Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Цитокины в онкогематологии

од

На правах рукописи

ГРАЧЕВА Людмила Александровна

ЦИТОКИНЫ В ОНКОГЕМАТОЛОГИИ

14.00.29 - гематология и переливание крови 14.00.36 - иммунология и аллергология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва - 1997

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте детской гематологии Минздравмедпрома Российской Федерации (директор - академик РАЕН, доктор медицинских наук, профессор А.Г.Румянцев) и Научно-исследовательском институте клинической кардиологии им. А.Л.Мясникова кардиологического научного центра РАМН (директор - член-корр. РАМН, доктор медицинских наук, профессор Ю.Н.Беленков).

Научные консультанты:

академик РАЕН, доктор мед.наук, профессор Румянцев А.Г. доктор мед.наук Осипов С.Г.

Официальные оппоненты:

член-корр. РАЕН, доктор мед.наук, профессор Ковальчук Л.В. член-корр. РАМН, доктор мед.наук, профессор Козлов В.А. доктор мед. наук, профессор Аграненко В.А.

Ведущее учреждение:

г. Москва, Институт иммунологии Министерства Здравоохранения РФ.

Защита диссертации состоится 1997 г. на заседании дис-

сертационного совета Д.084.61.01. в НИИ детской гематологии Минздравмедпрома Российской Федерации по адресу: 117513, Москва, Ленинский пр-т, 117.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ детской гематологии

Автореферат разослан "«¡¿^ " г.

Ученый секретарь диссертационного

совета Д.084.61.01

доктор мед.наук, профессор,

Заслуженный врач РФ А.Е.Бухны

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Проблема цитокинов (ЦТ) - новое актуальное направление медицинской науки, что обусловлено их ведущим значением в регуляции иммунной системы, участием в патогенезе заболеваний, а также в их перспективном терапевтическом потенциале.

Значение цитокинов в норме и патологии, а также их роль в лечении заболеваний интенсивно изучается отечественными и зарубежными исследователями (Кетлинский С.А.,1992 г.; Владимирская Е.Б., 1994 г.; Долгина E.H., 1994 г.; Ко-вальчук Л.В., 1995 г.; Махонова JI.A., 1995 г.; Balkwill F.R.,1989 г.; Bendtzen К.,1994 г.; Howard M., 1993 г.; Goto M., 1994 г.; Colombo М.В., 1995 г.; Kleitman R.J., 1995г.и др.).

Цитокины - это низкомолекулярные белковые вещества, продуцируемые клетками, эндогенные регуляторы всех звеньев иммунной системы. Способность цитокинов регулировать пролиферацию, дифференцировку, функции и апоптоз клеток обусловлена тем, что после взаимодействия с комплементарными рецепторами к ним на поверхности клеток, сигнал через элементы внутриклеточной трансдукции передается в ядро, где активируются соответствующие данным цитокинам гены. Белки, продукты активированных цитокином генов, секрети-руются клетками и регулируют перечисленные выше процессы (Hall M.J., 1991 г.; Bendtzen К.,1994 г.; Heike Т., 1994 г.; Fmbloom D.S., 1995 г.; Lee J.D., 1995 г.; Bosco М.С., 1995 г.).

В условиях нормального организма цитокины действуют местно, их уровни повышаются в очаге проникновения инфекта. Значительно увеличиваются уровни так называемых провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-6, ГМ-КСФ, ФНО-а) в сыворотке крови при выраженных воспалительных процессах, при многих инфекционных, аутоиммунных и других заболеваниях. В высоких концентрациях они действуют системно, токсичны, являются эндогенными пироге-нами, медиаторами септического и эндотоксического шока, вызывают кахексию, играют роль в патогенезе и осложнениях различных заболеваний (Кетлинский С.А.,1992 г.; Потапнев М.П., 1994 г.; Hall M..!.. 1991 г.; Bendtzen К.,1994 г.; Kubonishi Ich., 1995 г. и др.).

Патогенетическую роль играет также понижение или генетический дефект продукции цитокинов. Генетический дефект продукции ИФН- у установлен у-больных рассеянным склерозом, очаговой склеродермией, вегето-сосудистой дистонией по гипертоническому типу, т.е. при заболеваниях, сопровождающихся иммунорегуляторным дисбалансом (Чекнев С.Б., 1993 г.; Чекнев С.Б., 1994 г.; Kolits J.E., 1985 г.; Barcellim W., 1988 г. и др.).

Злокачественные поражения лимфоидных тканей и большинство гемоблас-тозов развиваются из клеток основных продуцентов и/или потребителей цитокинов. Гены цитокинов активируются при хромосомных аберрациях и при ретровирусных инфекциях, в результате чего опухолевые клетки конститутивно продуцируют ЦТ, которые ауто- и паракринно стимулируют их пролиферацию и активируют антиапоптозные факторы (Loten J., 1989 г.; Hall M.J., 1991 г.; Kishimoto Т., 1992 г.; Knauf W.U., 1995 г.; Rook А.Н., 1995 г.; Lu J., 1995 г.; Renauld J.Ch., 1995 г.; Antoni В.А., 1995 г.).

С другой стороны, нарушение продукции цитокинов, возникающее при опухолевом росте, приводит к нарушению цитокиновой регуляции иммунной системы у онкогематологических больных (Tendier C.L., 1994 г.). Больные с опухолевыми процессами в иммунной системе с ведущим иммунопролиферативным синдромом входят в группу риска по иммунодефицитному состоянию среди населения (Хаитов P.M., 1995 г.). Поэтому особенно важную роль цитокины играют в реализации различных этапов патогенеза этих заболеваний (Shadendorf J., 1994 г.; Knauf W.U., 1995 г.; FordR., 1995г.).

Исследование механизма действия цитокинов и участия их в патогенезе заболеваний открывает возможности для использования препаратов на их основе для лечения ряда заболеваний, особенно опухолевых заболеваний иммунной системы (Tsutsumi Y., 1994 г.; Schmidt-Wolf G.D., 1995 г.; Kleitman R.J., 1995 г.).

Экспериментальные и клинические направления в изучении проблемы цитокинов являются актуальными, так как нам представляется, что разработка методов лечения больных опухолевыми заболеваниями иммунной системы с применением препаратов на основе цитокинов увеличит возможности коррекции патогенеза и в значительной мере будет определять прогресс в терапии этих патологий.

Интенсификация химиотерапевтнческих методов лечения онкогематологиче-ских заболеваний приводит к усугублению побочных эффектов терапии: имму-носупрессии, аплазии кроветворения и инфекционных осложнений, нередко приводящих к гибели больных в периоде полной ремиссии (Ковалева Л.Г., 1992 г.; Джонс Т.С., 1993 г.; Buchner Th., 1994 г. и др.).

В настоящее время цитокины представляют высокоспецифические вещества для терапевтического воздействия, с помощью которых можно устранять побочные эффекты полихимиотерапип.

Иммунотерапия является наиболее физиологическим методом лечения, стимулирующим на борьбу с неопластическим процессом естественные силы организма.

Разработка способов и средств направленной иммунокоррекции является одной из ключевых проблем клинической иммунологии. Поэтому, несомненный интерес представляет изучение применения ЦТ для устранения нарушений функций иммунной системы и специфической стимуляции противоопухолевого иммунитета, в частности, естественных киллерных и Т-клеток у больных.

Среди возможных иммунокорректоров был выбран интерлейкин-2, как ци-токнн, влияющий практически на все клеточные функции иммунитета. Понимание особенностей механизма действия интерлейкина-2 на иммуноциты здоровых лиц и больных с иммунодефицитным состоянием открывает возможности его применения с лечебной целью.

Таким образом, роль ЦТ в патогенезе лейкозов не вызывает сомнений, однако, многие стороны этой сложной проблемы остаются неясными, в частности, не изучен вопрос об индивидуализации лечения отдельных групп больных онкогематологическими заболеваниями, что в итоге приводит к неудовлетворительным результатам лечения и может быть устранено применением препаратов на основе цитокинов.

Значение цитокинов в патологии и использование препаратов на их основе как лечебных средств, нашло отражение, главным образом, в отдельных разрозненных журнальных публикациях, нередко недоступных для широкого круга врачей, иммунологов, гематологов.

В связи с этим мы представляем настоящую монографию, которая включает результаты собственных исследований и современные литературные данные

по проблеме цитокинов, освещает анализ функций цитокинов, значение их в патогенезе и лечении ряда заболеваний, в том числе онкогематологических. Данная монография определяет перспективы дальнейшей разработки патогенеза и новых эффективных методов терапии различных заболеваний, включая коррекцию нарушений иммунитета применением препаратов на основе цитокинов.

Цель работы

Сравнительное изучение нарушений иммунитета и роли цитокинов в патогенезе и лечении неопухолевых (ишемическая болезнь сердца, дилятационная кардиомиопатия) и опухолевых заболеваний иммунной системы.

Анализ иммунологического обоснования применения цитокинов при онкогематологических заболеваниях.

Задачи исследования

1. Изучить состояние клеточного звена иммунитета при ряде неонкологических заболеваний (ишемическая болезнь сердца (ИБС), дилятационная кардиомиопатия (ДКМП).

2. Изучить состояние специфического противоопухолевого клеточного иммунитета при опухолевых заболеваниях иммунной системы.

3. Сопоставить нарушения иммунной системы при ряде неонкологических (ИБС, ДКМП) и онкогематологических заболеваний.

4. Провести сравнительную оценку влияния ИЛ-2 на функции Т- и ЕК-клеток здоровых лиц, неонкологаческих и онкогематологических больных. Изучить возможность коррекции цитокинами нарушений функций иммунокомпе-тентных клеток.

5. Изучить возможность отмены интерлейкином -2 действия ингибирующих факторов на функциональную активность иммунокомпетентных клеток.

6. Обобщить собственные и литературные данные и установить роль и место цитокинов в патогенезе и лечении ряда неопухолевых и опухолевых заболеваний иммунной системы.

7. Разработать показания лечебного применения цитокинов на основе иммунологических параметров при неопухолевых заболеваниях и опухолевых заболеваниях иммунной системы.

Научная новизна и теоретическая значимость

- Впервые показана универсальная роль цитокинов в патогенезе неопухолевых заболеваний и опухолевых заболеваний иммунной системы и возможность коррекции иммунодефицитных состояний препаратами на основе цитокинов.

- Показано участие цитокинов в формировании патогенеза ряда неонкологических заболеваний (ИБС, ДКМП).

