50%) продолжили наблюдения для оценки ранозаживляющей способности композиций. Результаты представлены в таблице 5

Таблица 5

Биохимических показатели крови у крыс, на фоне лечения

их композициями (п=10)

Исследования Показатели биохимических анализов полученных у крыс, на фоне лечения их композициями Контрол. группа крыс

«Силат-1» «Силат-2» «Силат-3»

Общий белок (г/л) 71,50±2,5* 72,00±2,0* 75,0±2,10* 66,80± 3,31

Альбумины (%) 29,75±2,2* 30,16± 1,37 33,6±1,12* 33,86± 2,68

Глобулины (%) 41,75±3,7* 41,50±1Д* 48,6±2,64* 32,90± 1,16

А/Г 0,73± 0,11* 0,72± 0,03* 0,69±0,05* 1,02± 0,06

Мочевина (мМоль/л) 5,940,20 6,06±0,43 6,04±0,12 6,12± 0,47

Креатинин (мкМоль/л) 41,87±1,73 41ДЗ±5,78 42,8±2,11* 41,74±6,41

АсАТ (Ед/л) 135,25±15,21* 156,5±7,12* 129,6±7,2* 261,8±18,4

АлАТ (Ед/л) 69,00±4,82* 75,50± 2,16* 71,2±7,09* 122,00±34,23

ЩФ (Ед/л) 414^5^28,02* 381,8±62,14* 364,2±11,24* 776,20i67,94

ХС (мМоль/л) 1,57±0,10* 1,08± 0,13* 1.60±0,21* 2,31± 0,30

ТГ(мМоль/л) 0,70± 0,08 1,46±0,68* 0,88±0,08* 1,43±0Д5

ЛПВП (мМоль/л) 1,8±0,08 1,66±0,11* 1,48±0,04 1,52±0,19

ЛПНП (мМоль/л) 0,12±0,04 0,11 ±0,08 0,15±0,03 0,086± 0,07

ЛПОНП (мМоль/л) 1,17±0,15 1,03±0,14 1,06±0,08 1,04±0,16

Глюкоза (мМоль/л) 7,15±0,40* 7,60± 0,55* 8,04±0,14* 9,46± 0,98

Примечание: различия статистически значимы по отношению к показателям в контрольной группе, * р< 0,05

На 15"ые сутки после ожога в контрольной группе отмечается снижение концентрации общего белка, повышение

альбумино/глобулинового коэффициента, увеличение АсАТ, АлАТ, ЩФ, холестерина и глюкозы, по отношению к опытным группам животных, что свидетельствует о более выраженном патологическом процессе в группе нелеченых животных. В опытных группах данные изменения менее выражены, что подтверждает факт более благоприятного течении ожоговой болезни.

Сравнительная оценка микробной обсемененности ожоговых ран на фоне применения фармакологических композиций в условиях in vivo и in vitro

Отбор материала для микробиологического исследования с ожоговых ран проводили на 4 сутки после ожога у всех групп крыс в среду Эймса. В дальнейшем микробиологические исследования проводили согласно классической трехэтапной схеме, направленной на выявление и идентификацию чистых культур. В результате данного исследования выявили, что у первой, второй и третьей групп животных на фоне лечения опытными образцами композиций, микробиологический пейзаж несколько отличался между собой, и тем более по отношению к контрольной группе, которая в период всего эксперимента оставалась без лечения. Результаты исследований представлены в таблице 6.

Таблица 6

Сравнительная характеристика выделенных микроорганизмов

с ожоговых ран, в % (п=10)

Выделенные микроорганизмы «Силат-1» «Силат-2-M» «Силат-3-HK» Контроль, группа

S. epidermidis 40 50 30 10

S. sapraphyticus 20 50 50

Pr. mirabilis _ 10

Ps. aeruginosa _ _ 20

S. aureus * * * 60

Coiynebacterium 40* - 20 -

Примечание: В данном разделе для удобства в сравнительной оценки результатов исследования использована схема, согласно которой одна пробирка составляет 10 % (всего по 10 пробирок на группу-100 %)

- у опытных групп на фоне «Силат-2-M» и «Силат-З-НК», а также в контрольной группе из пробирок выделена смешанная микрофлора.

