Автореферат и диссертация по медицине (14.02.01) на тему:Токсиколого-гигиеническая оценка дигидрокверцетина, получаемого из природного сырья

На правах рукописи

ЩУКИНА Ольга Геннадьевна

ТОКСИКОЛОГО-ГИГИЕНИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ДИГИДРОКВЕРЦЕТИНА, ПОЛУЧАЕМОГО ИЗ ПРИРОДНОГО СЫРЬЯ

14.02.01 - гигиена

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

004615352 - 2 "Ей 2010

Иркутск-2010

004615392

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Ангарская государственная техническая академия» Министерства образования и науки РФ, г. Ангарск.

Научный руководитель:

кандидат медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук кандидат медицинских наук, доцент

Юшков Геннадий Георгиевич

Попкова София Марковна Жукова Елена Викторовна

Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Владивостокский государственный медицинский университет» Росздрава.

Защита состоится: « /О » фРКЗ^ <-С 2010 г. в уУ часов на заседании Диссертационного Совета Д 208.032.02 при ГОУ ВПО «Иркутский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 664003, г. Иркутск, ул. Красного Восстания, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Иркутский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Автореферат разослан « @ » _2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук,

профессор Лемешевская Е.П.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

В последние годы возрос интерес к препаратам, получаемым из растительного сырья. Это обусловлено их высокой биологической и фармакологической активностью, определенной естественным сочетанием целого комплекса действующих веществ. Последние обладают как самостоятельным лекарственным действием, так и способностью к синергизму. Являясь живыми организмами, растения синтезируют вещества, более физиологичные по отношению к организму человека.

Для лечения ожоговой болезни и профилактики послеожоговых последствий широко используются биологически активные вещества - антиоксиданты, связывающие свободные радикалы и токсиканты в раневой поверхности.

Одним из представителей антиоксидантов является дигидрокверцетин (ДКВ), получаемый из природного сырья. На предприятии ООО «Сибирский кедр» разработано производство ДКВ из отходов лесопереработки. Однако до настоящего времени не проводилась гигиеническая оценка производства ДКВ. Не было изучено токсическое влияние вещества на живой организм в зависимости от вводимой дозы и его эффективность действия на раневую поверхность.

В связи с этим изучение влияния производственной среды на работающих при получении ДКВ из природного сырья является весьма актуальным.

Цель работы: токсиколого-гигиеническая оценка дигидрокверцетина - вещества природного происхождения - с определением возможного механизма и эффективности действия ДКВ на организм.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Дать гигиеническую характеристику условий труда в опытном производстве дигидрокверцетина.

2. Исследовать «острую», «подострую», «хроническую» токсичность дигидрокверцетина и сравнить с подобным веществом по физиологическим, биохимическим, гематологическим и поведенческим показателям.

3. Установить возможный механизм биологического действия дигидрокверцетина.

4. Осуществить идентификацию и количественную оценку дигидрокверцетина в пробах препарата, а также в биосредах (моча).

5. Оценить эффективность мази для лечения ожоговой болезни, в состав которой входит дигидрокверцетин.

Научная новизна и теоретическая значимость работы

Впервые проведена гигиеническая оценка условий труда на опытном производстве дигидрокверцетина.

Показана возможность использования природного соединения ДКВ для наружного применения при лечении термического ожога.

Природный антиоксидант - ДКВ является выраженным представителем ряда флавоноидов, поэтому результаты токсиколого-гигиенических исследований, полученные для этого вещества, могут быть использованы при изучении других аналогов.

В результате проведенных исследований было выявлено, что механизм положительного действия ДКВ заключается в активации антиоксидантной системы организма. Это способствует уменьшению отечности раневой поверхности, улучшению кровообращения и успешному регенераторному процессу; в то же время при «остром» воздействии ДКВ отмечен негативный отклик - образование хелатного комплекса с ионом железа, блокадой активного переноса кислорода и создание ситуации гемической гипоксии.

Практическая значимость работы

Проведенные гигиенические исследования на ООО «Сибирский кедр» позволяют считать, что условия труда на предприятии по получению дигидрокверцетина отвечают гигиеническим требованиям и соответствуют санитарным нормам.

Разработан способ получения мази для лечения термических ожогов из отходов лесоперерабатывающей промышленности. Экспериментально показана эффективность наружного применения ДКВ в композиции с нутряным свиным жиром в качестве противоожогового средства.

Материалы по гигиеническим и токсикологическим исследованиям используются администрацией для расширения производства дигидрокверцетина (акт внедрения от 8.03.2010), в учебном процессе кафедры «Охрана окружающей среды и рациональное использование природных ресурсов» АГТА при изучении курса «Основы токсикологии» (акт внедрения от 15.02.2010). Они внедрены в отделе токсикологии НИИ биофизики АГТА доя развитая методологии экспериментального изучения новых веществ (акт внедрения от 4.02.2010), в системе Регионального управления Госсанэпиднадзора для оценки производств подобных химических соединений на предприятиях, контролируемых территориальным органом Госсанэпиднадзора ФМБА России (акт внедрения от 19.02.2010), в НЦреконструктивной и восстановительной хирургии СО РАМН в научно-исследовательском процессе создания модели раневой болезни и ее лечения на лабораторных животных в условиях эксперимента медикаментозными средствами (акт внедрения от 25.02.2010). Рецептура мази защищена патентом № 2008109778/15 от 06.09.2010 с перспективой дальнейшего производства.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Условия труда в производстве дигидрокверцетина соответствуют гигиеническим требованиям и санитарным нормам.

2. Дигидрокверцетин относится к IV классу опасности.

3. При действии дигидрокверцетина в токсических дозах органами — мишенями являются сердце и печень, отмечены изменения в биохимических показателях крови.

4. Дигидрокверцетин в составе мази эффективен при лечении ожоговой болезни.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы представлены, доложены и обсуждены на: XI международной научной школе-конференции студентов и молодых ученых «Экология Южной Сибири и сопредельных территорий» (Абакан, 2007); международной научно-практической конференции в области экологии и безопасности жизнедеятельности «Дальневосточная весна-2008» (Комсомольск-на-Амуре, 2008); III съезде ток-4

сикологов России (Москва, 2008); научно-практической конференции, посвященной 25-летию создания службы экспериментального биомедицинского моделирования (Томск, 2009); международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы электрофизиологии и незаразной патологии животных» (Улан-Удэ, 2009); международной научно-практической конференции «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности» (Санкт-Петербург, 2010).