- Впервые проведен анализ собственных и обобщенных литературных данных на клеточном, молекулярном и геномном уровнях и установлено важное значение цитокинов в патогенезе онкогематологических заболеваний.

- Установлена аналогичность нарушений функций иммунной системы (понижение функций Т-клеточного звена иммунитета и уменьшение естественной цитотоксичности) при ряде неопухолевых (ИБС, ДКМП) и опухолевых заболеваниях иммунной системы.

- Впервые проведена сравнительная оценка влияния рекомбинантного интер-лейкина-2 на функции пммуноцитов здоровых лиц и больных с иммунодефи-цитным состоянием. Обнаружено, что интерлейкин-2 не только повышает функциональную активность Т- лимфоцитов и ЕК- клеток, но и отменяет действие ингибирующих факторов.

- Сравнительный анализ активирующего влияния интерлейкина-2 на пролиферацию Т - лимфоцитов , индуцированную разными дозами митогена показал, что наиболее выраженное действие интерлейкин-2 проявлял при стимуляции Т-лимфоцитов субоптимальными дозами митогена.

- Выявлена зависимость выраженности активирующего действия интерлей-кина -2 на функции иммуноцитов от исходного уровня активности клеток.

- Охарактеризовано нарушение цитокиновой регуляции иммунной системы, представлено клинико-лабораторное обоснование терапевтического применения препаратов на основе цитокинов, критерии их эффективности и преимущества в сравнении с обычными химиотерапевтическими методами при терапии онкогематологических заболеваний.

- Проанализированы методы профилактики с помощью цитокинов осложнений полихимиотерапии; определены обязательные условия применения препаратов на основе цитокинов при лечении онкогематологических заболеваний на фоне интенсивной химиотерапии.

Практическая значимость работы

- Определение уровней цитокинов в сыворотке крови больных служит дополнительным диагностическим и прогностическим критерием, позволяет уточнять патогенез заболевания, более четко ориентироваться в интерпретации лабораторных и клинических данных, своевременно принимать решение о назначении цитокиновой терапии.

- Показано, что состояние иммунной системы играет существенную роль в патогенезе и лечении заболеваний, в том числе гемобластозов. Обнаруженное участие цитокинов в патогенезе заболеваний и возможность коррекции отдельных звеньев патогенеза и нарушений иммунитета препаратами на основе цитокинов открывает возможности применения новых методов терапии.

- Рекомендуется применение ИЛ-2 для коррекции однотипных иммунодефи-цитных состояний при ряде неопухолевых заболеваний и опухолевых заболеваний иммунной системы.

- В диссертации представлены экспериментальные и клинические обоснования для терапевтического использования препаратов на основе цитокинов.

- На основе представленных в работе данных выработаны рекомендации для лечебного применения цитокинов при неопухолевых заболеваниях и опухолевых заболеваниях иммунной системы.

- Данные о способности интерлейкина -2 стимулировать функции Т- и ЕК-клеток иммунодефицитных больных и отменять действие ингибирующих факторов уточняют представления о механизмах действия интерлейкина-2 на клеточное звено иммунитета.

- Сравнительный анализ естественной цитотоксичности здоровых лиц и больных с иммунодефицитным состоянием позволил установить компенсаторное повышение интерферона- альфа при понижении активности ЕК- клеток, что позволяет рекомендовать применение интерферона для повышения естественной цитотоксичности.

- Предложен способ блокады пролиферации неопластических клеток путем нейтрализации цитокинов положительного контроля пролиферации опухолевых клеток с помощью антител к ним или к их рецепторам.

- Наши исследования показали необходимость разработки отечественного производства лечебных препаратов на основе цитокинов.

Внедрение результатов работы в практику

Обосновано внедрение методов определения уровней цитокинов в сыворотке крови больных опухолевыми заболеваниями иммунной системы в гематологических отделениях НИИ детской гематологиии РФ и онкогематологических отделениях Республиканской детской клинической больницы РФ.

Основные положения работы имеют определенное значение для обоснования и планирования дальнейших научных исследований по изучению роли цитокинов в патогенезе и терапии онкогематологических заболеваний.

Данная монография представляет теоретический и практический интерес для научных сотрудников, иммунологов и врачей-гематологов.

Апробации работы

Основные положения работы обсуждались на 1-ом Всесоюзном съезде иммунологов (Сочи, 15-17ноября 1989г.), на 12-ом Европейском конгрессе иммунологов (Барселона, 14-17 июня 1994 г.), на совместной научной конференции клинических и лабораторных отделов НИИ детской гематологии Минздрава РФ и Республиканской детской клинической больницы РФ и в изданной монографии "Цитокины в онкогематологии".

Структура н объем диссертации

Диссертация представлена в виде монографии, изложена на 168 печатных страницах и иллюстрирована 12 таблицами и 4 рисунками. Состоит из предисловия и шести глав, посвященных: функциям и метаболизму цитокинов; участию цитокинов г патогенезе неонкологических и онкогематологических заболевании; терапевтическому потенциалу цитокинов (собственные клиниче-

ские данные и данные литературы); заключения и указателя использованной литературы. Список литературы включает 350 источников (70 отечественных и 280 зарубежных).

Работа выполнена в лаборатории контроля иммунного ответа НИИ детской гематологии Минздрава РФ и в лаборатории клинической иммунологии НИИ клинической кардиологии им. А.Л.Мясникова КНЦ РАМН.

Положения, выносимые на защиту

- Цитокины играют важную роль в реализации различных этапов патогенеза онкогематологических заболеваний и онкологических заболеваний лимфоид-ной ткани.

- Анализ изучения нарушений иммунитета и коррекции с помощью цитоки-нов патогенетических звеньев заболеваний и функций иммунной системы позволил выявить определенный терапевтический потенциал препаратов на основе цитокинов при ряде заболеваний.

- При неопухолевых заболеваниях (ИБС, ДКМП) выявлены нарушения функций иммунной системы (снижение функций Т-клеточного звена иммунитета и ЕЦТ), которые корригируются применением ИЛ-2.

- ИЛ-2 аналогично корригирует однотипные нарушения функций иммунной системы (понижение функций Т-клеточного звена иммунитета и естественной цитотоксичности) при неонкологических и онкогематологических заболеваниях.

- Терапевтический потенциал препаратов на основе цитокинов при онкогематологических заболеваниях заключается в возможности: коррекции нарушений иммунной системы и усилении противоопухолевого иммунитета; блоке пролиферации опухолевых клеток; активации гемопоэза.

- Показания применения цитокинов при лечении заболеваний, в том числе онкогематологических.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы собственных исследований

Нами была обследована кровь 358 человек, из них 72 здоровых лиц, 205 неонкологических больных - 164 ишемической болезнью сердца (ИБС) в возрасте 27 -54 года и 41 дилятационной кардиомиопатией (ДКМП) в возасте от 17 до 57 лет и 71 больного острым лейкозом, в возрасте 2-15 лет.

Диагноз хронической ИБС устанавливали на основании критериев ВОЗ по данным клинических, электрокардиографических и инструментальных методов исследования, включая велоэргометрию (ВЭМ). Оценка функционального класса стенокардии проводилась на основании данных исследований: ВЭМ, чреспищеводноп стимуляции, суточного мониторирования. У части больных коронарный атеросклероз был подтвержден при проведении селективной коро-нарографии.

Диагноз ДКМП ставили на основании данных анамнеза и клинического обследования при наличии кардиомегалии и дилятации полостей сердца по данным рентгенографического и эхокардиографического исследований. При этом исключали такие заболевания, как ишемическая болезнь сердца, пороки сердца, артериальная гипертония, повреждение миокарда при эндокринных и системных заболеваниях, болезни перикарда. У 16 больных диагноз был подтвержден с помощью вентрикулографии или коронарографии с биопсией миокарда, у 3 больных на аутопсии. Недостаточность кровообращения (по классификации ЫУНА) I класса обнаружена у 3, II - 13, III - 10 и IV у 15 больных.

Указанные труппы неонкологических больных были нами выбраны вследствие установленного участия нарушений иммунной системы в патогенезе этих патологий.

Диагноз острый лейкоз был установлен на основании наличия основных симптомов острого лейкоза : интоксикации (у 69 больных), лихорадке (у 44), бледность кожных покровов (у 58), кровоизлияния на коже слизистых (у 39), боли в костях (у 21), увеличение периферических лимфатических узлов (у 54), печени (у 60), и селезенки (у 56 больных). В стационар дети поступали с развернутыми клинико-гематологическими проявлениями болезни. Количество лей-

коцитов и содержание бластных клеток в периферической крови, а также количество лейкозных клеток в костном мозге больных варьировало в широких пределах (таблица 1).

Таблица I

Количество лейкоцитов и лейкозных клеток в периферической крови и костном мозге детей, больных острым лейкозом.

Периферическая кровь Лейкоциты (в тыс.) Бласты (в %)

<3 3-10 10- 30- >100 30 100 8 24 29 8 2 <10 10-30 30-70 70-100 10 37 18 6

Количество больных

Костный мозг Бласты (в %)

20-50 50-80 80-100

Количество больных 4 13 54

Распределение больных по полу, возрасту и клеточным вариантам было типичным для детских острых лейкозов.

После установления диагноза "острый лейкоз" больным назначалась анти-лейкозная терапия, проводимая до полной ремиссии. В периоде ремиссии больные получали поддерживающую химиотерапию.

Характеристика методов исследования

Для изучения функций иммунной системы применяли следующие методы:

1. Спонтанную и митоген-индуцированную пролиферацию мононуклеаров периферической крови человека изучали in vitro с помощью микромодификации метода бласттрансформации с радиоизотопным способом учета реакции (Хоробых В.В., 1983 г.).

Прилипающие клетки удаляли инкубацией на пластиковых чашках Петри в течение 1 часа при 37° С.' Неприлипающие клетки ресуспендировали в полной культуральной среде RPMY 1640 ("Flow Labs"), с 2 Mm L-глютамина ("Merk"),

10% эмбриональной сыворотки теленка ("Flow Labs"), 10 Mm Hepes ("Flow Labs") и 50 мкг/млгеитамицина, доводя концентрацию клеток до 1 х 106в 1 мл.

Пролиферативный ответ лимфоцитов оценивали по включению 3Н-тимидина. Лимфоциты вносили в лунки плоскодонных микроплат ("Titertek") в конечной концентрации 1 х 106 клеток в 1 мл среды и стимулировали конкана-валином А (Кон-А) ("Flow Labs") в субоптимальной дозе (1 мкг/мл).

