Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Фармакологические свойства и клинические эффекты белково-полимерных лекарственных средств, созданных электронно-лучевым синтезом

0050467Ьэ

На правах рукописи

Мадонов Павел Геннадьевич

«Фармакологические свойства и клинические эффекты белково-полнмерных лекарственных средств, созданных электронно-лучевым синтезом»

14.03.06 — фармакология, клиническая фармакология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

3 о двг им.

ТОМСК-2012

005046769

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН, заслуженный деятель науки РФ Удут Владимир Васильевич

Официальные оппоненты:

Венгеровский Александр Исаакович, доктор медицинских наук, профессор, заслуженный работник высшей школы РФ, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, кафедра фармакологии, заведующий кафедрой

Дурнев Андрей Дмитриевич, доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт фармакологии им. В.В. Закусова» Российской академии медицинских наук, лаборатория лекарственной токсикологии, руководитель лаборатории

Грек Олег Рувимович, доктор медицинских наук, профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Новосибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, кафедра фармакологии, заведующий кафедрой

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования « Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н. И. Пирогова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится « » в__£^часов на заседании

диссертационного совета Д 001.031,(Й' при Федеральном государственном бюджетном учреждении« Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения « Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Автореферат разослан « ^^у> 2012 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук

Амосова Е.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Обеспечение лекарственной безопасности России, как одной из важнейших составляющих её независимости, обозначено первостепенной задачей на ближайшее десятилетие. Действительно, в настоящее время объем потребления лекарственных препаратов, производимых в Российской Федерации, составляет не более 20 процентов рынка в денежном выражении и не более 65 процентов в натуральном. Отечественные производители лекарственных средств проигрывают в рыночной конкуренции не только крупнейшим мировым фармацевтическим корпорациям, разрабатывающим инновационные препараты, но и производителям воспроизведенных лекарственных средств [ФЦП "Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу", утверждена Постановлением Правительства Российской Федерации от 17 февраля 2011 г. № 91]. В ходе реализации Программы планируется, в том числе, решить следующую задачу: ускоренное формирование научно-технологического потенциала для разработки импортозамещающих и инновационных лекарственных средств, медицинской техники и изделий медицинского назначения на основе выполнения масштабных научно-исследовательских и опытно-конструкторских работ [ФЦП «Фарма 2020», стр.6].

Решение этой проблемы видится в развитии отечественных фармпредприятий, ориентированных на выпуск импортзамещающих и оригинальных лекарственных средств, что настоятельно диктует необходимость разработки и освоения новых технологических решений по синтезу или модификации лекарственных препаратов обладающих высокой эффективностью и безопасностью. Особенно это актуально для фармакологических средств белковой природы.

В клинической практике лекарственные препараты этой группы применяются достаточно широко в силу высокой эффективности и специфичности. При этом белковые фармакологические средства не всегда имеют выгодный фармакокинетический профиль, а при энтеральном приёме их биодоступность не превышает 1,5 % [Ram I. Mahato, Ajit S. Narang, Laura Thoma, 2003]. Кроме того, общеизвестно, что белковые молекулы аллергогенны и иммунотоксичны.

Таким образом, главное противоречие использования белковых фармакологических средств заключается в их высокой клинической эффективности и ограничениях применения - парентерально ввиду токсичности, а энтерально -ввиду низкой биодоступности.

Возможность устранения обозначенного противоречия видится в создании их модифицированных лекарственных форм: полимер-белковых конъюгатов для парентерального и энтерального введения, микрокапсулирования, и т.д. [Никитин И. Г., Сторожаков Т.Н.,2002.]

Работы в этом направлении ведутся с 1970-х годов, когда предпринимались попытки применять ковалентное присоединение полимеров для повышения безопасности и эффективности различных протеинов [патент США 4179337]. Использовалось связывание полиэтиленоксида с аденозиндезаминазой для лечения иммунодефицитных состояний [Дэвис С., 1981, Хершфилд, М. С.,1987], связывание полиэтиленоксида с

супероксиддисмутазой для лечения хронических воспалительных заболеваний [патенты США 5006333, 5080891].

Наибольшую привлекательность в повышении эффективности, снижении аллергогенности и токсичности лекарственных препаратов белковой природы представляет их модификация, состоящая не в изменении структуры, что, несомненно, сказывается на специфичности и эффективности, а в физико-химической трансформации, достигаемой соединением белковой молекулы с полимерным носителем. В настоящее время известно достаточно большое количество модифицирующих полимеров как природного, так и синтетического происхождения. Особое значение отводится полиэтиленгликолям различной молекулярной массы, сополимерам этиленоксида и пропиленоксида, а так же некоторым полисахаридам. При этом полиэтиленгликоль/полиэтиленоксид (ПЭГ7ПЭО) и его сополимеры используются чаще всего [Caliceti Р., Veronese F.M., 2003]. Феномен присоединения молекулы полиэтиленгликоля к другой молекуле носит название пегиляция или пегилирование [Duncan R., Spreafico F., 1994, Harris J.M., Martin N.E., Modi M., 2001].

Первые работы по успешному пегилированию лекарственных препаратов опубликованы в прошлом веке [Duncan R., Spreafico F.,1994], В начале нынешнего столетия число исследований, посвященных этой проблеме, постоянно росло, что демонстрирует большой интерес к данной технологии [Takagi A., Yamashita N., Yoshioka Т. е.а., 2007, Bailón Р., Won С.Y., 2009, Дыгай А.М., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др., 2009, 2010, 2011, El-Komy М.Н., Widness J.A., Veng-Pedersen Р., 2011].

Синтез ПЭГ-белок, ПЭГ-пептид, ПЭГ-олигонуклеотид в последнее десятилетие стал часто использоваться для улучшения фармакокинетических свойств и токсикологических характеристик известных лекарственных препаратов. Для этих целей в подавляющем большинстве случаев используется химический синтез, позволяющий пегилировать различные антигены, антитела, факторы роста, клеточные рецепторы, ферменты, олигонуклеотиды и др. Некоторые из полученных указанным способом препаратов одобрены для использования в клинической практике во многих странах мира («Neulasta», «Mircera», «Pegasys» и др.) [Heathcote E.J., Shiffman M.L., Cooksley W.G. е.а., 2000, Curran M.P., Goa K.L., 2002, Hamidi M„ Azadi A., Rafiei Р., 2006, Kobbe G„ Bruns I., Fenk R. e.a., 2009, Mallorquí J., Gutiérrez-Gallego R., Segura J. e.a., 2010].

Химический синтез «полимер-лекарство» является весьма сложным многоступенчатым и дорогостоящим технологическим процессом, с применением высокотоксичных реагентов, требующих использования многочисленных стадий очистки с целью получения гомогенной популяции модифицированных молекул [Patent LU91006, 2003, Piedmonte D.M., Treuheit M.J., 2008]. Тем не менее, результатом синтеза белка и полимера является изменение фармакокинетических и фармакодинамических параметров соединения за счет повышения его стабильности, увеличения времени жизни в организме. И, как показала уже клиническая практика, появляется возможность энтерального использования лекарственного средства. На этом фоне имеет место снижение токсичности и увеличение избирательности действия синтезированного продукта [Nucci M.L., Olejarczyk J., Abuchowski А., 1986; Delgado С., Francis G.E., Fisher D., 1992, Francis G.E., Fisher D., Delgado C. e.a., 1998, Chinol M., Casalini Р., Maggiolo M., 1998, Bruce A., 2001; Avgoustakis K.^

2004, Maullu С., Raimondo D„ Caboi F. e.a., 2009, Huang Z„ Ni С., Chu Y., Wang S. e.a., 2009].

Таким образом, синтез «полимер-лекарство» по крайней мере в отношении пегилированных белковых молекул, обеспечивает неоспоримые преимущества лекарственных средств белковой природы. Единственным ограничением создания инновационных продуктов этого направления выступает сложность технологии химического синтеза и, следовательно, кратное повышение стоимости лекарственных средств подобного плана. Однако существует альтернатива многоступенчатому процессу химической пегиляции -электронно-лучевой синтез. Изучение и понимание общих принципов образования и свойств соединений «полимер-лекарство», полученных при помощи ионизирующего излучения, представляет большой интерес для фармакологии в рамках улучшения фармакокинетических свойств лекарственных препаратов белковой природы и уменьшения их токсических эффектов. [Vereschagin E.I., Khan D.H., Troitsky A.W. е. a., 2001, Патент РФ № 2406528, 2010, Патент РФ № 2405822, 2010, Патент РФ № 2414926,2011]. В качестве источника воздействия наиболее предпочтительным является использование потока ускоренных электронов, а в качестве носителя -низкомолекулярного ПЭГа [Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др., 2009, 2010, 2011, Дыгай A.M., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н. и др., 2009, 2011].

В связи с вышеизложенным, разработка новой технологии электронно-лучевого синтеза «полимер-лекарство» представляется актуальной и своевременной, открывающей новые перспективы совершенствования лекарственных средств белковой природы.

Цель исследования. Изучить возможности электронно-лучевого синтеза белковых молекул с полиэтиленгликолем для создания новых фармакологических средств с оценкой их токсичности, переносимости, специфической активности и фармакокинетики.

Задачи исследования:

1. На примере двух различающихся по химическим и фармакологическим свойствам белковых молекул показать возможности электронно-лучевого синтеза с полиэтиленгликолем для создания пегилированных фармакологически активных лекарственных средств;

2. Изучить физико-химические свойства созданных посредством электронно-лучевого синтеза пегилированных белковых молекул;

3. Изучить фармакодинамические свойства созданных посредством электронно-лучевого синтеза пегилированных белковых молекул;

4. Изучить параметры фармакокинетики созданных посредством электронно-лучевого синтеза пегилированных белковых молекул;

5. Оценить токсические эффекты созданных посредством электроннолучевого синтеза пегилированных белковых молекул;

6. На примере лекарственного средства - пегилированного субтилизина, созданного посредством электронно-лучевого синтеза, показать терапевтические возможности по соотношению клиническая эффективность/безопасность;

7. Обосновать возможности технологии электронно-лучевого синтеза для создания новых, инновационных лекарственных препаратов, обладающих оптимальным соотношением польза/риск.

Научная новизна.

В результате проведенных исследований впервые показана возможность радиационного синтеза белковых молекул с полиэтиленгликолем при использовании пучка ускоренных электронов. Определена ключевая роль дозы излучения, концентрации ПЭГ, нативного белка в растворе и его температуры в образовании белково-полимерных соединений за счёт карбонильной связи полимера и аминной связи белка, водородных связей, оснований Шиффа. Впервые доказана возможность, варьируя дозой облучения, концентрацией и молекулярной массой одного и того же полимера и белка, создавать композиции от единичных молекул полимера на белке до включения белка в полимерный кросслинкинг, изменяя фармакокинетические характеристики вещества. Результатом исследования явилось подтверждение стабильности соединений белок-полимер в течение 2 лет при температуре 8-10°С.

При оценке фармакодинамики полученных соединений в эксперименте in vitro и на моделях патологических состояний показано, что белково-полимерные препараты, созданные по технологии электронно-лучевого синтеза, обладают специфической фармакологической активностью свойственной нативным белкам. Так, на модели миелосупрессии, продемонстрировано, что пегилированный по технологии электронно-лучевого синтеза Г-КСФ и нативный Г-КСФ обладают идентичной специфической активностью, отличаясь лишь профилем достижения терапевтических эффектов: при применении пегилированного Г-КСФ достижение максимальной гемостимулирующей активности запаздывает на 1 сутки, но эффект сохраняется более продолжительно (до 13 суток). Для фармакологического препарата на основе пегилированного, посредством электронно-лучевого синтеза, фермента-субтилизина молекулярной массой 30 кДа, продемонстрирован, свойственный нативному белку, выраженный фибринолитический эффект как в экспериментах in vitro, так и in vivo. Тромболитический эффект лекарственного средства на основе пегилированного субтилизина подтвержден в клинических исследованиях при лечении венозной недостаточности и инфаркта миокарда.

Впервые изучено и показано, что одноступенчатый электронно-лучевой синтез нативного белка с полиэтиленгликолем модифицирует фармакокинетические характеристики нативного белка и обеспечивает новые, терапевтически значимые пути его введения в организм. На примере пегилированного Г-КСФ показано, что препарат быстро проникает в системный кровоток и достигает максимальных концентраций при подкожном и ректальном введении в течение 1 часа, а при внутрижелудочном введении через 10 мин. Значения максимальных концентраций лежат в диапазоне 1700-2500 пг. Препарат пегилированного субтилизина всасывается из кишечника с биодоступностью 16-18% и имеет пик концентрации в плазме через 4 часа после энтерального введения.

Электронно-лучевое пегилирование белковых молекул обеспечивает низкую токсичность созданных на их основе лекарственных препаратов. При определении параметров острой токсичности ПЭГ-ГКСФ выявлено, что достигнутые дозы препарата многократно превышают терапевтические, применяемые в клинической практике - от 300 до 1500 раз. Изучение хронической токсичности показало отсутствие поражений органов при длительном приёме, отсутствие аллергизирующего и иммунотоксического

действия, не выявлены мутагенные свойства и генотоксичность, препарат не обладает местнораздражающим действием. Пегилированный субтилизин при парентеральном и энтеральном введении не оказывает выраженных токсических эффектов и относится к классу малотоксичные вещества.

В результате проведённых клинических исследований установлено, что электронно-лучевое пегилирование субтилизина обеспечивает тромболитическое, цитопротективное, противовоспалительное действие в организме человека при энтеральном и парентеральном путях его введения. На основе данного исследования фармакологический препарат пегилированного субтилизина создан в двух лекарственных формах. Продемонстрирована его эффективность как прямого тромболитика при остром инфаркте миокарда с более благоприятным соотношением эффективность/безопасность по сравнению с активаторами плазминогена. Таблетированная форма является эффективным средством для лечения венозной недостаточности и тромбозов венозной системы.

Практическая значимость.

Технология электронно-лучевого пегилирования демонстрирует возможности создания инновационных высокоэффективных и безопасных лекарственных препаратов белковой природы для лечения различных заболеваний. Электронно-лучевое пегилирование белковой молекулы способно изменить фармакокинетические показатели, особенно в части повышения энтеральной биодоступности, снизить токсичность, обеспечить невысокую стоимость конечного продукта. Данный способ позволяет синтезировать фармакологически активные белковые молекулы для лечения конкретной нозологии с требуемыми параметрами фармакокинетики и оптимальным способом введения в организм. Лекарственные препараты на основе пегилированных белков, созданные по технологии ЭЛП комплаентны для пациентов за счёт возможности использовать твёрдые лекарственные формы (капсулы, таблетки, суппозитории), безопасны с точки зрения иммунотоксичности и аллергогенности. Эти лекарственные препараты могут использоваться человеком достаточно долгое время и несколькими курсами для лечения тяжёлых хронических дегенеративных заболеваний.

Положения, выносимые на защиту:

1. Технология электронно-лучевого синтеза фармакологически активного белка с полиэтиленгликолем позволяет создавать соединения ПЭГ-Белок со стабильными физико-химическими свойствами, обладающие фармакодинамикой, присущей нативному белку;

2. Технология электронно-лучевого синтеза фармакологически активного белка с полиэтиленгликолем различной молекулярной массы позволяет модифицировать фармакокинетические характеристики соединения ПЭГ-Белок. Позволяет создавать лекарственные препараты белковой природы с высокой терапевтической активностью и низкой токсичностью.

Апробация работы

Основные положения работы представлены на 3-м Съезде токсикологов России (Москва, 2008), на Международном форуме по нанотехнологиям (Москва, 2009), на Объединенном съезде по кардиологии и кардиохирургии СФО (Томск, 2009), на IV Национальном конгрессе терапевтов (Москва, 2009), на XVI Российском конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2010), на научно-практической конференции ЦФО РФ с международным участием «Инновации и информационные технологии в диагностической, лечебно-профилактической и учебной работе клиник» (Тверь, 2010), на 2-й всероссийской научно-практической конференции «Учёные Урала и Сибири - развитию отечественной фармации» (Новосибирск, 2011), на Всероссийской научной конференции «Фармакологическая регуляция стволовых клеток» (Томск, 2011), на Всероссийской научной конференции «Современная лекарственная токсикология» (Томск, 2012).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 2 монографии, 40 печатных работ, в том числе 22 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 350 страницах машинописного текста, состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и библиографического указателя использованной литературы, который включает 140 отечественных и 105 иностранных источников. Работа иллюстрирована 128 таблицами и 64 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Электронно-лучевая пегиляция белковых молекул.

В качестве объекта для исследований закономерностей электроннолучевой пегиляции был выбран широко известный белок из класса цитокинов -рекомбинантный человеческий гранулоцитаркый колониестимулирующий фактор (рчгКСФ) и полиэтиленгликоли различной молекулярной массы. Электронно-лучевая пегиляция осуществлялась в центре электронно-лучевой обработки Института ядерной физики им. Будкера СО АН РФ г.Новосибирск. Реакция пегиляции происходила под пучком ускоренных электронов, создаваемым ускорителем ИЛУ-10, производства Института ядерной физики им. Будкера СО АН РФ. Для исследования образовавшихся в результате облучения молекулярных комплексов были использованы следующие методы: Гель-электрофорез, эксклюзионная ВЭЖХ, спектроскопия. Метод эксклюзионной ВЭЖХ хроматографии (SEC-HPLC), позволяет оценить молекулярные массы молекул веществ различной химической природы. Метод основан на принципе разделения молекул вещества в хроматографической системе, за счет их разной способности проникать в поры стационарной фазы. При этом первыми выходят из хроматографической колонки наиболее крупные молекулы способные проникать в минимальное число пор стационарной фазы. Последними выходят вещества с малыми размерами молекул, свободно проникающие в поры. При проведении анализов облученных ПЭГов в качестве подвижной фазы (элюента)

была использована очищенная вода, детекцию проводили на ELS детекторе, скорость потока элюента 1 мл/мин, неподвижная фаза колонка PROGEL-TSK GMPWXL с пределами фракционирования молекулярных масс от 500 до 8 млн. Да (по ПЭГу). Дополнительно испытуемые образцы анализировались электрофорезом в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (SDS-PAGE). Данный метод позволяет разделять белки на отдельные фракции в зависимости от их молекулярной массы. При проведении хроматографии в качестве элюента был использован ОДМ раствор хлорида натрия, закисленный уксусной кислотой до рН=4,0, детекцию проводили на проточном ВЭЖХ-спектрофотометре при >.=215 им, скорость потока элюента 1мл/мин в изократическом режиме при комнатной температуре, неподвижная фаза: ВЭЖХ-колонка TSK-GEL G3000SWxl. Последовательно проведены следующие исследования: исследование молекулярных взаимодействий между полиэтиленоксидами различной молекулярной массы и рчГ-КСФ, возникающих в результате облучения препаратов потоком ускоренных электронов; исследование образцов облученных растворов ПЭГов без добавления рчГ-КСФ; исследование образцов совместно облученных растворов ПЭГов с рчГ-КСФ.

2. Исследование фармакологических свойств пегилированного посредством ЭЛП гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (ПЭГ-Г-КСФ).

Комплекс ПЭГ-Г-КСФ получен посредством воздействия потока ускоренных электронов с энергией 2,5 МэВ, поглощенной дозой от 2 до 10 кГр и скоростью набора дозы 1,65 кГр/час. Факт образования принципиально нового вещества - конъюгата ПЭГ-Г-КСФ, был установлен с помощью метода SEC-HPLC-хроматографии (ВЭЖХ-гель-фильтрация), а использование SDS-ПААГ электрофореза позволило определить молекулярную массу синтезированного соединения, составляющую 90-100 кДа (при 19,6 кДа у немодифицированного Г-КСФ).

Изучение фармакокииетики и фармакодинамики ПЭГ-Г-КСФ. На данном этапе исследования были поставлены следующие задачи: 1. Оценить способность ПЭГ-Г-КСФ, вводимого внутрижелудочно, подкожно, ректально и внутривенно, детектироваться с помощью ИФА-метода; 2. Исследовать динамику содержания ПЭГ-Г-КСФ в сыворотке крови при парентеральном и пероральном введении; 3. Изучить колониестимулирующую активность сыворотки крови при парентеральном и пероральном введении ПЭГ-Г-КСФ. Были проведены 2 полностью идентичных серии экспериментов: а) эксперимент, направленный на изучение способности ПЭГ-Г-КСФ детектироваться с помощью ИФА-метода и исследованию динамики содержания Г-КСФ в сыворотке крови при парентеральном и пероральном введении. Интактные мыши: 3 мыши; б) эксперимент, направленный на изучение фармакологического профиля ПЭГ-Г-КСФ методом тестирования колониестимулирующей активности сыворотки крови. Фармакокинетику ПЭГ-Г-КСФ определяли по содержанию Г-КСФ в сыворотке крови с помощью ИФА. Кроме того, внемодельным методом с использованием пакета программ M-IND [Агафонов А. А., Пиотровский В.К., 1991]. Тестирование колониестимулирующей

активности проводили микрометодом в 96-луночных планшетах [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П., 1992].