Публикации

Основное содержание диссертации опубликовано в 21 научной работе, из них 8 - в журналах, рецензируемых ВАК. Получен патент на изобретение № 2008109778/15(010571) от 06.09.2010.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа выполнена на 151 странице машинописного текста: состоит из введения, обзора литературы (глава 1), материалов и методов исследования (глава 2), собственных исследований (главы 3,4,5), обсуждений полученных результатов, 12 таблиц и 72 рисунков, выводов, списка цитируемой литературы (131 источник отечественных авторов и 67 зарубежных) и приложений.

Личный вклад автора

Автором проведен анализ данных литературы, поставлена цель, сформулированы задачи исследования. Выполнены гигиенические, токсикологические и биохимические исследования с их последующей статистической обработкой, и анализом полученных результатов. Экспериментальный материал обобщен и изложен в ряде публикаций. Осуществлено оформление диссертационной работы. Личный вклад автора составляет 80 %.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В соответствии с целью и задачами работы выполнен комплекс гигиенических, токсикологических, физиологических, биохимических, гематологических, морфологических и статистических исследований.

В качестве объекта изучения служил образец препарата - ДКВ, полученный из лиственницы Даурской и Гмелина, и предоставленный ООО «Сибирский кедр» (г. Са-янск) ТУ 2455-001-53364601-05. Структурная формула ДКВ представлена на рисунке 1.

ОН

Рис. 1. Структурная формула дигидрокверцетина.

Выделенный из древесины лиственницы высокочистый ДКВ представляет собой белый или слегка с желтым оттенком мелкокристаллический порошок с температурой плавления 220-222 °С, хорошо растворимый в ацетоне, метаноле, этаноле, этилацетате, плохо — в воде. ДКВ существует в виде четырех энантио-меров, что отражается на его физико-химических свойствах и характеристиках (удельное оптическое вращение, растворимость в воде, температура плавления, относительные интенсивности полос в УФ-спектре и др.) (рис. 2).'

Количественная характеристика исследований представлена в таблице 1.

Таблица 1

Характеристика исследований

Вид исследования Методы исследования Объем исследований

Гигиенические исследования 1. Определение химических и взвешенных веществ в воздухе рабочей зоны: количественное определение метилтретбутилового эфира, этилового спирта, древесной пыли 45 проб

2. Оценка параметров микроклимата, уровней шума и освещенности в производственных помещениях согласно соответствующим нормативным документам 150 проб

Определение «острой» токсичности ДКВ Поведенческие, физиологические (масса тела, состояние волосяного покрова), выживаемость, Ш=,0 по методу Кербера Белые мыши - 42 Белые крысы - 20

Влияние ДКВ на организм животных при однократном введении в динамике 1. Исследование сердечнососудистой системы: а) ЭКГ во II стандартном отведении со скоростью 25 мм/с (прибор ЭК 1Т - ОЗМ); б) физиологические (масса тела, состояние волосяного покрова); в) морфологические исследования препаратов сердца с окраской гематоксилин-эозином. 2. Гистохимические исследования препаратов печени: активность ферментов, содержание гликогена и общих липидов. Белые крысы -12

Оценка эффективности дигидрокверцетина как антиоксиданта при однократном введении Уровень малонового диальдегида (МДА), ГПЛ, активность АЛТ, восстановленный глутатион (вБН) в сыворотке крови. Белые крысы - 24

Определение содержания дигидрокверцетина в моче при однократном введении Количественное определение ДКВ в моче животных методом ВЭЖХ Белые крысы - 24

Исследование кумуляции дигидрокверцетина (повторное введение] Поведенческие, физиологические (масса тепа, состояние волосяного покрова), выживаемость. Расчет коэффициента кумуляции по методу Жданова. Белые крысы - 6

Изучение «хронической» токсичности ДКВ (многократное введение) Физиологические, гематологические, биохимические, гистохимические. Белые крысы - 90

Изучение действия дигидрокверцетина в составе мази при лечении термического ожога 1. Физиологические: измерение температуры тела; измерение температуры кожи в области раны с использованием прибора КТД-8 (°С); Морфологические: измерение площади раны (мм2): тест Л.Н. Поповой; измерение толщины кожной складки в области раны с использованием микрометра (мм); модуль комплексного сопротивления кожи (кОм). 2. Биохимические. 3. Гематологические. 4. Патоморфологические исследования. Беспородные кролики - 18

'он

он о

•он

•он

он о

он о

он о

TpaHC-(2R, 3R)- Цис-(2И, 3S)- TpaHC-(2S, 2S)- L(mc-(3S, 3R)-

Рис. 2. Энантиомеры дигидрокверцетина.

Гигиеническая оценка производства ДКВ

Гигиеническая оценка условий труда проводилась в теплый период года на постоянных рабочих местах. Измерение параметров микроклимата производства ДКВ осуществляли Метеометром МЭС-200 согласно СанПин 2.2.4.548-96. Измерение массовых концентраций древесной пыли проводили гравиметрическим методом (МУ 4.1.2468-09). Отбор проб воздуха осуществляли прибором ПА-300М-2 с использованием фильтра АФА-ВП. Концентрацию метилтретбутилового эфира в воздухе рабочей зоны определяли с помощью газожидкостной хроматографии. Колонка заполнялась твердым поглотителем Целит-22, обработанным 20% полиэтиленгликолем-1500. Для анализа использовали хроматограф «Цвет-500» (МУ 2703-83). Для определения концентрации этилового спирта в воздухе рабочей зоны использовали метод газожидкостной хроматографии с применением пламенно-ионизационного детектора. Колонку заполняли полисорбом-1. Отбор проб производили в газовые пипетки с твердым сорбентом — активным углем. Для анализа использовали хроматограф «Цвет-500» (МУ 2902-83, МУК 4.1.624-96). Оценка условий труда по показателям световой среды проводилась Люксметром Ю-116 в соответствии со СНиП 23-05-95, ГОСТ 24940-96. Измерение и гигиеническая оценка уровней шума на рабочих местах осуществлялась шумомером-анализатором ОКТАВА-110А согласно СН 2.2.4/2. 1.8.562-96, МУ 1844-78. Идентификация вещества методом высокоэффективной жидкостной хроматографией

