Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Эффекторная функция иммуноглобулин-синтезирующих клеток в культуре in vitro больных иммунопролиферативным и аутоиммунным заболеваниями

! ' ■

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИИ

РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИМ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

копылов

Александр Евгеньевич

ЭФФЕКТОРНАЯ ФУНКЦИЯ ИММУНОГЛОБУЛИН — СИНТЕЗИРУЮЩИХ КЛЕТОК В КУЛЬТУРЕ

IN VITRO

БОЛЬНЫХ ИММУНОПРОЛИФЕРАТИВНЫМ И АУТОИММУННЫМ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ

14.00.36 — аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 1992

Работа выполнена в Российском Государственном Медицинском Университете.

Научные р у к о в о д и т е л ¡и:

доктор медицинских наук, профессор Л. В. Ковальчук, доктор медицинских наук А. К. Голенков.

О ф и ци а л ь н ы е о п п о н ент ы:

доктор1 медицинских наук С. С. Василейский, доктор медицинских наук, профессор И. В. Петрова.

Ведущее учреждение — Институт Иммунологии МЗ России.

Защита диссертации состоится « . . . ».....1992

года на заседании специализированного совета К.084.14.06 при Российском Государственном Медицинском Университете (117513, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан « . . . » . . . . . 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат медицинских наук,

доцент Т. Е. Кузнецова

, ..! общая шг&шеты работы.

I Актуальность теш.

■х-лацим 1 .

.....Важной задачей совреме"ной иммунологии является кзучошто

клеточных основ функционирования иммунной системы, с учетом тати основных его этапов,как распознование, активация, пролиферация, дяфферзнцировка и регуляция (Ковальчук Л.В.,Чередев А.Н.,1990). Зто в полной мере относится к исследованиям свойств кялуноглобулин-синтезиру-щих меток. В настоящее время они активно изучаются не только й физиологических условиях, но и при иммунопатологических состояниях о их нарушениями, что ига от знач-лшэ для более полного понимания шханизмов этиопатогенээа тают заболеваний.

к числу таких .заболеваний гозно отнести «.лзломпую болезнь (№) п болезнь АльцгеЯквра (БА), при которых дефекта 15,?,!у:ЮГЛО0уЛШ-СИНТ031!руЕПЦЕ£ клеток приводят Й ПОВЫШАЛИ) уровня пр дукции имушглобуязнов. Прп Ш повидается продукция моноклоналыгого 'иммуноглобулина, а при ВА поликлональных антимозгоБцх оутоантнтал. ПодоСное повышение синтеза иммуноглобулинов осиливает образование амилоидных отлоиений при БА, для которой они являются ведущей патогенетической причиной, а также способствуют формирезапив вторичного емилоидоза при МБ, который встречается в 10-15% случаев (Мегер А'.,1986).Увеличение чвстотн этих заболеваний с возрастом также свидетельствует о наличие общих патогенетических чер-" у этих двух патологий ДОя^-агЬ в. е* а1. 1989).

Ва:сно,что влияние возрастного компонента нь развитие иммунологических нарушений при БА расценивается некоторыми авторами как ведущее (Ыоазгго Р. at а1.,1990), что требует специальной оценки его значения.

Реиеа в ряде работ было продемонстрировано существование

повышенной активности иммунорегуляторных пептидов при МБ интерлейкина-6 (ИЛ-6) (Kawano M. et al.,1988). миелопептидов (ПетроЬ Р.В. с соавт. 1984), фактора активирующего миграцию лимфоцитов (Борисова A.M. с соавт. 1988). Известно, что в частности ИЛ-6 и миелопетиды стимулируют продукции иммуноглобулинов мононуклеарами периферической крови (МНПК) человека (Власенко Р.Я. I990,Muraguohi A. et al., 1988). Вместе с тем усилению активности этих цитокинов противоречит снижение количества сывороточных иммуноглобулинов не моноклональных классог у больных МБ (Голенков А.К.,1977).Кроме того следует отметить, противоречивый характер данных, отражающих способность к продукта .иммуноглобулинов в культуре in vitro лимфоцитами больных МБ. Таи наряду со снижением индуцированной митогеном лаконоса (МЛ) продукции иммуноглобулинов при МБ, есть данные показывающие неизмененную функцию периферических иммуноглобулин-синтезирующго клеток у таких больных (.Levinson À Л. et al.,1985, Twomey R.U., 1982). Аналогичные.результаты с исследованием функции В~лимфоцито1 при БА фрагментарны и также на дают полного представления об ю дефектах (Skias »., 1985). Все это позволяет считать актуально! задачу изучения функции иммуноглобулин-синтезирующих клеток i культуре in vitro у больных с этими патологиями.

Основным методом исследования для изучения поставленные вопросов в данной работе стала модель поликлонального синтез! иммуноглобулинов in vitro индуцированная МЛ. Благодар; кооперативному взаимодействию при этом разных субпопуляций клеток она позволяет дать широкую характеристику не только функцм В-лимфоцитов, но и других иммунокомпетентных клеток (Zola н.

1905).

• -з-

Цаль и задачи исследования.

Целью данной работы явилось изучение эфрвкторной функции иммуноглобулин-синтезируюцих клеток in vitro у больных с миелошюй болезнью и у больных с болезнью Альцгеймера.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи

I.Охарактеризовать продукцию иммуноглобулинов in vitro, стимулированную МЛ, и пролиферативный ответ лимфоцитов на ФГА и МЛ у здоровых доноров.

2.Изучить и сопоставить содержание igA, IgM, IgG in vivo (сыворотка) и продукцию иммуноглобулинов, стимулированную МЛ in vitro У больных с миеломной болезнью, болезнью Альцгеймера.