- статистически значимым явилось отсутствие роста S. aureus в опытных группах животных на фоне аппликаций композициями, а так же рост Corynebacterium на фоне «Силат-I» по отношению к контрольной группе, * р= 0,005 и соответственно р= 0,004.

- в контрольной группе крыс в 60 % случаев (в 6-и пробирках) ожоговая рана представлена S. aureus, и в 20 % (в 2-х пробирках) Ps. aeruginosa

В дальнейшем было проведено исследование по ингибирующему действию композиций на выделенные микроорганизмы с ожоговых поверхностей крыс in vitro, согласно требованиям ГФ XI издания (2007 г). Рабочие концентрации композиций, согласно прописи, смешивали с приготовленным теплым (48-50 °С) кровяным агаром в соотношении 1: 9 (одна часть композиции и девять частей среды) и затем разливали по чашкам Петри. После застывания агара, чашку Петри делили на 4 сектора и в каждый сектор вносили суспензию микроорганизмов бактериологической петлей (диаметр 3 мм) в концентрациях 10 КОЕ/мл; 104 КОЕ/мл: 10s КОЕ/мл; 10б КОЕ/мл (0,5 по стандарту мутности McFarland). Посев каждого микроорганизма проводился на 5 чашках, в 4-х секторах в указанных концентрациях. Результаты исследований представлены в таблице 7.

Таблица 7

Результаты ингибирующего действия фармацевтических

композиций на микроорганизмы, выделенные с ожоговых ран

Выделенные микроорганизмы n Наличие (да) или отсутствие (нет) роста микрофлоры в указанных концентрациях на композиции (КОЕ/мл)

Ю3 ю4 ю5 106

S. epidermidis 5 нет* нет* нет* нет*

S.sapraphyticus 5 нет* нет* нет* нет*

Pr. mirabilis 5 нет* нет* нет* нет*

Ps. aeruginosa 5 да да да да

S. aureus 5 нет* нет* нет* нет*

Corynebacterium 5 нет* нет* нет* нет*

Примечание: в условиях in vitro, на всех композициях в указанных концентрациях отсутствовал, за исключением Ps. aeruginosa, рост ее был отмечен во всех концентрациях. Термин «нет»- подчеркивает полное отсутствие роста микроорганизмов в 100 % случаев. Результат статистически значим по отношению к Ps. aeruginosa, * р< 0,05 (п=30)

Все композиции, входящие в состав агара, в рабочих концентрациях проявили ингибирующее действие к выделенным штаммам, за исключением синегнойной палочки, которая росла на среде, содержащей фармацевтические композиции в указанных концентрациях.

Исследование ингибирующего действия мягких фармацевтических композициям на отдельные госпитальные штаммы микроорганизмов в условиях in vitro. В данном разделе работы представлены результаты исследования, направленные на определение ингибирующего действия фармацевтических композиций к госпитальным штаммам микроорганизмов. Схема данного эксперимента аналогична предыдущему. Результаты исследований представлены в таблице 8.

Таблица 8

Ингибирующее действие фармацевтических композиций на

отдельные госпитальные штаммы микроорганизмов,(п=20)

Госпитальн ые штаммы микроорган измов n Наличие (да) или отсутствие (нет) роста микрофлоры в указанных концентрациях на композиции (КОЕ/мл)

10 ю4 106

Ps. aeruginosa 5 да да да да

S. aureus 5 нет* нет* нет* нет*

E. coli 5 нет* нет* нет* нет*

K.pneumoniae 5 нет* нет* нет* нет*

Примечание: все композиции проявили ингибирующее действие к микроорганизмам в указанных концентрациях и их рост-отсутствовал, за исключением Ps. aeruginosa. Термин «нет»-подчеркивает полное отсутствие роста микроорганизмов в 100

% случаев. Инкубация 24-48 час. Результат статистически значим по отношению к Ps. aeruginosa, * р< 0,05, (п=30)

Таблица 9

Диаметры зоны роста Ps. aeruginosa на фармацевтических _ композиция, Т=37 "С (п=15)_