Количественное определение ДКВ проводилось в трех образцах в этиловом спирте с концентрацией 0,8-1,1 мг/мл на жидкостном хроматографе «Милихром А-02» (ЗАО «ЭкоНова», Новосибирск, Россия) с колонкой 75 * 2 мм, упакованной обращенно-фазным сорбентом «Nucleosil, С18» и эффективностью не менее 5000 т.т. (по пику хрезена; k = 10). В качестве элюента А брали водный раствор трифторуксусной кислоты 0,1 М (ТФУ), в качестве элюента В - ацетонитрил с 0,1 М ТФУ. Образцы анализировали в режиме градиентного элюирования с увеличением доли органического растворителя в элюенте с 10 до 64 %. Время разделения — 9 минут. Содержание ДКВ в образцах рассчитывали по методу внешней стандартизации с использованием в качестве стандарта ГСО ДКВ (ООО «Флавир»), Содержание основного вещества в образцах ДКВ относительно ГСО составило 97,0 %. Оценка токсичности при однократном воздействии ДКВ Использовали лабораторных мышей (самцы), средний вес которых составил 22 г. Для сравнения был выбран чистый витамин Р (LD50 для мышей п/к -1350 мг/кг). ДКВ растворяли в очищенной воде до получения суспензии молочного

цвета с желтоватым отливом. Последнюю вводили однократно 5 группам животных перорально через атравматический зонд в дозах 2000,5000,7000,8000 и 10000 мг/кг.

Исследования по определению повторного воздействия (кумуляция) проводились на мышах при ежедневном введении препарата в дозе 2000 мг/кг.

Многократное воздействие ДКВ осуществлялось в течение 3 месяцев на 90 белых беспородных крысах-самцах массой 180-220 г, поделенных на 5 групп по 6 крыс в каждой - на каждый срок обследования. ДКВ включали в суточный рацион подопытных групп в дозах:

1-я группа - 86 мг/кг (минимально действующая);

2-я группа - 860 мг/кг (промежуточная);

3-я группа - 3000 мг/кг (токсическая).

В качестве группы сравнения использованы животные, получавшие в указанные сроки витамин Р в дозе 86 мг/кг. Контрольную группу составили интактные животные, содержавшиеся в аналогичных условиях на протяжении всего исследования.

Изучение действия дигидрокверцетина в составе мази при лечении

термического ожога

Нами был смоделирован термический ожог Ша степени стандартной площади. Доклинические исследования проводились на кроликах в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР № 755 от 12.08.1977 г.). Эксперименты ставились в соответствии с официальными «Методическими указаниями по доклиническому изучению новых препаратов, разрабатываемых из природного сырья» и с использованием монографии И.О. Убашеева с соавт. «Раны и их лечение в тибетской медицине» (1990).

Для лечения использовали мазь, полученную на основе ДКВ в отделе токсикологии НИИ биофизики. Мазь наносили на рану марлевым тампоном один раз в сутки. Для сравнения использовали облепиховое масло. Заживление ран контролировали на 1, 3, 7, 14, 21, 30 и 40 сутки (табл. 1). Кролики содержались в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей. По окончании эксперимента животных умерщвляли методом декапитации, соблюдая «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Страсбург, 1986). Исследования проводились в соответствии с официальными методическими указаниями по доклиническим изучениям лекарственных средств.

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программ «Microsoft Excel» и «Biostat» с использованием параметрического (/-критерия Стыодента) и непараметрического (¿/-критерия Манна-Уитни) критериев, достоверными считались различия при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Гигиеническая оценка производства дигидрокверцетина

Производство дигидрокверцетина размещено на промышленной площадке бывшего Зиминского гидролизного завода. 8

Труд операторов и инженеров, работающих в отделениях экстракции, дистилляции, кристаллизации и очистки ДКВ, относится по тяжести к категории 16. Работа производится сидя, стоя, связана с ходьбой и сопровождается некоторым физическим напряжением (включение, выключение аппаратов, открытие вентилей и заглушек для перемещения продукта из одного аппарата в другой, контроль параметров процессов по приборам).

Труд работающих в отделении фасовки готовой продукции относится по тяжести к категории 2а. Лаборанты, занимающиеся фасовкой дигидрокверцетина, в течение смены находятся в положении стоя или сидя, их труд связан с ходьбой, перемещением мелких капсул готового продукта (упаковка содержит 30 капсул по 255 мг). Параметры микроклимата приведены в таблице 2.

Таблица 2

Параметры микроклимата в помещениях производства ДКВ

№ п/п Отделение Категория работ по уровню энергозатрат (Вт) Температура воздуха (°С) Влажность воздуха(%) Скорость движения воздуха (м/с)

1 Экстракция 16 (140-174) 21,0 ±0,9 55,0 ±4,7 0,17 ±0,03

2 Дистилляция 16 (140-174) 24,0 ± 1,0 60,0 ± 3,4 0,16 ±0,01

3 Кристаллизация 16(140-174) 22,5 ±0,8 50,0 ±4,2 0,2 ± 0,04

4 Очистка ДКВ 16(140-174) 21,4 ±1,3 42,0 ±6,1 0,15 ±0,04

5 Фасовка и упаковка 2а (175-232) 19,2 ±1,1 38,0 ± 2,6 0,1 ±0,01

СанПин 2.2.4.548-96 1Б 2А

20-28 18-27 15-75 0,1-0,4

Параметры микроклимата на рабочих местах в производстве ДКВ соответствуют требованиям СанПин 2.2.4.548-96.

Исходные ингредиенты технологического процесса: дигидрокверцетин сырец, класс опасности - 4; метилтретбутиловый эфир, класс опасности - 4; спирт этиловый, класс опасности - 4; натрий металлический технический, класс опасности - 4; кальций хлористый технический, класс опасности - 3.