Изучении гемостимулирующей активности препарата ПЭГ-Г-КСФ на модели цитостатической миелосупрессии. В данном разделе были поставлены следующие задачи: 1. Охарактеризовать изменения картины периферической крови и костного мозга, возникающие под действием ПЭГ-Г-КСФ при его введении различными путями, либо нейтростима, на модели угнетения гемопоэза циклофосфаном; 2. Исследовать содержание коммитированных предшественников эритро- и грануломоноцитопоэза в костном мозге мышей, получавших ПЭГ-Г-КСФ, либо нейтростим, на фоне ЦФ; 3. Изучить влияние ПЭГ-Г-КСФ в сравнении с нейтростимом на интенсивность пролиферации и созревания гемопоэтических клеток-предшественников в условиях миелосупрессии, вызванной введением ЦФ; 4. Определить изменения содержания стромальных прекурсоров в костном мозге под влиянием ПЭГ-Г-КСФ в сравнении с нейтростимом на модели угнетения гемопоэза ЦФ; 5. Оценить секреторную активность клеток различных фракций гемопоэзиндуцирующего микроокружения у мышей при введении им ПЭГ-Г-КСФ, либо нейтростима, на фоне ЦФ.

В экспериментах использовано 160 мышей-самцов линии CBA/CaLac, массой 18-20 гр. в возрасте 2-х месяцев. Миелосупрессию вызывали однократным внутрибрюшинным введением ЦФ в дозе 250 мг/кг. Непосредственно перед введением ЦФ (Циклофосфан-Лэнс, ЗАО «Верофарм», г. Москва) растворяли в стерильном физиологическом растворе.

На 2, 3, 5, 7, 10 и 13 день эксперимента в периферической крови животных всех групп общепринятыми методами определяли общее количество лейкоцитов, подсчитывали лейкоцитарные формулы. [В.В. Меньшиков, 1987]. С помощью автоматического гематологического анализатора ABACUS (Diatron, Австрия) оценивали состояние периферического звена эритрона (содержание гемоглобина, количество эритроцитов, гематокрит, средняя корпускулярная концентрация гемоглобина). Стандартным способом определяли общую клеточность костного мозга (на бедро) и его морфологический состав (по данным миелограмм) [В.В. Меньшиков, 1987]. Методом клонирования в полувязкой среде на основе метилцеллюлозы определяли содержание эритроидных (КОЕ-Э), гранулоцитомакрофагальных (КОЕ-ГМ) и стромальных (КОЕ-Ф) предшественников в костном мозге экспериментальных животных [Е.Д. Гольдберг и др., 1992]. Кроме того, изучали интенсивность пролиферации и дифференцировки кроветворных клеток-предшественников. С целью оценки функциональной активности гемопоэзиндуцирующего микроокружения (ГИМ) определяли интенсивность секреции факторов, составляющих колониестимулирующую (КСА), эритропоэтическую (ЭПА) и фибробластстимулирующую (ФСА) активности, элементами.

Изучение токсического действия в остром эксперименте при однократном введении. Целью данного исследования явилось определение переносимых, токсических и летальных доз предлагаемого средства при различных путях его введения с использованием метода Литчфилда и Уилкоксона, установление

причин наступления гибели животных в течение 14 дней наблюдения, изучение влияния его на общее состояние, некоторые функциональные и морфологические показатели. Эксперименты поставлены на половозрелых белых неинбредных мышах (18 животных с исходной масса тела 25-35 г) и крысах (18 животных с исходной массой тела 250-350 г. Препарат вводили мышам и крысам однократно внутривенно, внутрижелудочно и подкожно.

Изучение общетоксического действия в течение 6 месяцев (хроническая токсичность). Целью хронического токсикологического исследования является характеристика степени повреждающего действия ПЭГ-Г-КСФ при многократном введении крысам и кроликам, выявление наиболее чувствительных органов и систем организма, а также степени обратимости вызываемых испытуемым средством повреждений. Изучение хронической токсичности проведено на 120 крысах (самцах и самках) и 12 кроликах. Изучалось влияние ПЭГ-Г-КСФ при пероральном введении препарата крысам в трех дозах (50, 250 и 500 мкг/кг) и кроликам в двух дозах (50 и 250 мкг/кг) в течение трех месяцев. Так как получить значение LD50 для ПЭГ-Г-КСФ не было возможным, за минимальную дозу была выбрана терапевтическая доза, полученная в экспериментальном исследовании на мышах - 100 мкг/кг, третья -рассчитывается с учетом доз, полученных в остром эксперименте, и превосходит первую дозу в 10 раз. Вторая доза - промежуточная. Контролем служили животные, получавшие в эквиобъеме большой дозе 2 % раствор ПЭГа. Величина минимальной дозы для крыс была получена после соответствующего перерасчета дозы для мышей по Freireich [1966].

3. Исследование фармакологических свойств пегилированного посредством ЭЛЛ ферментного препарата протеиназы (ПЭГ-П).

Физико-химические свойства ПЭГ-П. Электронно-лучевая пегиляция протеиназы осуществлялась потоком ускоренных электронов с энергией не менее 2,0 МэВ до поглощенной дозы 1,0 Мрад [Патент РФ № 2270861 «Способ получения водорастворимого иммобилизованного ферментного препарата протеаз»]. В качестве стандарта при проведении химической аналитики использовался ферментный продукт - Декозим-NP представляющий собой фермент (из нейтральных бактериальных протеаз) для гидролизации белка, который применяется в различных отраслях промышленности, таких как производство выпечки, спиртных напитков (в т. ч. в пивоварении) и кормовых добавок. Исследование проводилось методом ВЭЖХ-МС/МС в режиме наноэлектроспрея. Сущность метода состоит в предварительном трипсинолизе анализируемых белков, ОФ-ВЭЖХ разделении полученных пептидов, их последующем анализе по молекулярным массам (пептидный фингерпринт) и анализе полученных данных с помощью программного обеспечения MASCOT. В результате был получен белковый сиквенс протеиназы.

Исследование тромболитической активности in vitro. Исследование фибринолитического действия ПЭГ-П заключалось в определении характера разрушения молекул фибрина: является ли ПЭГ-П активатором плазминогена или обладает прямым фибринолитическим эффектом. Использоватись следующие материалы и оборудование: Хромогенный субстрат For-Ala-Phe-Lys-pNA.HBr в

составе набора реагентов «ХромоТех-Плазминоген», производитель ООО фирма «Технология-Стандарт», серия Б31227; Стрептокиназа, 5000 ME/мл, в составе набора реагентов «ХромоТех-Плазминоген», производитель ООО фирма «Технология-Стандарт», серия Б40323 (необходима для контрольного исследования); ПЭГ-П, активностью 5,10 и 20 Ед/мл дистиллированной воды; Трис-HCI буфер 0,IM, Ph=7,4 производитель ООО фирма «Технология-Стандарт», серия Б40412; Референтная нормальная плазма (РНП-плазма), производитель ООО фирма «Технология-Стандарт» (смесь образцов плазмы от 40 здоровых доноров), серия Б40206; Фотометр RA-50, производитель фирма Bayer. Измерения проводились при длине волны 405 нм; Эуглобулины, приготовленные из пулированной плазмы крови практически здоровых людей; Тромбин человека 50 NIH ед/мл, производитель ООО фирма «Технология-Стандарт», серия Б41333; Термостат для исследования гемокоагуляции (ТПС); Фибрин-мономер, лиофилизированный. Компонент набора «ТехФактор ХШ-тест», производитель ООО фирма «Технология-Стандарт», серия Б271322.

Исследование фибринолитической активности ПЭГ-П. Была проведена предварительная полуколичественная (без калибровки по стандарту) сравнительная оценка фибринолитической активности ПЭГ-П. Исследование фибринолитической активности ПЭГ-П проводилось по методу Аструпа. Оценка эффектов препарата ПЭГ-П также была выполнена на пуле плазмы, полученной при смешивании равных объемов образцов бедной тромбоцитами плазмы стабилизированной цитратом венозной крови 12 практически здоровых людей в возрасте от 19 до 35 лег. Препарат растворяли дистиллированной водой до концентрации 5 Ед/мл, 10 Ед/мл, 20 Ед/мл. Фибринолигическое действие ПЭГ-П исследовали в следующих тест-системах: 1. по оценке гидролиза хромогеннош субстрата For-Ala-Phe-Lys-pNA.HBr, специфичного к действию плазмина (по патенту РФ № 2121690,1998); 2. по определению времени лизиса эуглобулинов плазмы крови (по Kowarzyk etal., 1950); 3. по определению времени лизиса сгустка нестабилизированного фибрина, полученного из очищенного фибрин-мономера

Исследование антиагрегантной активности ПЭГ-П. Препарат во флаконах всех изучаемых серий растворяли при комнатной температуре (+18...+25°С) путем добавления дистиллированной воды до концентрации 5 Ед/мл, 10 Ед/мл и 20 Ед/мл. Оценка эффектов препарата ПЭГ-П была выполнена на пуле плазмы, полученной при смешивании равных объемов образцов бедной тромбоцитами плазмы стабилизированной цитратом венозной крови 20 практически здоровых людей в возрасте от 18 до 36 лет.

Электрокоагулографическое исследование цельной крови. Графическую регистрацию процесса свертывания цельной крови проводили методом низкочастотной вибрационной пьезоэлектрической гемокоагулографией (НПГК) (Патент на изобретение МПК6 G01 N33/48 от 6 марта 1995 г. «Способ оценки функционального состояния системы гемостаза». На рисунке 2 представлен график регистрации НПГК с временными и амплитудными характеристиками, используемыми для расчета коэффициентов.

Исследования фармакологических свойств in vivo.

Исследование специфической фибринолитической активности препарата ПЭГ-П. Эксперименты проведены на 20 крысах-самцах линии Вистар массой 220-240 г. ПЭГ-П вводили в дозе 10 ПЕ/кг внутривенно и 70 ПЕ/кг внутрибрюшинно. Фибринолитическую активность оценивали методом определения спонтанного эуглобулинового фибринолиза с использованием набора "Фибринолиз-тест" фирмы "Технология стандарт".

Исследование гемореологической активности. Исследование гемореологической активности ПЭГ-П проведено на 18 крысах-самцах линии Вистар массой 220-240 г. ПЭГ-П вводили в дозе 10 ПЕ/кг внутривенно и 70 ПЕ/кг внутрибрюшинно. Вязкость крови и плазмы измеряли на ротационном вискозиметре АКР-2: кровь в диапазоне скоростей сдвига от 3 с" до 300 с , плазму на 300 с"'. Содержание фибриногена в плазме крови определяли на гемокоагулометре "Согшау KG-4". Гематокрит определяли методом центрифугирования в стеклянных капиллярах. Агрегацию эритроцитов исследовали силлектометрическим методом на модифицированном микроколориметре МКМФ-1 с регистрацией на графопостроителе Н306.

Исследование тромболитической активности ПЭГ-П при профилактическом и лечебном введении. Исследование тромболитической активности ПЭГ-П при профилактическом введении проведено на 19 крысах-самцах линии Вистар массой 220-240 г. Кровоток в сонных артериях измеряли с помощью электромагнитного расходомера крови MFV-1100 и MFV-2100 (Nihon Kohden, Япония) с графической регистрацией на самописце КСП-4. Моделирование тромбоза проводили с использованием железа (II) хлорида: ватный тампон массой 1,5 мг смачивали до полного пропитывания в 10% растворе хлорида железа и накладывали на отпрепарированную общую сонную артерию. Окружающие ткани от тампона изолировали прокладкой из полиэтиленовой пленки. Через 15 мин ватный тампон убирали и трехкратно промывали операционное поле физиологическим раствором. Кровоток регистрировали в течение 90 минут от момента аппликации хлорида железа. Через 24 часа у крыс определяли наличие кровотока по общим сонным артериям. После эвтаназии животных передозировкой эфирного наркоза, вырезали сегменты правой и левой общих сонных артерий равной длины. Промывали просвет сосуда от наличия крови, просушивали марлевой салфеткой и взвешивали. Массу тромба определяли по разнице масс сегментов ипсилатеральной и контрлатеральной артерий.

Исследование тромболитической активности ПЭГ-П при лечебном введении проведено на 20 крысах-самцах линии Вистар массой 220-240 г. Кровоток в сонных артериях измеряли с помощью электромагнитного расходомера крови MFV-1100 и MFV-2100 (Nihon Kohden, Япония. Системное артериальное давление (САД) измеряли прямым методомМоделирование тромбоза проводили с использованием железа(П) хлорида. ПЭГ-П вводили через 5 мин после удаления хлорида железа в дозе 150 ЕД на крысу внутрибрюшинно (1,5 мл) и 10 ЕД на крысу внутривенно инфузионно в течение 10 мин (0,1 мл тромбовазима, разведенного в 0,5 мл физиологического раствора). В контроле

животным вводили физиологический раствор из расчета 1,5 мл на крысу внутрибрюшинно и 0,6 мл на крысу внутривенно инфузионно в течение 10 мин.

Исследование тромболитической активности энтеральной формы ПЭГ-П при лечебно-профилактическом введении. Исследование тромболитической активности ПЭГ-П проведено на 20 крысах-самцах линии Вистар массой 250300 г. Артериальный тромбоз моделировали с использованием FeCl2. Кровоток регистрировали в течение 40 мин от момента аппликации хлорида железа. Через 48 часов крыс повторно наркотизировали и определяли наличие кровотока по общим сонным артериям. После эвтаназии животных передозировкой наркоза, вырезали сегмент левой общей сонной артерии, извлекали тромб, промывали его в физиологическом растворе, удаляли избыток влаги фильтровальной бумагой, высушивали до постоянной массы при температуре 60 °С и взвешивали на аналитических весах. ПЭГ-П вводили внутрижелудочно в дозе 1000 ЕД/кг. Первое введение проводили за 4 часа до аппликации FeCl2, второе - через 2 часа после. В последующий период ПЭГ-П вводили дважды в сутки. Животные контрольной группы получали эквиобъемное количество дистиллированной воды.

Исследование антиагрегантной активности. Исследование антиагрегантной активности ПЭГ-П проведено на 23 крысах-самцах линии Вистар массой 220240 г. ПЭГ-П вводили в дозе 10 ПЕ/кг в бедренную вену и 70 ПЕ/кг внутрибрюшинно. Кровь для исследования забирали через 1 час после введения ПЭГ-П методом катетеризирования общей сонной артерии. Для получения богатой тромбоцитами плазмы (БТП) кровь центрифугировали при 1000 об./мин в течение 10 мин на центрифуге РС-6. Бедную тромбоцитами плазму получали центрифугированием супернатанта при 3000 об./мин в течение 20 мин. Агрегацию тромбоцитов, вызванную индуктором АДФ в концентрации 110 е М, измеряли на анализаторе агрегации тромбоцитов АТ-02, агрегатограммы регистрировали на самописце Recorder 2210.

Исследование фармакокинетики ПЭГ-П. Для исследования фармакокинетики ПЭГ-П использовали метод определения кислоторастворимых продуктов протеолиза. В экспериментах использовали "Azocasein" производства ISN Pharmaceuticals. Кислоторастворимые продукты гидролиза определяли по поглощению света при длине волны 350 нМ на спектрофотометре "Hitachi-557". После свертывания кровь центрифугировали при 2700 об./мин в течение 20 мин (центрифуга Элекон ЦЛМН Р10-01). К 1 мл полученной сыворотки добавляли 2,5 мл 0,2% раствора азоказеина в 0,05 М натрий-фосфатном буфере с рН 8,2. Пробирки инкубировали при 45 °С в течение 2 часов на водяной бане, затем прибавляли по 2,5 мл 10% трихлоруксусной кислоты и оставляли при температуре инкубации на 20 минут для осаждения непрореагировавшего субстрата. Затем содержимое пробирок фильтровали через бумажные фильтры "синяя лента" и определяли поглощение при 350 нМ, используя в качестве сравнения контрольную пробу, содержащую сыворотку крови крыс, не получавших препарат. После измерения экстинции по калибровочной кривой определяли содержание ПЭГ-П в сыворотке. Интегральные модельно-независимые параметры фармакокинетики ПЭГ-П рассчитывали методом статистических моментов по фармакокинетической кривой, построенной по

14

средним концентрациям препарата в крови крыс на каждый временной промежуток. Для расчета биодоступности препарата использовали фармакокинетические параметры ПЭГ-П при внутривенном введении.

Исследование фармакокинетики ПЭГ-П при энтеральном введении.

Эксперименты проведены на 70 беспородных крысах-самцах массой 350-420 г. ПЭГ-П вводили внутрижелудочно в дозе 2250 ЕД/кг. Пробы крови забирали из сонной артерии крыс (под эфирным наркозом) через тефлоновый катетер через 1, 2, 3, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7 и 8 часов после введения ПЭГ-П.

Исследование фармакокинетики ПЭГ- при внутривенном введении.

Эксперименты проведены на 36 беспородных крысах-самцах массой 240-280 г. ПЭГ-П вводили в хвостовую вену в дозе 30 ЕД/кг. Кровь для получения сыворотки забирали после декапитации животных на 1, 5, 10, 15 и 30 минутах. Исследование параметров токсичности при парентеральном введении. Изучение токсичности ПЭГ-П при однократном введении лабораторным животным. В эксперименте использованы половозрелые неинбредные мыши, исходной массой 20-30 г (42 животных), и крысы (17 самцов и 17 самок), исходной массой 200-250 г, полученные из вивария "Рассвет" (г. Томск). Наблюдение за животными осуществляли в течение 2 недель. Следили за поведением, внешним видом, двигательной активностью, реакцией животных на внешние раздражители, общей массой (до и через 14 дней после введения). Мышам (по 4-5 $ и с? на дозу) препарат вводили внутрибрюшинно в дозе 0,9 мл (18 ЕД или 135,5 мг/ на 20 г массы тела мыши или 6750 мг/кг) двукратно через 3 часа (13500 мг/кг) и трехкратно через 2 часа (20250 мг/кг), а внутривенно в течение 10-20 с однократно - в дозах 0,3; 0,4 и 0,5 мл (6, 8, 10 ЕД или 37,5; 50,0 и 62,5 мг/ на 20 г массы тела мыши или 1875, 2500 и 3125 мг/кг). Крысам (по 3-5 $ и с? на дозу) препарат вводили внутрибрюшинно в дозе 7500 мг/кг (100 ЕД на 100 г общей массы крысы) в максимально допустимом объеме (5 мл) и внутривенно в течение 10-20 с в дозе 1250, 2500 и 3750 мг/кг (20, 40 и 60 ЕД на 100 г общей массы крысы) в максимально допустимом объеме (2 мл).

Изучение токсичности ПЭГ-П при многократном введении (хроническая токсичность). В эксперименте использовано 82 крысы (41 самец и 41 самка). ПЭГ-П животным опытных групп вводили внутрибрюшинно ежедневно в течение 14 дней. Перед введением содержимое одного флакона растворяли в 1012 мл физиологического раствора. Контрольные крысы получали 1,5 мл на 100 г их массы физиологический раствор. О токсичности ПЭГ-П судили по общему состоянию, динамике общей массы при еженедельном взвешивании, картине периферической крови, костного мозга, функции печени, почек, нервной системы, сердца (ЭКГ, АД), а также данным морфологического исследования внутренних органов и их массы (головной мозг, сердце, легкое, печень, тимус, селезенка, лимфатические узлы, желудочно-кишечный тракт, надпочечники, половые железы, поджелудочная и щитовидная железа). Исследования проводили после окончания 14-дневного введения препарата, а также через 2 недели после его отмены.

Исследование параметров токсичности при энтеральном введении.

Эксперименты поставлены на половозрелых неинбредных мышах и крысах, а также кроликах. Исследования проведены в соответствии с методическими

15

указаниями по изучению общетоксического действия фармакологических веществ [«Руководство по экспериментальному /доклиническому/ изучению новых фармакологических веществ», под ред. Р.У.Хабриева, 2005].

Изучение токсичности однократном введении лабораторным животным. В эксперименте ПЭГ-П растворяли в физиологическом растворе и вводили однократно внутрижелудочно с помощью металлического зонда мышам (15 самцов и 15 самок), исходной массой 23-36 г, в дозах 5,0, 10,0 и 20,0 г/кг (соответственно 3500, 7000 и 14000 ЕД/кг), и крысам (5 самцов и 5 самок), исходной массой 140-215 г, в дозе 5,0 г/кг (3500 ЕД/кг). Наблюдение за животными осуществляли в течение 2 недель. Следили за поведением, внешним видом, двигательной активностью, реакцией животных на внешние раздражители, общей массой (до и через 14 дней после введения).