3.Изучить особенности пролиферативного ответа лимфоцитов больных in vitro, в том числе и при стимуляции специфическими антигенами мозга у больных с болезнью Альцгеймера; оценить степень взаимозависимости пролиферации и продукции иммуноглобулинов.

4.Оценить степень влияния возраста на изученные показатели продукции иммуноглобулинов in vitro и пролиферативного ответа у больных болезнью Альцгеймера путем сравнения их с одновозрастной группой больных мультиинфарктной деменцией.

5.Оценить влияние аутологичной сыворотки больных миеломной болезнью на продукцию иммуноглобулинов и цитокинов in vitro.

■ 6.Охарактеризовать продукцию комплокса цитоют'ов (интерлейгаша-I (ШЫ), ИЛ-6, фактора некроза опухоли-a (ФНО-а)) у больных миеломной болезнью.

Научная новизна работы.

Впервые проведено углубленное изучение • и сопоставление функции иммуноглобулин-синтезирующих клеток у = больных МБ.БА, мультиинфарктной деменцией (МИД).Показано, что на уровне •

спонтанной продукции иммуноглобулинов наиболее подворзан изменениям igü, которая оказался снижен у всех категорий больных. Стимулированная Ш продукция igA, IgM, IgG менялась по разному'у разных групп больных. В том числе выявлен нормальный ответ у больных с МБ, повышенная продукция IgM, igG у больных БА и снижение продукции igA, igii, у больных МИД. Полученные данные сов1 вдали с оценкой содерзания иммуноглобулинов в сыворотке больных только прй Бд.гда наблюдалось достоверное повышение igA и IgG.

Установлено, чт пролиферативный ответ мононуклеароз: периферической крови после стимуляции поликлональныш активаторам! был снижен у всех изученных категорий больных в даннол исследовании.Не было установлено достоверной корреляционной связз между продукцией иммуноглобулинов и пролиферативной активносты лимфоцитов, но более выраженное снижение на W1 было при сшкенй продукции иммуноглобулинов,стимулированной им.Также получен приоритетше данные, опистакщио появление сгюцкфаческог пролиферативного ответа лимфоцитов больных БА после стану ля ци

антигенами мозговой ткани - общим белком миелина <0БУ)

»

глиифибрилляр.лш кислым белком (ГФКБ).

• Впервые определено, что аутологичная сыворотка больных I обладает способностью . усиливать спонтанный синтч иммуноглобулинов,но угнетает их продукцию, стимулированную М. Кроме того в присутствии аутосыворотки нарушается синтез üilO-a.

Лзучещш комплекса секре тируемых мононуклеара периферической крови цитокинов позволило впервые установи изменение его профиля. Высокая спонтанная продукция WI сопровождается его накоплением в сыворотке больных Iffl. Кроме тс установлена повышенная стимулированная . ЛПС продукция Неполученные результаты,характеризующие секрецию цитокинов. г

. МЗ,позволили установить существование достоверной' корреляционной связи мозду уровнем стимулировашюй ЛПС продукции ИЛ-6 и количеством плазматических клеток костного мозга больных.

Практическая ценность работы.

Полученные в работе результаты имеют важное значение для понимания закономерностей нарушения . функции

иммупоглобулинсинтезирующих . клеток, что является ценным для раскрытия механизмов эткопатогенеза изученных патологий.

'выявлеште тесной связи между продукцией ИЛ-6 in vitro, его содержанием в сыворотке и наличием плазматических клеток в костном мозге больных, а также с их клшшческщл состоянием позволяет рекомендовать определение уровня ИЛ-6,как важного диагностического показателя,' в гематологической клинике. i

Полученные доказательства участия иммунной системы в развитии БА могут явиться основанием для дальнейших исследований, с целью определения возможности применения в лечении этих больных иммунсмодуляторов.

Публикация результатов исследования и апробация роботы.

По теме диссертационной работы опубликовано 3 работы. Результаты исследований доложены и обсуждены на совместной научной конференцш кафедры иммунологии и отдела иммунологии МЛК Р17Я (1992). , ■

Объем и структура диссертации.

Работа излажена на ПЗ страницах машинописного. текста, содержит 5 рисунков и 15 таблиц. Описок литературы включает 216 источников,' из которых 26 отечостгешшх и 19(3 иностранных.

-6:

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и иетода исследования.

В' работо использованы МНПК 20 здоровых доноров (возраст 29,3 лет), 39 больных МБ (возраст 66,1 лет), 15 больных БА (возраст 64,4 года). 12 больных МИД (возраст 66,2 лет).

Для получения фракции мононуклеоров из венозной крови использовали центрифугирование в одноступенчатом градиенте ' "Fiooll-Paque" .(Pharmaoia) по мэтоду Boyura (1968).

Культивирование МНПК (0,5x10® кл/мл для оценки пролиферации, 1x10® кл/мл для оценки продукции иммуноглобулинов, 0,2 мл/лунку) проводилось в круглодонных 96-луночных планшетах "interMed" (nunc) _ в среде rpmi 1640 с добавлением 10% сыворотки плода коровы, 2 мМ L-глютамина, 10 wM Гепес-буфера, БхЮ""& М 2-меркаптозтанола и 50 мкг/мл гентамицш.а. Клетки культивировали при 37° с в атмосфере Б2 С02. В опытные лунки добавляли МЛ (0,25 мкг/мл), ФГА (5 мкг/мл). Для изучения специфического пролиферативного ответа к МНПК больных БА в луцки добавляли ОБМ (50 мкг/мл),,ГФКБ (20 мкг/мл).