При разборке и промывке аппаратов в воздух производственных помещений поступают пары метилтретбутилового эфира и этилового спирта. Концентрации последних не превышают ПДК (табл. 3).

Таблица 3

Концентрации веществ, поступающих в рабочую зону

№ Вещество Концентрация ингредиента (мг/м'1) ПДК„Л. (мг/м3)

1 Метилтретбутиловый эфир 10,0 ±0,8 100

2 Этиловый спирт 5,0 ±0,6 1000

Одним из неблагоприятных производственных факторов является древесная пыль. Пылевые частицы, как правило, вытянутой формы, имеют резкие изломы и отверстия с острыми краями и способны травмировать слизистые оболочки верхних дыхательных путей и глаз. Содержание древесной пыли в воздухе рабочей зоны отделения экстракции не превышает среднесменную ПДК (6 мг/м3); средние концентрации ее на рабочем месте составили 1,2 ± 0,3 мг/м3 (ГН 2.2.5.1313-03).

В производственных помещениях используется совмещенное освещение. Естественное осуществляется через световые проемы в наружных стенах (окна). В качестве искусственных источников света применяются люминесцентные лампы типа ЛБ-80. Уровни искусственного и совмещенного освещения на рабочих местах соответствуют СНиП 23-05-95. «Естественное и искусственное освещение» (табл. 4).

Таблица 4

Показатели световой среды

№ п/п Отделение Класс зрительной работы Искусственная освещенность рабочей поверхности (лк) Совмещенное освещение КЕО (%) Коэффициент пульсации (%)

1 Экстракция УГ 400,2 ± 7,5 0,55 ± 0,07 19,35 ±0,54

2 Дистилляция 1УВ 380,0 ±6,2 2,36 ± 0,21 18,71 ±0,64

3 Кристаллизация 1УВ 375,5 ±8,5 2,33 ±0,18 19,10 ±0,57

4 Очистка ДКВ ШГ 600,0 ±9,1 3,00 ±0,16 14,38 ±0,59

5 Фасовка и упаковка ШВ 398,1 ±8,5 2,93 ±0,14 14,68 ±0,61

СНиП 23-05-95

УГ 400 0,6 20

1УВ 400 2,4 20

ШГ 600 3,0 15

ШВ 400 3,0 15

Гигиеническая оценка шума в производстве дигидрокверцетина представлена в таблице 5.

Таблица 5

Уровни звука на рабочих местах производства ДКВ

№ п/п Отделение Уровень звука (дБА)

1 Экстракция 69,1 ±6,1

2 Дистилляция 61,3 ±1,8

3 Кристаллизация 55,7 ±1,2

4 Очистка ДКВ 58,3 ±1,3

5 Фасовка и упаковка 68,8 ± 4,2

СН 2.2.4/2.1.8.562-96 80

Уровни звука на всех рабочих местах производства не превышают ПДУ. Максимальные значения зарегистрированы в отделении экстракции, фасовки и составили соответственно 69,1 ± 6,1 и 68,8 ± 4,2 дБА. Источниками шума в данных отделениях являются загрузка щепы в аппарат, работа мешалки экстрактора, упаковка готовой продукции.

Гигиенические исследования условий труда на рабочих местах производства дигидрокверцетина ООО «Сибирский кедр» показали, что параметры микроклимата соответствуют санитарным нормам, уровни шума и освещенности не превышают предельно допустимых; концентрации вредных веществ (метилтретбутилового эфира, этилового спирта, древесной пыли) не превышают ПДК.

Оценка общетоксического действия

1. При однократном воздействии

При однократном воздействии ДКВ число погибших через сутки мышей составило 50 % в группах с дозами 8000 мг/кг и 9000 мг/кг; в группах с дозами 2000 мг/кг, 5000 мг/кг и 7000 мг/кг - 25 % (рис. 3).

Доза, мг/кг

Рис. 3. Зависимость «доза - эффект» дигидрокверцетина при пероральном

введении.

На основании полученных результатов была рассчитана 1Л)5() для мышей. Летальная доза для мышей, полученная с использованием формулы Кербера — ЬО50 = 76 66,7 ± 345,3 мг/кг, что позволило отнести ДКВ к 4 классу опасности.

При введении ДКВ крысам перорально в дозе до 10000 мг/кг гибели животных не наблюдалось. Для крыс ЬО50 принята более 10000 мг/кг, согласно «Руководству по доклиническим исследованиям».

2. При повторном воздействии (кумуляция)

Группе животных вводилась ежедневно минимально смертельная доза 2000 мг/ кг. В течение первых двух суток животные не отличались от контрольной группы. Количество погибших мышей к концу третьих суток составило 50 % (табл. 6).

Таблица 6

Динамика смертности

Время (сутки) Гибель (%)

1 0

2 0

3 50,0 ± 2,5

4 66,7 ± 3,9

5 70,2 ±2,8

6 71,0 ± 3,3

7 100 ± 2,7

Перед гибелью у подопытных животных наблюдались малоподвижность, парез задних конечностей, одышка. Оставшиеся в живых были угнетены, некоторые сидели нахохлившись.

Коэффициент кумуляции рассчитывали по Жданову: К= 8000 / 6000 = 1,3, где 8000 - среднесменная доза при однократном введении вещества;

6000 - среднесменная доза при п-кратном введении вещества.

Полученные данные свидетельствовали о выраженной кумуляции, степень которой составила 77 %.

Определение влияния ДКВ на организм животных при однократном

введении в динамике

1. Исследование сердечно-сосудистой системы

Электрокардиограмма записывалась у животных во II стандартном отведении со скоростью 25 мм/с через 1, 3, 7, 14 суток на фоне динамического контроля (табл. 7). Препараты сердца подвергались морфологическому исследованию с окраской гематоксилин-эозином (рис. 4).

Таблица 7

Динамика показателей электрокардиограммы

№ п/п Сутки Частота (уд./мин) Высота зубца (т\/)

1 Эт (контроль)** 524 ± 8,6 0,36 ±0,03

2 02 (5000 мг/кг) /1 сутки 510 ± 5,8 0,45 ±0,03*

3 02 (5000 мг/кг) / 3 сутки 486,8 ±4,7* 0,33 ±0,01*

4 Р2 (5000 мг/кг) / 7 сутки 580 ± 4,6* 0,43 ±0,07*

5 (5000 мг/кг) /14 сутки 500 ± 14,1 0,40 ±0,07*

Примечание: * - отличия достоверны при р < 0,05 (по Стьюденту); ** - значения контрольной группы средние, т.к. в течение 1-14 суток практически не менялись.