Изучение токсичности ПЭГ-П, таблетки при многократном введении (хроническая токсичность). Результаты исследования на крысах. В эксперименте использовано 80 крыс (40 самцов и 40 самок). Выбранные дозы приблизительно в 4, 20 и 40 раз превышали суточную дозу на кг массы для человека. ПЭГ-П животным опытных групп вводили внутрижелудочно с помощью металлического зонда ежедневно в течение 30 дней. О токсичности испытуемого средства судили по общему состоянию, динамике общей массы при еженедельном взвешивании, картине периферической крови, костного мозга, функции печени, почек, нервной системы, сердца (ЭКГ), а также данным морфологического исследования внутренних органов и их массы (головной мозг, сердце, легкие, печень, тимус, селезенка, лимфатические узлы, желудочно-кишечный тракт, почки, надпочечники, половые железы, поджелудочная и щитовидная железа). Исследования проводили после окончания 30-дневного введения препарата, а также через 2 недели после его отмены. Результаты исследования на кроликах. Изучение месячной токсичности ПЭГ-П проведено на 15 кроликах (7 самцов и 8 самок), исходной массой 1,2-2,0 кг (возраст - 2-3 мес). Препарат животные получали 7 раз в неделю в течение 30 дней внутрь с пищей (измельченная морковь): кролики I группы (2 самца и 3 самки) получали 0,5 таблетки препарата (150 ЕД), II группы (2 самца и 3 самки) - одну таблетку (300 ЕД), Контроль (3 самца и 2 самки), интактные животные, - только морковь. Велось наблюдение за общим состоянием животных, взвешивание через 2 недели. Через 30 дней опыта у животных брали кровь из краевой вены уха для определения параметров общего анализа крови и биохимических показателей, а после эфтаназии путем введения внутривенно насыщенного раствора хлористого калия в дозе 1 мл/кг массы животного (гибель животных наступала практически мгновенно от остановки сердца) проводилось вскрытие животных, после чего забор мочи для биохимического исследования из мочевого пузыря и внутренних органов для их макроскопического и микроскопического изучения Исследование местнораздражающего действия ПЭГ-П. О местно-раздражающем действии ПЭГ-П у крыс, получавших препарат внутрижелудочно, судили по макро- и микроскопическому состоянию слизистой оболочки желудка.

Клинические исследования инъекционной формы. Согласно разрешению № 244 от 22 декабря 2003 года Департамента государственного контроля

лекарственных средств, изделий медицинского назначения МЗ РФ на проведение клинических испытаний, исследования I и П-й фазы проводились в четырех клинических центрах: ГУ НИИ кардиологии ТНЦ СО РАН, г. Томск; МУЗ Городская клиническая больница № 1, Новосибирск; Центральная клиническая больница СО РАН, Новосибирск; Городская клиническая больница № 34. Цель исследования изучить безопасность и эффективность терапии ПЭГ-П у больных острым инфарктом миокарда в сравнении с терапией стрептокиназой.

Задачи исследования в 1-й фазе: 1. изучить безопасность лекарственного средства ПЭГ-П; 2. оценить частоту и сроки достижения реперфузии инфаркт-связанной коронарной артерии; 3. определить частоту 30-дневной летальности, рецидивов инфаркта миокарда; 4. определить частоту и выраженность гипотензивной реакции на фоне введения тромболитического препарата; 5. установить частоту и выраженность геморрагических осложнений; 6. оценить влияние изучаемых препаратов на показатели гемостаза. Способ введения: препарат вводится в дозах 10-20 ЕД на кг массы тела в разведении 1 флакон лиофилизата в 200-400 мл физиологического раствора. Введение препарата осуществляется внутривенно капелыю со скоростью не более, чем 40 ЕД в минуту. Препарат вводится 1-3 раза в первые сутки и 1-2 раза в течение последующих 2-4 суток.

Задачи во 2 фазе: 1. на основании данных ЭКГ оценить частоту и сроки достижения реперфузии инфаркт-связанной коронарной артерии и сравнить с результатами при лечении стрептокиназой; 2. определить частоту 30-дневной летальности, рецидивов инфаркта миокарда и постинфарктной стенокардии (частоту кардиальных событий) при лечении ПЭГ-П и стрептокиназой; 3 одобрать наиболее эффективные дозы ПЭГ-П для получения тромболитического эффекта. Способ введения. Внутривенное капельное введение ПЭГ-П в течение 60 мин в дозе 2000 Ед со скоростью не более 40 Ед/мин. После ударной дозы вводится поддерживающая доза ПЭГ-П 2000 ЕД со скоростью 100 Ед/час через перфузомат в течение суток. Последующие введения ПЭГ-П осуществляются во 2-е и 3-й сутки со скоростью 100 Ед/час через перфузомат в дозе 2000 Ед/сутки. В группу наблюдения был включен 61 больной с острым инфарктом миокарда. Этим пациентам для реперфузии ИСКА ПЭГ-П вводился сразу после рандомизации, а затем на 2-е и 3-й сутки наблюдения с целью профилактики реинфарктов. В группу сравнения было включено 38 человек с острым инфарктом миокарда. Пациентам из группы контроля тромболитическую терапию также начинали сразу после рандомизации. Пациентам вводилась стрептокиназа в дозе 750 тыс. или 1500 тыс. ЕД.

Клиническое исследование 3 фазы проводилось в два этапа. ША фаза проводилось по разрешению № 256 от 12 июля 2005 года Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития МЗ и Социального развития Российской Федерации в период с 12 июля 2005 года по 1 марта 2006 года. ШБ фаза клинических исследований была проведена на основании разрешения №145 от 6 апреля 2007 года и разрешения на продление от 1 октября 2008 года в период с 6 марта 2007 года по 31 января 2009 года. Результаты исследований были объединены для анализа. Всего в исследовании

приняли участие 118 больных острым инфарктом миокарда. Цель исследования изучить эффективность и безопасность терапии ПЭГ-П у больных острым инфарктом миокарда в сравнении с терапией Стрептокиназой. Задачи исследования: 1. оценить частоту и сроки достижения реперфузии инфаркт-связанной коронарной артерии; 2. оценить частоту кардиальных событий (летальности в течение 30 дней, нефатальных реинфарктов и нестабильной стенокардии); 3. оценить частоту и выраженность гипотензивной реакции на фоне введения тромболитического препарата; 4. оценить частоту и выраженность геморрагических осложнений; 5. оценить влияние изучаемых препаратов на показатели гемостаза; 6. оценить восстановление гемодинамической функции миокарда. Вид исследования: открытое рандомизированное с использованием метода параллельных групп. Способ и дозы введения: внутривенное капельное введение ПЭГ-П в течение 60 мин в дозе 2000 ЕД со скоростью не более 40 ЕД/мин. После ударной дозы вводилась поддерживающая доза ПЭГ-П 2000 ЕД со скоростью 100 ЕД/час через перфузомат в течение суток. Для участия в исследовании отбирались пациенты мужского и женского пола в возрасте от 40 до 75 лет, у которых в течение 6 часов развились признаки инфаркта миокарда.

Клинические исследования энтеральной формы ПЭГ-П.

Клинические исследования безопасности и эффективности при хронической венозной недостаточности. 1 и 2 фазы проводились по разрешению № 257 от 12 июля 2005 года Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации. Клинические исследования проводились по Правилам GCP в соответствии с действующими нормативными требованиями (ОСТ 42511-99 от 01.01.99 г. Клинические центры: ГУ НИИ клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН, Новосибирск; МУЗ Городская клиническая больница № 12, Новосибирск; Некоммерческая организация, фонд развития и оказания специализированной медицинской помощи «Медсанчасть-168», Новосибирск. Цель исследования изучить эффективность и безопасность терапии ПЭГ-П у больных хронической венозной недостаточностью. Задачи исследования: 1. оценить изменения степени венозной недостаточности при 14-дневном курсе лечения ПЭГ-П по данным объективного и клинического обследования в день поступления и на 15-й день после начала лечения; 2. оценить частоту и выраженность геморрагических осложнений; 3. изучить влияние ПЭГ-П на показатели гемостаза. Для участия в исследовании отбирались пациенты 40-75 лет мужского и женского пола с хронической венозной недостаточностью, (III-VI степень по международной классификации СЕАР) с отёками, экземой, гиперпигментацией, трофическими нарушениями кожи. В группу наблюдения (ПЭГ-П) было включено 33 больных хронической венозной недостаточностью. Эти пациенты принимали ПЭГ-П сразу после рандомизации. В группе контроля (29 пациентов) в качестве препарата сравнения был использован Троксевазин в дозе 600 мг в сутки. Способ введения: ПЭГ-П вводился per os, продолжительность лечения 14 дней. Максимальная разовая доза - 8 таблеток. Максимальная суточная доза 10 таблеток. Максимальная курсовая доза не превышала 28 000 ЕД. Эффективность терапии оценивалась по динамике следующих показателей: окружность голени, размеры

трофической язвы, показатели реолимфовазографии и лазерной доплеровской флоуметрии, отражающие характер вено- и лимфооттока, а также балльной оценки по клинической шкале СЕАР. Для части пациентов факультативно была проведена лимфосцинтиграфия.

3 фаза проводились по разрешению № 146 от «06» апреля 2007 года Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации. Клиническое исследование проводились по Правилам GCP в соответствии с действующими нормативными требованиями (ОСТ 42-511-99 от 01.01.99 г., Приказ Минздрава РФ №266 от 19.06.2003 г. Клинические центры: ГУ НИИ клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН, Новосибирск; ФГУ «Новосибирский научно-исследовательский институт патологии кровообращения им. ак. Е.Н.Мешалкина Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», Новосибирск; Некоммерческая организация, фонд развития и оказания специализированной медицинской помощи «Медсанчасть-168», Новосибирск. Цель исследования изучить эффективность и безопасность терапии ПЭГ-П у больных хронической венозной недостаточностью. Задачи исследования: 1. оценить изменения степени венозной недостаточности при 20-дневном курсе лечения ПЭГ-П по данным объективного и клинического обследования в день поступления, на 10-12 день и на 20 день после начала лечения; 2. оценить частоту и выраженность геморрагических осложнений; 3. изучить влияние ПЭГ-П на показатели гемостаза. Вид исследования - открытое рандомизированное с использованием метода параллельных групп. В исследовании приняли участие 57 больных хронической венозной недостаточностью. Рандомизация обеспечивалась методом случайных чисел. В группу наблюдения (ПЭГ-П) было включено 40 больных хронической венозной недостаточностью. В группе контроля (17 пациентов) в качестве препарата сравнения был использован Троксевазин в дозе 600 мг в сутки. Анализ побочных эффектов и осложнений проведен у всех больных, которые принимали ПЭГ-П и Троксевазин._Способ введения: ПЭГ-П вводился per os. Продолжительность лечения 20 дней. Максимальная разовая доза - 8 таблеток. Максимальная курсовая доза не превышала 32000 ЕД. Эффективность терапии оценивалась по динамике следующих показателей: окружность голени, размеры трофической язвы, показатели реолимфовазографии и лазерной доплеровской флоуметрии, отражающие характер вено- и лимфооттока, а также балльной оценки по клинической шкале СЕАР. Для части пациентов факультативно была проведена лимфосцинтиграфия.

Клиническое исследование для определения эффективности и безопасности применения препарата ПЭГ-П у пациенток с хронической венозной недостаточностью на фоне применения гормональной заместительной терапии и гормональных контрацептивов. Исследование проведено в МУЗ «Муниципальный центр планирования семьи и репродукции», Новосибирск. В исследовании приняли участие 13 пациенток, принимающих гормональную заместительную терапию и гормональные оральные контрацептивы, у которых развились признаки хронической венозной недостаточности. Вид исследования: Открытое, несравнительное клиническое исследование. Цель исследования:

изучить эффективность и безопасность терапии ПЭГ-П у женщин с хронической венозной недостаточностью на фоне применения гормональной заместительной терапии и гормональных контрацептивов. Задачи исследования: 1. оценить эффект курсовой дозы ПЭГ-П на выраженность симптомов ХВН; 2. оценить показатели гемостаза у данной группы после проведения терапии ПЭГ-П; 3. оценить характер и выраженность нежелательных явлений или нежелательных реакций, если они наступят в результате приема ПЭГ-П; 4. в зависимости от полученных данных об эффективности и безопасности расширить позиционирование препарата. Способ применения: ПЭГ-П принимается per os. Продолжительность лечения - 12 дней. Препарат принимается по 4 таблетки за 1 час до еды 2 раза в день. Суточная доза - 8 таблеток (1600 Ед). Максимальная суточная доза 2000 ЕД. Максимальная курсовая доза не должна превышать 30000 ЕД. Методы и порядок контроля исследуемых признаков: оценка по клинической шкале СЕАР до начала исследования и на 12 -14 сутки; оценка толерантности к нагрузкам по бальной шкале при ХВН до начала исследования и на 12-14 сутки; оценка показателей гемостаза, отражающие процессы тромбообразования до начала лечения и на 12-14 сутки; данные о безопасности на момент окончания курса терапии ПЭГ-П. Исследования гемостаза проводились с помощью современных стандартизированных коагулологических наборов на коагулометре «Sysmex СА-50» (Япония), лазерном анализаторе микрочастиц «Ласка-БИО» (НПФ «Люмекс», Санкт-Петербург, Россия).

Клиническое исследование по эффективности и безопасности применения ПЭГ-П у пациентов с цереброваскулярными расстройствами и тромбозом венозной системы головного мозга. Исследование проводилось в условиях стационара на базе МУЗ ГМКБ №1 г. Новосибирска. Длительность наблюдения за пациентом осуществлялась в течение 12 дней. В группу наблюдения включено 13 пациентов с цереброваскулярными расстройствами и выявленными на компьютерной томографии тромбозом венозной системы головного мозга, протекающими на фоне хронической венозной недостаточности. Цель исследования оценить эффективность и безопасность препарата ПЭГ-П у больных с цереброваскулярными нарушениями вследствие тромбоза венозной системы головного мозга. Задачи исследования: оценить терапевтические возможности препарата по следующим критериям эффективности: динамика неврологического статуса; динамика показателей томографического исследования: структурные изменения тромботических масс, степень восстановления кровотока; динамика хронической венозной недостаточности по бальной шкале СЕАР; динамика показателей гемостаза (АЧТВ, ПТВ, ТВ, ФГ, РФМК, Д-димер, антитромбин III, ХИа- зависимый фибринолиз, плазминоген).

СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Электронно-лучевая пегиляция белковых молекул.

Исследование образцов облученных растворов ПЭГов без добавления рчГ-

КСФ. Свойства растворов ПЭГ во многом зависят от молекулярной массы. Очень важна так называемая «точка 3400». Это экспериментально найденное значение молекулярной массы ПЭГ, при которой происходят резкие изменения свойствах макромолекул, их поведения в растворах. В нашем случае меняется

механизм воздействия радиационного облучения на молекулу ПЭГ, так как значение 3400 Да является минимальным размером цепи ПЭГ, необходимым для кооперативного перехода в системе полимер - растворитель. Следствием неоднородности свойств ПЭГ может стать различие в механизмах взаимодействия молекул ПЭГ с молекулами белка в водных растворах при облучении. Для низкомолекулярных ПЭГ возможно присоединение только по концевой группе полимера, когда как для высокомолекулярных ПЭГ данное взаимодействие граничит с физическим включением в гель и образованием более сложных структур при помощи водородных связей. При облучении ПЭГа одновременно проходят два процесса: деструкция полимера в результате которой происходит образование карбонильных групп и сшивание ПЭГа, что приводит к увеличению мол массы ПЭГа. Так как ПЭГ относится к преимущественно сшивающимся полимерам, то процесс сшивки идет намного интенсивней, чем процесс деструкции, что и приводит к увеличению молекулярной массы и в конечном итоге гелированию. В результате проведённых экспериментов установлено, что облучение водных растворов ПЭГа ускоренными электронами в независимости от молекулярной массы полимера приводит к увеличению молекулярной массы, причем эффект более выражен у высокомолекулярных ПЭГов с начальной низкой концентрацией. Облучение ПЭГов приводит к дозозависимому накоплению карбонильных группировок. После облучения у высокомолекулярных ПЭГов наблюдается эффект перехода в состояние предгелирования (образование ассоциатов, обладающих сверхвысокими молекулярными массами), что может быть обусловлено процессом кросслинкинга, инициированного облучением. В растворах низкомолекулярных ПЭгов протекают процессы связывания между отдельными короткими цепями полимера по радикальному механизму. Облучение ПЭГов свободными электронами инициирует переход от линейной структуры к сетчатой вне зависимости от молекулярной массы облучаемого полимера.

Исследование образцов совместно облученных растворов ПЭГов с рчГ-КСФ.В результате облучения ускоренными электронами субстанции Г-КСФ с различными ПЭГами происходит образование комплексов белок-ПЭГ. Во всех исследуемых пробах с той или иной степенью конъюгации, доказательством чего служит сокращение времени выхода пиков облученных образцов по сравнению с временем выхода исходных образцов. Результаты предствлены на рисунках 1-6.

Рис. 3. Хроматографии субстанции рчГ-КСФ с 5% ПЭГ 1500 до и после облучения в дозе 1 Мрад

Рис.5. Хроматографии субстанции рчГ-КСФ с 0,18% ПЭГ10000 до и после облучения в дозе 2Мрад.

i \ f{ I ЧГ^ \

J

Рис.4. Хроматофафии субстанции рчГ-КСФ с 5% ПЭГ 1500 до и после облучения в дозе 2 МРад

i ...

¡1 ! 1 i» \l!

Рис.6. Хроматографии субстанции рчГ-КСФ с 0,36% ПЭГ20000 до и после облучения в дозе 0,5Мрад.

Для подтверждения включения Г-КСФ в образующиеся в результате облучения с ПЭГом комплексы, был проведен электрофорез всех исследуемых образцов в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях, с последующим окрашиванием гелевой пластины специфичным белковым красителем Coomassie G 250. Результаты электрофореза подтверждают образование в исследуемых образцах комплекса ПЭГ-Г-КСФ (наличие на электрофореграммах зон, расположенных выше полосы исходной субстанции рчГ-КСФ), причем это образование обусловлено исключительно воздействием потока ускоренных электронов, поскольку образцы, содержащие Г-КСФ и ПЭГи до облучения идентичны исходной субстанции. В образовавшиеся комплексы достоверно включена белковая составляющая, что доказывается окрашиванием их специфичным белковым красителем Coomassie G 250. На основании результатов электрофореза также можно предположить ковалентный характер связей, возникающий между Г-КСФ и молекулами ПЭГов, поскольку предварительная пробоподготовка образцов, состоящая из добавления денатураторов и кипячения, разрушает неспецифические межмолекулярные взаимодействия. В тоже время следует отметить, что прочность образовавшейся связи зависит от дозы облучения, что наглядно продемонстрировали образцы Г-КСФ с ПЭГ20000, облученные в низких дозах. На электрофорезе данных образцов наряду с зонами ПЭГ-Г-КСФ, наблюдаются единичные белковые полосы соответствующие исходному Г-КСФ, причем в образце, облученном в дозе 0,25Мрад, не связавшийся с ПЭГом остаточный белок, детектируется и на хроматограмме, что говорит о недостаточности выбранной дозы. В случае с

образцами ПЭГ-Г-КСФ20000 0,5Мрад и 0,75Мрад хроматографический анализ не выявил свободного Г-КСФ, в то время как электрофорез этих же образцов зафиксировал наличие несвязанного белка. Исходя из утверждения того, что чувствительность хроматографии и электрофореза сопоставима, можно заключить, что происходит частичное высвобождение Г-КСФ из комплекса ПЭГ-Г-КСФ в процессе пробоподготовки и проведения электрофореза. Это позволяет сделать заключение о том, что дозы в 0,5Мрад и 0,75Мрад в выбранных соотношениях концентрации белка и ПЭГ20000 не обеспечивают достаточно прочной связи, как это наблюдалось в случае с образцами ПЭГ-Г-КСФ 10000. Следует отметить, что именно в образцах с ПЭГЮООО, наблюдается наиболее полное включение белка в образующиеся ассоциаты (вследствие индуцированного ускоренными электронами кросслинкинга), в то время как во всех образцах с ПЭГ1500 наряду с ПЭГ-Г-КСФ детектируется несвязавшийся мономер рчГ-ГКСФ. Результаты электрофореза также выявили зависимость между молекулярной массой образующихся ПЭГ-Г-КСФ и дозой облучения. Наиболее выражено этот эффект проявился при анализе образцов с низкомолекулярными ПЭГ400 и ПЭГ1500, у которых наблюдалось увеличение диапазона молекулярной массы ПЭГ-Г-КСФ, в зависимости от дозы облучения. Для образцов с высокомолекулярными ПЭГами, подобной картины получить не удалось поскольку, при выбранных концентрациях и дозировках облучения, происходил кросслинкинг, с включенными в него ассоциатами ПЭГ-Г-КСФ. Таким образом, на основании проведенных исследований очевидно, что: 1. облучение растворов содержащих рчГКСФ и ПЭГи ускоренными электронами приводит к достоверному образованию комплекса ПЭГ-Г-КСФ в независимости от выбранного типа ПЭГа; 2. прочность образующихся связей, а также распределение по молекулярной массе ПЭГ-Г-КСФ, зависят от дозы облучения; 3. в формировании ассоциатов ПЭГ-Г-КСФ в образцах с высокомолекулярными ПЭГами задействован процесс кросслинкинга, индуцированный ускоренными электронами.