Для определения продукции цитокинбв по I мл МППК в концентрации IxIO6 кл/мл вносили в лунки 24-луночных планшетов "Nuncion Delta". В клеточные культуры добавляли 5 мкг/мл ЛПС е.coil штамм oii:B4 и инкубировали 24 часа в тех же условиях.

Для изучения влияния аутологичной сыворотки на продукцию

--—.. ..........д---

иммуноглобулинов in vitro больных МБ клетки (1x10 кл/мл, I мл/проб.) культивировали в к.'углодонных пробирках "шио". Количество свежей вутосиворотки и контрольной 4 AB группы крови здоровых доноров составляло 20$ от объема культуры. Для удаления фоновых иммуноглобулине)?, синороток клетки через 24 часа, отмывали 3 раза средой, .после . чего -' культивировали "ото .7 г.гок.

Оценка пролифератйвной активности клеток проводилась путем внесения за 6 чосон до окончания'"' 72-часового • культивирования .в

лугаш по I мкКюри 3Н-тимидина. Микрокультуры переносили на фильтры GPB и измеряли уровень включения метки на счетчике ^-сцинтилляций. Индекс стимуляции определяли по формуле ИС= (имп/мин. о митогеном) (имп/мин. без митогена).

Определение проекции иммуноглобулинов в 8-суточных культурах МНПК in vitro проводили с помощью твердофазного неконкурентного двухцэнтрового ишунофермэнтного анализа (Voller А. et al.,1976). Индекс стимуляции ' определяли по формуле ИС= (продукция иммуноглобулинов с митогеном) (продукция иммуноглобулинов • без митогена).

Оценку активности ИЛ-1 проводили с использованием клеток мышиного ИЛ-1 чувствительного антигенспецифического Т-хелперного клона ^.10,G4.1 (Kurt-Jones Е.А. et al.,1985).

Для определения активности ИЛ-6 использовали клетки ИЛ-6 чувствительной гетерогибридош D6.C8 (Клшненкова E.H., 1991).

Оценку продукции ФНО-а проводили с помощью твердофазного двухсайтового ' иммуноферментного анализа, ум энного авидин-биотгаювым взаимодействием (Оганезов В.К. о соавт.,1991).

Для определения популяций и субпопуляций лимфоцитов использовали моноклональные антитела (МкАТ) к антигенам CD2, CD3, CD20, CD4, CM (Ortho Diagnostic). Процентное содержание меток, связавшихся с определенным МкАТ, определяли на проточном цитофлуориметре Epios с.

Реакции Е и ЕАС-розеткообразования проводили по общепринятым методам (Петров Р.В. с соавт.,1976).

Определение уровня сывороточных иммуноглобулинов проводилось методом радиальной иммунодиффузии в геле (Manchini G. et al.,1965).

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью критерия t и непараметрических критериев Манна-Уипш,

Сгшрмена, точного матода Фишера.

Результаты работы и их обсуждение.

I.О.Продукция ммлуноглобуличов и пролиферхтивный ответ МНПК здоровы? доноров.При изучении уровней спонташюй и индуцированной МЛ ПРОДУКЦИИ иммуноглобулинов in vitro МНПК 15 здоровых доноров били получены следующие результаты (табл. I).

Таблица Ш. Продукция igo, igA, igM МНПК здоровых доноров

(иг/мл).

спонтшшая" —

продукция МЛ HC

IgA 154±63 392±I48* 3,9t2,0

IgM 10R±I17 4Ь9*24У* 4.0^2,5

IgG 237±I34 . 532±265* 3.3±I,5

*рГоТ05 ™ 1 ' ~

Отметим, что МЛ в различной степени стимулировал продукцию иммуноглобулинов рапных классов. Полученные значения продукции после стимуляции митогеном достоверно отличались по сравнению с уровнем спонташюй продукции.

Сопоставление уровней продукции иммуноглобулинов трех классов у отдельных доноров между собой выявило достоверную корреляционную связь между ними, как в случае спонташюй продукции, так и в случаи стимулированной митогоном. По нашему мнению это говорит о существовании сбалансированности синтеза иммуноглобулинов каждого и:', определяемых классов, т.о. количество иммуноглобулинов одного класса у отдельного донора тесно связано с количеством других классов, что свидетельствует об одинаковой степени ra'VimnrciûiHHocTH iU!tvr«K. оинтогшрупцих разные классы

Таблица :'й. Спонтанная и ипдуцироваимя ФГЛ и !М

пролифорптивпая активность в культуре МНПК здоровых доноров

(cpm/min).

сутки • спонтанно ФГА ИС МЛ ИС

3 I054±34L? 98486-48I7I 96¿29 42923^10255 48-14

4 1854-923 * - 49453¿I4995* 35-20

5 5337±2597 * - 50510^14113 13-9

*р<0,05

Изучение данных пролиферативного ответа показывает, что ФГА обладает значительно более выражению.! стимулирующим эффектом на МНПК здоровых допоров по сравнению с МЛ (ИС 96 и 48). Кроме того увелич-нио сроков культивирования приводит к увеличению спонтанной пролиферации ' и индуцированной ГИЛ. Увеличение спонтанной пролиферации оказалось достоверным на 4 сутки по сравнению с з и на 5 сутки по сравнению с 4. В отличио от этого стимулированная пролиферация достоверно увеличивалась только на 4' су^ки по сравнению с 3 и не'■ различалась между 5 сутками

культивировать. ¿ .