Рис. 4. Препарат сердечной мышцы крысы на 3 сутки после однократного перо-рального воздействия ДКВ в дозе 5000 мг/кг массы тела. Расширение капилляров, просветление цитоплазмы миофибрилл. Окраска гематоксилин-эозином. Ув. об. х 12,5, ок. х 10.

На 3 сутки хорошо видно расширение капилляров, просветление цитоплазмы миофибрилл. Результаты исследования сердечно-сосудистой системы констатировали изменения в работе сердца.

2. Гистохимические исследования препаратов печени выявили на 3 сутки увеличение гликогена в опыте (4—5 баллов) по отношению к контролю (до 3 баллов). Незначительно увеличилась активность моноаминооксидазы (МАО) и щелочной фосфатазы (ЩФ) в подопытной группе. Активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) на уровне контроля (рис. 5, 6, 7).

Рис. 5. Препарат печени крысы после однократного воздействия ДКВ в дозе 5000 мг/кг: 1 - опыт; 2 - контроль. Окраска по Шабадашу.

Рис. 6. Препарат печени крысы после однократного воздействия ДКВ в дозе 5000 мг/кг: 1 - опыт; 2 - контроль. Окраска по Пирсу.

Рис. 7. Препарат печени крысы после однократного воздействия ДКВ в дозе

5000 мг/кг: 1 - опыт; 2 - контроль.Увеличение

ЩФ в опыте. Окраска азосочетанием.

На 14 сутки в подопытной группе при вскрытии в макроскопическом обследовании, отметили более светлое окрашивание печени и почек.

Гистохимическое исследование показало, что активность МАО и ЛДГ находится на уровне контроля (рис. 8), активность СДГ снижена на 1-1,5 балла (рис. 9), а ЩФ - выше контроля на 1 балл.

Рис. 8. Микроскопическое исследование печени на 14 сутки после однократного воздействия ДКВ в дозе 5000 мг/кг. Активность ЛДГ в опыте (1) и контроле (2). Окраска по Пирсу.

Рис. 9. Микроскопическое исследование печени на 14 сутки после однократного воздействия ДКВ в дозе 5000 мг/кг. Снижение активности СДГ в опыте (1) относительно контроля (2). Окраска по Пирсу.

Активация дыхательных ферментов и ЩФ указывает на процесс трансформирования и проницаемости мембран.

Прослеживалась непрямолинейная зависимость многих показателей между собой и друг от друга. Биохимические изменения в печени подтвердили выведение ДКВ из организма в виде метаболитов, что согласуется с изменениями гистохимических показателей (активности сукцинатдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы, моноаминооксидазы и щелочной фосфатазы).

3. Определение содержания дигидрокверцетина в моче Проведенные исследования выявили четкую зависимость обнаруженного в суточной моче количества ДКВ от введенного (рис. 10-12).

Рис. 10. Хроматограмма мочи крысы после однократного введения ДКВ (О, = 86 мг/кг).

Рис. 11. Хроматограмма мочи крысы после однократного введения ДКВ (02 = 860 мг/кг).

Рис. 12. Хроматограмма мочи крысы после однократного введения ДКВ (03 = 3000 мг/кг).

Общий процент содержания ДКВ в пробах по сравнению с контролем невелик, однако его вполне достаточно для достоверной идентификации в лабораторных условиях (табл. 8).

Таблица 8

Содержание ДКВ в суточной моче крыс

N3 п/п Группа 5ср. пика (МКЛ-С) % от контроля*

1 Контроль 227,39 -

2 01 (86 мг/кг) 0,689 0,303

3 02 (860 мг/кг) 1,856 0,082

4 Бз (3 000 мг/кг) 8,818 0,111

Примечание: * - с учетом вводимых концентраций.

Так, при дозе Э, (86 мг/кг) выход с мочой составил 0,303 % от контроля. При этом видимых изменений в содержании меркаптуровой кислоты, сульфатов и глюкуроновой кислоты не отмечали.

При дозе Б2 (860 мг/кг) выход ДКВ составлял 0,082 %. При увеличении дозы препарата выделение последнего уменьшилось, и, следовательно, увеличилось

содержание метаболитов, приведшее к росту меркаптуровой кислоты, сульфатов и глюкуроновой кислоты. Наличие метаболитов в организме влечет за собой стрессовое состояние животных, что проявлялось в пассивном передвижении и беспокойстве («норковый рефлекс»).

При дозе Б3 (3000 мг/кг) выход ДКВ составляет 0,111 % от контроля. Проявление нелинейной зависимости выведения вещества из организма от дозировки последнего присуще лекарственным препаратам.

Исследование влияния дигидрокверцетина на организм животных

при многократном воздействии

Исследования динамики токсичности при многократном воздействии показали, что каждой дозе препарата соответствует определенный эффект.

В группе, получавшей минимальную дозу препарата (Б1 = 86 мг/кг), двигательная активность крыс к концу первого месяца была несколько выше таковой в контрольной группе. Норковый рефлекс в сочетании со статическим мышечным напряжением превышал контроль в 2,5 раза. Отмечалось увеличение гемоглобина, эритроцитов и лейкоцитов, при этом содержание ретикулоцитов оставалось в норме. Свертываемость крови возрастала ко второму месяцу, и уменьшалась к третьему. К первому и второму месяцам биохимические показатели увеличились. К третьему месяцу АЛТ, глюкоза, холестерин и общий белок сравнялись с контролем, содержание же мочевины оставалось по-прежнему высоким. Количество меркаптуровой кислоты, сульфатов, глукуроновой кислоты было близко к контролю на протяжении эксперимента. Защитные системы организма отреагировали ростом МДА и ГПЛ, уменьшением вЗН и повышенным в 1,5 раза содержанием АК. Это доказало выведение метаболитов из организма при активации АК в присутствии ДКВ как веществ, «работающих в паре». Ко второму месяцу ГПЛ все еще выше контроля, а МДА значительно снизился при нормализации СБН и АК. К третьему месяцу ОБН не изменился, а остальные показатели были выше контроля.