Компози- п Средний диаметр зоны (мм) роста Ps. aeruginosa при концентрации (КОЕ/мл)

ции 10 ю4 10* 10й

Силат-1 5 0,64±0,07 0,90±0,08* 1,24±0,04* 1,58±0,07*

Силат-2-M 5 0,62± 0,11 0,80± 0,10 1,30±0,06* 1,52t 0,07*

Силат-3 НК 5 0,56± 0,13 0,78± 0,08* 1,26±0,07* 1,50± 0,06*

Примечание: на каждую композицию определено по 5 чашек Петри, в каждой чашки 4 сектора, в каждый внесена Ps. aeruginosa,- согласно указанных концентраций. Результат статистически значим по отношению к зоне роста в группе с меньшей концентрации, * р< 0,05

Влияние лекарственных композиций при накожном применении на гисто-морфологические структуры кожи крыс без термического ожога и на отдельные висцеральные органы при 90- дневной аппликации. Были сформированы 3 группы крыс в возрасте 1,5-2 месяца по 10 особей обоего пола в каждой. Для оценки влияния изучаемых композиций на гисто-морфологическое состояние биологических тканей их наносили на подготовленные от шерсти 2x2 см участки кожи животных в объеме 50 мг на правое бедро животных, через сутки, а так же на 5"ые, 10"ые, 15"ые и 20"ые сутки. В указанные сроки под эфирным наркозом с последующей эвтаназией, вырезали фрагменты кожных лоскутов фиксировали в 10% раствор формалина, заливали парафином и делали срезы для гисто-морфологических исследований. На гистограммах структурных органических изменений во всех препаратах кожи трех групп животных на фоне 20-дневной аппликации фармацевтическими композициями не выявлено. Полученные результаты исследований кожных фрагментов соответствуют гистологической норме контрольной группы животных.

Проведенные гисто-морфологические исследования при сравнительной оценке отдельных гисто-препаратов висцеральных органов крыс (головной мозг, миокард, легкое, надпочечники, печень, поджелудочная железа, почки, селезенка, тонкий кишечнике), на фоне фармацевтических композиций «Силат-1», «Силат-2-М» и «Силат-З-НК» так же позволяют сделать заключение о безопасном применении новых композиций при достаточно длительном (90- дневном) их применении.

Выводы

1. Определена рецептура трех фармацевтических композиций в мягкой лекарственной форме на основе кремнийорганического глицерогидрогеля (Силативита) для местного лечения термических ожогов и установлена фармацевтическая совместимость фармакологически активных веществ, которая указывает на сохранность фармакологической активности лекарственных препаратов, входящих в состав композиций.

2. В условиях экспериментальных исследований при однократном и длительном (90-дневном) применении при различных путях введения установлено отсутствие острой и хронической токсичности, аллергизирующих и сенсибилизирующих свойств, а так же установлена безвредность для экспериментальных животных применение данных опытных образцов фармацевтических композиций, что подтверждено гисто-морфологическими результатами.

3. На фоне смоделированного термического ожога у крыс при накожных аппликациях композиций выявлено более легкое течение ожоговой болезни, о чем подтверждено полученными показателями локомоторной активности опытных групп животных в методике «открытое поле».

4. При сравнительной оценке полученных показателей общего и биохимического анализов крови в условиях эксперимента на фоне лечения термических ожогов у опытных животных

выявили закономерности и особенности, свидетельствующие о более благоприятном течении ожоговой болезни, а так же о более ранних сроках заживления термических ран (на 3- 6 суток) на фоне лекарственных композиций.

5. В условиях in vitro и in vivo микробиологический пейзаж ожоговых ран на фоне лечения композициями представлен в основном «условно-патогенной» микрофлорой. При этом выявлена особенность ингибирующей активности лекарственных композиций в отношении отдельных госпитальных штаммов микроорганизмов в концентрациях 103-Ю6КОЕ/ мл.