Таким образом.с учетом приведенных результатов можно считать оптимальным сроком'культивирования клеток для изуче!шя ответа на МЛ, принимая во внимание макет,1шльный индекс .'стимуляции на это время, ■ 72 часа. Эти данные совпадают' с . дагшыми литературы, показывающей оптимальный уровень' .'пролиферации. на. 3-5 . сутки (Власенко Р.Я.,1989). '. . V '

Анализ существования- зависимости между стимулированными МЛ продукцией 'иммуноглобулинов и пролифератившм ответом показал. отсутствие такой достоверной корреляционной связи.

3.0.Уровень иллупоглобулинов ,in ■ vivo и продукция'

иллунослайултюЬ in vitro ШШК больных лиелолной болезнью. Данные

кол/'-ю ствышого определения классов и типов. иммуноглобулинов я^ляптсл важнейшими показателями при моноклоналышх гаммапатиях (Черновестона Е.В. ,1984). В таблице 3 приведены данные такого определения у 12 человек с множественной миеломой ige типа.

.Таблица Х2>.Сывороточные уровни IgG,IgA;IgM больных MB luv/%).

группы IgA Ig« IgG

доноры (n=3G) 2I3±2I 158-30 1240^50

больные (п=12) 46-33* II—4* 2990^-910*

*р<0.05

В/дао, что при значительном повышении уровня igG, то есть моногслзнального иммуноглобулина количество igA и igH резко снижено.

Снежа уровней сывороточных иммуноглобулинов представляет собсй интегральную характеристику их продукции и деградации, поэтому для оценки непосредственно иммуноглобулинсинтезируицей Функции В-лкмфоцитов необходимо прямое изучение ее in vitro. В

Таблица Jp4. Продукция in vitro IgA, IgM, IgG (нг/мл) МНПК больных миеломной болезнью.

спонтанная проду!«цйя ~ индуцированная МЛ группы -;-:-i-—-:-

IgA IgM IgG IgA IgM IgG

доноры 154±63 I86-117 237-143 392±I48 459-249 532±265

больные 133±78 59-29* 188-102 253-101 615-301 657-376

ИС-доноры 3,4-2,0 4,0±2,5 3,3-1(5

ИО-больные 5,I±3,3 4,4-2,1 3,5-1,6

<0,01

тиолгло 4 приведены результаты спонтанной и' МЛ-Ш1Дуцированно{

нродузсщгн нммуноглобулпюв MHRK больных 13.

При сопоставлении полученных результата с данными контроля не удалось выявить сущастввшшх аэивиешШ й способности отвечать на МЛ. Единственное достоверно значимо® изменение состояло в сшгаашга спонтанного синтеза igM клеткзж! больных. Таким образом при сниженном уровне ггазуноглобулинов в еаворотке их продукция in vitro практически оказалась мало подаеркзниоЗ измвне/тям.

3.0. Пролифсрсшвтй сг.бегг L'MK, яямулированных ФГЛ и ил' у бальных L'B.f.toiioiiyittaорпне платки Оолшсг МБ имели заметно более (Изгсгй уровень пролиферации, стимулзрованной митогенами по сравнена» с контрольной группой» тогда как спонтанная ороляфзратпвиал ак'ппзгость оказалась без изменений. При этом репрессия пролкфэратИЕНого ответа пз Ш.была более выражена (40% &!■ уровня контроля), чем на ЗГА (50% от уровня контроля) (тзбл.5).

Сшг-nmo пролкферативного ответа лимфоцитов у больных -КБ отмечалась многими авторш®. В качестве его возможных причин

Таблица £5. Пролпфератшягй ответ МНПК больных МБ в MC.

группа ФГА ЕЯ

доноры 96-29 48*14

больные 45-23* 16*5*

*р<0.01

рассматривались различные нарушения иммунокомпетонтнкх клеток, в том число связанные с недостаточностью хелперн '. функции cd4+ лимфоцитов (Oken U.U. et al.,1981).Поскольку нарушения регуляции игамунного ответ» обычно связывают с активностью функционально обособленных субпопуляций., лимфоцитов, мы изучили их количественный сост;щ у больных МБ (Таб.6). .

-12- . -

Полученные методом проточной цитофлуорометрпи результаты выявили выраженный субпопуляционшй дисбаланс лимфоцитов периферической крови у больных МБ. Общее • количества Т- ' и В-лимфоцитов оказалось не. измененным, что совпадает с данными литаратуры (Boooardo Ы. et al. ,1988).В то see время- процент CD4+

Табл1ща йЗ.Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови больных KfB.

- -группы CD2 CD20 CD4 CD8 CD4/CD8 CD38

больные - 67-5 14*7 25*6* 41*10 1* 0,7*0,29* 24*14*

доноры 70-5 10*3 36*1,3 28*0, 9 1.4*0,07 13*1

* р<0,05

клеток. был 'резке снижен, a CD8+ повышен. Индекс отношения этих двух- субпопуляций 'инвертирован в- сторону резкого снижения. По-видимому, механизмы супрессии, проявляемой в снижении пролифератив'но'го потенциала клеток'; могут, быть связаны как со снижением количества CD4+. клеток- и' вероятным нарушением их функции, так'и с■увеличением количества супрессорных субпопуляций лимфоцитов. В то же время увеличение числа клеток, несущих антиген CD38,. который по 'Некоторым данным необходим для процессов активации Т^лимфоцитов и nk-клеток (Funaro A. et al.,1990), может-свидетельствовать', о нарушении процессов активации "лимфоцитов больных МБ. ■"■.••..-'

4.0.Влияние ' аутологичной сыйордаоки ш-'. продукцию иллуиоглобулинов. in vitro МНПК Сольют МБ. Установленная нами

разница, между -сниженным количеством'иммуноглобулинов в сыворотке больных и измененным лишь . в небольшой • степени . ' у pi -:i«m шмуноглобулшюг. in vi'tro -г-.аптаьило -нас „ предположить, что Г.оа\ижно одной иг,, причин -таких расхождений яелястся изменение

условий пребывания :слетс;с, так как но учитывается возможное действие аутосыворотки.