Клетки инкубировали 72 часа при 37° С во влажной атмосфере с 5% СОг. За 4 часа до окончания инкубации в лунки вносили 0,5 мк Ки 3Н-тимидина. После осаждения лимфоцитов на миллипоровых фильтрах с помощью автоматического сборщика клеток "Titertek Cell Harvester-500" ("Flow"), подсчитывали интенсивность включения 3Н-тимиднна на жидкостном сцинтиляционном счетчике "1215 Rackbeta 11" (LKB-Wallak).

Для индукции пролиферации лимфоцитов использовали также Т-митоген ФГА (Difco М).

2. Естественную циготоксичность лимфоцитов оценивали в 4-х часовом мик-роцитотоксическом тесте с использованием в качестве мишеней клетки эритромиелоидной линии К-562, меченных 51Сг (Александрова E.H., 1989 г.).

В качестве клеток-мишеней использовали также аллогенные криоконсерви-рованные властные клетки, полученные от 5 больных острым лимфолейкозом (ОЛЛ) до начала терапии. Лейкоцитоз у этих больных превышал 30000 в 1 мм3 крови и количество лимфобластов превышало 85%. Все доноры клеток-мишеней имели 0(1)КЬ-положительную группу крови.

К лейкоцитарной массе, полученной после отстаивания в течении 1 часа при комнатной температуре гепаринизированной крови, добавляли криопротек-тор - диметилсульфоксид, в конечной концентрации 7-10%. После 30-минутной экспозиции клеточную суспензию разливали в стерильные пробирки объемом 1 мл. Замораживание проводили в камере программного замораживания со скоростью 1°/мин до -40°С, затем 5°/мин до -80°С и далее 20°/мин до -120°С. После этого пробирки помещали в бункер с жидким азотом (до -196°С). Размораживали лейкозные клетки в день постановки реакции в водяной бане при +40°С в течение 70 секунд.

При проведении реакции с криоконсервированными властными клетками были выбраны оптимальные условия проведения реакции: время инкубации 107

клеток-мишеней равное 2 часам с 200-250 мкКи 51Сг и соотношение эффектор : мишень, равное 100 : 1.

1-5 х 10б клеток линии К-562 инкубировали в 0,3 мл полной среды ЯРМГ 1640 с 100 мк Ки ЫагСгОд в течение 1 часа при 37° С, трижды отмывали и ресуспен-дировали в культуральной среде, доводя концентрацию клеток до 1 х 106 в 1 мл. В лунки 11-образных микроплат ("1Чипк") вносили по 0,1 мл суспензии лимфоцитов и меченых клеток-мишеней в соотношении эффектор : мишень, равном 40 : 1. Смесь клеток инкубировали 4 часа при 37° С во влажной камере с 5% СО2, осаждали центрифугированием и 0,1 мл супернатанта удаляли из лунок для измерения радиоактивности на гамма-счетчике ЬКВ. ЕЦТ лимфоцитов определяли по высвобождению 51Сг из лизированных клеток-мишеней К-562 или криоконсервированных лейкозных клеток в инкубационную среду. ЕЦТ высчитывали по формуле:

кол-во имп./мин. в надосадочной жидкости

ЕЦТ =...............—--------------------------------------------------х 100%

кол-во имп./мин. в надосадочной жидкости + кол-во имп./мин. в осадке

3. Реакцию торможения миграции лейкоцитов проводили капиллярным методом (Новиков Д.К., 1976 г.). Клетки инкубировали 20 часов при температуре 31°С. Лимфоциты стимулировали ФГА в дозе 5 мкг/мл. Учет реакции производили на приборе "Пикоскель".

4. При постановке кожной реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) применяли лейкозный и нормальный лейкоцитарный экстракты, полученные по методу Bull D.M. (1973 г.).

5. Субпопуляции лимфоцитов, экспрессирующие антигены CD3, CD4, CDs, CDií, (ЕК-клетки, гранулоциты, макрофаги (Fcy R III) и ОКМ1 (моноциты, ЕК-клетки) идентифицировали методом непрямой иммунофлюоресценции, с помощью коммерческих моноклональных антител серий BMA (фирмы "Behring". ФРГ) и ОКТ (фирмы "Orto Diagnostic" США), согласно рекомендациям фирм-изготовителей. Для подсчета флюоресцирующих клеток использовали люми-нисцентный микроскоп фирмы "Leitz" ФРГ, а также подсчет субпопуляций

лимфоцитов осуществляли с помощью проточного цитофлюоримстра (FACS-11 "Becton-Dickenson", США).

6. Концентрацию сывороточного ИФН- а определяли по методу J.Campbell, 1976 г.

7. Концентрацию ИЛ-2 определяли с помощью радиоизотопного набора фирмы "Amerscham" Англия. Концентрацию (3-2 микроглобулина и неоптерина определяли радиоиммунологическим методом с использованием коммерческих наборов (соответственно "Pharmacia" Швеция и DRG США).

Мононуклеарные клетки выделяли из гепаринизированной венозной крови в градиенте плотности фиколл-гипака по методу (Boyum А., 1966 г.).

Нами было изучено влияние ИЛ-2 (Yskra) с активностью 10 7 ед/1мг белка и ИФН- а на функциональную активность лимфоцитов и ЕК-клеток периферической крови.

Для статистической обработки использовались общепринятые методы математической статистики, основанные на вычислении критерия Стьюдента. За достоверность принимали отличия при р < 0,05 .

Результаты собственных исследований

Наши исследования касались изучения влияния ИЛ-2 на функции иммуно-компетентных клеток здоровых лиц, сравнительного изучения функций иммунной системы и коррекции ИЛ-2 нарушений иммунитета при ряде псонколо-гических (ИБС, ДКМП) и онкогематологических заболеваниях.

1. Действие ИЛ-2 на функциональную активность Т-ЛФ и EIC-клеток периферической крови здоровых лиц.

При изучении влияния ИЛ-2 на митоген-индуцированную бласттрансфор-мацию лимфоцитов были получены следующие результаты: ИЛ-2 дозозависимо усиливал митоген-индуцированную пролиферацию ЛФ здоровых лиц. При этом, ИЛ-2 проявлял свое влияние более выраженно при активации ЛФ субоптимальными дозами митогена (таблица 2).

Таблица 2

Увеличение митоген-индуцированной пролиферации лимфоцитов здоровых лиц под влиянием ИЛ-2 (30 ед/мл).

Кол-во распадов в минуту (ОРМ), п=40

Спонт. пролиф. Кон-А 0.5мкг/мл Кон-А 0.5+ИЛ-2 Кон-А 1 мкг/мл Кон-А 1.0+ИЛ-2 Кон-А 5мкг/мл Кон-А 5.0+ИЛ-2

2.376 + 0.196 20.216 + 1.369 68.314 + 5.143 43.342 + 3.236 71.714 + 4.383 118.224 + 9.819 129.871+ 18.132

Р <0.05 <0.05 >0.05

Влияние ИЛ-2 выражали в процентах по отношению к контролю (уровню пролиферативного ответа клеток на Кон-А в отсутствии ИЛ-2).

Процент усиления включения Н3-тимидина в лимфоциты под влиянием ИЛ-2 рассчитывали по формуле:

процент БРМ (Кон-А+ИЛ-2)-БРМ Кон-А

=--------------------------------------------------------------X 100%

усиления ЭРМ Кон-А - ОРМ спонт.прол.

где БРМ - число распадов в минуту (включение Н3-тимидина в пролиферирующих клеток).

При разных концентрациях Кон-А процент усиления пролиферации ИЛ-2 в среднем составлял:

0.5 мкг/мл Кон-А - 217% 1.0 мкг/мл Кон-а - 65% 5.0 мкг/мл Кон-а - 7%

Процент усиления в ответ на ИЛ-2 пролиферации ЛФ, стимулированных субоптимальными концентрациями митогена Кон-А, был значительно выше, чем процент усиления пролиферации ЛФ стимулированных оптимальной концентрацией митогена, при которой ИЛ-2 своего действия почти не проявлял.

ДНК ЛФ на

Это объясняется тем,что большие концентрации митогенов приводят к максимальной активации ЛФ, максимальной выработке ими ИЛ-2 и наиболее выраженной бласттрансформации ЛФ. Вследствие этого, экзогеннно добавленный ИЛ-2 не усиливает пролиферативный ответ ЛФ, что подтвердили наши исследования содержания ИЛ-2 в опытных лунках с помощью радиоиммунологического метода. ИЛ-2 определяли через 20 часов (период наибольшей продукции лимфоцитами ИЛ-2 при стимуляции митогеном). При добавлении к клеткам 0.5; 1.0; 2.5 мкг/мл Кон-А и 1.0 ФГА, концентрация ИЛ-2 в клеточных культурах была в среднем 60-73 рй/мл, при концентрации Кон-А 5,0 мкг/мл составила 198 р^мл, при добавлении ФГА 5.0 и 10.0 мкг/мл, концентрация ИЛ-2 была от 124 до 235 р^мл.

ИЛ-2 дозозависимо усиливал спонтанную пролиферацию мононуклеаров периферической крови и естественную цитотоксичность здоровых доноров (см. ниже подпункт 4).

Кроме того, мы установили, что ИЛ-2 способен отменять ингибицию пролиферации ЛФ, вызванную ингибирующими факторами (таблица 3). В качестве ингибитора пролиферации ЛФ мы использовали ЛПНП, выделенные методом дифференциального ультрацентрифугирования из сыворотки крови здорового донора (Грачева Л.А., 1986 г.).

Таблица 3

Отмена ИЛ-2 ингибирующего действия ЛПНП на пролиферацию ЛФ __ст! I м улид о в а н н ы х К он - А._

% прироста (+) или снижения (-) пролиферации ЛФ

Группы обследованных ИЛ-2 100 ед/мл ЛПНП 40 мкг/мл ЛПНП+ИЛ-2

Больные ИБС (п=20) +342+7.1 -38.0+5.1 + 19.5+2.1

Больные ДКМП (п=21) +31.8+6.2 -29.4+4.3 +21.3+3.8

Здоровые лица (п=20) +65.2+11.4 -21.6+3.1 +29.3+3.8

Р1 <0.05 <0.05

Р2 <0.01

Р1 - достоверность различий С1ш.:улг.щш ИЛ-2 или ингибиции ЛПНП пролиферации ЛФ на Кон-А.

Р2 - достоверность различий о : пени ИЛ-2 ингнбицин пролиферации ЛФ под влиянием ЛПНП.