2. Исследование фармакологических свойств пегилированного посредством ЭЛЛ гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (ПЭГ-Г-КСФ).

Для исследования фармакологических свойств ПЭГ-Г-КСФ была выбрана композиция рчГКСФ с ПЭГ 15 00. Факт образования ПЭГ-Г-КСФ подтверждён на хроматограмме и электрофореграмме. Образцы ПЭГ-Г-КСФ, использующиеся в исследованиях по изучению фармакологических свойств были заложены на ускоренное старение при повышенной температуре (термостат 38 С) для подтверждения сохранения физико-химических и фармакодинамических свойств.

Представленные в таблице 1 данные свидетельствуют о том, что ЭЛП рчГКСФ, с образованием ПЭГ-Г-КСФ обеспечивает высокую стабильность белка (рчГКСФ) как с точки зрения его физико-химических свойств, так и фармакодинамических эффектов.

Таблица 1.

Данные по ускоренному хранению ПЭГ-Г-КСФ

0 точка 1 точка 2 точка 3 точка 4 точка В холодильнике за 3 мес.

Дни хранения 0 12 соответствует 3 мес. Т=8°С 24 соответствует 6 мес. Т=8°С 48 соответствует 12 мес. Т=8°С 96 соответствует 24 мес. Т=8°С

Падение концентрации г-ксф (% уменьшения площади основного пика г-ксф по ВЭЖХ) 100% 79,9% 74,8% 74,3% 67% 98%

Падение специфической активности 100% 74,8% 78,0% 98,0%

Изучение фармакокинетики ПЭГ-Г-КСФ. Абсолютная биологическая доступность (Р) препарата при изучаемых путях введения ПЭГ-Г-КСФ рассчитывалась по формуле Р=АиО/АиСр* 100%, где ЛЮ - площадь под фармакокинетической кривой при внутривенном введении препарата, а АИСр -площадь под фармакокинетической кривой в сыворотке при изучаемом пути введения. При этом значение Р составляло: 4,3%, 79,5% и 32,1% при внутрижелудочном, подкожном и ректальном введении соответственно. Таким образом, наиболее существенная биодоступность ПЭГ-Г-КСФ при указанных путях введения наблюдается при подкожном использовании препарата. При ректальном введении препарат достаточно быстро попадает в системный кровоток Тгаах- 1 час, при этом максимальная концентрация (Спих) достигает значения 2400 пг (что сопоставимо с максимальными значениями при внутривенном введении препарата), и относительно (по сравнению с внутрижелудочным введением) длительно циркулирует в крови. Так, концентрация препарата при данном способе введения к 5 часу снижалась до исходного уровня (Т,/2=3.3 ч). Подкожное введение ПЭГ-Г-КСФ, по данным исследования, является наиболее адекватной альтернативой внутривенного введения, за исключением параметра Ттах, значение которого составляет 1 час. Величины остальных параметров - период полувыведения, клиренс, площадь под фармакокинетической кривой, либо соответствуют, либо приближаются к таковым при внутривенном введении препарата. Вне зависимости от пути введения ПЭГ-Г-КСФ достаточно быстро достигает системного кровотока. Время достижения максимальных концентраций (Ттах) при подкожном и ректальном введении составило 1 час, а при внутрижелудочном введении 10 мин. Значения максимальных концентраций достигнутых при различных путях введения лежат в диапазоне 1700-2500 пг, включая и внутривенное введение препарата.

Параллельно фармакокинетическому исследованию было проведено изучение биологической (колониестимулирующей) активности сыворотки у животных, получавших ПЭГ-Г-КСФ. Независимо от пути введения препарата в организм животного КСА сыворотки возрастала. Вместе с тем при внутривенном введении препарата КСА возрастала уже к 1 часу после начала эксперимента, к 3 часа достигала наибольших значений показатель и сохранялась повышенной на протяжении последующих 4 ч. В то время как при ректальном введении иммобилизированного гранулоцитарного

колониестимулирующего фактора КСА сыворотки возрастала более плавно, а наиболее значимых величин достигала на 7 ч.

Таблица 2.

Сывороточные концентрации КСФ у мышей, после введения препарата, pg/ml

Time, ПЭГ-Г-КСФ ПЭГ-Г-КСФ ПЭГ-Г-КСФ ПЭГ-Г-КСФ Г-КСФ

h р/о s/c i/v р/г i/v

0 0,00 0,00 1984,60 0,00 1748,01

0.17 1795,83 1460,83 1904,17 258,33 1575,83

0.5 255,83 1463,33 1653,33 374,17 1993,33

1 170,00 1781,67 1866,67 2416,67 1272,50

3 80,83 1370,83 1824,17 2355,83 1362,50

5 140,00 1380,83 1760,83 143,33 1534,17

7 2,00 1622,50 1546,67 96,67 1574,17

12 6,67 1091,67 1570,00 55,00 1492,50

24 2,00 2,00 33,33 85,83 34,17

Таблица 3.

Фармакокинетические показатели ПЭГ-Г-КСФ при введении мышамв дозе 100

мкг/кг _

Путь введения препарата AUCo-t С ,„x, ПГ/МЛ Тщах, час Тш MRT, час Kel, 1/час С1, л/час

р/о 1284,96 1795,83 0,17 0,4 37,85 1,54 1556,47

s/c 23672,83 1781,67 1,00 8,3 6,99 0,08 84,49

i/v 29792,53 С0=1984,84 10,4 8,52 0,07 67,13

p/r 9559,86 2416,67 1,00 3,3 16,80 0,21 209,21

i/v 27154,56 С0=1748,01 10,8 12,05 0,06 73,65

Примечание: С0 - расчетное значение препарата в нулевой момент времени

Сравнительный анализ концентрации Г-КСФ и КСА сыворотки крови животных в случаях использования препарата внутривенно, подкожно и ректально показал наличие однотипной динамики. В то время как динамика исследуемых показателей при внутрижелудочном введении ПЭГ-Г-КСФ практически не совпадают. Последнее обстоятельство указывает на возможность перераспределения молекул ПЭГ-Г-КСФ в лимфатическом и кровеносном секторах при их прохождении через ЖКТ. Использование ПЭГ-Г-КСФ путем его введения per rectum обеспечивает значительно более существенное всасывание

препарата в кровь, чем рег оз. Полученные данные однозначно свидетельствуют о перспективности данного способа назначения, альтернативного парентеральному применению ПЭГ-Г-КСФ. Также перспективным представляется и энтеральный путь приёма препарата. В исследованиях показано, что биодоступность пегилированной молекулы превышает всасываемость нативного белка более, чем в 3 раза без учёта возможного перераспределения по лимфатическому руслу кишечника (эти исследования не были запланированы в данной работе). Энтеральный путь всасывания демонстрирует проникновение ПЭГ-Г-КСФ в интерстициальное пространство, что в свою очередь, позволяет рассчитывать на применение данного препарата в регенеративной медицине.

Изучение токсического действия ПЭГ-Г-КСФ в остром эксперименте при однократном введении.

Результаты проведенных исследований на мышах. Внутривенное введение. Препарат ПЭГ-Г-КСФ был введен в максимально возможном для данного пути введения объеме - 0,2 мл на 20 г массы животного, что составило 10 мл/кг или 3000 мкг/кг. Внутрижелудочное введение. Препарат ПЭГ-Г-КСФ был введен в максимально возможном для данного пути введения объеме - 1,0 мл на 20 г массы животного, что составило 50 мл/кг или 15000 мкг/кг. Подкожное введение. Препарат ПЭГ-Г-КСФ был введен в максимально возможном для данного пути введения объеме — 1,0 мл на 20 г массы животного, что составило 50 мл/кг или 15000 мкг/кг. Наблюдение за животными в течение 14 дней не выявило никаких изменений внешнего вида, поведения и двигательной активности мышей. При взвешивании мышей в конце эксперимента (через 2 недели) отмечено, что все животные равномерно прибавили в массе.

Результаты проведенных исследований на крысах. Внутривенное введение. Препарат ПЭГ-Г-КСФ был введен в максимально возможном для данного пути введения объеме - 2,0 мл на 200,0 г массы животного, что составило 10 мл/кг или 3000 мкг/кг. Подкожное введение. Препарат ПЭГ-Г-КСФ был введен в максимально возможном для данного пути введения объеме - 5,0 мл на 200,0 г массы животного, что составило 25,0 мл/кг или 7500 мкг/кг. Внутрижелудочное введение. Препарат ПЭГ-Г-КСФ был введен в максимально возможном для данного пути введения объеме - 5,0 мл на 200,0 г массы животного, что составило 25,0 мл/кг или 7500 мкг/кг. Наблюдение за животными в течение 14 дней не выявило никаких изменений внешнего вида, поведения и двигательной активности мышей. При взвешивании мышей в конце эксперимента (через 2 недели) отмечено, что все животные равномерно прибавили в массе.

Анализ полученных результатов изучения острой токсичности позволил установить, что однократное введение ПЭГ-Г-КСФ в крысам и мышам внутривенно, подкожно и внутрижелудочно в максимально возможном для данного пути введения объеме не оказывает токсического действия на организм животных при наблюдении за ними в течение 14 дней.

Выявленные параметры острой токсичности ПЭГ-Г-КСФ на мышах и крысах при разных путях введения (внутривенно, подкожно и внутрижелудочно), не позволяют точно определить значение 1ЛЭ50 для изученной фармакологической композиции из-за невозможности достижения больших концентраций препарата. Условно данное вещество можно отнести в

соответствии с ГОСТ 12.1.007-76 (по внутрижелудочному пути введения), к классу менее второго класса опасности, хотя это не дает полной характеристики безопасности. Достигнутые дозы при определении токсичности многократно превышают терапевтические, применяемые в клинической практике - от 300 до 1500 раз.

Таблица 4.

Параметры острой токсичности ПЭГ-Г-КСФ при однократном введении мышам и крысам, мл/кг (мкг/кг)

Вид, пол животных, способ введения 1^50

Мыши (самцы и самки) Внутривенно Внутрижелудочно Подкожно >10,0 (3000 мкг) >50,0(15000 мкг) >50,0 (15000 мкг)

Крысы (самцы и самки) Внутривенно Подкожно В нутриже лудоч но >10,0 (3000 мкг) >25,0 (7500 мкг) >25,0 (7500 мкг)

Изучение общетоксического действия в течение 6 месяцев (хроническая токсичность). Введение ПЭГ-Г-КСФ в дозах 50 и 250 и 500 мг/кг внутрижелудочно в течение 6 мес. не вызывало гибели животных; крысы не проявляли признаков беспокойства, не были выявлены изменения аппетита, выделений, состояния слизистых, шерсти, кожи и др. Отмеченное обратимое снижение процента прироста массы тела у крыс-самок не приводило к значимому изменению средней массы животных экспериментальных групп в сравнении с контрольными значениями.

Влияние ПЭГ-Г-КСФ на показатели форменных элементов периферической крови. Анализ полученных результатов у крыс (самцов и самок) через 3 и 6 мес. внутрижелудочного введения ПЭГ-Г-ГКСФ в трех дозах выявил ряд умеренных изменений со стороны показателей периферической крови. Через 3 мес. опыта следует отметить у крыс-самцов повышение гематокритного числа в 1 группе, повышение числа эритроидных клеток и снижение количества незрелых лейкоцитов во 2 группе и снижение общего количества лейкоцитов в 3 группе за счет падения числа зрелых и незрелых лейкоцитов и моноцитов. У крыс-самок во 2 группе отмечено повышение СОЭ, в 3 группе - эозинофильных лейкоцитов и снижение числа моноцитов. Через 6 мес. введения ПЭГ-Г-КСФ следует отметить развитие эритропении и снижение уровня гемоглобина в 1 группе крыс-самцов, тромбоцитопении - во 2 и 3 группе, и снижения ОКЛ во 2 группе. У крыс-самок при введении препарата увеличивалось СОЭ в 1 и 2 группах, снижалось ОКЛ, за счет падения числа моноцитов и лимфоцитов, в 1 группе. Через 2 недели после отмены введения ПЭГ-Г-КСФ не было отмечено никаких изменений в картине периферической крови ни в одной из экспериментальных групп.

Таким образом, виутрижелудочное введение в течение 3-х месяцев крысам ПЭГ-Г-КСФ в дозах 50, 250 и 500 мг/кг не вызывает патологических изменений основных показателей форменных элементов периферической крови. Выявленные изменения ряда показателей периферической крови через 3 и 6 мес. введения препарата носят обратимый характер.

3. Исследование фармакологических свойств пегилированного посредством ЭЛП ферментного препарата протеиназы (ПЭГ-П).

Физико-химические свойства ПЭГ-П. Молекулярная масса 27,7 кДа, 275 аминокислотных остатков. На рисунке 7 представлены данные электрофореза в 12,5% ПААГ-Геле с окраской нитратом серебра ПЭГ-П, культуральной жидкости (к/ж) из которой экстрагируется протеиназа ПЭГ-П и Декозима. Очевидно, что ПЭГ-П имеет высокую степень выделения и последующей очистки.

Рис. 7. Электрофорез в 12,5% ПААГ-Геле с окраской нитратом серебра. Примечание 1 — Декозим 13мкг/лунка; 2 - ПЭГ-П 20мкг/лунка; 3 -к/ж 24мкг/лунка

Рис.8. SDS-ПААГ- электрофорез в 10% а/а геле.1-Субстанция ПЭГ-П с230209 20мкг/лунка; 2-Субстанция ПЭГ-П с240209 20мкг/лунка; З-Субстанция ПЭГ-П С250209 20мкг/лунка; 4-Субстанция ПЭГ-П с270209 20мкг/лунка; 5-Субстанция ПЭГ-П C280209 20мкг/лунка; 6-Субстанция ПЭГ-П C290209 20мкг/лунка; 7-Субстанция ПЭГ-П с300309 20мкг/лунка; 8-Субстанция ПЭГ-П с310309 20мкг/лунка; 9-Субстанция ПЭГ-П с30409 20мкг/лунка; 10-Субстанция ПЭГ-П с40409 20мкг/лунка.

ПЭГ-П имеет стабильные физико-химические свойства при соблюдении условий хранения, предусмотренных для ферментных препаратов. Лекарственный препарат ПЭГ-П имеет заявленные производителем сроки хранения 2 года для твёрдой лекарственной формы и 18 месяцев для лиофилизата (ФСП 42-0562656805, ФСП 42-0562569804).

Исследование тромболитической активности in vitro.

Исследование фибринолитической активности ПЭГ-П. Полученные результаты свидетельствуют о наличии прямого фибринолитического действия препарата ПЭГ-П на нестабилизированный фибрин in vitro в концентрациях 5,0 и 10,0 Ед/мл. При использовании же более высоких концентраций ПЭГ-П проявляется его противосвертывающая активность, выражающаяся в уменьшении размеров сгустка или отсутствии его образования. На модели лизиса тромба in vitro отмечено, что ПЭГ-П обладает выраженным тромболитическим действием, достоверно превосходящим фибринолизин в стандартной лечебной концентрации - 50 ФЕ/мл (р<0,02), трипсин (р<0,01) и спонтанный лизис тромба в физиологическом растворе (р<0,01). В течение первых двух часов действие фибринолизина на тромб достоверно не отличается от спонтанного фонового лизиса в физиологическом растворе. К концу 4-го часа ПЭГ-П полностью растворяет тромб, в то время как фибринолизин за это время лизирует только 20 % массы «старого» тромба.

Исследование антиагрегантной активности ПЭГ-П. Исходная агрегация тромбоцитов в данной серии экспериментов составила 32±2%. После добавления в плазму ПЭГ-П в концентрациях 0,1, 0,2 и 0,3 ПЕ/мл наблюдалось достоверное снижение степени агрегации на 41%, 25% и 19% соответственно по отношению к контролю. С увеличением дозы ПЭГ-П прослеживалась тенденция к восстановлению значений агрегации тромбоцитов. Так при добавлении ПЭГ-П в концентрации 0,4 ПЕ/мл агрегация составила 33±1%, в концентрации 0,5 ПЕ/мл -34±1%, в концентрации 1,0 ПЕ/мл - 31±1, что не отличалось от контрольного показателя. ПЭГ-П в низких концентрациях (0,1-0,3 ПЕ/мл) приводит к достоверному снижению агрегации тромбоцитов при действии АДФ (1><10"6 М). В диапазоне концентраций ПЭГ-П от 0,4 до 1,0 ПЕ/мл агрегация тромбоцитов находится на уровне, близком к исходному.

Электрокоагулографическое исследование цельной крови. Как видно из представленного графического материала, курсовой прием препарата обеспечивает статистически значимое снижение контактной фазы свертывания крови с 318±19 до 178±21, увеличение времени её достижения с 1,1±0,3 мин до 3,2±0,4 мин (р<0,5). При этом выражено снижается интенсивность контактной фазы коагуляции с -141,82±13,21 до 18,13±6,27 (р<0,5) и константа тромбиновой активности с 58,82±4,37 до 23,81±3,36 (р<0,5). Эти изменения регистрируются на фоне снижения интенсивности коагуляционного драйва с 41,89±2,35 до 25,34±3,12 (р<0,5) и увеличения времени свертываемости цельной крови с 3,7±0,1 мин до 10,3±1,1 мин (р<0,5). Полученные результаты полностью подтверждают эффективность применяемого препарата в отношении не только его фибринолитической активности, но и в отношении снижения прокоагулянтной активности в тромбоцитарно-сосудистом и прокоагулянтном

звеньях гемостаза.

Рис.9. Суммарные гемокоагулограммы, полученные у пациентов с ИБС: стенокардия напряжения I-II ФК, НК 0-1 до (верхний график) и после (средний график) курсового приема препарата ПЭГ-П. Нижний график — 120 минут после приема 800 ЕД препарата ПЭГ-П.

Приведенный на рисунке 9 нижний график, полученный в пробах цельной крови пациентов ИБС: стенокардия напряжения I-II ФК, НК 0-1 на 120 минуте после приема 800 ЕД препарата ПЭГ-П демонстрирует эффекты препарата in vitro. В анализируемой пробе цельной крови, содержащей аликвоту поступившего в системный кровоток препарата, в результате контактной активации запускается каскадный процесс гемокоагуляции, где, через образование тромбина, конечным этапом выступает формирование фибринового сгустка. Но, как видно из «поведения» графика гемокоагулограммы, концентрации перорального фибринолитика, содержащегося в анализируемом объеме цельной крови, оказывается достаточно для выраженного торможения фибринообразования, что подтверждается волнообразными изменениями кривой лишь с постепенным приростом её амплитуды. Косвенным образом это подтверждает гипотезу о постепенном высвобождении активного начала - ПЭГ-П из пегелированной структуры.

Таким образом, по результатам исследования курсового приема препарата ПЭГ-П в суточной дозе 1600 ЕД показано достижение выраженной эффективности в отношении повышения резервных возможностей антикоагулянтного звена гемостаза и снижения агрегационной активности тромбоцитов на фоне оптимизации соотношения ряда цитокинов, ответственных за реализацию про- и противовоспалительной активностей.

Исследование фармакологических свойств in vivo.

Исследование влияния ПЭГ-П на фибринолитическую систему крови.У

животных контрольной группы время спонтанного лизиса сгустка, получаемого из эуглобулиновой фракции плазмы при добавлении к ней хлорида кальция, достигало 229±17 мин. У крыс, получавших ПЭГ-П, через час после введения

время лизиса сгустка снизилось в 1,4 раза и составило 162±23 мин, что статистически значимо меньше, чем в контрольной группе.

Исследование гемореологическои активности. У животных, получавших ПЭГ-П через 1 час после введения препарата наблюдалось достоверное повышение вязкости крови_(на 10-25% по сравнению с контрольной группой) во всем исследуемом диапазоне скоростей сдвига. Вместе с тем на этом фоне выявлено статистически значимое снижение вязкости плазмы до 1,29±0,02 сПз. При введении ПЭГ-П значение гематокрита увеличивалось до 44±1% и являлось достоверно более высоким по сравнению с контрольными крысами (38±1%). Под действием препарата полупериод агрегации эритроцитов возрастал в 2,3 раза (до 28,3±5,4 с), что свидетельствует об ослаблении процессов эритроцитарной агрегации.

Исследование тромболитической активности при профилактическом введении. Профилактическое введение ПЭГ-П эффективно ограничивает процесс тромбообразования в сонной артерии в первые 1,5 часа после воздействии на нее хлоридом двухвалентного железа и уменьшает количество тромбов через 24 часа.