Для исключения искажающего влияш?я фона сывороточных иммуноглобулинов, был введен дополнительный этап промежуточной отмывки для их максшалыюго удалешя.

Таблица Ш. Продукция Iда МНПК больных Ж в условиях

культивирования с добавлением аутологичной и АВ 4 здоровых доноров'

сывороток.

группы спонтанно МЛ аут.-с. аут.-с.+МЛ ЛВ АВ+МЛ

больные(п=15) 7-4* 45^27* 10±6& 42-39 12±4& 21*11*

доноры(п=6) 29±31 18-21 33-29' 40-28 19-10 48-41"

ИС-больше 2,3-2, 5 2,1-1,0 1,8*1,3*

ИС-доноры 0,7-0, 6 1,1*0,3 2,6—2 ,2

х«л

больные(п=15) 40-23 62^31' 110*74* 129±87* 30±18 37*21

. доноры(ц=6) 18±12 23±32 36±203' . 40±52& 39*9 55-19"

ИС-больные 1,3±0 ,5 0,95-0,4 1,5-0,7

ИС-доноры 1,2-1 ,3 1,0*0,6 1,5-0,6'

18! г»

больные<п=15) 69-34 144-79- 833*543*®;9615*252*&<э 73-53 57-35

доноры(п-6) 63-38 59±27 159±34&<э 213±66&"9 37-12 48*8'

ИС-больные . 1,5-0 .4 1,0*0,3& о,б±о;з*&

ИС-доноры 1,2-0 ,8 1,1-0,3 1,3-0,4

Примечания * - достоверное различие по сравнен со здоровыми донорами; * - (точка) достоверное различие по сравнению с продукцией <Зоз митогена; ' & - достоверное различие с соответствующим уровнем продукции без сыворотки; а - достоверное рзг-лвчие с продукцией 1гри добаплешт .контрольной сыворотки.

'.тимулировпнная . МЛ 'продукция иммуноглобулинов у здоровых

доноров не отличалась достоверно от уровня спонтанной продукции, а для igM она была даже ниже хотя п но достоверно. Добавление аутосыЁоротки привело к достоверному увеличении уровня определяемых igG, igA. Количество igM, продуцируемого ¡слетками в присутствии аутосыворотки не отличалось от просто спонтанной продукции, но при совместном культив1гровашш с аутосывороткой и МЛ уровень igrj достоверно повышался по отнойзнш к синтезу без аутосыворотки. Вместе с тем для всех трех классов иммуноглобулинов не было определено достоверной разницы иэзду продукцией их в присутствии аутосыворотки• я аутосыворотки, вместе с МЛ, т.е. митоген не мог индуцировать сйнтоз иммуноглобулинов.

При добавлеюш контрольной сиаоротки уровень сштоза иммуноглобулинов клетками стаыулироааннш! МЛ напротив был достоверно вшга, чем баз кгтогена для IgG, ig/.-, igu. Контрольная сыворотка здоровых допоров явилась нстовдйси дополнительных активирущих влияний, что. позволило при с ИВ

добиться усилештя синтеза я^здноглобулпион.

Клетки больных в тех со условия культивирования ишда заметные отличия в продукций иммуноглобулинов. Оказалось, что спонтанная продукция igu по огоэаеиию к продукции здоровых доноров тагакэ снижена, как и при обыч:шх условиях культивирова(шя (7-4 и 29^31). В присутствии митогеяа метки продуцировали достоверно более высокий уровень иммуноглобудшнов для всех трех классов. Добавление аутосыворотки больных привело к достоверному увеличению количества иммуноглобулинов, причем салоэ заметное увеличение в 12 раз было для ige.

Ранее было показано, что шфзияти в присутствии иммуноглобулинов способны абсорбировав i'ga « 'IgA (Kuinagai 1- et al.,1975), что в данном случае могло приводить к искажению результатов. Вместе с тем ■ при ' сотстпьимых ' уровнях

кдлуноглобулгаюв в контрольной сыворотке !! сыворотке больных, которое приведет к одинаковой абсорбции, изменешю их количества в процессе культивироввния позволит сделать вывод об их разных количествах в опыте иг в контроле. 13 из 15 изучавшихся в данном жсперименте больных имели да-секретирующуга шелому, и лишь 2 [вловека 1ел-мяелому, т.е. большинство имели в сыворотке избыток Остальные гслассы иммуноглобулинов как известно меньше по содержанию или сравнимы с их уровнем у здоровых людей.

Сравнение о контрольной сывороткой показало, что ое добавление не приводит к увеличению да и хва и их количество не отличалось от продукции иммуноглобулинов без сыворотки. Синтез в присутствии контрольной сыворотки был сравним в уровнем синтеза в присутствии аутосыворотют и . был достоверно выше спонтанного синтеза.

Таким образом если учесть сравнимы" уровень в контрольной сыворотке и примерно один уровень их абсорбции, то достоверное увеличение продукции в присутствии аутосыворотки мозпет

свидетельствовать в пользу наличия1 в ней активности, усиливающей синтез иммуноглобулинов.

Сравнение продукции иммуноглобулинов в присутствии сывороток и МЛ 'с продукцией без ШГ выявило другое свойство аутосыворотки. Оказалось, что МЛ в присутствии аутосыворотки не способен индуцировать синтез да и 1&А, что проявилось в отсутствии достоверных различий мевду их продукцией с добавлением аутосыворотки и аутосыворотки вместе с МЛ. Индекс стимуляции для Продукции да с яутосывороткой бил достоверно меньше, чем без сыворотки (1,0 и 1,5).