Как видно из таблицы 3, ИЛ-2 отменял ингибирующее действие ЛПНП на пролиферативный ответ ЛФ, стимулированных Кон-А (1 мкг/мл) и здоровых лиц и больных обеих групп.

Эти данные, полученные нами в отношении отмены интерлейкином-2 влияния ингибирующих факторов на пролиферацию лимфоцитов, подтверждаются данными литературы. О.БсЬок и соавторы в 1996 г. показали, что ИЛ-2 отменяет ингибицию пролиферации и анергию периферических мононукпеаров ВИЧ-1 инфицированных больных, вызванную ИЛ-10, усиленно продуцируемого моноцитами больных. Р. Мог и соавторы в 1996 г. показали отмену интерлейкином-2 апоптоза АГ-специфических Т-лимфоцитов, вызванного радиотерапией и дексаметазоном у больных. Данный эффект ИЛ-2 коррелировал с индукцией гена Ъс1-2 в АГ-специфических Т-лимфоцитах.

Значение результатов исследований влияния ИЛ-2 на иммунокомпетентные клетки здоровых лиц заключается в том, что подробное изучение свойств ИЛ-2 позволило проводить много сопоставлений.

2. Нарушение функций иммунной системы у неонкологических больных.

При изучении пролиферативного ответа ЛФ периферической крови больных ДКМП и ИБС на Т-митогены (ФГА и Кон-А) было выявлено снижение функциональной активности лимфоцитов, что проявилось в снижении пролиферации ЛФ в ответ на эти митогены (таблица 4).

Таблица 4

Снижение пролиферативного ответа Т-ЛФ на митогены больных ИБС и ДКМП по сравнению со здоровыми лицами.

Митогены Число] эаспадов в минуту (ОРМ) Дост.разл.

б-ные ДКМП п=41 б-ные ИБС п=164 здоровые п= 32 Р1 Р2

ФГА (5.0 мкг/мл) 55.690+4.932 43.511+5.398 75.503+4.296 <0.05 <0.05

Кон-А (1.0 мкг/мл) 28.187+2.333 32.0.73+3.433 46.342+3.236 <0.05 <0.05

Спонт. пролиферация 1.697+643 2.349+719 1.827+343 >0.05 >0.05

Р1 - достоверность различий пролиферативного ответа ЛФ больных ДКМП. Р2 - достоверность различий пролиферативного ответа ЛФ больных ИБС.

Мы разделили больных хронической ИБС на 2 группы : I группа (п =129) -больные с I и II функциональными классами, 2 группа (п = 35) больные с III и IV функциональными классами. При сравнении пролиферативного ответа ЛФ на митоген ФГА в этих группах, мы установили, что снижение пролифера-тивной активности Т-ЛФ было более выражено у больных с III, IV функциональными классами (38.924+1.982) по сравнению с этим же показателем у больных I группы (46.416+2.412, р<0.05). Таким образом, более выраженное снижение пролиферативного ответа Т-ЛФ наблюдали у больных ИБС с тяжелым течением атеросклероза и ИБС.

Наши исследования функциональной активности Т-лимфоцитов больных хронической ИБС показали, что снижение пролиферативной активности Т-клеток сопровождается снижением выработки ими цитокинов. В частности, у больных хронической ИБС происходит угнетение выработки митоген-индуцированными лимфоцитами фактора, тормозящего миграцию лейкоцитов по сравнению со здоровыми лицами (таблица 5).

Таблица 5

Снижение продукции лимфоцитами фактора, тормозящего миграцию лейко-

цитов у больных хронической ИБС по сравнению со здоровыми лицами.

Группы обследованных Процент ингибиции миграции лейкоцитов (ФГА 5 мкг/мл)

Больные ИБС(п=164) 50.61 + 3.13

Здоровые(п=40) 86.50+1.86

достов. различий р < 0.001

Процент ингибиции миграции лейкоцитов высчитывали по формуле: Кк- Ко

% ИМ =.............- X 100% , где

Кк

Кк - число клеток в контроле, мигрировавших в лунку без митогена. Ко - число клеток в опыте, мигрировавших в лунку при добавлении к клеткам митогена.

Как видно из таблицы 5, в тесте торможения миграции лейкоцитов, процент ингибиции миграции лейкоцитов оказался достоверно ниже у больных ИБС.

Эти данные свидетельствуют о том, что на фоне снижения пролиферативной активности лимфоцитов у больных происходит снижение функциональной активности клеток и в отношении продукции цитокинов.

Понижение функций Т-клеток у больных ИБС обусловлено ингибирующим действием повышенного уровня атерогенных липопротеидов в сыворотке крови больных (Грачева JI.A., 1986 г.; Hui D., 1980 г.), а также может быть связано с понижением продукции ИЛ-2, в частности блокаторами кальция, применяемыми для лечения больных этим заболеванием. Показано ( Хараева З.Ф. 1997г. ), что внутриклеточные антагонисты кальция (риосидин) в большей степени угнетают продукцию ИЛ-1 моноцитами периферической крови, чем внеклеточные антагонисты кальция ( этиленгуанинтетрауксусная кислота).

У больных ДКМП со стороны клеточного иммунитета было выявлено также снижение естественной цитотоксичности (ЕЦТ). Уровень ЕЦТ при ДКМП (24.9 + 4.4) был достоверно ниже, чем у здоровых лиц (45.6 + 10.1) - р < 0.02. Приблизительно 50% больных ДКМП имели низкие показатели ЕЦТ (менее 20%). Понижение ЕЦТ сопровождалось понижением содержания клеток с фенотипом CÜ4, понижением соотношения CDi/CDg : с-ыГунщъ-шения содержания CÜ4) и повышением содержания клеток с фенотипом CDi6, а также увеличением уровня Ia-Dr-положительных клеток (таблица 6).

Таблица 6

Изменение клеточных иммунологических показателей у больных ДКМП.

Иммунологические Здоровые Больные ДКМП Р

показатели

CÖ4 52+17 34+16 <0.001

CDi6 9+5 14+15 <0.05

(2-21) (2-54)

IaDr+ 15+8 26+17 <0.05

(2-26) (2-65)

ЕЦТ 40+10 24+4 <0.05

Наряду с установленными сдвигами клеточного иммунитета, нами было выявлено изменение гуморальных показателей: повышение уровня интерферона-а, которое ассоциировалось с повышением серологических маркеров иммунной

активации; увеличением концентрации неоптерина и Р2 микроглобулина в сыворотке крови больных ДКМГТ (таблица 7).

Таблица 7

Повышение уровня ИФН-а. неоптерина. (5-2 микроглобулина у больных ДКМП.

Гуморальные показатели Больные ДКМП (п=41) Здоровые лица (п=22) Р

Неоптерин (норма<9нМ/л) 12.9+4.1 5.6+2.3 <0.05

ИФН-а (норма<12ед/мл) 21.6+4.3 6.8+1.2 <0.05

Р2 микроглобулин (норма<2,4мг/л) 2.54+0.5 0.9+0.3 <0.05

Выявленная нами интерферонемия сопровождалась повышением числа IaDr ' позитивных клеток в крови больных ДКМП, часть которых является активированными Т-ЛФ .

Как показали наши исследования, у больных ДКМП с измененным показателем CD4/CD8, чаще встречались повышение IaDr-Ь клеток, повышение уровня ИФН-а, Р2 микроглобулина и неоптерина, являющихся маркерами активации иммунной системы.

Данные, полученные нами в отношении ЕЦТ и уровня ИФЦ-а в сыворотке крови больных ДКМП соответствуют данным литературы о существовании связи между повышением концентрации ИФН-а в сыворотке крови больных и снижением ЕЦТ лимфоцитов. Повышение уровня ИФН-а объясняется компенсаторным усилением его продукции моноцитами/макрофагами.

Снижение функциональной активности Т-лимфоцитов и ЕК-клеток у больных ДКМП и ИБС может быть связано с недостаточной продукцией ИЛ-2, или с его ингибицией или может быть следствием понижения экспрессии рецепторов или экспрессией низкоафинных рецепторов ИЛ-2 на Т-ЛФ и ЕК-клетках (Lewis С.Е., 1990 г.; Azzoni L., 1995 г.).

3. Нарушение функций иммунной системы при опухолевых заболеваниях иммунной системы.

Анализ ЕЦТ выявил существенное различие реактивности лимфоцитов у больных острым лейкозом и здоровых доноров. В ЕЦТ против криоконсерви-рованных лейкозных клеток положительный ответ был выявлен в 58 % случаев у больных острым лейкозом против 13,3 % у здоровых (р < 0,01), что соответствует литературным данным (Leventhal B.G., 1972 г.; Oldham R.K., 1976 г.).

Величина цитотоксичности лимфоцитов больных варьировала в широких пределах от 35,9 % до 64,4 %, а у здоровых равнялась 37,1- 40,4%.

Однако, при динамическом исследовании цитотоксичность была выявлена только в 39,2 % случаев у больных, что указывает на необходимость сопоставления показателей клеточного иммунитета с течением лейкозного процесса и проводимой терапией.

Анализ ЕЦТ в зависимости от периода заболевания выявил следующие особенности. Как показано на рисунке, цитотоксичность лимфоцитов имеет тенденцию к двухфазности, с увеличением частоты положительных результатов до 50%, к моменту констатации полной ремиссии, и особенно перед рецидивом (75 %), со снижением в период разгара болезни и в еще большей степени на фоне рецидива (10 %). ЕЦТ больных в остром периоде острого лейкоза изучали при нормализации формулы периферической крови на фоне химиотерапии и при наличии бластомного процесса в костном мозге и в экстрамедуллярных очагах. В периоде стабильной ремиссии ЕЦТ наблюдалась у 37,5 % больных.

Повышение ЕЦТ в период индукции ремиссии, по-видимому, опосредованно повышенной антигенной стимуляцией в результате распада большого количества бластных клеток и выхода лейкозассоциированных антигенов.

Наступление рецидива сопряжено с усилением активности иммунных противоопухолевых механизмов, которые мобилизуются для борьбы с наступающей опухолевой прогрессией и, наконец, окончательный перевес последней приводит к депрессии клеточных факторов иммунитета.

80 т

% 40

20

10

70

60 -■

30

50 ■■

0

До начала

Процесс Становление Полная Стабильная Перед Рецидив лечения ремиссии ремиссия полная ре- рецидивом

лечения Острый период

Острый период

миссия

Рис. 1. Частота положительных реакций ЕЦТ и ГЗТ у больных острым лейкозом в зависимости от периода заболевания.