Исследование тромболитической активности ПЭГ-П при лечебном введении. При терапевтическом введении ПЭГ-П а через 24 часа достоверно и существенно (в 3 раза) снижается доля животных с полной окклюзией сонной артерии и наличием в ней тромба, что свидетельствует о выраженной тромболитической активности препарата при лечебном применении.

Исследование тромболитической активности энтеральной формы ПЭГ-П при лечебно-профилактичексом введении. Тромболитическое действие ПЭГ-П при внутрижелудочном введении в дозе 1000 ЕД/кг по лечебно-профилактической схеме в половине опытов вызывало реканализацию общей сонной артерии у крыс и способствовало снижению массы тромба при тромбоокклюзии, вызванной аппликацией хлорида двухвалентного железа.

Исследование антиагрегантной активности. ПЭГ-П, вводимый в дозе 10 ПЕ/кг внутривенно и 70 ПЕ/кг внутрибрюшинно, достоверно не изменял степень агрегации тромбоцитов.

Исследование фармакокинетики ПЭГ-П при энтеральном введении. В

данном эксперименте установлено, что ПЭГ-П имеет достаточно большую для крупной белковой молекулы биодоступность (17%) и длительное время достижения максимальной концентрации в кровотоке (5 часов). Колоколообразный тип фармакокинетической кривой ПЭГ-П позволяет предполагать высокую способность ПЭГ-П накапливаться в интерстиции и лимфатическом русле (что было впоследствии определено).

0,04

0,03

0,02

0,01

0,00

012345678

Рис.10. Фармакокинетическая кривая ПЭГ-П при внутрижелудочном введении. По оси абсцисс - время (ч), по оси ординат - концентрация ПЭГ-П в сыворотке крови (ЕД/мл)

Таблица 5.

Фармакокинетические параметры ПЭГ-П при внутрижелудочном введении

Параметры Значения

AUC, ЕД-ч/мл (нулевой момент) 0,132

AUMC, ЕД-ч2/мл (первый момент) 0,640

AUMMC, ЕД-ч7мл (второй момент) 0,778

Тщах, ч (время достижения максимальной концентрации) 5

Спи*, Ед/мл (максимальная концентрация) 0,044

Cipo, мл/ч (клиренс) 6,792

КеЬ 1/ч (константа элиминации) 5,319

Ti/2, ч (период полувыведения) 0,43

MRTP<>, ч (среднее время удержания) 4,832

Vp„, л (объем распределения) 1,277

F (доля всосавшегося препарата) 0,17

Исследование фармакокинетики при внутривенном введении

В таблице 6 представлены данные по фармакокинетике пегилированной протеиназы.

Таблица 6.

Фармакокинетические параметры ПЭГ-П при внутривенном введении

Параметры Значения

AUC, ЕД мин/мл (нулевой момент) 4,91

AUMC, ЕД мин2/мл (первый момент) 56,71

AUMMC, ЕД-.мип'/мл (второй момент) 1747,41

Сд, мл (общий клиренс) 1,2

Ке|, 1/мин (константа элиминации) 0,057

Т1/2, мин (период полувыведения) 12,27

MRT, мин (среднее время удержания) 11,56

MRTo, мин (среднее время удержания в центральном пуле) 8,03

MRTp, мин (среднее время удержания в периферическом пуле) 3,53

V5S, мл (стационарный объем распределения) 14,1

V0, мл (центральный объем распределения) 9,8

Vp, мл (периферический объем распределения) 4,3

С0, ЕД/мл (начальная концентрация) 0,61

Установленный в данном эксперименте тип фармакокинетической кривой обуславливает необходимость наряду с болюсным введением препарата ПЭГ-П продолжать титрованное введение для удержания терапевтической концентрации (впоследствии был установлен режим введения курсовой дозы в два этапа).

Т, мин

Рис.11. Фармакокинетическая кривая ПЭГ-П после экспоненциального сглаживания.

Исследование параметров токсичности при парентеральном введении.

Изучение токсичности ПЭГ-П при однократном введении лабораторным животным. Результаты эксперимента позволили установить параметры острой токсичности ПЭГ-П для мышей и крыс при однократном внутрижелудочном и внутривенном его введении с использованием метода Литчфилда и Вилкоксона.

Таблица 7.

Результаты однократного введения ПЭГ-П животным на выживаемость _(взято в опыт / погибло из них)_

Способ введения, Вид, пол животных

доза (мг/кг) Самцы Самки

мыши

Внутрибрюшинно

13500 4/1 4/1

20250 4/3 4/4

Внутривенно

1875 5/0 4/0

2500 4/0 4/0

3125 4/0 5/2

крысы

Внутрибрюшинно

5000 5/0 5/1

7500 5/2 5/0

Внутривенно

1250 3/0 5/0

2500 3/0 5/0

3750 4/0 4/0

Таблица 8.

Параметры острой токсичности (мг/кг) ПЭГ-П при однократном введении мышам и крысам (самцы + самки), Х±т

Вид животных, способ введения 1ЛЭ10 1ЛЭ50 Ы)9„

Мыши Внутрибрюшинно Внутривенно 9687,7+2003,8 2883,8±378,6 15917,3+2435,0 3797,2+370,6 26152,8±5409,4 5000,0±656,5

Крысы Внутрибрюшинно Внутривенно 5556,3±1414,1 8844,7± 1122,3 >3750 14879,4±3583,3

На основании анализа параметров острой токсичности ПЭГ-П отнесится к 4 классу (малоопасные вещества) согласно ГОСТ 12. 1. 007 - 76.

Изучение токсичности ПЭГ-П при многократном введении (хроническая токсичность). Двухнедельное внутрибрюшинное введение ПЭГ-П в дозах 10, 20 и 30 ЕД/ЮОг общей массы крыс не вызывает патологических изменений основных показателей форменных элементов периферической крови. Выявленные у крыс - самок умеренные изменения со стороны содержания гемоглобина и ретикулоцитов после введения больших доз препарата носят обратимый характер. Двухнедельное внутрижелудочное введение ПЭГ-П а в дозах 10, 20 и 30 ЕД/100г общей массы крыс не оказывает токсического влияния на показатели костного мозга крыс, не приводит к каким-либо нарушениям функционального состояния печени, не оказывает токсического воздействия на метаболизм почек. ПЭГ-П при курсовом введении в дозах 10 Ед/100 г, 20 Ед/100 г и 30 Ед/100 г не оказывает существенного токсического влияния на электрическую активность сердца крыс. ПЭГ-П при длительном введении в различных дозах, не изменяет системного артериального давления у крыс. При анализе полученных данных выявлено через 14 дней введения ПЭГ-П в дозах 20 и 30 ЕД/100 г массы тела крыс только у самцов увеличение показателей эмоциональной реакции. Через две недели после отмены курса средние величины этого показателя нормализовались.

Исследование параметров токсичности при энтеральном введении.

Изучение токсичности при однократном введении. В течение первых часов и суток после введения ПЭГ-П, у животных наблюдалось снижение двигательной активности, размягчение фекальных шариков, повышенный диурез, более выраженные с увеличением дозы испытуемого средства. Затем до конца эксперимента животные не проявляли признаков беспокойства, изменения аппетита, выделений, состояния слизистых, шерсти, кожи и др. Введение ПЭГ-П не влияло на прирост общей массы крыс и мышей (как самцов, так и самок).

Таблица 9.

Результаты однократного внутрижелудочного введения ПЭГ-П животным на _выживаемость (взято в опыт / погибло из них)

Доза (мг/кг) Вид, пол животных

Самцы Самки

мыши

5000 5/0 5/0

10000 5/0 5/0

20000 5/0 5/0

крысы

5000 5/0 5/0

Таблица 10.

Параметры острой токсичности (мг/кг) ПЭГ-П при однократном внутрижелудочном введении мышам и крысам (самцы + самки)

Вид животных, 1ЛЭ10 ьо50 ьп90

Мыши >20,0

Крысы >5,0

Результаты эксперимента выявили отсутствие летальности у животных, получавших препарат, что не позволило установить параметры острой токсичности испытуемого средства (ЛД16, ЛД50, ЛД90). В связи с этим ЛД50 ПЭГ-П при введении крысам и мышам (самцам и самкам) внутрижелудочно можно условно принять за величину больше максимальной введенной дозы (табл. 5), что дает основание изученный препарат отнести согласно ГОСТ 12. 1. 007 — 76 к 4 классу (малоопасные вещества).

Изучение токсичности ПЭГ-П при многократном введении (хроническая токсичность). Крысы. Ежедневное введение ПЭГ-П в дозе 40, 200 и 400 ЕД/кг внутрижелудочно в течение 30 дней не вызывало гибели животных, выраженных изменений общего состояния, средних величин процента прироста общей массы, температуры тела. Внутрижелудочное введение ПЭГ-П в дозах 40, 200 и 400 ЕД/кг массы крыс не вызывает патологических изменений основных показателей форменных элементов периферической крови. Выявленные умеренные статистически значимые изменения в конце 30 дневного введения испытуемого средства со стороны ряда показателей являются обратимыми. Внутрижелудочное введение ПЭГ-П в дозах 40, 200 и 30 ЕД/кг крыс не оказывает токсического влияния на показатели костного мозга крыс. Выявленные изменения ряда показателей костного мозга не имеют дозозависимости и не являются патологическими. Внутрижелудочное введение ПЭГ-П крысам в дозах 20 ЕД/кг, 200 ЕД/кг, 400 ЕД/кг массы тела в течение месяца не приводит к токсическим нарушениям функционального состояния печени, не оказывает токсического воздействия на метаболизм почек. Месячное внутрижелудочное введение ПЭГ-П в дозах 40, 200 и 400 ЕД/кг крысам не вызывает развития патологических изменений со стороны изученных показателей ЦНС, не оказывает токсического влияния на электрическую активность сердца животных. Исследование местнораздражающего действия ПЭГ-П. При осмотре желудка крыс на вскрытии макроскопически во всех

случаях слизистая оболочка желудка имела хорошо выраженную складчатость. Макроскопических признаков гиперемии, отека или каких-либо дефектов слизистой оболочки не отмечено. Микроскопически у всех крыс в желудке умеренная гиперемия слизистой и подслизистой оболочек, отека и инфильтрации нет. Покровно-ямочный эпителий имел обычное строение, дистрофических изменений и слущивания эпителия не отмечено. Просветы желез слизистой оболочки желудка не расширены, секреторные клетки имеют обычные размеры и окраску. Таким образом, ПЭГ-П при внутрижелудочном введении в дозах 40, 200, 400 ЕД/кг не оказывает местнораздражающего действия на слизистую оболочку желудка.

Кролики. Введение ПЭГ-П кроликам в течение 30 дней не вызывало патологических изменений общего состояния. Гибели животных не наблюдалось. При взвешивании средние величины общей массы кроликов и процента её прироста в опытных и контрольной группах статистически достоверно не разнились. ПЭГ-П не оказывает токсического влияния на показатели периферической крови и на показатели костного мозга, не оказывает токсического влияния на изученные биохимические показатели сыворотки кроликов при длительном его потреблении в дозах 150 и 300 ЕД/кролик, превышающих для человека на кг массы в 5 и 10 раз.

Клинические исследования инъекционной формы ПЭГ-П.

Проведенные исследования 1-й фазы лекарственного средства ПЭГ-П позволили сделать вывод о том, что полученные результаты согласуются с данными доклинических испытаний, показавших низкую токсичность препарата. В лечебных дозах 10-30 ЕД на кг массы тела препарат не вызывает каких-либо токсических или аллергических реакций. Отсутствуют осложнения связанные с тромболитическим действием препарата - кровотечения и инсульты. Вместе с тем, обнаружено умеренное гипотензивное действие препарата, которое проявляется в 50% случаев его введения. Наблюдаются также проявления индивидуальной повышенной чувствительности к препарату в виде тошноты и однократной рвоты, которые не наблюдаются при повторном введении препарата. Через 3 часа после начала введения ПЭГ-П наблюдались признаки реперфузии коронарной артерии в 25-70% случаев при использовании прямых (во время экстренной коронарной ангиографии) и непрямых (по динамике ЭКГ) методов оценки соответственно.

Во второй фазе КИ было выявлено, что признаки реперфузии коронарной артерии при лечении ПЭГ-П во всей группе (дозы от 10 до 40 ЕД/кг) имели место в 66,7% случаев, при этом у тех больных, кому вводили ПЭГ-П в дозе 40 ЕД/кг эффективность составила 89%. Полученные результаты согласуются с данными доклинических испытаний, показавших низкую токсичность и достаточную эффективность препарата. Имея близкие значения по эффективности со стрептокиназой, ПЭГ-П оказался достоверно менее опасным препаратом. В лечебных дозах от 10 до 40 ЕД на кг массы тела препарат обладает тромболитическим действием, не вызывая каких-либо токсических или аллергических реакций.

В 3 фазе КИ как суррогатная точка проверялась нулевая статистическая гипотеза о равенстве относительных частот реперфузии ИСКА, зарегистрированной в пределах 3-х часов от начала тромболитической терапии, в двух группах, и сроки достижения реперфузии ИСКА в двух группах. По этим параметрам не найдено достоверных статистических различий между активатором плазминогена Стрептокиназой и препаратом ПЭГ-П. Основным критерием эффективности препарата с тромболитическим эффектом следует считать «конечные точки», которые характеризуются частотой кардиальных событий на 30 или 60 день от начала развития ОИМ. В данном исследовании выявлены достоверные различия в уровне летальности в течение 30 дней между группами. Так, в группе пациентов, которые получали ПЭГ-П, летальность составила 3%, в группе пациентов, получавших Стрептокиназу - 17% (р= 0,0124). Геморрагические осложнения являются серьезной проблемой тромболитической терапии — их частота составляет в среднем около 0,7%, причем 0,4% приходится на наиболее грозные осложнения - геморрагические инсульты. Поэтому при проведении тромболизиса особое внимание необходимо уделять состоянию свертывающей системы крови. В данном исследовании установлено, что у пациентов, которым проводилась терапия ПЭГ-П, уровень фибриногена достоверно не снижается. Этот факт предполагает малый риск возникновения геморрагических осложнений после применения ПЭГ-П. В контрольной группе, после применения Стрептокиназы, интерквартильный размах фибриногена к 24 часам снижается ниже физиологической нормы, возвращаясь к исходным значениям только к 48 часам. Такое снижение уровня фибриногена может приводить к высокому риску возникновения геморрагических. В дальнейшем в группе 2 отмечается подъём уровня фибриногена, как «белка острой фазы».

В группе больных, тромболизис которым проводился Стрептокиназой, минимальное значение систолического АД был ниже, чем в группе ПЭГ-П. Хотя различие статистически недостоверно, следует обратить внимание, что у пациентов, получавших ПЭГ-П, ни в одном случае наблюдения систолическое АД в течение 60 минут от начала тромболизиса не снижалось ниже критических значений.

Таблица 11.

Сравнительные данные параметров эффективность/безопасность

Результаты ПЭГ-П Стрептокиназа

30-ти дневная летальность 5% 14,6 %

Реперфузия инфаркт-связанной коронарной артерии 64,7 % 69%

Малые и умеренные кровотечения 0% 3,4 %

Инсульт 0% 1,1 %

Таким образом, анализируя вышеизложенные факты, можно сделать вывод, что ПЭГ-П является эффективным и безопасным тромболитическим средством для лечения острого инфаркта миокарда.

Клинические исследования энтеральной формы ПЭГ-П.

Клинические исследования безопасности и эффективности при хронической венозной недостаточности - 1-2 фаза.

В группу наблюдения ПЭГ-П было включено 33 больных хронической венозной недостаточностью. Эти пациенты принимали ПЭГ-П сразу после рандомизации. В группе контроля (29 пациентов) в качестве препарата сравнения был использован Троксевазин в дозе 600 мг в сутки. Результаты анализа клинической эффективности в обеих группах полностью согласуются с динамикой функциональных показателей реолимфовазографии и лазерной допплеровской флоуметрии. По всем критериям оценки венозного кровотока и лимфодренажной функции ПЭГ-П оказывает выраженный лечебный эффект. В группе больных, в которой использовался для лечения ПЭГ-П, отмечен комплексный терапевтический эффект. Отмечено позитивное влияние на размер сопутствующих тромбов, у больных с трофическими язвами достигнуто заживление у 60%, при этом общая площадь сократилась на 94% от исходных размеров. Уменьшение отёка нижних конечностей и болевого синдрома сопровождалось увеличением скоростей и объёма венозного и лимфатического оттока, а также снижением динамического сопротивления лимфовенозному оттоку. Позитивные изменения зарегистрированы также при лазерной флоуметрии, свидетельствующей об улучшении микроциркуляции в поражённых конечностях. Восстановление лимфатического дренажа подтверждено результатами лимфосцинтиграфии при факультативном исследовании. Данные результаты согласуются с результатами доклинических исследований, в которых был доказан тромболитический эффект, антитромботический и противовоспалительный эффекты, а также цитопротективный и репаративный эффекты. Позитивное влияние на лимфатический дренаж является неспецифическим для большинства ферментных протеолитических препаратов (террилитин, папаин, трипсин, и т.д.), поэтому выраженный позитивный эффект ПЭГ-П на скорость и объём лимфооттока может быть связан с этим неспецифическим действием. ПЭГ-П не влиял на нормальные показатели гемостаза. В группе больных с исходно высокой концентрацией фибриногена отмечалась нормализация уровня фибриногена. По-видимому, этот эффект связан с общим противовоспалительным эффектом ПЭГ-П, поскольку у ряда больных с лейкоцитозом также отмечалось восстановление нормального уровня лейкоцитов. Нежелательные и побочные явления. В отчёте о безопасности, согласно Протоколу, фиксируются следующие нежелательные явления: смерть, кровотечение, аллергия и другое (с конкретным описанием). В обеих группах не было отмечено серьезных нежелательных явлений. В группе ПЭГ-П было отмечено 2 побочных эффекта (тяжесть в эпигастрии), которые исследователи связали с приёмом препарата ПЭГ-П. Оба пациента живы, никаких дополнительных лечебных мероприятий не потребовалось.

Клиническое исследование безопасности и эффективности при хронической венозной недостаточности - 3 фаза.

В группу наблюдения ПЭГ-П было включено 40 больных хронической венозной недостаточностью. Эти пациенты принимали ПЭГ-П сразу после рандомизации.

В группе контроля (17 пациентов) в качестве препарата сравнения был использован Троксевазин в дозе 600 мг в сутки. Анализ обследуемых групп показал их полную сопоставимость по всем изучаемым параметрам, что позволило проведение сравнительного анализа между группами. Число обследованных в группах в сочетании с вариабельностью количественных параметров и частотой встречаемости качественных показателей позволяет сделать вывод о достаточном объёме представленных выборок и о том, что полученные факты следует трактовать как закономерные. Как и в предыдущем исследовании в группе больных, принимающих ПЭГ-П, отмечен хороший терапевтический эффект. Позитивная динамика со стороны клинического статуса сопровождалась увеличением периферического объемного кровотока, а также снижением динамического сосудистого сопротивления по данным реовазографии. Позитивные изменения зарегистрированы также при лазерной флоуметрии, свидетельствующей об улучшении микроциркуляции в поражённых конечностях. В группе больных с исходно высокой концентрацией фибриногена отмечалась нормализация уровня фибриногена. По-видимому, этот эффект связан с общим противовоспалительным эффектом ПЭГ-П, поскольку у ряда больных с лейкоцитозом также отмечалось восстановление нормального уровня лейкоцитов.

Проведённые клинические исследования лекарственного средства ПЭГ-П позволяют сделать вывод о том, что полученные результаты согласуются с данными доклинических испытаний, показавших низкую токсичность и достаточную эффективность препарата ПЭГ-П. Имея лучшие значения по эффективности в сравнении с венотоником, ПЭГ-П является безопасным препаратом. В лечебных дозах 8 таблеток в сутки (1600 ЕД) препарат обладает тромболитическим и репаративным действием, не вызывая каких-либо токсических или аллергических реакций.

Клиническое исследование для определения эффективности и безопасности применения препарата ПЭГ-П у пациенток с хронической венозной недостаточностью на фоне применения гормональной заместительной терапии и гормональных контрацептивов.

Найдены статистически значимые изменения таких признаков как: боль, отеки и субъективное ощущение распирания после курса лечения ПЭГ-П. Отмечается положительная динамика показателей по модифицированной шкале СЕАР. В исследуемой группе пациенток повышается толерантность к физическим нагрузкам. Статистически достоверно показана нормализация показателей свертывающей системы крови - ПТВ, MHO, агрегация с коллагеном, что подтверждает снижение влияния на один из основных факторов тромбообразования. Так же результаты статистического анализа показали отчетливую тенденцию изменения в оценке динамики уровня РФМК и Д-димеров, которые являются наиболее информативными показателями тромбинемии и активации внутрисосудистого свертывания. Так уровень РФМК до начала приема ПЭГ-П превышал нормативный показатель в среднем в 1,83 раза, а уровень Д-димеров имел тенденцию к увеличению в 1,53 раза в сравнении с физиологической нормой. После приема ПЭГ-П отмечается достоверное уменьшение этих маркеров тромбинемии. Оценка безопасности. В

отчёте о безопасности, согласно протоколу, фиксировались следующие нежелательные явления: смерть, кровотечение, аллергия и другое (с конкретным описанием). В группе наблюдения нежелательных явлений отмечено не было.