В группе, получавшей промежуточную дозу препарата = 860 мг/кг), происходило понижение двигательной активности к концу первого месяца в 14 раз, в 7 раз - к концу второго месяца, в 2,2 раза - к концу третьего месяца относительно контроля. Норковый рефлекс к концу первого месяца подопытных животных увеличился в 1,5 раза, что может быть связано с беспокойством; ко второму месяцу он стабилизировался. Статическое мышечное напряжение к первому месяцу превышало контроль в 1,5 раза, ко второму месяцу он снизился в 1,5 раза, к третьему - приблизился к контролю. Возможно, препарат проявлял себя как стимулятор физической активности. Увеличение гемоглобина, эритроцитов и лейкоцитов в первые два месяца свидетельствовало о начале развития гипоксии, повлекшей аритмию и признаки нарушения легочно-сердечной деятельности. Необычное поведение животных подтверждалось повышением АЛТ, характеризующим мышечную дистрофию и изменения в печени и сердце. Увеличивалось содержание глюкозы, мочевины, общего белка и количество меркаптуровых кислот в моче подопытных крыс (рис. 13).

В контроль и О, (86 мг/кг) ИЗ 02 (860 мг/кг)

И Оз (3 ООО мг/кг) И Р4 (вит. Р86 мг/кг)

Рис. 13. Динамика меркаптуровых кислот.

Месяц

К третьему месяцу организм вышел на стационарное состояние, приближенное к контролю. Это частично свидетельствует о привыкании организма к новому веществу. Повышенное содержание сульфатов в моче к первому месяцу выявило наличие метаболитов и вывод их из организма (рис. 14).

В контроль а О) (86 мг/кг) О [}> (860 мг/кг)

□ Оз (3 000 мг/кг) и 04 (вит. Р86 мг/кг)

Рис. 14. Изменение содержания сульфатов.

(Ц 20

2 18

5 16

14

12

10 о

о 6

4

2

0

Месяц

Та же динамика отмечена для глюкуроновой кислоты в моче и печени (табл. 9). Ко второму месяцу показатели приблизились к контрольной группе.

Таблица 9

Изменение анализируемых показателей защитной системы организма животных (М± т)

Показатели

Срок Группа вБИ МДА гпл АК

(мкмоль/г) (нмоль/г) (ед. опт. пл/г) (мкмоль/л)

Контроль 5,88 ±0,31 37,05 ± 0,98 40,37 ± 0,97 28,85 + 1,35

5 01 = 86 мг/кг 4,84 ±0,19" 47,05 ± 5,43* 43,00 ± 2,30* 41,41 ±0,84"

г 02= 860 мг/кг 4,99 ±0,41* 50,38 ±4,94" 43,93 ±2,94* 36,62 ± 2,00"

Из = 3000 мг/кг 5,33 ± 0,37* 53,21 ± 4,49" 42,87 ± 3,34* 37,66 ± 1,91"

04 (вит. Р) 4,26 ± 0,35" 44,74 ± 3,83* 42,17 ±0,91* 34,51 ± 2,25"

■з Контроль 6,45 ± 0,73 57,95 ± 1,34 50,17 ±4,85 25,08 ± 0,93

к и 01 = 86 мг/кг 5,78 ± 0,42* 49,49 ± 1,87" 55,50 ±3,46* 27,05 ±0,92*

5 Р2= 860 мг/кг 6,81 ±0,28* 49,87 ± 3,54* 54,10 ±3,01* 25,74 ± 0,46*

>5 Э3 = 3000 мг/кг 7,04 ±0,27* 47,44 ± 2,40" 51,17 ±5,33* 25,30 ± 0,80*

(вит. Р) 5,59 ± 0,34* 45,51 ± 3,66" 57,77 ± 1,95* 27,26 + 0,75"

Контроль 5,36 ± 0,78 57,31 ± 1,46 57,43 ±0,86 28,39 ± 0,36

к о 01 = 86 мг/кг 4,35 ± 0,23" 60,77 ± 3,99* 62,60 ±4,19* 35,77 ± 0,36"

2 02 = 860 мг/кг 4,64 ± 0,28* 58,33 ±4,59* 56,43 ±3,81* 28,39 ± 1,14*

>5 03 = 3000 мг/кг 4,41 ± 0,20" 49,87 ± 1,70" 57,33 ± 1,23* 27,78 ±1,61*

Од (вит. Р) 4,48 ±0,12" 52,69 ± 3,68* 57,00 ± 0,96* 28,49 ± 0,23*

Примечание: * - отличия достоверны при р < 0,05 (по Стьюденту); ** - отличия достоверны при р < 0,05 (по Манну-Уитни).

Группа, получавшая токсическую дозу ф3 = 3000 мг/кг), внешне не отличалась от остальных, но так же, как и группа, принимавшая препарат с дозой П2, проявляла пассивность в двигательной активности к первому месяцу.

Ко второму месяцу активность уменьшается в 2,7 раза, а к третьему - в 3 раза. Показатели «норкового рефлекса» возросли в 1,5 раза от контроля, оставаясь стабильными и к третьему месяцу.

Статическое мышечное напряжение к концу первого месяца в 1,5 раза превышало контроль, ко второму месяцу увеличилось в 2 раза, к третьему - приблизилось к контролю, оставаясь, однако, значительно выше последнего.

Данное поведение животных, принимавших ДКВ, аналогично таковому при употреблении допинговых средств. По характеру действия эти вещества способствуют быстрому наращиванию мышечной массы, сохранению деятельности в течение длительного времени.

При использовании ДКВ происходит изменение поведения животных, рост показателей анизоцитоза, содержания ретикулоцитов и лейкоцитов и понижение эритроцитов. Ретикулоциты ко второму месяцу оставались повышенными. Можно предположить проявление анемии на фоне возросшего содержания гемоглобина.