Нами проводилось изучение специфического клеточного иммунитета с помощью кожных тестов на гиперчувствительность замедленного типа к лей-козному и нормальному лейкоцитарным антигенам. В 44 наблюдениях у больных замедленная гиперчувстительность на нормальный лейкоцитарный антиген наблюдалось в 15,9 % случаев и на лейкозный антиген в 31,8 % случаев.

При изучении ГЗТ в динамике заболевания мы установили, что реактивность больных на нормальный лейкоцитарный антиген определялась лишь на фоне индукции ремиссии или в ранние сроки ремиссии, но не выявлялась до начала терапии. Реактивность больных на лейкозный лейкоцитарный антиген также изменялась в динамике заболевания (рисунок 1).

Как видно из рисунка, частота ГЗТ на лейкозный антиген не зависела от проводимой химиотерапии (43,8 %), но была низкой в острый период (25 %) заболевания и еще больше уменьшалась вплоть до полной анергии в период рецидива заболевания. Следовательно, снижение показателей клеточного иммунитета

опосредовано не столько проводимой терапией, сколько иммунодепрессивным действием самого лейкозного процесса.

После химиотерапии на фоне рецидива заболевания наблюдались самые низкие показатели клеточного иммунитета в обеих реакциях, что свидетельствует о том, что интенсивная химиотерапия в остром периоде острого лейкоза усиливает иммунодепрессивное влияние прогрессирующего лейкозного процесса на специфический клеточный иммунитет.

4. Влияние ИЛ-2 на коррекцию функций Т-ЛФ и ЕК- клеток периферической крови неонкологических больных.

Выявленная нами у больных ИБС и ДКМП супрессия Т-клеточного звена иммунитета и понижение ЕЦТ могут быть преодалены с помощью ИЛ-2, который, как известно, является фактором положительного контроля пролиферации Т-ЛФ и ЕК-клеток и активирует их (Вошбю^з У.А., 1994 г., СЬакгаЬоПу А., 1994 г.). Поэтому нами использовался ИЛ-2 для коррекции функций Т- и ЕК-клеток больных.

При изучении влияния ИЛ-2 на митоген-индуцированную бласттрансфор-мацию лимфоцитов были получены следующие результаты: ИЛ-2 дозозависимо усиливал митоген-индуцированную пролиферацию ЛФ больных обеих групп (рисунок 2).

-больные ДКМП, ИБС

ИНДЕКС СТИМУЛЯЦИИ

Кон-А

Кон-А+ИЛ-2

II - здоровые лица

ИНДЕКС СТИМУЛЯЦИИ

140

120 • ■ " 100 ■■ 80 ■• 60 •■

20 ■ ■

о —I—--—I--

Кон-А Кон-А+ИЛ-2

* Р<0.05 - по сравнению с пролиферативным объемом Т-ЛФ на митоген

Рис.2. Увеличение пролифератиеного ответа митогеп-стимулированных ЛФ периферической крови больных ИБС, ДКМП и здоровых лиц на ИЛ-2.

Увеличение интерлейкином -2 пролиферации Кон-А - стимулированных лимфоцитов здоровых лиц и больных объясняется прямым митогенным эф-

фектом ИЛ-2 на Т- лимфоциты, а также может быть связано с тем, что интер-лейкин- 2 и интерферон- гамма усиливают способность углеводраспознающих рецепторов взаимодействовать с лигандами (Хараева З.Ф. 1997г.).

При изучении в сравнительном аспекте стимулирующего действия ИЛ-2 на естественную цитотоксичность лимфоцитов периферической крови больных ДКМП и здоровых лиц было выявлено, что ИЛ-2 вызывал дозозависимое усиление ЕЦТ у больных ДКМП и здоровых лиц (рисунок 3). При этом, наиболее выраженное действие на ЕК-клетки ИЛ-2 оказывал в концентрациях, превышающих в 10 раз те, которые усиливали пролиферацию ЛФ.

ЕЦТ

Дозы ИЛ-2

Рис. 3, Дозозависимое усиление естественной цитотоксичности под влиянием ИЛ-2 у больных ДКМП и здоровых лиц.

Добавление 500 ед. ИЛ-2 в культуру клеток сопровождалось повышением ЕЦТ с 45.б± 12.7 до 65.4 ±7.2 % (р<0.02) у здоровых; и с 24.9±4.4 до 42.7 ± 11.4% (р<0.05) у больных ДКМП (рисунок 4).

Больные ДКМП

ЕЦТ

60 50

40 I

10

О ]-1-1—-1--

+ ИЛ-2

Здоровые лица

ЕЦТ

во

50___

40 30 20 10

О -------

+ИЛ-2

* - Р<0.05 - по сравнению с контрольной группой

Рис. 4. Усиление естественной цитотоксичпости под влиянием ИЛ-2 у больных ДКМП и здоровых лиц.

Таким образом, наши исследования показали, что в присутствии ИЛ-2 цито-литическая активность ЕК-клеток при ДКМП возрастала в среднем до нормального уровня ЕЦТ, не стимулированной ИЛ-2 здоровых лиц, но была достоверно ниже соответствующего показателя в контрольной группе. Необходимо отметить, что ответ ЕК-клеток зависел от исходного уровня ЕЦТ. У тех больных, у которых были выше показатели ЕЦТ (> 30%), мы наблюдали более выраженную активацию ЕЦТ. У здоровых лиц стимулирующее действие ИЛ-2 на ЕЦТ было более выражено, чем у больных.

Механизм терапевтического влияния ИЛ-2 на ЕК-клетки обусловлен усилением продукции ИФН-у и других ЦТ ЕК-клегками, повышением продукции цитотоксического фактора, повышением пролиферации ЕК-клеток и экспрессии ИЛ-2 рецепторов на них, усилением кинетики лизиса клеток-мишеней клетками фенотипа CDi6, в результате чего ЕК-клетки прямо лизируют неопластические и вирус-инфицированные клетки (Naume В., 1994 г.; Angulo I., 1995 г.).

Кроме того, нами установлено in vitro дозозависимое увеличение интерлей-кином-2 спонтанной пролиферации мононуклеаров периферической крови больных обеих групп и здоровых лиц (рисунок 5).

20 -г-18 - -16 - ■ 14 - ■ 12 -10 -В - • 6 - -4 - -2 - • о 4—

спонт. про- спонт. лиф. пролиф

.+ 4 ед./мл ИЛ-2

спонт. спонт.

пролиф. пролиф.

+ 10 ед./мл +20 ед./мл

ИЛ-2 ИЛ-2

спонт. спонт.

пролиф. лропиф.

+ 30 ед./мл + 40 ед./мл

ИЛ-2 ИЛ-2

*- Р<0.05

** Р<0.001 - по сравнению со спонтанной пролиферацией мононуклеаров

Рис. 5. Дозозависимое усиление иптерлейкином-2 спонтанной пролиферации мононуклеаров периферической крови больных ИБС, ДКМП и здоровых лиц.

Данные по усилению спонтанной пролиферации мононуклеаров периферической крови под действием ИЛ-2, полученные in vitro обосновывают терапевтическое применение одного ИЛ-2 без дополнительных активаторов иммунной системы (в частности АГ)> которое будет приводить к усилению активности иммунной системы и противоопухолевого иммунитета, так как спонтанно-

пролиферирующие мононуклеары это потенциальные клетки для осуществления иммунной реакции при их стимуляции in vivo интерлейкином-2.

5. Влияние ИЛ-2 на коррекцию функций Т-ЛФ и ЕК-клеток периферической крови онкогематологическнх больных по сравнению с неонкологическими больными

Особого внимания заслуживают данные наших исследований о возможности коррекции функции ЕК-клеток и Т-ЛФ с помощью ИЛ-2, т.к. ЕК-клетки и Т-ЛФ играют большую роль в противоопухолевом иммунитете.

Как показали результаты наших исследований, понижение ЕЦТ и функции Т-лимфоцитов наблюдается у онкогематологическнх больных. Аналогичные данные получены авторами Lewis С.Е., 1990 г.; Lorensen J., 1991 г.; Chakraborty А., 1994 г. Опухолевые клетки секретируют растворимые факторы (ПГЕг, ТФР-ß, ИЛ-10, ганглиозиды), угнетающие продукцию ИЛ-2 и связывающие или повреждающие его молекулы, ингибируют цитотоксичность ЕК-клеток и генерацию ЛАК-клеток in vitro (Кондратенко И.В., 1992 г.; Lorenzen J., 1991 г.).

Снижение продукции ИЛ-2 выявлено при лимфогранулематозе и у больных после химио-, лучевой и кортикостероидной терапии. Снижение продукции ИФН-у выявлено при синдроме Сезари, ОЛЛ, ХЛЛ, не-Ходжкинских лимфо-мах, СПИДе (Bergmann L., 1995 г.; Rook А.Н, 1995 г.).

Whittingam S. и соавторы (1993 г.) на модели ВЭБ-инфекции in vitro установили, что ИЛ-2 и ИФН-у формируют эффекторные механизмы, направленные на предотвращение пролиферации вирус-ЭБ-инфицированных клеток, а ИЛ-6 и ГМ-КСФ усиливают пролиферацию вирус-управляемых неотрансформиро-ванных клеток.

При онкогематологических заболеваниях снижена, в основном, продукция ИЛ-2 и ИФН-у, формирующих противоопухолевый иммунитет. Нарушения иммунной системы, связанные с отсутствием продукции цитокинов или их ин-гибиции у больных, устраняются применением экзогенных цитокинов.

Экзогенно добавленный ИЛ-2 in vitro и in vivo поддерживает пролиферацию Т-ЛФ, отменяет действие ингибирующих факторов на пролиферацию Т-ЛФ, увеличивает цитотоксичность ЕК-клеток, тем самым восстанавливает дефицит Т- и ЕК-клеточных функций, который наблюдается у онкогематологиче-

ских больных. Таким образом, ИЛ-2 способен восстанавливать сниженную у больных функциональную активность Т- ЛФ и ЕК-клеток (Мицкевич П.Б., 1994 г.; Cheever М.А., 1986 г.; Etlinghausen S.E., 1987 г.).

Авторы Musto Р. и др.(1994 г.) описали случаи спонтанной ремиссии у больного ОМЛ и установили, что большую роль в ее возникновении играли ЕК-клетки (содержание возрастало до 22 %) и ИЛ-2 и ФНО-а, l;¡loCuií ¡с<>го[>их сильно увеличивались у больных в период ремиссии (250 U/ral и 950 pg/ml соответственно; норма < 2 U/ral и 20 pg/ml соответственно).