Таким образом, ПЭГ-П является эффективным и безопасным для лечения хронической венозной недостаточности и дисгормональных тромбофилических состояний у женщин на фоне длительного приема гормональной заместительной терапии и гормональных контрацептивов. Препарат может быть рекомендован для включения в программу превентивной терапии реогемостазиологических нарушений, что весьма позитивно отразиться на уменьшении риска сосудистых осложнений и качества жизни женщин.

Клиническое исследование по эффективности и безопасности применения ПЭГ-П у пациентов с цереброваскулярными расстройствами и тромбозом венозной системы головного мозга.

В соответствии с задачами клинического исследования была проведена оценка неврологического статуса, томографическое исследование сосудов головного мозга, определены параметры системы гемостаза, дана оценка переносимости препарата пациентами с данной нозологией. После проведения курса комплексной терапии с применением препарата ПЭГ-П у всех пациентов, включенных в исследование, наблюдалась положительная динамика неврологического статуса (уменьшение выраженности или отсутствие синдромов/симптомов). В соответствии с задачами клинического исследования была проведена оценка тромба и состояния кровотока в венозной системе головного мозга после проведения комплексной терапии с применением препарата ПЭГ-П. По данным томографического исследования наблюдались сочетанные тромбозы. Локализация визуализированных тромбов: поперечный синус - 10, сигмовидный - 9, венозный -1, прямой - 1. По характеру расположения тромба: пристеночное, внутристеночное и субтотальное. После проведения комплексной терапии с применением препарата ПЭГ-П наблюдалась следующая картина: у 9 (64%) пациентов из 13 тромб отсутствовал, уменьшился в размерах у 4-х (31%). Полное восстановление кровотока в бассейне тромбированных сосудов наблюдалось у 6 (46%) пациентов, у 7 (54%) пациентов кровоток увеличился в сравнении с исходным. Включение препарата ПЭГ-П в комплексную терапию цереброваскулярных расстройств с тромбозом венозной системы головного мозга позволило у всех пациентов добиться увеличения мозгового кровотока в зоне тромбоза. В отчете о безопасности, согласно протоколу, фиксировались следующие нежелательные явления: смерть, кровотечение, аллергия и другое (с конкретным описанием). В группе наблюдения нежелательных явлений отмечено не было. Полученные результаты доказывают хорошую переносимость и безопасность проводимой терапии препарата ПЭГ-П у пациентов цереброваскулярными расстройствами с тромбозом венозной системы головного мозга.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате изучения возможностей использования пучка ускоренных электронов для синтеза белково-полимерных лекарственных средств были получены данные по возможности создания новых, оригинальных фармакологически активных молекул. Исследования не ограничились фармакологическими свойствами и клиническими эффектами, а имели расширенный характер за счёт изучения межмолекулярных взаимодействий под воздействием пучка ускоренных электронов. Были установлены механизмы воздействия радиационного облучения на молекулу ПЭГ, зависимость дозы, концентрации, температуры. Установлено различие в механизмах взаимодействия молекул ПЭГ с молекулами белка в водных растворах при облучении. Результаты исследований был подтверждён ковалентный характер связей, возникающий между белком и молекулами после облучения потоком ускоренных электронов. Установлено, что прочность образовавшейся связи зависит преимущественно от дозы облучения, например, 0,5Мрад и 0,75Мрад в определённых соотношениях концентрации белка и ПЭГ не обеспечивают достаточно прочной связи.

На этапе изучения фармакологических свойств было показано, что белок-полимерный комплекс вне зависимости от пути введения достаточно быстро достигает системного кровотока. Значения максимальных концентраций достигнутых при этом лежат в диапазоне 1700-2500 пг. При определении токсичности достигнутые дозы комплекса ПЭГ-ГКСФ многократно превышают терапевтические, применяемые в клинической практике - от 300 до 1500 раз. При этом специфичность действия, присущая нативной молекуле ГКСФ, сохранялась прежней. При исследовании лекарственного средства на основе пегилированного, посредством электроннолучевого синтеза, фермента субтилизина молекулярной массой 30 кДа, установлены ещё более показательные фармакологические эффекты. Фермент-полимерный комплекс оказывал выраженный фибринолитический и тромболитический эффект, присущий нативному ферменту. Наряду с сохранённой специфичностью действия пегилированный препарат всасывался из кишечника с биодоступностью 16-18 %, а при парентеральном введении не оказывал токсических эффектов. Возможности использования технологии электронно-лучевого синтеза не исчерпываются представленными в работе данными и предоставляют определённый задел для продолжения изучения данной технологии с использованием других полимеров и фармакологически активных веществ не только белковой природы.

ВЫВОДЫ

1. Электронно-лучевая пегиляция белковых молекул может быть использована для создания пегилированных

фармакологических препаратов белковой природы. Под действием пучка ускоренных электронов в одну технологическую стадию удаётся получить фармакологически активный белково-полимерный комплекс ПЭГ-Г-КСФ и ПЭГ-Протеиназа.

2. В результате электронно-лучевого пегилирования исследованных фармакологически активных белковых молекул изменяются их физико-химические свойства. Увеличивается их молекулярная масса, они обладают хорошей растворимостью в воде и не выпадают в осадок. Созданные посредством ЭЛП белково-полимерные комплексы обладают хорошими показателями по стабильности при различных условиях хранения.

3. В процессе электронно-лучевой пегиляции специфическая фармакологическая активность нативной белковой молекулы не утрачивается. Созданные белково-полимерные комплексы ПЭГ-Г-КСФ и ПЭГ-Протеиназа сохраняют необходимые фармакодинамические характеристики.

4. В результате электронно-лучевого пегилирования изменяются параметры фармакокинетики исходных фармакологически активных белковых молекул. Белково-полимерные комплексы ПЭГ-Г-КСФ и ПЭГ-Протеиназа приобретают увеличенную энтеральную биодоступность с созданием терапевтически значимых концентраций препарата в кровотоке.

5. Белково-полимерные комплексы ПЭГ-Г-КСФ и ПЭГ-Протеиназа, созданные посредством ЭЛП обладают низкой токсичностью при различных способах применения. Пегилированная протеиназа классифицируется как малоопасное вещество. Токсические дозы ПЭГ-Г-КСФ многократно превышают терапевтические.

6. Фармакологический препарат на основе ПЭГ-Протеиназы в твёрдой лекарственной форме демонстрирует высокую клиническую эффективность при венозной недостаточности. При внутривенном способе введения данный препарат как прямой тромболитик используется при остром инфаркте миокарда. Наряду с высокой клинической эффективностью фармакологический препарат на основе ПЭГ-Протеиназы хорошо переносится больными и не имеет выраженных побочных эффектов.

7. Технология электронно-лучевой пегиляции белковых молекул позволяет создавать оригинальные, инновационные лекарственные препараты, в том числе и на основе известных ранее субстанций. ЭЛП позволяет синтезировать лекарственные препараты с заданными параметрами фармакокинетики: от ускоренного достижения пиковых концентраций до создания тканевых депо с пролонгированным клиническим эффектом.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Верещагин Е.И., Мадонов П.Г., Киншт Д.Н., Григорьев Е.В. Обмен нуклеиновых кислот у больных, находящихся в критическом состоянии, и пути их коррекции //Современные лечебные и диагностические методы в медицинской практике. Новосибирск, 2008. С. 40-44 ISBN 978-5-89027-011-8

2. Плотников М.Б., Дыгай A.M., Алиев О.И., Смольякова В.И., Васильев A.C., Марков В.А., Вышлов Е.В., Верещагин Е.И., Киншт Д.Н., Мадонов П.Г. Антитромботический и тромболитический эффект нового отечественного протеолитического препарата Тромбовазим // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2009. — Т. 147. - №4,-С. 418-421.

3. Буевич Е.И., Котовщикова Е.Ф., Верещагин Е.И., Мадонов П.Г., Попова Л.А. О состоянии эндотелия при остром инфаркте миокарда до и после приема Тромбовазима // Тромбоз, гемостаз и реология. 2009. - №3. - C..33-37

4. Дыгай A.M., Артамонов A.B., Верещагин Е.И., Мадонов П.Г. Создание нового класса лекарственных препаратов на основе нанотехнологий // Международный форум по нанотехнологиям. Москва, 2009. - С.609.

5. Киншт Д.Н., Верещагин Е.И., Мадонов П.Г., Дыгай A.M., Плотников М.Б. Эффективность препарата Тромбовазим в лечении хронической венозной недостаточности // XVI Российский конгресс «Человек и лекарство». Москва. 2009. - С. 127.

6. Верещагин Е.И., Киншт Д.Н., Мадонов П.Г., Марков В.А., Вышлов Е.В. Клиническая эффективность нового отечественного тромболитического препарата Тромбовазим // XVI Российский конгресс «Человек и лекарство». Москва. 2009. - С. 629

7. Верещагин Е.И., Плотников М.Б., Любарский М.С., Марков В.А., Мадонов П.Г. Вазопротектор с тромболитическими свойствами Тромбовазим в терапии сердечно-сосудистых заболеваний // Новосибирск, 2008 ISBN987-5-9747-0105-4.

8. Дыгай A.M., Верещагин Е.И., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В., Мадонов П.Г., Симанина Е.В., Ставрова Л.А., Удут Е.В., Хричкова Т.Ю., Мирошниченко Л.А., Минакова М.Ю., Ермакова H.H. Мобилизация прогениторных клеток в кровь с помощью иммобилизированного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора Клеточные технологии в биологии и медицине // 2009 № 2, - С. 63-66.

9. Дыгай A.M., Верещагин Е.И., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н., Ермакова H.H., Мадонов П.Г., Мирошниченко Л.А., Минакова М.Ю., Симанина Е.В., Ставрова Л.А., Удут Е.В., Фирсова Т.В., Хричкова Т.Ю. Механизмы гранулоцитопоэзстимулирующей активности иммобилизированного гранулоцитарного

колониестимулирующего фактора при цитостатической миелосупрессии // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2009. -Т. 150. -№ 7. - С.418-421.

Ю.Дыгай A.M., Верещагин Е.И., Ветошкина Т.В., Воронова O.JI., Дубская Т.Ю., Карпова Г.В., Мадонов П.Г., Плотников М.Б., Фомина Т.И., Чурин A.A. Доклиническое исследование общей токсичности фармакологических веществ, полученных методами био- и нанотехнологии // Материалы 3-го Съезда токсикологов России. Москва, 2008г. - С.493-495.

П.Дыгай A.M., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н., Симанина Е.В., Верещагин Е.И., Мадонов П.Г. Фармакологические свойства нового препарата гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, созданного с использованием нанотехнологии // Материалы Международного форума по нанотехнологиям. Москва, 2008г. С.607-609.

12.Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов ВВ., Верещагин Е.И., Удут Е.В., Хричкова Т.Ю., Симанина Е.В., Ставрова JI.A., Андреева Т.В., Минакова М.Ю., Мадонов П.Г., Киншт Д.Н. Регуляция функций прогениторных клеток с помощью гиалуронидазы // Вестник РАМН. - 2009. - № 11. - С. 6-9.

13.Андреева Т.В., Верещагин Е.И., Ермакова H.H., Мадонов П.Г., Першина О.В., Скурихин Е.Г., Зюзьков Г.Н., Минакова М.Ю., Хмелевская Е.С., Дыгай A.M. Нейропротективные эффекты иммобилизированного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора и гиалуронидазы // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2010. - №4. - С. 405-408.

14.Дыгай A.M., Скурихин Е.Г., Андреева Т.В., Мадонов П.Г., Верещагин Е.И., Киншт Д.Н., Першина О.В., Хмелевская Е.С. Действие иммобилизированного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора на кроветворные предшественники разных классов при цитостатической миелосупрессии // Бюл. эксперим. биол. и мед. - 2010. - № 3. -С. 255-260.

15. А. М. Дыгай, Г. Н. Зюзьков, В. В. Жданов, Е. В. Удут, Е. В. Симанина, Т. Ю. Хричкова, JI. А. Ставрова, Т. В. Андреева, А. В. Чайковский, Е. И. Верещагин, П. Г. Мадонов Мобилизация стволовых клеток пегилированным с помощью нанотехнологии гранулоцитарным колониестимулирующим фактором как модель изучения процессов миграции прогениторных элементов Биомедицина № 1, 2010. - С. 17-23.

16.Верещагин Е.И., Киншт Д.Н., Мадонов П.Г. Оценка эффективности и безопасности инъекционной формы Тромбовазима // Сибирский медицинский журнал. 2009. - Т. 24. -№1. - С. 38-39.

17.Буевич Е.И., Котовщикова Е.Ф., Сюльжина E.H., Пенькова Е.В., Попова Л.А., Верещагин Е.И., Мадонов П.Г., Киншт Д.Н. Алтайский государственный медицинский университет, г.

Барнаул. Влияние Тромбовазима на противовоспалительные цитокины. // Сборник Материалы научно-практической конференции ЦФО РФ с международным участием «Инновации и информационные технологии в диагностической, лечебно-профилактической и учебной работе клиник», Россия, Тверь, С. 132.

18.Котовщикова Е.Ф., Буевич Е.И., Сюльжина E.H., Пенькова Е.В., Попова JI.A., Верещагин Е.И., Мадонов П.Г., Киншт Д.Н., Алтайский государственный медицинский университет, г. Барнаул. Влияние Тромбовазима остеопротегирин у пациентов с острым инфарктом миокарда // Сборник Материалы научно-практической конференции ЦФО РФ с международным участием «Инновации и информационные технологии в диагностической, лечебно-профилактической и учебной работе клиник», Россия, Тверь, С. 154 - 155.

19.Е.И. Буевич Е.Ф., Котовщикова E.H., Сюльжина Е.И., Пенькова Е.В., Попова JI.A., Е.И. Верещагин, П.Г. Мадонов, Д.Н. Киншт, Влияние Тромбовазима на васкулоэндотелиальный фактор роста //Сборник материалов IV Национального конгресса терапевтов, Москва, 2-4 декабря 2009. - С.38.

20.Е.И. Буевич Е.Ф., Котовщикова E.H., Сюльжина Е.И., Пенькова Е.В., Попова JI.A., Е.И. Верещагин, П.Г. Мадонов, Д.Н. Киншт, Влияние Тромбовазима на фактор роста фибробластов // Принято к публикации в Сборник материалов IV Национального конгресса терапевтов, Москва, 2-4 декабря 2009. - С.39.

21.А.М.Дыгай, В.В.Жданов, Г.Н.Зюзьков, Л.А.Ставрова, Е.В.Семанина, Е.В.Удут, Т.Ю.Хричкова, Л.А.Мирошниченко, Е.И.Верещагин, П.Г.Мадонов, Д.Н.Киншт, Т.И.Фомина, Т.В.Ветошкина, Т.Ю.Дубская, Л.А.Ермолаева. Механизмы гепатопротекторного действия иммобилизованного колониестимулирующего фактора.// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2010. - Т. 150. - № 10. С. 371-375.

22.Андреева Т.В., Артамонов A.B., Бекарев A.A., Верещагин Е.И., Мадонов П.Г., Першина О.В., Скурихин Е.Г., Хмелевская Е.С., Дыгай A.M. Роль стромальных и THY 1,2+-клеток в механизмах действия иммобилизированного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора при цитоствтической миелосупрессии.// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2010, Том 150, № 11. - С. 523-528

23 .A.M. Дыгай, Г.Н.Зюзьков, В.В.Жданов, Е.В. Удут, A.B. Артамонов, A.A. Бекарев, Л.А.Ставрова, Е.В.Семанина, Е.В.Удут, Т.Ю.Хричкова, Л.А.Мирошниченко, П.Г.Мадонов, Д.Н.Киншт, Л.А. Мирошниченко, Т.Ю. Хричкова, Е.В. Симанина, Л.А. Ставрова, A.B. Чайковский, Т.С. Маркова, М.Ю. Минакова, Р.В. Гурто Гепатопротекторные эффекты иммобилизированной с помощью нанотехнологии электронно-

лучевого синтеза гиалуронидазы и механизмы их развития // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2011. — Т. 151.-№ 1.-С. 86-90.

24.Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В., Артамонов A.B., Бекарев A.A., Мадонов П.Г., Киншт Д.Н., Удут Е.В., Мирошниченко JI.A., Хричкова Т.Ю., Симанина Е.В., Ставрова JI.A., Чайковский A.B., Маркова Т.С., Минакова М.Ю. Гемостимулирующие свойства иммобилизированного с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза эритропоэтина// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2011.-Том 151.- №2. - С. 207-210.

25.Дыгай A.M., ., Жданов В.В. Зюзьков Г.Н, Удут Е.В., , Хричкова Т.Ю., Симанина Е.В., Ставрова JI.A., Мирошниченко JI.A.,Чайковский A.B., Маркова Т.С., Гурто Р.В., Артамонов A.B., Бекарев A.A., Мадонов П.Г., Модуляция иммобилизированной гиалуронидазой гемостимулирующего действия гранулоцитарного колониестимулирующего фактора. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2011. -Том 157,- №3.-С. 207-210.

26.Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В., Удут Е.В., Мирошниченко JI.A., Хричкова Т.Ю., Симанина Е.В., Ставрова JI.A., Чайковский A.B., Маркова Т.С., Минакова М.Ю., Гольдберг В.Е., Артамонов A.B., Бекарев A.A., Мадонов П.Г., Киншт Д.Н., Гурто Р.В. Влияние иммобилизированной с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза гиалуронидазы на чувствительность прогениторных клеток к регуляторным факторам// Клеточные технологии в биологии и медицине. 2011.-№1.-С.47-51.

27.Боровская Т.Г., Полуэктова М.Е., Пахомова A.B., Щемерова Ю.А., Румпель O.A., Гольдберг В.Г., Мадонов П.Г, Киншт Д.Н. Использование препарата «Мужской диэнай» для профилактики отдаленных последствий тестикулярной токсичности цитостатических воздействий // Российский биотерапевтический журнал. 2011. —№1. С. 11-12.

28.Дыгай A.M., Гольдберг В.Е., Артамонов A.B., Бекарев A.A., Верещагин Е.И., Мадонов П.Г., Скурихин Е.Г., Першина О.В., Андреева Т.Н., Хмелевская Е.С., Ермакова H.H. Эффекты и механизмы гемопоэзстимулирующего действия иммобилизированных олигонуклеотидов при цитостатической миелосупрессии // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2011,- Том 152. - № 10. - С. 432-437.

29.Соловьёв М.А., Мадонов П.Г., Семиглазова Т.А., Ксенева С.И., Тарасова И.В., Мареев И.В., Бородулина Е.В., Удут В.В. Адьювантная терапия ишемической болезни сердца //

Диагностика, лечение и профилактика тромбозов и тромбоэмболии. Томск, 2011. С. 67-68 .

30.Соловьёв М.А., Мадонов П.Г., Семиглазова Т.А., Ксенева С.И., Тарасова И.В., Мареев И.В., Бородулина Е.В., Удут В.В. Нестероидные противовоспалительные препараты в коррекции эндотелиальной дисфункции на фоне артериальной гипертензии // Диагностика, лечение и профилактика тромбозов и тромбоэмболии. Томск, 2011. - С. 69-73.

31. Чурин А. А., Ермолаева JI. А., Дубская Т. Ю., Фомина Т. И., Ветошкина Т. В., Артамонов А. В., Бекарев А. А., Мадонов П. Г. Оценка противовоспалительного действия тромбовазима на модели ишемии-реперфузии печени. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2011. - Т. 152, N 8. -С. 170-172.

32.Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В., Мадонов П.Г., Артамонов A.B., Бекарев A.A., Удут В.В. «Иммобилизированный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (фармакологические свойства и перспективы использования)». Томск, 2011, ISBN978-5-94476-239-9.

33.Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В., Удут Е.В., Мирошниченко JI.A., Хричкова Т.Ю., Симанина Е.В., Ставрова Л.А., Гурто Р.В., Минакова М.Ю., Чайковский A.B., Маркова Т.С., Артамонов A.B., Бекарев A.A., Мадонов П.Г., Киншт Д.Н. Гипогликемические свойства иммобилизированной с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза гиалуронат-эндо-ß-N-ацетилгексозаминидазы // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2012. - Том 153. -№1. - С. 106-109.

34.Дыгай A.M., Артамонов A.B., Бекарев A.A., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н., Мадонов П.Г., Удут В.В. «Нанотехнологии в фармакологии», Издательство РАМН, Москва, 2011 ISBN 978-57901-0111-3.