Практические рекомендации

На основании представленных результатов можно рекомендовать для использования, разработанные и изученные лекарственные композиции на основе Силативита для апробации в ветеринарной и клинической практике при местном лечении ожогов, а так же гнойных кожных ран после получения разрешения Этического комитета.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Алтухов, В. В. Использование кремнийорганического глицерогидрогелия при термических ожогах у экспериментальных животных [Текст ] / В. В. Алтухов, Т. Г. Хонина, Т. Г. Бояковская:. //Клинические исследования лекарственных средств»: матер. V Междунар. конф - М.: РАМН, 2005.- С. 8-9.

2. Алтухов, В. В. Возрастные особенности физиологической активности и показателей крови у экспериментальных животных [Текст ] / В. В. Алтухов, А. А. Волков // Вестник уральской мед. акад. наук.- 2009 .- №2.- С. 223- 224.

3. Алтухов, В. В. Возможные варианты облегчения физиологического восстановления тканей кожи

экспериментальных животных при использовании фармацевтических композиций на основе

кремнийорганического глицерогидрогеля [Текст ] / В. В. Алтухов, А. А. Волков, Л. П. Ларионов, Т. Г. Хонина, Е. В. Шадрина // Вестник уральской мед. акад. наук.- 2009.- №2.-С. 259- 260.

4. Алтухов, В. В. Особенности локомоторной активности и показателей периферической крови у экспериментальных животных различных возрастов [Текст] / В. В. Алтухов, Л. П. Ларионов // Химия и медицина, 0рхимед-2009:тезисы докл. VII Всерос. конф.- Уфа, 2009.- С. 107-108.

5. Алтухов, В. В. Разработка фармацевтической композиции мягкой лекарственной формы на основе кремнийтитанорганического глицерогидрогеля и изучение ее влияния на локомоторные функции экспериментальных животных при термическом ожоге [Текст] / В. В. Алтухов, В. В. Волков, Л. П. Ларионов, Т. Г. Хонина, Н. А. Забокрицский, Е. В. Шадрина, М. В. Иваненко //Клиническая фармакология и терапия.- Москва, 2009.-№6.- С. 257- 259.

6. Алтухов, В. В. Современные инновационные транскутанные препараты, обладающие ранозаживляющей активностью, и их возможность применения в педиатрической практике [Текст] / В. В. Алтухов, Л. П. Ларионов, А. А. Волков, Е. К. Серегина // Вестник уральской государственной медицинской академии.-

2009.-№20,-С. 214-216.

7. Алтухов, В. В. Значение возрастных особенностей отдельных показателей крови в условиях эксперимента [Текст] / В. В. Алтухов// Вестник уральской государственной медицинской академии!- 2009,- №20,- С. 356- 358.

8. Алтухов, В. В. Биологические аспекты интегральных показателей крови при модели термического ожога у экспериментальных животных [Текст] / В. В. Алтухов //Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам : матер. V Междунар. конф..- Москва,

2010.

9. Алтухов, В. В. Влияние «Силативита» на локомоторную активность и отдельные показатели крови у экспериментальных животных при термическом ожоге [Текст] / В. В. Алтухов, Л. П. Ларионов, Т. Г. Хонина//. II Конгресса Международного общества клинических фармакологов и фармацевтов стран СНГ: тезисы докл..- Москва, 2010.

10. Алтухов, В. В. Микробиологические аспекты ожоговых ран у экспериментальных животных и возможности их коррекции фармацевтическими композициями [Текст] / В. В. Алтухов, Л. П. Ларионов, Т. Г. Хонина, Т. В. Колосова // Вестник уральской мед. акад. наук,- 2011.- №6. - С. 75- 77.

11. Алтухов, В. В. Возможности создания новых фармацевтических композиций на основе Силативита для наружного применения в лечении ожоговых ран [Текст] / Алтухов В. В., Жданова Т. И. //. Формация и общественное здоровье: матер. IV Междунар. конф. -Екатеринбург: УГМА, 2011.-С. 17-19.

OAK- общий анализ крови

АлАТ- аланинаминотрансфераза

АлАТ- аспартатаминотрансфераза

Подписано в печать 06.04.2012 г. Формат 60x84 1/16 Тираж 100 экз.

Отпечатано ООО "ИД Ажур" Екатеринбург, ул. Восточная, 54,

Список сокращений

+7-912-24-969-03