Данные этих исследований также подтверждают наше заключение о важной роли ИЛ-2 в коррекции нарушений иммунной системы и усилении противоопухолевого иммунитета у онкогематологических больных.

Положительное действие ИЛ-2 может быть использовано для усиления и других показателей противоопухолевого иммунитета:

1. активации Т-хелперов (усиление синтеза В-ЛФ противоопухолевых антител);

2. усиления цитотоксичности моноцитов;

3. генерации лимфокинактивированных клеток. (Кетлинский С.А.,1992 г.; Pohler H.Li.H., 1994г.; Chakraborty А., 1994г.; Schmidt-Wolf G.D., 1995г.; Bosco М.С. 1995г.).

Важное значение имеет усиление интерлейкином-2 противоопухолевой активности мононуклеарных фагоцитов, т.к. фагоцитарные клетки играют большую роль в имунном ответе и осуществляют антимикробную, антипаразитарную и противоопухолевую защиту организма. Установлено, что лица, получающие ИЛ-2 в качестве терапии злокачественных заболеваний, имеют высокий уровень периферических мононуклеарных клеток, несущих рецепторы к ИЛ-2. Среди ИЛ-2 - положительных клеток оказалось 83,7% моноцитов, остальные -лимфоциты. Показано, что обработка моноцитов периферической крови человека in vitro интерлейкином-2 повышает их функциональную активность. Так, в липополисахарид - активированных моноцитах под действием ИЛ-2 увеличивается внутриклеточное содержание активных форм кислорода и повышается продукция моноцитами ПГЕг, тромбоксана В, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, М-КСФ, ГМ-КСФ, ФНО-а, что приводит к возникновению противоопухолевых свойств у моноцитов (Хараева З.Ф.,1997, Malkovsky M., 1987, Bosco М.С.,1995).

Hladik F. и соавторы в 1994 г. исследовали экспрессию генов цитокинов в мононуклеарах периферической крови больных после лечения различными дозами ИЛ-2 и установили, что низкие дозы (30 ООО ЕД) вызывали экспрессию rtiRNA ГМ-КСФ, ИФН-у и ИЛ-2, но не ИЛ-6 и ФНО-а, что сопровождалось благоприятным течением заболевания.

Большие дозы ИЛ-2 (1 ООО ООО ЕД) имели неблагоприятный эффект, что обусловлено значительным повышением экспрессии mRNA ИЛ-2 и мононуклеарах периферической крови и индукцией лимфопении в результате подъема уровня сывороточного растворимого рецептора ИЛ-2, повышением экспрессии mRNA ГМ-КСФ, которое сочеталось с индукцией нейтрофилии и повышением mRNA ИЛ-6 и индукцией повышенного уровня С-реактивного белка. В результате чего авторы заключили, что очень низкие и нетоксичные дозы ИЛ-2 обладают in vivo иммунорегуляторной активностью, приводящей к положительным изменениям в иммунной системе и клинического состояния больных. Это позволило авторам рекомендовать изучение иммуномодулирующего эффекта применения низких доз ИЛ-2 при лечении злокачественных заболеваний (Hughis P.A. 1992г.; Hladik F., 1994г.).

При Не-Хождкинских лимфомах применение низких доз ИЛ-2 в комбинации с B-клеточными специфическими моноклональными антителами (CLB-CD4) приводит к ускорению и удлинению ремиссии (Vlasveld L.T., 1995 г.).

Buchner Th. и соавторы в 1993 г., Bergmann L. и соавторы в 1995 г. изучали применение ИЛ-2 в комплексном лечении ОМЛ. Данные этих авторов подводят к заключению, что инфузия ИЛ-2 может применяться как консолидирующая терапия во вторичной ремиссии при ОМЛ. Meloni G. и соавторы в 1994 г. установили, что применение ИЛ-2 вызывает продолжительную ремиссию у больных ОМЛ с низким уровнем остаточных бластов в костном мозге.

В литературе последних лет появилось много работ по экспериментальному обоснованию и клиническому использованию и других препаратов на основе ЦТ для лечения больных, в том числе онкогематологических.

Изучается возможность использования ФНО для лечения онкогематологических заболеваний. В экспериментальных исследованиях на клетках Meth-A-индуцированной мышиной модели саркомы показано, что усиление противоопухолевого действия ФНО происходит при применении полиэтиленгликоль-

модифицированного ФНО, который имеет больший период полужизни, что удлиняет его период влияния (Tsutsumi Y., 1994 г.).

При сочетании ФНО с адриамицином или цисплатином опухолевые клетки утрачивают резистентность к ФНО (Waltanabe N., 1995 г.).

Повышение уровней ЦТ при онко- и вирусных гематологических заболеваниях имеет диагностическое значение. Уровни провоспалительных ЦТ повышаются при следующих заболеваниях: ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-а - при ВКЛ и СПИДе; ИЛ-3 и ИЛ-6 - при ММ, ИЛ-1, Г-КСФ, ГМ-КСФ - при ОМЛ, ИЛ-1 при ХМЛ и ХЛЛ. Уровни ЦТ (ИЛ-4 - при синдроме Сезари; ИЛ-10 - при ВИЧ-негативных и при Не-Ходжкинских лимфомах) повышаются. Эти ЦТ ингиби-руют синтез ИЛ-2 и ИФН-у, формирующих противовирусный и противоопухолевый иммунитет (Hall M.J., 1991 г.; Knauf W., 1995 г.; Kishimoto Т., 1992 г.; Rook А.Н., 1995 г.). При Т-лимфопролиферативных заболеваниях увеличиваются уровни ЦТ, усиливающих пролиферацию Т-клеток: ИЛ-2 (при Т-клеточных лимфомах), ИЛ-9 (при болезни Ходжкина и тимических лимфмах) (Mc.Kenzic A.N., 1993 г.; Renauld J.Ch., 1995 г.). При В-лимфопролиферативных заболеваниях увеличиваются факторы B-клеток, например, уровень ИЛ-14 определяется в эффузионной жидкости у больных агрессивными B-клеточными лимфомами (Ford R., 1995 г.).

Но даже ангипролиферативные ЦТ и цитотоксические факторы опухолевых клеток в условиях неотрансформации иногда извращают свое влияние и становятся факторами роста при ряде онкогематологических заболеваний (ТФР-ß -при хроническом В-ЛЛ, ФНО-а - при ВКЛ) (Bendtsen К., 1994; Fluckigek A.C., 1995 г.).

Увеличение уровня ЦТ имеет и прогностическое значение. В частности, при высоком уровне ИЛ-6 и белков острой фазы в сыворотке больных множественной миеломой, хуже прогноз (Pellinieniemi Т.Т., 1995 г.).

Роль аутокринно и паракринно выделяемых ЦТ особенно важна для клеток прогрессирующих и метасгазирукицих опухолей.

При патологиях, сопровождающихся высоким уровнем ЦТ, необходима нейтрализация провоспалительных цитокинов и факторов роста неопластических клеток, что возможно с помощью блокады ЦТ, что приводит к выраженному эффекту при эндотоксическом и септическом шоке, бактериальном перитоните (AT к ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-а); бронхиальной гиперреактивности (AT к

ИЛ-5); аллергическом энцефаломиелите, инсулннзависимом диабете (AT к ИЛ-12); нейтрофильиых повреждениях легких (AT к ИЛ-8); множественной миеломе (AT к ИЛ-6) (Schiag G, 1993 г.; Pitti R.M., 1994 г.; Akutsu I., 1995 г.; Wernette М.Е., 1995 г.; Tremblean S., 1995 г.; Goto М., 1994 г.; Colombo М.В., 1995 г.).

Так как ФНО усиливает репликацию ВИЧ-вируса, то растворимый рецептор ФНО, связывая ФНО приводит к блоку репликации ВИЧ-1 вируса (Howard М., 1993 г.).

Блок пролиферации опухолевых клеток можно получать с помощью блокады рецепторов ЦТ.

Токсин Pseudomonas exotoxin (РЕ) связывает ИЛ-4 рецепторы. Кроме того он увеличивает цитотоксичность и антиопухолевую активность in vivo. Соединение ИЛ-4 с частью РЕ имеет благоприятный клинический эффект. CP-IL-4 toxin (IL4 (38-37)) РЕ 38 KDEL проходит предклиническую стадию изучения, как потенциальный реагент для лечения ИЛ-4 рецептор-несущих злокачественных опухолей (Kleitman R.J., 1995 г.).

В эксперименте применение ЦТ приводит к усилению дифференцировкимно-гих клеточных трансформированных линий: ФНО-а и ФНО-ß усиливают дифференцировку миелоидных лейкемических клеток линий HL-60, U-937, и ML-3 и т.д. (Nilsson G., 1994 г.).

Свойства ЦТ усиливать дифференцировку клеток тоже используется в онко-гематологии: при лечении онкогематологических заболеваний ГМ-КСФ вводит покоящиеся миелоидные клетки "дремлющего" пула в состояние циклических делений, что увеличивает процент клеток, вошедших в S-фазу, и делает ци-тотоксическую химиотерапию, специфическую в отношении клеточного цикла, более эффективной. Поэтому действие S-фазных химиопрепаратов (таких как арабинозид-С) повышается (Джонс Т.С., 1993 г.).

После химиотерапии применение соответствующих ЦТ купирует и/или предупреждает иммуносупрессию, аплазию кроветворения, нейтропению, а также частые и тяжелые инфекции. Так, факторы роста Г-КСФ и ГМ-КСФ укорачивают время восстановления нейтрофилов и смягчают миелосупрессию, ________возникающую после химиотерапии, однако, необходимо опасаться возможности усиления пролиферации лейкозных клеток ИЛ-6, продукцию которого усиливает ГМ-КСФ (Buchner Т.Н., 1993 г.).

В клинической практике используются и другие ЦТ, когда установлено отсутствие их продукции. Продукция ИЛ-12 отсутствует у больных с синдромом Сезари, поэтому ИЛ-12 является антиопухолевым агентом при этом заболевании с минимальной токсичностью (опухолевая регрессия связана с продукцией ИФН-у и с CD4+, CDg+ клетками) (Rook А.Н., 1995 г.).

Вследствие влияния ИФН на множество внутриклеточных механизмов, приводящих к регрессии опухоли и снижению репликации вирусных частиц, ИФН широко применяется в онкогематологической практике. Помимо воздействия на опухолевые клетки ИФН активирует функции иммунной системы, в частности активирует ЕК-клетки и МФ, что тоже приводит к его выраженному терапевтическому эффекту (таблица 8).

Таблица 8

Применение ИФН при лечении онкозаболеваний.