35.Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В., Удут Е.В., Мирошниченко Л.А., Хричкова Т.Ю., Симанина Е.В., Ставрова Л.А., Гурто Р.В., Минакова М.Ю., Чайковский A.B., Маркова Т.С., Артамонов A.B., Бекарев A.A., Мадонов П.Г., Киншт Д.Н. Гипогликемические свойства иммобилизированной с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза гиалуронат-эндо-ß-N-ацетилгексозаминидазы // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2012. - Том 153. - №1. - С. 106-109.

36.Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Чурин A.A., Жданов В.В., Артамонов A.B., Бекарев A.A., Мадонов П.Г., Киншт Д.Н., Фомина А.Т., Ветошкина Т.В., Дубская Т.Ю., Ермолаева Т.А., Удут Е.В., Мирошниченко Л.А., Симанина Е.В., Ставрова Л.А., Чайковский A.B., Маркова Т.С., Мнакова М.Ю., Рейхарт Д.В. Фармакологические свойства пегилированного с помощью

нанотехнологии электронно-лучевого синтеза соматотропина Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2012. -Том 153,-№2.-С. 232-234.

37.Дыгай A.M., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н., Ставрова Л.А., Мирошниченко Л.А., Удут Е.В., Хричкова Т.Ю., Симанина Е.В., Артамонов А.В., Бекарев А.А., Мадонов П.Г., Киншт Д.Н., Гурто Р.В., Чайковский А.В., Маркова Т.С., Фомина А.Т., Ермолаева Т.А., Ветошкина Т.В., Дубская Т.Ю. Гепатопротекторные эффекты иммобилизированных препаратов гранулоцитарного колониестимулирующего фактора и гиалуронидазы и механизмы их развития // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2012.-№ 1.-С. 14-18.

38.Dygai A.M., Vereshchagin E.I., Zhdanov V.V., Zyuz'kov G.N., Ermakova N.N., Madonov P.G., Miroshnichenko L.A., Minakova M.Y., Simanina E.V., Stavrova L.A., Udut E.V., Firsova T.V., Khrichkova T.Y. Mechanisms of granulocytopoiesis-stimulating activity of immobilized granulocytic colony-stimulating factor in cytostatic myelosuppression.Bull Exp Biol Med. 2009 Jul;148(l):49-53. English, Russian.

39.Dygai A.M., Vereshchagin E.I., Zyuz'kov G.N., Zhdanov V.V., Madonov P.G., Simanina E.V., Stavrova L.A., Udut E.V., Khrichkova T.Y., Miroshnichenko L.A., Minakova M.Y., Ermakova N.N., Firsova Т. V. Mobilization of progenitor cells into the blood by immobilized granulocytic colony-stimulating factor.Bull Exp Biol Med. 2009 Apr;147(4):499-502. English, Russian.

40.Plotnikov M.B., Dygai A.M., Aliev O.I., Chernyshova G.A., Smol'yakova V.I., Vasil'ev A.S., Markov V.A., Vyshlov E.V., Vereschagin E.I., Kinsht D.N., Madonov P.G. Antithrombotic and thrombolytic effects of a new proteolytic preparation Trombovazim (Russia).Bull Exp Biol Med. 2009 Apr;147(4):438-40. English, Russian.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АЧТВ - активированное частичное тромбопластиновое время

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ГИМ - гемопоэзиндуцирующее микроокружение

ИСКА - инфаркт связанная коронарная артерия

КОЕ-Э - колониеобразующие единицы

КОЕ-ГМ - гранулоцитомакрофагальные колониеобразующие единицы

КСА - колониестимулирующая активность ОИМ - острый инфаркт миокарда

НПГК - низкочастотная вибрационная пьезоэлектрическая гемокоагулография

ПТВ - протромбиновое время

ПЭГ - полиэтиленгликоль

ПЭГ-Г-КСФ - пегилированный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор

ПЭО - полиэтиленоксид

ПЭГ-П - пегилированная протеиназа

рчГКСФ - рекомбинантный человеческий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор

ФСА - фибробластстимулирующая активность

ФЦП - федеральная целевая программа

ХВН - хроническая венозная недостаточность

ЭПА - эритропоэтическая активность

Развитие мировой фармацевтической индустрии в основном зависит от двух составляющих: достижений фармакологии в части поиска и обоснования применения новых лекарственных компонентов и второе-внедрение новых технологических решений на фармацевтических производствах. Бизнес-акселерация фармацевтических компаний из числа мировой «биг-фармы» обеспечивается сочетанием в каждой из них этих двух ключевых компетенций. Успехи мировых лидеров фармацевтической индустрии с одной стороны позволяют рассчитывать на ощутимые успехи в лечении сложных заболеваний человека, с другой стороны ставят государства, не имеющие у себя мировых фармгигантов, в зависимое положение от импорта дорогостоящих лекарственных средств.

В 2010 году Правительство Российской Федерации приняло концепцию развития отечественной фармацевтической отрасли «Стратегия развития фармацевтической промышленности России на период до 2020 года». Как указано в этом документе: «Основной целью государственной политики Российской Федерации по развитию национальной фармацевтической промышленности на период до 2020 года является создание условий для ее перехода на инновационную модель развития, что должно привести к росту обеспеченности населения, учреждений здравоохранения, лекарственными средствами отечественного производства.». Одной из основных задач Стратегии обозначено стимулирование разработки и производства отечественных инновационных лекарственных средств. Стратегия развития национальной фармацевтической промышленности основывается на следующих приоритетах:

• приоритет инновационной модели развития отрасли;

• приоритет качества, эффективности и безопасности лекарственных средств;

• приоритет национальной фармацевтической отрасли в реализации государственных программ в области обеспечения лекарственными средствами;

• приоритет производства высокотехнологичных фармацевтических субстанций на территории РФ;

• приоритет развития экспортоспособных производств и новых разработок;

• приоритет замещения импортных лекарственных средств отечественными, полный цикл производства которых находится на территории РФ;

Тенденции развития мировой экономики диктуют необходимость создания собственных фармацевтических производств, ориентированных на импортозамещение и лекарственную безопасность России. Политические и экономические решения правительства Российской Федерации создают условия для государственных и частных бизнес структур по инвестированию больших денежных средств в разработку новых лекарственных препаратов и техническое перевооружение фармацевтических предприятий.

Совершенно очевидно, что поиск новых технологических решений по синтезу или модификации лекарственных препаратов должен иметь главную задачу - их высокую эффективность и безопасность. Особенно это актуально для фармацевтических препаратов белковой природы. В клинической практике лекарственные препараты этой группы имеют очень широкое применение. Между тем, известно, что белковые молекулы массой более 7 ООО Да приобретают аллергогенные и иммунотоксические свойства при попадании в организм человека. Белковые фармацевтические препараты не всегда имеют выгодный фармакокинетический профиль, а при энтеральном приёме их биодоступность не превышает 1,5 %. Таким образом, главное противоречие применения белковых фармацевтических препаратов заключено в их высокой клинической эффективности и ограничении применения парентерально ввиду высокой токсичности, а энтерально ввиду низкой биодоступности. Ликвидация этого противоречия возможно путём производства модифицированных лекарственных форм посредством создания полимер-белковых конъюгатов для парентерального и энтерального введения, микрокапсулирования, включения активного фармацевтического ингредиента в липосомы для перорального приёма.

Создание конъюгатов ПЭГ-белок, ПЭГ-пептид, ПЭГ-олигонуклеотид в последнее десятилетие стало часто использоваться для улучшения фармакокинетических свойств и токсикологических характеристик данных лекарственных препаратов. Для этих целей в подавляющем большинстве случаев используется химическая пегиляция.

В настоящей работе представлены материалы по внедрению новой технологии пегилирования белковых молекул - электронно-лучевой пегиляции (ЭЛТТ). В качестве исследуемых веществ были взяты две белковые молекулы -рекомбинантный человеческий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор и протеолитический фермент субтилизин, существенно отличающиеся друг от друга по физико-химическим свойствам, механизму фармакологического воздействия, по параметрам фармакокинетики и токсичности. Посредством ЭЛП созданы пэгилированные модификации данных фармакологически активных белковых молекул. Исследованы их фармакодинамические, фармакокинетические параметры, оценена токсичность на лабораторных животных. Пегилированная форма субтилизина изготовлена в двух лекарственных формах - энтеральной и инъекционной. На обеих лекарственных формах проведен полный комплекс регистрационных клинических исследований. Получена Государственная регистрация под торговым названием Тромбовазим. Инъекционная форма предложена в качестве тромболитического препарата для лечения острого инфаркта миокарда, твёрдая лекарственная форма для лечения нарушений периферического кровообращения. Пегилированный ГКСФ прошёл весь комплекс доклинических исследований и подготовлен для клинических исследований.

На основании представленных материалов можно заявить о создании нового класса лекарственных препаратов — радиационных конъюгатов ПЭГ-Белок. Это новое отечественное направление в фармакологии. Технология ЭЛЛ основана на фундаментальных разработках отечественных учёных - физиков, химиков, биологов СО АН Российской Федерации. В настоящий момент нет сведений о подобного рода разработках за рубежом. Отладка технологических приёмов электронно-лучевой пегиляции, изучение фармакологических свойств белковых молекул, модифицированных по технологии ЭЛЛ, позволили заявить данную методику, как оригинальную отечественную технологию создания инновационных лекарственных препаратов.

Цель исследования: Изучить возможности электронно-лучевого синтеза белковых молекул с полиэтиленгликолем для создания новых фармакологических средств с оценкой их токсичности, переносимости, специфической активности и фармакокинетики.

Задачи исследования:

1. На примере двух различающихся по химическим и фармакологическим свойствам белковых молекул показать возможности электроннолучевого синтеза с полиэтиленгликолем для создания пегилированных фармакологически активных лекарственных средств;

2. Изучить физико-химические свойства созданных посредством электронно-лучевого синтеза пегилированных белковых молекул;

3. Изучить фармакодинамические свойства созданных посредством электронно-лучевого синтеза пегилированных белковых молекул;

4. Изучить параметры фармакокинетики созданных посредством электронно-лучевого синтеза пегилированных белковых молекул;

5. Оценить токсические эффекты созданных посредством электроннолучевого синтеза пегилированных белковых молекул;

6. На примере лекарственного средства - пегилированиого субтилизина, созданного посредством электронно-лучевого синтеза, показать терапевтические возможности по соотношению клиническая эффективность/безопасность;

7. Обосновать возможности технологии электронно-лучевого синтеза для создания новых, инновационных лекарственных препаратов, обладающих оптимальным соотношением польза/риск.

Научная новизна.

В результате проведенных исследований впервые показана возможность радиационного синтеза белковых молекул с полиэтиленгликолем при использовании пучка ускоренных электронов. Определена ключевая роль дозы излучения, концентрации ПЭГ, нативного белка в растворе и его температуры в образовании белково-полимерных соединений за счёт карбонильной связи полимера и аминной связи белка, водородных связей, оснований Шиффа. Впервые доказана возможность, варьируя дозой облучения, концентрацией и молекулярной массой одного и того же полимера и белка, создавать композиции от единичных молекул полимера на белке до включения белка в полимерный кросслинкинг, изменяя фармакокинетические характеристики вещества. Результатом исследования явилось подтверждение стабильности соединений белок-полимер в течение 2 лет при температуре 8-10°С.

При оценке фармакодинамики полученных соединений в эксперименте in vitro и на моделях патологических состояний показано, что белково-полимерные препараты, созданные по технологии электроннолучевого синтеза, обладают специфической фармакологической активностью свойственной нативным белкам. Так, на модели миелосупрессии, продемонстрировано, что пегилированный по технологии электроннолучевого синтеза Г-КСФ и нативный Г-КСФ обладают идентичной специфической активностью, отличаясь лишь профилем достижения терапевтических эффектов: при применении пегилированиого Г-КСФ достижение максимальной гемостимулирующей активности запаздывает на 1 сутки, но эффект сохраняется более продолжительно (до 13 суток). Для фармакологического препарата на основе пегилированного, посредством электронно-лучевого синтеза, фермента-субтилизина молекулярной массой 30 кДа, продемонстрирован, свойственный нативному белку, выраженный фибринолитический эффект как в экспериментах in vitro, так и in vivo. Тромболитический эффект лекарственного средства на основе пегилированного субтилизина подтвержден в клинических исследованиях при лечении венозной недостаточности и инфаркта миокарда.

Впервые изучено и показано, что одноступенчатый электроннолучевой синтез нативного белка с полиэтиленгликолем модифицирует фармакокинетические характеристики нативного белка и обеспечивает новые, терапевтически значимые пути его введения в организм. На примере пегилированного Г-КСФ показано, что препарат быстро проникает в системный кровоток и достигает максимальных концентраций при подкожном и ректальном введении в течение 1 часа, а при внутрижелудочном введении через 10 мин. Значения максимальных концентраций лежат в диапазоне 1700-2500 пг. Препарат пегилированного субтилизина всасывается из кишечника с биодоступностыо 16-18% и имеет пик концентрации в плазме через 4 часа после энтерального введения.

Электронно-лучевое пегилирование белковых молекул обеспечивает низкую токсичность созданных на их основе лекарственных препаратов. При определении параметров острой токсичности ПЭГ-ГКСФ выявлено, что достигнутые дозы препарата многократно превышают терапевтические, применяемые в клинической практике - от 300 до 1500 раз. Изучение хронической токсичности показало отсутствие поражений органов при длительном приёме, отсутствие аллергизирующего и иммунотоксического действия, не выявлены мутагенные свойства и генотоксичность, препарат не обладает местнораздражающим действием. Пегилированный субтилизин при парентеральном и энтеральном введении не оказывает выраженных токсических эффектов и относится к классу малотоксичные вещества.

В результате проведённых клинических исследований установлено, что электронно-лучевое пегилирование субтилизина обеспечивает тромболитическое, цитопротективное, противовоспалительное действие в организме человека при энтеральном и парентеральном путях его введения. На основе данного исследования фармакологический препарат пегилированного субтилизина создан в двух лекарственных формах. Продемонстрирована его эффективность как прямого тромболитика при остром инфаркте миокарда с более благоприятным соотношением эффективность/безопасность по сравнению с активаторами плазминогена. Таблетированная форма является эффективным средством для лечения венозной недостаточности и тромбозов венозной системы.

Практическая значимость.

Технология электронно-лучевого пегилирования демонстрирует возможности создания инновационных высокоэффективных и безопасных лекарственных препаратов белковой природы для лечения различных заболеваний. Электронно-лучевое пегилирование белковой молекулы способно изменить фармакокинетические показатели, особенно в части повышения энтеральной биодоступности, снизить токсичность, обеспечить невысокую стоимость конечного продукта. Данный способ позволяет синтезировать фармакологически активные белковые молекулы для лечения конкретной нозологии с требуемыми параметрами фармакокинетики и оптимальным способом введения в организм. Лекарственные препараты на основе пегилированных белков, созданные по технологии ЭЛП комплаентны для пациентов за счёт возможности использовать твёрдые лекарственные формы (капсулы, таблетки, суппозитории), безопасны с точки зрения иммунотоксичности и аллергогенности. Эти лекарственные препараты могут использоваться человеком достаточно долгое время и несколькими курсами для лечения тяжёлых хронических дегенеративных заболеваний.

Положения, выносимые на защиту:

1. Технология электронно-лучевого синтеза фармакологически активного белка с полиэтиленгликолем позволяет создавать соединения ПЭГ-Белок со стабильными физико-химическими свойствами, обладающие фармакодинамикой, присущей нативному белку;

2. Технология электронно-лучевого синтеза фармакологически активного белка с полиэтиленгликолем различной молекулярной массы позволяет модифицировать фармакокинетические характеристики соединения ПЭГ-Белок. Позволяет создавать лекарственные препараты белковой природы с высокой терапевтической активностью и низкой токсичностью.

выводы

1. Электронно-лучевая пегиляция белковых молекул может быть использована для создания пегилированных фармакологических препаратов белковой природы. Под действием пучка ускоренных электронов в одну технологическую стадию удаётся получить фармакологически активный белково-полимерный комплекс ПЭГ-Г-КСФ и ПЭГ-Протеиназа.

2. В результате электронно-лучевого пегилирования исследованных фармакологически активных белковых молекул изменяются их физико-химические свойства. Увеличивается их молекулярная масса, они обладают хорошей растворимостью в воде и не выпадают в осадок. Созданные посредством ЭЛП белково-полимерные комплексы обладают хорошими показателями по стабильности при различных условиях хранения.

3. В процессе электронно-лучевой пегиляции специфическая фармакологическая активность нативной белковой молекулы не утрачивается. Созданные белково-полимерные комплексы ПЭГ-Г-КСФ и ПЭГ-Протеиназа сохраняют необходимые фармакодинамические характеристики.

4. В результате электронно-лучевого пегилирования изменяются параметры фармакокинетики исходных фармакологически активных белковых молекул. Белково-полимерные комплексы ПЭГ-Г-КСФ и ПЭГ-Протеиназа приобретают увеличенную энтеральную биодоступность с созданием терапевтически значимых концентраций препарата в кровотоке.

5. Белково-полимерные комплексы ПЭГ-Г-КСФ и ПЭГ-Протеиназа, созданные посредством ЭЛП обладают низкой токсичностью при различных способах применения. Пегилированная протеиназа классифицируется как малоопасное вещество. Токсические дозы ПЭГ-Г-КСФ многократно превышают терапевтические.

6. Фармакологический препарат на основе ПЭГ-Протеиназы в твёрдой лекарственной форме демонстрирует высокую клиническую эффективность при венозной недостаточности. При внутривенном способе введения данный препарат как прямой тромболитик используется при остром инфаркте миокарда. Наряду с высокой клинической эффективностью фармакологический препарат на основе ПЭГ-Протеиназы хорошо переносится больными и не имеет выраженных побочных эффектов.

7. Технология электронно-лучевой пегиляции белковых молекул позволяет создавать оригинальные, инновационные лекарственные препараты, в том числе и на основе известных ранее субстанций. ЭЛП позволяет синтезировать лекарственные препараты с заданными параметрами фармакокинетики: от ускоренного достижения пиковых концентраций до создания тканевых депо с пролонгированным клиническим эффектом.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе представлены материалы изучению возможностей и по практическому использованию электронно-лучевой пегиляции для создания пегилированных фармакологических средств белковой природы. В доступном для нас массиве литературных источников, отражающих технологические приёмы синтеза и использования в клинической практике пегилированных лекарственных препаратов, нами не найдено аналогичных примеров. Несмотря на то, что электронно-лучевая конъюгация белков (иммобилизация) процесс в науке известный, не было попыток масштабных экспериментальных работ с целью глубокого анализа возможностей данного метода для синтеза фармацевтических субстанций. Принимая во внимание известные преимущества пегилированных лекарственных препаратов, автором работы была поставлена перед собой цель продемонстрировать возможности технологии электронно-лучевой пегиляции фармакологически активных белковых молекул на примере двух молекул, отличающихся друг от друга, как по химическим, так и фармакологическим характеристикам. В работе показана химическая аналитика полученных конъюгатов, отражены выполненные доклинические исследования, представлен созданный лекарственный препарат, его клинические исследования и вывод на фармацевтический рынок.

Актуальность использования известных пегилированных лекарственных препаратов, полученных посредством химического синтеза, их значимые клинические преимущества явились своего рода вызовом для представленной работы. Необходимо было показать не только адекватность технологии ЭЛП с точки зрения пегиляции белковых молекул против традиционного химического способа, но и определить преимущества данного метода. Сопоставляя масштаб выполненных исследований и достигнутую конечную цель можно смело утверждать, что в данной работе представлена новая технология производства лекарственных препаратов. Электроннолучевая пегиляция это не просто альтернатива химической, она в отличие от ззо неё, предоставляет дополнительные технологические возможности для модификации фармакокинетических свойств лекарственных препаратов. Особо хочется отметить тот факт, что это оригинальная отечественная разработка, как с позиции технологических решений, так и позиции научного обоснования.

Как было указано в обзоре литературных источников, попытки применять ковалентное присоединение полимеров с целью совершенствования безопасности и эффективности различных протеинов для использования в фармацевтическом производстве предпринимались с 70-х годов прошлого века. Конъюгаты Белок-ПЭГ преимущественно синтезируются с единственной нитью ПЭГа имеющей высокий молекулярный вес - до 30 кДа. Возможно конъюгирование с несколькими (до 10) нитями одного или нескольких ПЭГов. ПЭГ соединяется с целевым протеином через аминогруппы (эпсилон-аминогруппы радикалов лизина и альфа-аминогруппа 1Ч-концевой аминокислоты). С увеличением количества нитей ПЭГа, увеличивается вероятность того, что аминогруппа в активной части белка будет модифицирована, ослабляя его биологическую функцию (например, ферментативный катализ или рецепторное связывание цитокином). Для больших протеинов, содержащих много аминогрупп, и для ферментов с субстратами низкого молекулярного веса, данный компромисс между повышенной продолжительностью действия и пониженной удельной активностью может быть приемлемым, так как он дает чистое увеличение биологической активности ПЭГ-содержащих конъюгатов в живом организме.