Видимо совпадение стимулирующих возможностей аутосыворотки и МЛ . при их одновременном . сочетании- приводит к угнетению Функционального состояния иммуноглобулин-синтозируппих клеток.

Таким образом мо:;ско заключить, что с ирис;.' тствии аутосывороткк клетки больных не способны адекватно отвечать на активирующее влияние митогена.

б.О.Продущия цшоатюв ШШК болышх МБ.Спонтанная продукция Ш1-6 ШШК болышх достоверно превышала аналогичный показатель групры сравнения (соответственно 4345*588 ВД/мл и 1841*214 ЕД/мл). Отличие ДПС-стимулированной продукции ИЛ-6 ШШК болышх МБ от аналогичного показателя группы сравнения ■ не достигало математически достоверного уровня.. Сывороточные урошга .ИЛ-6-болышх. с высокой достоверностью (р<0,001) превысили активность дашюго цитокина в сыворотке людей группы сравнения (313*35 ЕД/мл и 87*16 ЕД/мл). Важно, что' была выявлена достоверная, корреляционная связь между уровне.« ДПС-стюлулароваиной проду1сщщ ИЛ-6 МНПК болышх и количеством плазматических' ¡слеток в костном мозге.

Изменение• продукции ИЛ-I при МБ имело характер обратный изменению продукции ИЛ-6. ЛПС-стимулировашюя продукция ИЛ-1 достоверно превышала аналогичны!! показатель группы сравнения (792*156 МЕ/мл и 278*66 МЕ/мл). Отличие спонтанной продукции ИЛ-1 МППК болышх МБ от контрольного показателя группы сравнения но .. достигала математически достоверного уров!щ.

' При сравнении' • спонтанной и ЛПС-стимулированной продукции ФНО-а МНПКi а также сывороточного урозня данного цитокина в груше больных МБ и группе сравнения достоверных изменений выявлено но было, что совпадает с результатами . Pisa' Р.с соавтора;,®, I9S0.

При изучении профилей продукции цитокинов у болышх' № и здоровых доноров с использованием коэффициента ранговой корреляции Спирмена были выявлены следующие счпткстически. достоверные корреляционные связи. В группе кия ' (р=0,9) - между

ЛПС-стимулированной продукцией ИЛ-1 а) ЛПС-стимулированной'

продукцией ФНО-а, б) сыЕоротсчтгм уровнем №0-« . у 'больных MS (р>0,7) а) между ЛПС-стимулированной продукцией ИЛ-1 и МЛ-6: 0) между спонтанной продукцией ИЛ-1 и ИЛ-6; в) между спонтанной и ЛПС-стимулированной продукцией ФНО-а.

Получешше результаты, в том числе изменение профиля продуцируемых цитокииов у большие КБ свидетельствуют о присухой этому заболеванию активации пула периферических .клеток кровл, активно продуцирующих цитокшш. Наши собственные данное' подтвердили через демонстрацию вовлечения з патологический процесс но только клеток костного мозга, но и •' периферических иммунокомпетентшж клеток получешше ранее доказательство о существовании иммунорегуляторного цитокинового каскада при МБ, включа;яцего 'в себя ИЛ-1 и ФНО-а, которые усиливают ИЛ-6-опосрвдованнуго пролиферацию кколомных клеток (Carter л. et al.,1990).

При изучении влияния аутосыворотки больных МБ на продукцию ФНО-а оказалось, что секреция данного цитокина стимулированная JL1C в присутствии аутосыворотки, была ш~::э чем .стимулировагппя только ЛПС, хотя и не достоверно, и достигала математически значимого меньшего уровня , чем стимулирования ЛПС продукция в присутствии контрольной сыворотки (табл.8).Если считать, что контрольная

Таблица ¿22.Влияние аутосыворотки больных МБ на продукцию ФНО-а.

спонтанно аут.-с. 4АВ ЛПС йут.-с.+ЛПС ■•¡ЛйьЧпС

нг/мл 92-48 75-30 102*39 229*123 225*119 258*91

'АС - 2,6 2,2*1,2* 3,2-1,0

Примечания: * - р<0,05 (по сравнекг.» с 4АВ+ЛПС)

сыворотка здоровых доноров обладает свойством усиливать продукции

ФНО-а, то можно сказать, что аутосыворотка не обладает таким качеством. То есть in vivo, где клетки находятся постоянно в сывороточной среде, продукция фно-а ингибируется.

б.О.Уровень иллуноглобулияов in vivo (сыворотка) и продукция идлуноглобулшов in vitro МИШ, стилулированньии И, у болыаа'БА. Нами.было проводено изучение содержания IgG, IgA, IgH в сыворотке

Таблица J69.Содержание igA, igfi, iga в сыворотке больных БА (мг/Ж).

группы • IgA IgM IgG

БА (п=12) 331±77* 160±55 I48I±I9I*

доноры (п=30) 213-21 158-30 I240±50

* - р<0,01

больных БА (табл.9). Изучешю атих'данных показало, что у больных БА имеется достоверно значимое повышение уровня igA и iga,

Таблица МО. Продукция igA, IgM, IgG МНПК больных МИД и БА (нг/мл).