Тип заболевания Ответ на ИНФ Связанные с малигниза-цией онкогены или их продукты

СПИД - опосредованная саркома Капоши Хороший в 30-40% Продукт онкогена - фактор ангиогенеза

Лимфома Беркита ? Транслокация хромосом 14:8 включая с-тус

Волосато-клеточный лейкоз Превосходный с-гаус и с-Ки активация

Хронический миелолейкоз Очень хороший Транлокация хромосом 9:22 включая с-аЫ

В таблице 7 использованны данные работы Hall M.J. (1991 г.).

В монографии (Hall M.J., 1991 г.) приведены также данные по клиническому использованию интерферона (роферона-А) в комбинации с химиотерапией. Положительный гематологический эффект от применения ИФН был выявлен при ХМЛ в 60-80% случаев (оптимальная доза (о.д.) роферона-А -9 х 106 IU/день); ВКЛ в 80-95% случаев (о.д. роферона-А - 3 х 10б IU/день); Не-Ходжкинских лимфомах в 40-60% случаев (о.д. роферона-А - 6-9 х 106 IU/день); эссенциальной тромбоцитопении в 90% случаев (о.д. роферона-А - 3-9 х !0б IU/день); ММ в 50% случаев (о.д. роферона-А-9-18 х 10б IU/день); саркоме Ка-

поши при СПИДе в 35-50% случаев (о.д. роферона-А - 3-50 х 10б IU/день, в зависимости от веса тела); синдроме Сезари в 83% случаев (о.д. роферона-А - 3 х 10« IU/день).

Trubiani О. и соавт. (1994 г.) показали, что ИФН-у вызывает апоптоз только в дифференцированных человеческих лейкемических линиях В-клеток и не действует на малодифференцированные клетки, т.е. антиапоптозный эффект ИФН-у зависит от стадии созревания клетки-мишени и происходит в более поздней стадии созревания клеток. Чувствительность клеток к ЦТ определяется также наличием на опухолевых клетках рецепторов к используемым ЦТ.

Кирзон С.С. и соавт. (1994 г.) установили, что реализация эффектов ИФН и других ЦТ, возможна лишь при условии сохранения функциональной целостности клеточных ядер. Эффект ИФН и других ЦТ проявляется в начальных и средних стадиях заболеваний, а в более поздней стадии эффект отсутствует. Например, при множественной миеломе в стадии прогрессирования злокачественные клетки теряют ИЛ-6-зависимость, так как на более поздней и более злокачественной стадии туморогенеза клеточные ядра теряют целостность и сохранность, поэтому контроль клеток цитокинами резко падает.

Таким образом, критериями терапевтической эффективности ЦТ при онкоге-матологических заболеваниях являются:

1) стадия заболевания (ЦТ действуют при условии сохранности ядер опухолевых клеток);

2) чувствительность опухолевых клеток к ЦТ (стадия дифференцировки клеток).

При использовании высоких доз ЦТ, в частности роферона-А, могут отмечаться острые и хронические побочные реакции. К острым реакциям относят- " ся: озноб в течении 30-60 мин, повышение t до 38-40°, миалгия, лейкопения, алопеция, летаргия, снижение АД, снижение аппетита, парастезии, наузе. Наиболее серьезные острые побочные реакции: сердечная аритмия и воздействие на ЦНС. К хроническим реакциям относятся: снижение веса, диаррея, лейкопения (протеинурия, повышаются печеночные трансаминазы), психические нарушения. --------- ------------ -----------

Для отмены нежелательных побочных эффектов применяют симптоматические препараты: противорвотные препараты, анти-диарейные препараты, при необходимости снижают дозу роферона-А (Hall M.J., 1991 г.).

Побочных эффектов лишены индукторы ЦТ, в частности такие индукторы ИФН как циклоферон.

ЦТ имеют определенное значение и при пересадке костного мозга.

Преинкубирование клеток костного мозга с ИЛ-3 и ГМ-КСФ повышает эффективность трансплантации при пересадке костного мозга, усиливается приживление клеток (хоминг клеток в костном мозге). Лечение AT к ФНО (нейтрализация ФНО), особенно в сочетании с применением пентоксифиллина, дает дополнительный эффект для предотвращения болезни "трансплантат-против-хозяина" (при мышиных, аллогенных, HLA - идентичных пересадках костного мозга) (Holler E.S., 1992 г.).

Если клетки костного мозга предварительно обрабатывали ИЛ-2 (1000 U/мл) в течении 24 часов, усиливался противоопухолевый эффект трансплантации. Инкубация клеток костного мозга с ИЛ-2 приводит к выраженной туморицид-ной активности против разнообразных опухолевых и свежих лейке.мических клеток (Sharnk В., 1991 г.).

В литературе последних лет встречаются работы по использованию ЦТ в практике детской онкогематологии. В частности, у детей, больных ОЛЛ, при применении лейкоферона (ИФН-а + ЦТ первой фазы иммунного ответа) - суммарная доза на курс лечения 120-140 тыс.ЕД - на фоне базисной терапии происходило улучшение иммунологических показателей (в 3-4 раза усиливалась фагоцитарная активность моноцитов, увеличивалось количество Т-клеток) и увеличение количества лейкоцитов (с 0,3х109/л до 6,7х10'/л), тромбоцитов (от единичных до 180x10'/л), лимфоцитов (от 7% до 30%). Этот положительный эффект позволил впоследствии продолжить цитостатическую терапию детям, больным ОЛЛ (Долгина E.H., 1994 г.).

Махонова Л.А. и др. (1995 г.) применяли человеческий лейкоцитарный ИФН для лечения детей, больных не-Ходжкинскими лимфомами, у которых до этого выявляли иммуносупрессию, особенно выраженную после химиотерапии. В результате применения ИФН у детей, больных не-Ходжкинскими лимфомами, происходило увеличение 2-х и 5-ти летней выживаемости.

В последние годы появились литературные экспериментальные и клинические данные о новых направлениях по применению ЦТ, которые заключаются в переносе генов ЦТ в ЛФ, опухолевые и другие клетки, что приводит к миграции генетически-псрестроепных ЛФ по всему организму, локальном}' освобождс-

нию ЦТ; к усилению антигенности опухолевых клеток, в результате чего можно избежать побочных токсических эффектов высоких доз ЦТ и усилить развитие противоопухолевого иммунитета (Мс. BrideN.H., 1994 г.; Zhang Q.X., 1995 г.; Schmidt-Wolf G.D., 1995 г.; Zitrogel L., 1995 г.; Koh J., 1995 г.).

Разрабатываются и другие направления применения цитокинов. Ковальчук JI.B. и соавт. (1995 г.) после исследования локального применения ЦТ рекомендуют применение локальной иммунокоррекции цитокинами для заживления ран в группах повышенного риска нарушения заживления.

Резюмируя результаты многочисленных исследований, можно заключить, что терапевтическое использование ЦТ способно принципиально изменить существующую тактику лечения ряда заболеваний, особенно онкогематологиче-ских.

Наши исследования о нарушении функций иммунной системы при некоторых неонкологических заболеваниях, а также анализ данных современной литературы о нарушениях функций иммунной системы у онкогематологических больных, позволил сделать важное заключение об однотипности нарушений функций иммунной системы: понижении активности Т-клеточного звена иммунитета и понижении естественной цитотоксичности (табл. 9).

Таблица 9

Однотипность изменении функций Т-лимфоцитов и ЕК-клеток при неонкологических и онкогематологических заболеваниях

Субпопуляц ии клеток Заболевания

Неонкологические* (ИБС, ДКМП) Онкогематологические

ОЛЛ* Литературные данные**

Т- лимфоциты понижение функций Т-лимфоцитов: -пролиферативного ответа Т-ЛФ на ми-тогены (ИБС, ДКМП); -продукции цитоки-нов: понижение выработки фактора, ингибирующего миграцию лейкоцитов (ИБС) понижение функций Т-лимфоцитов: -снижение частоты ГЗТ в острый период заболевания и рецидиве понижение функций Т-лимфоцитов: -понижение количества и функций Т-ЛФ (раковые, онкогематологические больные, ОЛЛ, Не-Ходжинские лимфомы) -снижение продукции ИЛ-2 при лимфогранулематозе; после цитостатической терапии, кортикостероидной и лучевой терапии -инактивация ИЛ-2 опухоль-освобождаемыми веществами (ганглиозидами, ПГЕ2,ТФР- р,ИЛ-10, растворимыми Р ИЛ- 2)

ЕК-клетки понижение функций ЕК-клеток: -цитотоксическоп активности ЕК-клеток понижение клеток: -снижение частоты ЕЦТ в острый период заболевания и рецидиве понижение функций ЕК-клеток: -активности ЕК-клеток (раковые, онкогематологические больные, ВКЛ, ОЛЛ, Т-лейкоз); -снижение продукции ИФН (ОЛЛ),ХЛЛ, Не-ходжинские лимфомы, СПИД).

* Собственные исследования

** Исследования авторов: Долгина E.H., 1994 г.; Махонова JI.A.,1995 г.; Ка-дагидзе З.П., 1995 г.; Кирзон С.С., 1994 г.; Мицкевич Н.Б., 1994 г.; Зимина И.В., 1994 г.; Tendier C.L., 1994 r.;Cheever H.A., 1986 г.; Kolits Т., 1985 г.; Barcellini W., 1988 г.; Lorenzen J., 1992 г.; Bergman L., 1995 г.; Rook A.H., 1995 г.).

Главным проявлением вторичных иммунодефицитов является инфекционный синдром, нарастание которого наблюдается у онкогематологических больных после специфической противоопухолевой терапии.

На основании наших исследований о влиянии ИЛ-2 на иммунокомпетент-ные клетки здоровых доноров и коррекцию функций иммуноцитов у неонкологических больных и онкогематологических больных, подтвержденных литературными данными, установлен "также однотипный характер влияния ИЛ-2 на функции одинаковых субпопуляций иммунокомпетентных клеток у здоровых лиц и коррекцию однотипных нарушений иммунитета при ряде неонкологических (ИБС, ДКМП) и онкогематологических заболеваний: ИЛ-2 увеличивает функциональную активность Т-ЛФ и ЕК-клеток здоровых лиц, отменяет действие ингибирующих факторов на функции Т-ЛФ, усиливает спонтанную пролиферацию мононуклеаров больных и здоровых лиц, восстанавливает пониженную функциональную активность Т-ЛФ и ЕК-клеток у неонкологических и онкогематологических больных (табл. 10).