Для осуществления ковалентного присоединения ПЭГа к протеину одна из гидроксильных концевых групп полимера должна быть вначале преобразована в химически активную функциональную группу (радикал). Этот процесс часто называется "активацией", а получаемый продукт называется "активированным ПЭГ". Монометоксильный ПЭГ, который с одного конца закрыт инертным, химически устойчивым диметиловым эфиром ("метоксильной группой"), а с другого конца - функциональной группой (радикалом), химически активной по отношению к аминогруппам на молекуле протеина, наиболее часто используется в подобных методиках. ПЭГи, которые содержат две и более метоксильные группы, наиболее удаленные от единственной активированной функциональной группы, используются не так часто. Активированные полимеры вступают в реакцию с терапевтическим средством, имеющим функциональные группы, которые служат местом присоединения. Одна функциональная группа, обычно используемая в качестве места присоединения, является эпсилон-аминогруппой радикалов лизина. Гидроксильная группа ПЭГа активируется хлорангидридом циануровой кислоты. Использование данного метода имеет свои недостатки, такие как токсичность хлорангидрида циануровой кислоты и её неспецифическая химическая активность для протеинов, имеющих функциональные группы, отличные от аминов, такие как растворимые радикалы цистеина или тирозина, которые могут быть существенными для выполнения фармакологических функций.

Для преодоления этих и других недостатков применяются альтернативные активированные ПЭГи, такие как сукцинимидилсукцинатные производные С^З-РЕС - СС-ПЭГ). СС-ПЭГ быстро вступает в реакцию с протеинами, давая активные, хотя и широко модифицированные конъюгаты. Известен ещё один вид активированного ПЭГа - полиэтиленгликоль 14-сукцинимидилкарбонат. Данная форма полимера ("БС-РЕО" СК-ПЭГ) легко вступает в реакцию с аминогруппами протеинов, а также с пептидами, имеющими низкий молекулярный вес, и другими материалами, которые содержат свободные аминогруппы, с которыми она образует уретановые связи. Также известны конъюгаты ПЭГ-белок посредством амидных связей, сложноэфирных связей, вторичных аминов и тиоэфирных связей.

Очевидно, что химическая пегиляция белковых молекул представляет из себя многостадийный процесс сопровождающийся использованием токсических соединений. Автор не располагает сведениями о материальном балансе производства пегилированных белков по технологии химического синтеза, но вне всяких сомнений этот процесс дорогостоящий. Это подтверждается анализом стоимости конечного продукта. Например, цена одного флакона нативного ГКСФ производства компании Хоффманн-ля-Рош - «Нейпогена» составляет примерно 300 долларов США, а пегилированный ГКСФ того же производителя - «Неуластим» уже 2 ООО долларов. Маловероятно, что столь значимое увеличение стоимости пегилированного ГКСФ всего лишь коммерческий ход. В итоге высокая цена «Неуластима» при всех его фармакологических преимуществах не позволяет иметь значимый положительный тренд реализации препарата в натуральном выражении - в 2009 году в России «Нейпогена» было продано 3 736 упаковок, а «Неуластима» всего 312 (база данных «Фармэксперт»). При этом необходимо учитывать, что «Неуластим» монопродукт в рынке, а в структуре продаж всех препаратов ГКСФ у него более чем скромная позиция, в том же 2009 году препаратов ГКСФ в России было продано 46 188 упаковок, из них «Неуластима» всего 312. Схожая ситуация и у пегилированных интерферонов, пегилированный интерферон-альфа2а в 10 раз дороже, чем нативный интерферон-альфа2а. В результате стоимость одного курса терапии вирусного гепатита С пегилированным интерфероном-альфа 2а («Пегасис», Хоффманн-ля-Рош) составляет примерно 450 тыс. рублей. Если представить себе общую стоимость лечения больных вирусным гепатитом С в России за один год, а их зарегистрировано около 4 млн. человек, то сложится очевидная картина необходимости иметь в арсенале инфекционистов доступного, недорого пегилированного интерферон-альфа2а.

Собственно говоря, подобного рода бескомпромиссные ситуации для государственного бюджета России и явились главной идеологической концепцией программы «Фарма 2020». Импортозамещение недорогими высокоэффективными лекарственными препаратами отечественного производства составляет концепцию лекарственной безопасности России, озвученную в программных государственных документах.

Автором работы упоминалось выше, что разработка технологии электронно-лучевого пегилирования белковых препаратов это не только амбициозная научная задача, но и конкретные практические предложения для фармацевтической промышленности. Механизм радиационной пегиляции белковых молекул был представлен в предшествующих главах и, анализируя факты, становится совершенно очевидно, что образование конъюгатов Белок-ПЭГ обусловлено исключительно воздействием потока ускоренных электронов, поскольку образцы, содержащие белок и ПЭГ до облучения идентичны исходной субстанции. Конъюгаты после облучения могут иметь не только ковалентный характер связи, прочность образовавшейся связи, зависит от дозы облучения. Дозы в 0,5 МРад и 0,75 МРад в выбранной модельной смеси белка, где используется ПЭГ 20 ООО Да не обеспечивают достаточно прочной связи, а в образцах с ПЭГ 10 ООО Да наблюдается полное включение белка в образовавшихся конъюгатах. Выявлена зависимость между молекулярной массой образующихся Белок-ПЭГ комплексов и дозой облучения. Наиболее выражено этот эффект проявляется с низкомолекулярными полимерами - ПЭГ 400 Да и ПЭГ 1 500 Да, когда наблюдалось увеличение диапазона молекулярной массы Белок-ПЭГ комплекса в зависимости от дозы облучения. Для образцов с высокомолекулярными ПЭГами, подобной картины не отмечается, поскольку возникает эффект кросслинкинга.

Таким образом, метод электронно-лучевой пегиляции позволяет синтезировать различные конструкции целевого белка с полимером. В зависимости от необходимых фармакокинетических, фармакодинамических и токсикологических характеристик перспективного лекарственного препарата можно воспользоваться той или иной технологической схемой производства посредством подбора дозы облучения, концентраций, молекулярной массы, агрегатного состояния композиции. Например:

1. Поставлена задача создать лекарственный препарат в форме тканевого депо с пролонгированным высвобождением фармацевтически активного

334 белкового компонента в нативном виде, пренебрегая возможной аллергогенностыо вследствие его малой молекулярной массы. Здесь следует воспользоваться технологическим приёмом электронно-лучевого кросслинкинга. Предварительно создаётся смесь белка и крупномолекулярного ПЭГа с нужной концентрацией и молекулярным весом, допустим, 20 кДа. Под потоком ускоренных электронов происходит одномоментная структурная перекрёстная полимеризация ПЭГа с включением в его каркас белка. Доза облучения подбирается с учётом необходимой степени структурирования ПЭГа (предгель или гель) и сохранности белковой молекулы. Возможности созданной фармацевтической . композиции будут иметь широкий диапазон использования - от парентеральных до наружных лекарственных форм. Это направление в настоящий момент выглядит весьма перспективным ввиду возможного применения других, кроме обычного ПЭГа, полимеров, которые, в свою очередь, имеют уникальные особенности деградации в организме человека. Это, так называемые, блок-сополимеры типа АВА, ВАВ; где А - ПЭГ, а В - различные вещества способные к биодеградации. Блок-сополимеры разрушаются по блоку В, который может быть рН-чувствительным или термолабильным. Экскреция из организма происходит молекулами малой молекулярной массы. Метаболизм конъюгатов Белок-ПЭГ в котором участвует низкомолекулярный ПЭГ сводится к окислению этанольной группы ПЭГа до карбоновой кислоты, где посредником служит алкогольдегидрогеназа. Затем, как неоднократно указывалось (Drug Metabolism and Disposition Vol.35, No.l, 2007, стр. 916.), низкомолекулярный ПЭГ выводится преимущественно (до 96%) почечной фильтрацией в течение 12 часов, а белковая составляющая конъюгата гидролизуется в печени.

Как показал литературный поиск, интерес могут представлять блоксополимеры на основе молочной, полимолочной, янтарной кислоты.

Межмолекулярный электронно-лучевой кросслинкинг блок-сополимера и

335 включение в его структуру фармацевтически активного белка обеспечит создание такой фармацевтической композиции, которая будет проявлять свои фармакологические свойства только при определённых условиях. Например, высвобождение активного вещества будет только при повышении температуры тела, или высвобождение вазоактивного препарата при ацидотическом состоянии, возникшем вследствие ишемии/гипоксии в том числе и локальной.

2. Известно, что при облучении водных растворов ПЭГа потоком ускоренных электронов, наряду с межмолекулярным кросслинкингом, формирующим в конечном итоге гидрогели, в зависимости от выбранных условий, возможен также внутримолекулярный кросслинкинг, приводящий к синтезу по радикальному механизму индивидуальных полимерных клубков, так называемых наногелей http://www.mitr.р.lodz.pl/biomat/raport/33radiatio nhydrogels.html). Схематически, межмолекулярный и внутримолекулярный кросслинкинг представлен на рисунке 63.

Рис. 63 Схематическое изображение межмолекулярного (а) и внутримолекулярного (б) кросслинкинга, возникающего в водных растворах полимеров в процессе облучения потоком ускоренных электронов (точки на молекулах изображают формирование радикальных сайтов в процессе облучения ускоренными электронами) (http://www.mitr.p.lodz.pl/biomat/raport/ 33radiationhydrogels.html).

На основе представленного феномена возможно создание фармацевтического препарата на основе белка с высокой молекулярной массой, который будет пегилирован по типу наногеля с целью снижения токсических свойств низкомолекулярным ПЭГом и посредством межмолекулярного кросслинкинга депонирован для создания пролонгированной лекарственной формы.

3. Если поставлена задача обеспечить низкую иммунологическую токсичность и отсутствие аллергогенности крупной белкой молекулы без ослабления её специфических химических свойств, следует произвести конъюгацию с низкомолекулярным ПЭГом в невысокой концентрации и в низкой дозе облучения. В результате вокруг глобулы белка появляется «рыхлое» гидрофильное облако полимера, которое не инактивирует специфические свойства белка. Увеличенный гидродинамический радиус полученного конъюгата изменяет его фармакокинетические свойства и улучшает его токсикологические характеристики.

Внутримолекулярный кросслинкинг возникает при облучении водных растворов с низкой концентрацией полимера, из-за значительного удаления молекул последнего в объеме раствора. Нами была предположена возможность формирования подобных структур в облученных растворах ПЭГа с молекулярной массой 1500, образующим в отличие от высокомолекулярных ПЭГов гидрогель при повышенных дозах облучения. Был проведен эксперимент по совместному облучению бычьей тестикулярной гиалуронидазы (БТГ) и 5% водного раствора ПЭГа 1500 в дозе заведомо ниже дозы гелирования Взаимодействие БТГ на матрице ПЭГа оценивали по изменению его профиля элюции методом эксклюзионной ВЭЖХ хроматографии. Детекцию проводили на проточном ВЭЖХ-спектрофотометре (БУКАМ) при длине волны 220нм, Результаты анализов представлены на следующем рисунке.

Рисунок 64. Профиль элюции БТГ после совместного облучения с ПЭГом 1500 в дозе 1,5Мрад Как видно из представленного на рисунке 65 сравнительного профиля элюции в результате облучения ускоренными электронами субстанции БТГ в 5% водном растворе ПЭГа1500 в дозе 1,5 Мрад не наблюдается принципиального изменения во времени выхода фракций, входящих в состав фермента. Это наглядно демонстрирует факт того, что процесс межмолекулярного кросслинкинга, приводящего к формированию водорастворимого предгеля в данном случае не произошел. Для доказательства взаимодействия между ПЭГом и белком, хроматографические фракции, отвечающие за специфическую активность, были собраны и подвергнуты центрифугированию в ультрафильтрационных пробирках (Агшсоп Шга-0,5 10К МПНроге) с пределом отсечения молекулярных масс до ЮкДа. Собранные после ультрафильтрации концентрат и пермеат были протестированы на специфическую активность и наличие ПЭГа (качественная реакция по ТУ 9154-027-59230155-10). Результаты анализа продемонстрировали наличие фермента и ПЭГа в концентрате, что может свидетельствовать о формировании комплексов БТГ с ПЭГом 1500 при их совместном облучении потоком ускоренных электронов.

Конкретным примером использования последнего технологического приёма является пегилированная протеиназа ПЭГ-П - Тромбовазим.

Выше было детально показано, что достаточно крупная белковая молекула фермента субтилизина (=30 кДа), существенно превышающая порог иммуногенностп (=7 кДа) после пегилирования с ПЭГом 1 500 Да имеет токсикологические характеристики присущие малоопасным веществам по ГОСТ 12.1.007 - 76 (IV класс - малоопасные вещества) и обладает энтеральной биодоступностыо. По сведениям уполномоченного по фармаконадзору компании-производителя Тромбовазима («Сибирский центр фармакологии и биотехнологии», г.Новосибирск) (ПОБ от 06.2011г.) в 11 700 случаях приёма препарата не отмечалось ни одного случая серьёзных нежелательных явлений. Очевидно, что профиль безопасности является одной из позитивных отличительных черт данного лекарственного препарата.

Другим преимуществом ПЭГ-П является достаточно выраженная энтеральная биодоступность. Известно, что в кишечнике человека возможна транслокация белковой молекулы в нативном виде через энтеральную стенку. Однако биодоступность при этом не превышает 1-1,5 % от количества введённого белка. Пегилированная посредством ЭЛП молекула субтилизина имеет иные характеристики в отличие от нативной. При подобранной технологии облучения образуется такой характер связи фермента с ПЭГом, который увеличивает его солюбилизацию, он становится защищённым от конкурентных гидролаз кишечника, при этом, что особенно важно, не блокируется активный центр фермента. В результате пегилированный субтилизин имеет весьма впечатляющую энтеральную биодоступность в 18%.

Наряду с этим ПЭГ-П сохраняет свои специфические протеолитические (фибринолитические и тромболитические) свойства как в экспериментах in vitro и in vivo, так и в организме человека. Тромболитический эффект демонстративен в случае острого инфаркта миокарда и венозного тромбоза мозговых синусов.

Представленную на примере Тромбовазима фармакологическую модель можно считать оптимальной для лекарственного препарата с болюсным режимом введения, когда в ограниченный (короткий) период времени создаётся высокая пиковая концентрация терапевтического белка, разворачивается его искомый фармакодинамический профиль без токсических побочных явлений и наступает быстрая экскреция через почки. Благоприятные токсикологические характеристики позволяют проводить эскалацию терапевтической дозы пегилированного белкового препарата посредством увеличения кратности введений без риска развития анафилактического состояния.

Электронно-лучевое пегилирование второй представленной в данной работе белковой молекулы - рчГ-КСФ также демонстрирует изменение фармакологических показателей, особенно в части повышения энтеральной биодоступности. Возможно, биодоступность ПЭГ-ГКСФ в тонком кишечнике не является впечатляющей с точки зрения перспективы создания пероральной лекарственной формы для лечения миелосупрессивных состояний в противовес парентеральной. Однако сам факт увеличения данного показателя в 4 раза достаточно демонстративен. При этом особенного внимания заслуживает биодоступность ПЭГ-ГКСФ через кишечную стенку прямой кишки. В экспериментах установлено, что биодоступность при введении препарата per rectum достигает 32 %.

Изучение транслокации пегилированных белков через эндотелиальную стенку посредством прямого детектирования в рамках данной работы не было предусмотрено. Однако автор, ссылаясь на выполненные и опубликованные работы по изучению действия пегилированной гиалуронидазы и пегилированных олигонуклеотидов, считает, что этот процесс имеет место быть. На рис. 65 и 66 представлены снимки конфокальной микроскопии участка тонкой кишки крысы, в котором детектируется накопление пегилированных белковых препаратов

ПЭГ-БП), меченных ИТС. На рис.65 отображено накопление в крипте кишечника пегилированного белкового препарата с молекулярной массой 5,5 кДа. На рис.66 этот же процесс с белковым препаратом молекулярной массой 30 кДа.

Рис. 65. Конфокальные снимки ткани тонкой кишки после инкубации пегилированного белкового препарата (ПЭГ-БП) ММ - 5,5 кДа (in vivo)

Рис. 66. Конфокальные снимки ткани тонкой кишки после инкубации ПЭГ-БП ММ - 30 к Да (in vivo).

Очевидно, что наряду с транслокацией пегилированных белковых препаратов из просвета кишечника в сосудистое русло, происходит накопление их в интерстиции кишечника. Причём конъюгаты ПЭГ-Белок, созданные по технологии электронно-лучевого синтеза, способны к накоплению в интерстиции в достаточно большом диапазоне молекулярных масс нативного белка.

Принимая во внимание возрастающий интерес к терапии цитокинами в регенераторной медицине, можно смело считать, что электронно-лучевое пегилирование белков-цитокинов позволит сформировать новый класс препаратов данной группы - это будут адресные регенеративные препараты. Преодоление энтерального барьера демонстрирует потенциальные возможности пегилированной молекулы, имеющей вокруг себя гидрофильное облако, проникать в интерстициальное пространство.

Лекарственные препараты на основе пегилированных цитокинов будут комплаентны для пациентов за счёт возможности использовать твёрдые лекарственные формы (капсулы, таблетки, суппозитории), безопасны с точки зрения иммунотоксичности и аллергогенности. Таким образом, эти лекарственные препараты могут использоваться человеком достаточно долгое время и несколькими курсами для лечения тяжёлых хронических дегенеративных заболеваний. Принимая во внимание указанные выше экономические преимущества электронно-лучевой пегиляции против химической, можно пренебречь не высокой энтеральной биодоступностыо против инъекционных форм. Увеличение дозы активного вещества не будет главным ценообразующим фактором конечного продукта. Эти лекарственные препараты будут относительно не дорогими как для частных покупок больными, так и для государственного бюджета в формате госзакупок.

В разное время автор участвовал в работах по созданию и изучению фармакологических свойств пегилированных препаратов ферментной природы, цитокинов, гормонов, олигонуклеотидов. Некоторые материалы и результаты опубликованы, другие материалы находятся на стадии доработки и патентования. Накоплен большой научный и практический опыт не только по созданию и исследованию пегилированных фармацевтических продуктов, но и по их внедрению в клиническую практику начиная с этапа регистрационных клинических исследований и заканчивая выводом лекарственного препарата на фармацевтический рынок. Автор имеет все основания считать технологию электроннолучевого пегилирования белковых молекул перспективной и значимой как для фармацевтической отрасли экономики, так и для здравоохранения Российской Федерации.

Производственный процесс электронно-лучевого пегилирования достаточно простой. Конъюгация белка и полимера осуществляется за один технологический этап, который по времени занимает менее одного часа, начиная с момента доставки исходного материала на производственный участок радиационного синтеза. Однако, это не значит, что электронно-лучевое пегилирование представляет собой универсальный приём для большинства белковых молекул. Каждая композиция - кандидат в лекарственный препарат на этапе отработки лабораторного регламента проходит несколько стадий испытаний и химической аналитики. По нашему опыту для создания фармацевтической субстанции пегилированного белка требуется от 50 до 250 экспериментов по подбору концентрации белка и ПЭГа, молекулярной массы полимера, дозы облучения, агрегатного состояния.

Наряду с процессом пегилирования происходит стерилизация фармацевтической субстанции, что, безусловно, является дополнительным положительным свойством технологии. Отдельно стоит остановиться на последствиях радиационного облучения исходных субстанций с точки зрения образования токсических метаболитов вследствие денатурации и источников остаточной радиации. Первое и второе являются потенциально опасными для организма человека, и упустить этот аспект электроннолучевого пегилирования не представляется возможным. Технология электронно-лучевого пегилирования фармацевтических субстанций предусматривает использование доз радиации в диапазоне от 0,25 до 2,5 Мрад. Для промышленной стерилизации пищевых продуктов, изделий медицинского назначения используются дозы от 1 до 3 Мрад, что предполагает отсутствие образования радиационных токсических метаболитов и продуктов деградации белка. Также стоит добавить, что технологический процесс производства лекарственных препаратов предусматривает контроль хроматографическим способом сохранности белковой молекулы, что в свою очередь подтверждает соблюдение безопасных параметров облучения и качество конечного продукта.

Подводя итог над изложенным в диссертации материалом, её автор считает поставленные цели и задачи выполненными. Наглядно представлена новая оригинальная отечественная технология создания лекарственных препаратов белковой природы. На примере двух лекарственных препаратов продемонстрированы возможности электроннолучевого пегилирования белковых молекул. Показано, что электроннолучевая пегиляция фармацевтически активной белковой молекулы обеспечивает ей выгодное соотношение терапевтической эффективности и безопасности. Материалы диссертации убедительно доказывают, что в настоящий момент отечественная фармакология и фармацевтическая промышленности не страдают от кризиса идей. Сочетание огромного потенциала Российской науки и возможностей отечественной фармацевтической промышленности позволяют создавать собственные уникальные промышленные технологии производства лекарственных препаратов, не уступающие зарубежным производителям.