спонтанная продукция 1шдуцировшшая МЛ

IgA IgM IgG IgA . IgM IgG-

МВД(п=10) 34I-I79*& 52±29* 296^136 342-113 I24iI25e&444±I83&

БА(п=12) I32±97 39-19* I00'±35* 6I0±245 967±443& 780-243

доноры(п=15)154—63 186^117 237-135 392^148 459-249 532±266

ис-мид 1,07-0,4 *&I,6^0,8*&I,4-0,6&

ИС-БА 9,2-5,2 28,5±I3,2*8,7±2,6*

КС-доноры 3,9±2,0 4,0-2,5 З^.б .

Примечания: * - различия достоверны по отноаеюпо к здоровым донорам; & - различия достоверны lio отношению к больным БА.

свидетельствующее о цоликлональной активации

шмуноглобулин-синтезпруквдх клеток. Уровень iga оказался в продолах нормальных значений. Сопоставление этях результатов, с данными поликлонального синтеза иммуноглобулинов in vitro МНПК, индуцированных МЛ выявило сводную картину изменений (табл.Ю).

Спонтанный уровень продукции xgs и- i£g был достоверно снижен. " Наоборот - стимулированная митогеном продукция Tgi оказалась достоверно повышенной (967*443 и 459*249). При сопоставлении ИС особенно четко видна как бы высокая функциональная "раздражимость"' пммуноглобулин-синтезирующих клеток для всех fpes классов иммуноглобулинов: Для igM например КС. составил 28^5» что в 7 раз выше соответствующего показателя для здоровых ло:юров. Такое • расхондение в уровнях спонтанного и стимулирозаппого синтеза позволяет расценивать его как эквиваленгтое извесгсгсму пр'Л данной патологии повышенному синтезу аутоантител (Бадаляп Л.0. ,1931) '

В качестве одновозрастноД групгш контроля »3. зюпо.'ьзовали больных гад, что было обусловлено наличием одинаковой г:лп::!ческоЯ • картины, но другими причинами» вызывающими демепгсса» тагкми как атеросклероз и гипертензия.

Спонтанная продукция igA У больных МИД оказалась достоверно повышенной по сравнению со спонтанной продукцпоЯ этого класса иммуноглобулина клетками как здоровых доноров, так :s Сольных БА. Был зафиксирован одинакого rarsrntft уровень споятзяпей продукции igM как и у больных БА, спонатнная продукция %,%<3 оказалась неизменненой. Поело стимуляции митогеном ШЗН больных МВД не смогли адекватно отвечать усилением продукции иммуноглобулинов. По сравнению с аналогичными показателями здоровых д .аров оказалась. сниженной продукция IgA, IgM. По сравнению с болышкд БА оказалась сниженной продукция всех трех классов иммуноглобулинов. Полученные результаты убедительно доказывают существование выраженных - различий между изучаемыми двумя формами дсмегщий. Эти различия по

наше.му мнению могут бить связана с различным г.."Тогене;<ом отж двух

Э.0.Проли/;крал1ивная активность МНПК больных , БА, ■стмж'л^ровсписая ФГА и ПЛ.В таблице Ш1 представлены данные прсд^ергтивпого ответа МНПК больных БА.

Пролпфора'тиЕная способность мононуклеарных клеток больных БА оказалась значительно снижена, что проявилось но только в ее ■низке,V. уровне после стимуляции поликлональными активаторами, но и г достоверно более низком уровне спонтанной пролифорг: да! клеток.

Тг.блица ЛИ. Про лифе ративная активность МНПК болышх МВД и БА.

группы спопташю ФГА ИС МЛ ИС

м:щп=ю) '308*57* 13522*10195* 40*22 * 4 406*3322в&12*5

БА(п---Э) '42S-I32* 21244^11065'" 51*27*1126344039*27*10"

доноры ('П-1 5) 1054*343 58486*48171 96*29 42923*10255 48*14

■Примечания: * - различия достоверны (р<0,05) по сравиетт со здоровыми донорами; & - различия достоверны (р<0,05) по сравнению с ЕА.

Необходимо отметить, что абсолютныв значения пролиферативного ответа били пике, чем аналогичные показатели у больных МБ. Но индекса стимуляции у зтих двух категорий больных имели обратные различия. Если . для ФГА они были практически одинаковы (соответственно МБ - 48, БА - 51), то для МЛ индекс стимуляции для БА -был выше, 'чем для МБ (соответственно 26 и 16). Такое расхождение мезэду ИС двух патологий молено косвенно свйзать. с продукцией иммуноглобулинов in vitro. Не смотря на то, что мы не нашли корреляционных связей, между уровнем включения тимидина и синтезом иммуноглобулинов у больных БА, также как и у больных МБ и у здоровых доноров, отчетливо • просматривается при качественной оцетгее результатов параллель между депрессией спонтанного уровня

тс.?луноглобулшов и пролкферативной активности МНПК. С другой сторона способность отвечать па стцляцяи Ш выраженная в ПС била . вше у больных с повывешшм синтезом иммуноглобулинов, т.е. при ЕА.

Пролкферативный ответ больных ЩД на МЛ оказался достоверно более низкшл по срашешта с группой больных БА.В данном случае сникента ответа на МЛ совпадало как при пршаферативном ответе, так и при продукции иммуноглобулинов, хотя мы и не' смогли* определить достоверной математической зависимости мевду данными параметрами. •'

Таблица УЛ2. Пролифератившй ответ МНПК больных БА на ОБМ и ГФКБ (opra/min).