К концу третьего месяца гематологические показатели возросли. Динамика биохимических показателей сходна: повышение АЛТ и глюкозы - к первому месяцу; глюкозы, мочевины и холестерина - ко второму месяцу; АЛТ, мочевины и общего белка — к третьему месяцу. Интенсивное выделение меркаптуровой кислоты, сульфатов и глюкуроновой кислоты происходило преимущественно с

мочой. Реакция защитной системы организма к первому месяцу проявлялась в повышении МДА, ГПЛ и АК, а ко второму месяцу - в увеличении ОБН и, соответственно, уменьшении АК.

Известно, что ряд органических соединения обладает сродством к биологическому железу, содержащемуся в цитохромных ферментах, в гемоглобине и миоглобине. Некоторые ароматические соединения могут избирательно усиливать прочность связи с железом. Это обусловлено образованием я-связи между неиспользованными электронами ЗсГорбитали железа и свободными молекулярными орбиталями лиганда. Данная связь обладает повышенной прочностью и устойчивостью.

В связи с вышесказанным можно предположить, что Ре2+ связывается с ДКВ и его метаболитами в хелатный комплекс, который выводится из организма (рис. 15).

Рис. 15. Образование хелатного комплекса.

Это объясняет проявление пареза задних конечностей у мышей при однократном введении ДКВ и анемию у крыс при его многократном введении.

Исследование специфического ранозаживляющего действия ДКВ

При лечении термического ожога мазью, содержащей ДКВ, на 14-е сутки изменилась площадь раны с 20500 до 20637 ± 2669 мм2 при уменьшающихся температурах тела и раны. Площадь раны по индексу Л.Н. Поповой при лечении мазью с ДКВ уменьшилась за период с 21 по 30 сутки на 8,6 %, при лечении об-лепиховым маслом - на 6,6 %, в контроле - на 6,8 %, что говорит о выраженной эффективности местного лечения раны мазью с ДКВ в сравнении с другими группами. Процесс заживления раны охарактеризовался на 40 сутки уменьшением площади раны до 1535 ± 567 мм2, нормализацией Ттела до 39,0 ± 0,14 °С, температуры кожных покровов - до 35,5 ± 0,68 °С. Заживление происходило с образованием грануляционной ткани, основная масса которой состояла из развившихся кровеносных сосудов. Грануляционная ткань формировалась из эндотелиальных отпрысков кровеносных сосудов, сопровождаемых адвентициальными клетками и пролиферирующими соединительными элементами. Эндотелиальные тяжи превращались в полые трубки, и далее образовывались сложно анастомозирующие широкие капилляры. В межсосочковых промежутках пальцевидные отростки сети направлены к эпидермису, а на вершине сосочка от сети отходили длинные агрофильные волокна.

К 40 и 47 суткам раны у всех животных затянулись. В группах, леченных облепиховым маслом, и в контроле заживление произошло быстрее, но в месте ожога образовался рубец. У группы, леченной мазью с ДКВ, заживление наступило позже, но без образования рубца. Во всех группах наблюдалось интенсивное зарастание шерстью здоровой кожи. Действие мази основано на уменьшении воспалительного процесса, размягчении струпа, предотвращении повреждения свежеобразовавшейся кожи и безболезненном отторжении некротизированных тканей. Это позволило нам рекомендовать данную рецептуру с использованием ДКВ для лечения термического ожога.

Разработанная нами мазь для наружного применения проста в изготовлении, не требует дорогостоящего оборудования для ее получения. Применение мази возможно для последующих косметологических манипуляций на месте бывшего ожога.

Получен патент на изобретение «Мазь для лечения термических ожогов, способ ее приготовления и способ лечения» № 2008109778/15 от 06.09.2010 г.

ВЫВОДЫ

1. Условия труда в производстве дигидрокверцетина отвечают гигиеническим требованиям и соответствуют санитарным нормам. Параметры микроклимата, уровни шума, освещенности, концентрации древесной пыли, метилтретбутилового эфира, этилового спирта не превышают допустимых значений.

2. Дигидрокверцетин относится к 4 классу опасности - малоопасное вещество, обладает выраженными кумулятивными свойствами (ВЦ0 = 7666,7 ± 345,3 мг/кг - по Керберу; = 1,3 мыши; ЭЦ0 крысы > 10 г/кг). В токсических дозах, в сердце отмечены регенеративные изменения, нарушения гемодинамики, выявлена дистрофия печени.

3. Предложен возможный механизм биологического действия дигидрокверцетина заключающийся в образовании хелатного комплекса с ионом двухвалентного железа крови, и выводе последнего из организма животных.

4. Осуществлена идентификация и дана количественная оценка дигидрокверцетина в пробах и биосредах (моча) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Отмечено повышенное содержание сульфатов, меркаптуровой и глюкуроновой кислот в моче, свидетельствующее о выведении метаболитов дигидрокверцетина через почки.

5. Дигидрокверцетин в составе мази для лечения термического ожога эффективно влияет на процесс заживления ран, а именно уменьшает воспалительный процесс, смягчает струп, и способствует восстановлению эпителиального слоя без образования рубца.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Щукина О.Г., Юшков Г.Г., Игуменыцева В.В. и др. К оценке острой токсичности дигидрокверцетина из лиственницы Сибирской // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - 2007. - Т. 1. - С. 152-156.

2. Щукина О.Г., Юшков Г.Г. К возможности определения дигидрокверцетина в биосубстратах методом ВЭЖХ// Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - 2008. - Т. 2. - С. 267-269.

3. Щукина О.Г., Юшков Г.Г., Бенеманский В.В. и др. К возможности лечения термического ожога кожи препаратом на основе дигидрокверцетина в условиях эксперимента // Вестн. Росс, военно-медицинской академии. - 2009. -Na 1 (25), Ч. 2. - С. 601.

4. Щукина О.Г., Юшков Г.Г., Игуменыцева В.В. и др. Исследование периферической крови при пероральном введении дигидрокверцетина //Вестн. Росс, военно-медицинской академии. - 2008. - № 3 (23), Ч. 1. - С. 39.

5. Щукина О.Г., Юшков Г.Г., Черняк Ю.И. Исследование процессов пе-роксидации в организме животных при пероральном введении дигидрокверцетина // Сибирский медицинский журнал. - 2008. - № 4. - С. 46-48.