группы спонтанно ОБМ ИС ГФКБ же-

БА(п=20) 2657*257* 5391*570* 1,8*0,2* 3436*685 1,6*0,4*

доноры<п= -30 ) 3023*424 3409*312 1,1*0,1 3867*647 1,1*0,2

* p<0,0S

Кзучешм результатов антигенспецифического пролиферативного ответа ШПК больных БА показало, что пролиферативюй ответ на ОБМ оказался достоверно более высоким по сравнению со здоровыми доиорвмз (таблЛ2). Такте достиг математически значимого уровня ИС для этого антигена. Пролиферативный ответ на ГФКБ такта окЬзался пс-вииои, хотя и пэ достоверно. Достоверный уровень различий был опредолон только для. сответствующего значения ИС. Наличие сенсибилизации к мозгоспецифическим белкам, а более правильно говорить в данном случае даже не о сенсибилизации, а о появлении ответа на эти антигены, поскольку у здоровых доноров на них не было ответа, может рассматриваться как своеобразный, маркер текущего аутоиммунного процесса.

Таким образом получены прямые доказательства того, что иммунная система больных БА формирует ответ на собственные белки, в данном случае на нейроспецифлческие антигены. По-видимому, одним из важных моментов в развитии БА следует считать потерю мозгом своего иммунологически привелегированного положения, что является прямым следствием его дегенеративного поражения.

Таблица JH3, Субпопуляционный . состав лимфоцитов периферической крови больных БА.

группы Е-РОК EAC-POK CD3 CD4 CDS CD4/CD8

БА(п=12) 68,2-6,4 13,2-3,5 79,2±6,7 36.4*3,7 33.3±4.7*1,1±0,2* доноры(п=30)68,3-1,4 13,7±0,1 78,1±6,6 36,7±1,3 28,0±0,9 1,4*0,07

* р<0,05

Количество Т- и В-лж.фоцитов, а также сС4+ клеток у больных .БА было соответствующим аналогичным контрольным показателям (табл.13). Содержание ош+ лимфоцитов было достоверно большим, чем • в контроле, что привело к достоверному уменьшению холперно-супрессорного соотношения. По сравнению с больными МБ эти показатели были значительно менее подвержены изменениям • (соответственно CD4+ - 36,4 и 25,0;сш+ - 33,3 и 41,0; CD4/CD8 -1,1 и 0,7). Такое умеренное снижение числа CD8+ клеток и хелперно-супрессорного индекса может соответствовать аутоиммунному процессу, хотя чаще при аутоиммунной патологии имеется более выраженное• повышение CD4+ клеток и снижение CD8+ • клеток (Чередеев А.Н.,1989).

вывода.

I.Спонтанная продукция in vitro igu подвержена наибольшим , изменениям и снижена при всех изученных в работе

иммунопатологических состояниях.

2.Индуцированная митогеном лаконоса продукция . иммуноглобулинов in vitro изменяется по-разному: при миеломной болезни она сохранена на уровне контроля, при болезни Альцгеймера достоверно повышена продукция ige, igM, при мультиинфарктной : деменции снижена продукция всех классов иммуноглобулинов.. Эти изменения соответствуют уровням сывороточных иммуноглобулинов только при болезни Альцгеймера, где повыиено содержание igA и ige.'

' З.Пролиферативный ответ .лимфоцитов на фитогемагглютшшн и митоген лаконоса снижен у всех изучавшихся в работе категорий больных. Ни в одном случае не было выявлено достоверной корреляционной связи между продукцией iöa, igu, ige и пролиферативной активностью, хотя более сильное снижение ответа на • митоген лаконоса. было у больных с мультиинфарктной демёнцией со снижением индуцированной им продукции иммуноглобулинов.

I

4.Для пролифоративного ответа . лимфоцитов при болезш' Альцгеймера характерно его достоверное повышенна после стимуляции нейроспецифическими антигенами общим белком миелина и глиофибриллярным кислым белком.

б.Аутологичная сыворотка больных миелоМной болезнью усиливает спонтанную продукцию igA, I so собственными лимфоцитами, но в ее присутствии митоген лаконоса не способен адекватно индуцировать синтез иммуноглобулинов. Также аутосыворотка снижает стимулированную ЛПС продукцию Ш>-е» ЕШПК болышх миеломной болезнью.

6.При миеломной болезни изменяется профиль секратируемых цитокииов. Достоверно повышена спонтанная продукция ШГ-6, стимулировашгая ЛПС продукция tlff-I. Уровень ШГ-6 в сыворотке также достоверно повышается. Существует достоверная корреляционная связь между уровнем спонтанной продукции ИЯ-6 МНПК и степенью

плазматкзации костного мозга.

Список работ,опубликованных по теме диссертации, I.Копылов Л.Е., Ковал1 гук Л.В., 'Степаненко Р.Н., Голенк'ов А.К.,

» I

Назарова И.Н. Сравнение цролифоративной и иммуноглобулин секретирующей способности лимфоцитов периферической крови здоровых людей и больных с B-клеточным шмунопролкферативным заболеванием // Бюлл.аксл.биол.мед. - 1991. - №12. - С.627-628. •З.Бадалян Л.О., Гроппа С.А., Козальчук Л.В., Копылов А.Е., Степаненко Р.Н., "Зойко А.Н. Особешости иммунологического статуса больных болезнью Альцгеймера. // Хурн.невропатол.пскэтттр, им.Корсакова. - 1992. в печати.

3.Копылов А.Е., Гроппа С.А. Болезнь ! тьцгеКмора, иммунитет и старение.// Хурн.невропатол.псжиатр. пм.Корсакогэ. 1992. в печати.

4.0ганозов В.К., Копылов А.Е., Ковальчук Л.В., Степаненко Р.И., Голе ков А.К.,- Назарова i/i.H., Клшяаккова E.H., 1лногин Б.В. Продукция некоторых цитокинов при миеломе.// Иммунология. - 1992. в печати.

Подписано к печати Iß.06.92 г. Тираж 100, зак. 510 Типография МЮ РФ