6. Игуменыцева В.В., Юшков Г.Г., Щукина О.Г. и др. Установление эффективности природного антиоксиданта для профилактики интоксикации дициклопентадиеном (ДЦПД) II Вестн. Росс, военно-медицинской академии. -2009. - Ч. 2, № 1 (25). - С. 350-351.

7. Черняк Ю.И., Щукина О.Г. Состояние процессов пероксидации у крыс в отдаленном периоде после хронического введения дигидрокверцетина // Бюлл. экспер. биол. и мед. - 2009. - Т. 147, № 5. - С. 532-535.

8. Chernyak Y.I., Shchukina O.G. Peroxidation processes in Rats during the delayed period after chronic administration of dihydroquercetin // Bull, of Exper. Biol, and Med. - 2009. - Vol. 5. - P. 603.

9. Щукина О.Г., Игуменыцева B.B., Малышкина H.A., Юшков Г.Г. и др. К обоснованию исследования токсикологических и терапевтических свойств дигидрокверцетина // Сб. научных трудов АГТА. - 2007. - Т. 1. - С. 199-203.

10. Щукина О.Г., Малышкина H.A., Игуменыцева В.В. Биологическое значение дигидрокверцетина как природного антиоксиданта // XI Междунар. научн. школа-конференция студентов и молодых ученых «Экология южной Сибири и сопредельных территорий». - Абакан, 2007. - Вып. 11, Т. 2. - С. 135-136.

11. Щукина О.Г., Юшков Г.Г., Игуменыцева В.В. и др. Исследование некоторых ферментативных процессов в организме животных при пероральном введении антиоксиданта дигидрокверцетина//VII Междунар. науч.-практ. конференция «Экология и безопасность жизнедеятельности» : тез. докл. - Пенза, 2007. - С. 223-224.

12. Щукина О.Г., Юшков Г.Г., Игуменыцева В.В. и др. Исследование реакции организма на пероральное введение антиоксиданта дигидрокверцетина // 3-я Всерос. науч.-технич. Интернет-конференция «Современные проблемы экологии и безопасности». - Тула, 2007. - С. 36-38.

13. Щукина О.Г., Юшков Г.Г., Игуменьщева В.В. и др. Флавоноиды - анти-оксидантная защита организма // Вестник АГТА. - 2008. - Xa 1, Т. 2. - С. 76-78.

14. Щукина О.Г., Юшков Г.Г. Динамика показателей периферической крови крыс при многократном внутрижелудочном введении дигидрокверцетина в различных дозах в условиях эксперимента // Междунар. науч.-пракгич. конф. в области экологии и безопасности жизнедеятельности «Дальневосточная весна - 2008». -Комсомольск-на-Амуре, 2008. - С. 436-438.

15. Щукина О.Г., Юшков Г.Г., Гущина A.A. Биоэтические проблемы выявления механизма действия фармакологических веществ в условиях экспериментально-биологического моделирования на примере дигидрокверцетина // Мат. Всерос. науч. конф. молодых ученых «Наука. Технологии. Инновации». - Новосибирск : Изд-во НГТУ, 2008. - Ч. 7. - С. 77-79.

16. Щукина О.Г., Юшков Г.Г., Гущина A.A. и др. К механизму токсического действия дигидрокверцетина // 3-й съезд токсикологов России : тез. докл. - М., 2008. - С. 538-540.

17. Щукина О.Г., Юшков Г.Г. К возможности использования кроликов при моделировании ожоговой болезни // Материалы науч.-практич. конф., поев. 25-летию создания службы экспериментального биомедицинского моделирования. -Томск : Изд-во «Печатная мануфактура», 2009 - С. 113-115.

18. Щукина О.Г., Юшков Г.Г., Бенеманский В.В. и др. К проблеме объективизации оценки кардиотропного действия некоторых химических веществ природного происхождения (на примере дигидрокверцетина) // Маг. междунар. науч.-практич. конф., поев. 70-летию зав. каф. терапии и клинической диагностики проф. Ю.А. Тарнуева «Актуальные вопросы электрофизиологии и незаразной патологии животных». - Улан-Удэ : Изд-во БГСХА им В.Р. Филиппова, 2009. -Ч. 2.-С. 173-175.

19. Щукина О.Г., Юшков Г.Г., Игуменьщева В.В. и др. Ожоговая болезнь, ее моделирование на лабораторных животных для испытания новых лекарственных средств // Вестник АГТА. - 2009. - Т. 3, № 1. - С. 143-146.

20. Щукина О.Г., Юшков Г.Г., Игуменьщева В.В. и др. Токсикологическая оценка биологического действия природного соединения на примере дигидрокверцетина на гигиенически значимых уровнях // Мат. междунар. науч.-практич. конф. «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности». - 2010. - Т. 2. - С. 63-65.

21. Мазь для лечения термических ожогов, способ ее приготовления и способ лечения : пат. Рос. Федерация : МПК7 А61 9/06 / Щукина О.Г., Юшков Г.Г., Игуменьщева В.В., Малышкина H.A. ; заявитель и патентообладатель ГОУ ВПО «Ангарская государственная техническая академия». - № 2008109778/15 ; заявл. 13.03.08 ; опубл. 20.09.09, Бюл. № 26.

СПИСОК ТЕРМИНОЛОГИЧЕСКИХ СОКРАЩЕНИЙ

АД - артериальное давление

АК - аскорбиновая кислота

AJ1T - аланинаминотрансфераза

ACT - аспартатаминотрансфераза

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ГПЯ - гидроперекиси липидов

ГСО - государственный стандартный образец

ДКВ - дигидрокверцетин

ЛДГ - лактатдегидрогеназа

МАО - моноаминооксидаза

МДА - малоновый диальдегид

ПОЛ - перекисное окисление липидов

СДГ - сукцинатдегидрогеназа

ЩФ - щелочная фосфатаза

ЭКГ - электрокардиограмма

GSH - восстановленный глутатион

LD50 - среднесмертельная доза

Подписано в печать 01.11.2010. Бумага офсетная. Формат 60х84716. Гарнитура Тайме. Усл. печ. л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ № 348-10.

РИОНЦРВХСОРАМН (Иркутск, ул. Борцов Революции, 1. Тел 29-03-37. E-mail: arleon58@gmai(.com)