Таблица 10

Однотипность влияния ИЛ-2 на функции Т-лимфоцитов и ЕК-клеток здоровых доноров, неонкологических и онкогематологических больных

Субпопуляция клеток Здоровые доноры* Заболевания

Неонкологические* (ИБС, ДКМП) Онкогематологические**

Т- лимфоциты усиление функций Т-ЛФ: -пролифера-тивного ответа на митоге-ны; -спонтанной пролифераци и ЛФ; -отмена действия ингиби-рующий факторов на пролиферацию усиление функций Т-ЛФ: -митогенинду-цированной пролиферации -отмена действия ин-гибируюших факторов на пролиферацию усиление функций Т-ЛФ: -пролиферативной активности; -пролиферации антиген-специфических цито-токсических Т-ЛФ (раковые больные, ОМЛ, меланома, геманглиоэн-дотелиома); -нарастание имунного ответа на Т-зависимые антигены; -отмена иммуносупрессии после химио-, лучевой и кортикостероидной терапии

ЕК-клетки повышение функций ЕК-клеток: -цитотокси-ческой активности повышение функций ЕК-клеток: -цитотоксической активности (ДКМП) повышение функций ЕК-клеток: -активация функций (раковые, онкогематологические больные, лейкозы)

* Собственные исследования

** Исследования авторов: Зимина И.В., 1994 г.; Мицкевич П.Б., 1994 г.; Cheever М.А., 1986 г.; Ellinghausen S.E., 1987 г., Lewis С.Е, 1990 г.; Lorenzen J., 1991 г.; Buchner Th., 1993 г.; Naume В., 1994 г.; AnguloL, 1995 г.

Таким образом, приведенные данные указывают на возможность экстраполяции результатов наших исследований о влиянии ИЛ-2 и коррекции им нарушений функций иммунной системы у неонкологических больных (ИБС, ДКМП) на онкогематологических больных. Т-ЛФ и ЕК-клетки играют важную роль в

формировании противоопухолевого иммунитета, что позволяет рекомендовать использование ИЛ-2 при лечении онкогематологических заболеваний для усиления функций Т-клеточного звена иммунитета и естественной цитотоксич-ности, особенно для ликвидации иммунодепрессии после химио-, лучевой и кор-тикостероидной терапии.

Значение данных результатов наших исследований по влиянию ИЛ-2 заключается в установлении универсальности его действия на коррекцию однотипных нарушений иммунитета, установленных при нозологически разных заболеваниях. С помощью ИЛ-2 можно нормализовать параметры иммунной системы больных, существенно улучшить клиническое состояние больных и снизить инфекционную заболеваемость.

Подводя итог, можно заключить, что терапевтическое действие препаратов на основе цитокинов должно быть направлено на отмену пролиферации и индукцию апоптоза опухолевых и вирус-инфицированных клеток, что достигается путем нейтрализации провоспалительных и других цитокинов положительного контроля пролиферации в сыворотке крови или блокадой их рецепторов на клетках. А для коррекции нарушений иммунной системы и усиления противоопухолевого иммунитета следует рекомендоватьприменение ИЛ-2 (кроме Т-лимфопролиферативных заболеваний) и интерферона.

Представляется очевидным, что положительные результаты при использовании ЦТ при онкогематологических заболеваниях, помимо разработки новых активных химиотерапевтических агентов, будут связаны с выяснением механизмов лечебного действия ЦТ.

Достижения фундаментальной иммунологии в последнее десятилетие и расширение методических возможностей исследования проблемы ЦТ позволили подойти к рекомендациям по лечению многих патологических состояний и заболеваний с применением ЦТ, особенно онкогематологических, что открывает новые перспективы повышения эффективности терапии и снижения смертности при этих тяжелейших заболеваниях.

ВЫВОДЫ

1. Цитокины играют важную роль в формировании патогенеза опухолевых заболеваний иммунной системы, развивающихся из клеток - основных продуцентов и/или потребителей цитокинов, которые ауто- и паракринно стимулируют рост неопластических иммунокомпетентных клеток, активируют антиапоп-тозные факторы и нарушают регуляцию функций иммунной системы.

2. Интерлейкин-2 является направленным иммуностимулятором, оказывая следующее действие на иммунокомпетентные клетки здоровых лиц in vitro:

1) увеличивает функциональную активность Т-лимфоцитов:

- усиливает митоген-индуцированную пролиферацию (р < 0,05);

- отменяет действие ингибирующих факторов на пролиферацию (р

<0,001);

2) повышает спонтанную пролиферацию мононуклеаров периферической крови (р < 0,001);

3) увеличивает цитотоксичность естественных киллерных клеток (р <0,02).

3. Неопухолевые заболевания - хроническая ишемическая болезнь сердца (ИБС) и дилятационная кардиомиопатия (ДКМП) характеризуются Т-иммунодефицитным состоянием, так как установлено понижение функций Т-лимфоцитов у больных обеих групп по сравнению со здоровыми:

- понижение пролиферативного ответа на митоген ФГА при ДКМП (р <0,05) и при ИБС (р < 0,05);

- понижение пролиферативного ответа на митоген Кон-А при ДКМП (р< 0,05) и при ИБС (р < 0,05);

- снижение продукции цитокинов (процент ингибиции миграции лейкоцитов при стимуляции лимфоцитов ФГА составил 50,61+3,13 (ИБС) против 86,50 7+0 1,86 здоровых лиц (р < 0,001).

4. Понижение функций естественных киллерных клеток у больных ДКМП сопровождается компенсаторным увеличением продукции интерферона-а моноцитами/макрофагами (установлено снижение естественной цитотоксичности (р < 0,05) и повышение уровня интерферона-а в сыворотке крови больных (р < 0,05).

5. Для устранения нарушений иммунитета (повышения функций Т- и ЕК-клеток) рекомендуется высокоспецифичная и направленная иммунокоррекция

с применением ИЛ-2 (кроме Т-лимфопролиферативных заболеваний) и интерферона, так как:

1) ИЛ-2 in vitro нормализует пониженные функции Т-клеток:

- увеличивает митоген-индуцированную пролиферацию (р < 0,05);

- отменяет действие ингибирующих факторов на пролиферацию Т-лимфоцигов при ИБС и ДКМП (р < 0,05 в обо их случаях).

2) увеличивает спонтанную пролиферацию мононуклеаров периферической крови (р < 0,001);

3) нормализует пониженные функции естественных киллерных клеток (р < 0,05);

6. Сравнительная оценка действия ИЛ-2 на основные показатели противоопухолевого иммунитета (Т-ЛФ и ЕК-клетки) у здоровых лиц и неонкологических больных выявила однонаправленный характер влияния ИЛ-2. При этом, у здоровых лиц ИЛ-2 усиливает функции этих клеток, а у больных нормализует их пониженные функции.

7. Опухолевые заболевания иммунной системы характеризуются понижением противоопухолевого иммунитета - снижением частоты положительных реакций естественной цитотксичности (р < 0,05) и гиперчувствительности замедленного типа (р < 0,05) в острый период и период рецидива заболевания.

8. На основании результатов собственных клинических исследований и анализа данных современной литературы установлено однотипное понижение функций Т-лимфоцитов и ЕК-клеток и универсальное действие ИЛ-2 на коррекцию иммунодефицита при ряде неонкологических (ИБС, ДКМП) и онкогемато-логических заболеваний.

9. Интерлейкин-2 усиливает спонтанную пролиферацию мононуклеаров периферической крови, отменяет действие ингибирующих факторов на пролиферацию Т-лимфоцитов, повышает цитотоксичность естественных киллерных клеток, что объясняет терапевтический эффект применения ИЛ-2 in vivo без дополнительной антигенной активации иммунокомпетентных клеток.

10. Интерлейкин-2 in vitro более выраженно проявляет ко-стимулирующее действие при субоптимальных стимуляциях Т-лимфоцитов митогенами (процент усиления пролиферации интерлейкином-2 при разных концентрациях Кон-А составил: 217% - при 0,5 мкг/мл; 65%- пр 1,0 мкг/мл; 7% при 5 мкг/мл), поэтому интерлейкин-2 рекомендуется применять при лечении опухолевых за-

болеваиий, так как опухолеассоциированные антигены относятся к слабым им-муногенам.

11. Представленные результаты и данные, обобщенные в монографии, позволяют заключить, что цитокины, с одной стороны, являются факторами патогенеза, а с другой стороны, цитокины и препараты на их основе могут служить терапевтическими средствами - направленными иммуномодуляторами, анти-пролиферативными агентами для опухолевых клеток и активаторами гемопоэза.

Практические рекомендации.

1. Рекомендуется проводить определение уровня цитокинов в сыворотке крови больных неопухолевыми заболеваниями и особенно опухолевыми заболеваниями иммунной системы с целью определения дополнительных патогенетических, диагностических и прогностических факторов; а также для выявления наличия и уточнения характера иммунной реакции организма.

2. Анализ результатов действия интерлейкина-2 in vitro показал, что ИЛ-2 является направленным иммуностимулятором и может применяться для повышения сниженной активности клеточного звена иммунитета у больных. Благодаря этому можно получить дополнительный терапевтический эффект. Интерферон является противовирусным цитокином и активирует естественную цито-токсичность организма. Оба препарата могут применяться в протоколах терапии лейкозов.

3. Рекомендуется терапевтическое применение интерлейкина-2, интерферона или его индукторов для усиления противоопухолевого и противовирусного иммунитета, устранения клеточного иммунодефицита, установленного при нозо-логически разных заболеваниях.

4. Лечебное применение интерлейкина-2 при гемобластозах наиболее целесообразно после химио- и кортикостероидной терапии, а интерферона - при понижении естественной цитотоксичности организма и при вирусных заболеваниях.

5. Определение естественной цитотоксичности и пролиферативной активности лимфоцитов в ответ на митогены может быть использовано для оценки эффективности терапевтического действия и оптимизации схем введения цитокинов.

6. Показаниями для клинического применения препаратов на основе ЦТ являются:

1. Установленное участие ЦТ в патогенезе заболеваний (повышение - уровня ЦТ в сыворотке крови или дефект продукции ЦТ).

2. Нарушения иммунитета и ослабление противоопухолевого иммунитета.

3. Блок дифференцировки, усиленная пролиферация и отмена апоптоза опухолевых клеток.

4. Побочные отрицательные эффекты химио-, радио- и кортикостероид-ной терапии.

5. Пересадка костного мозга.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Влияние липопротеидов на выработку лимфоцитами лимфокинов у больных хронической ишемической болезнью сердца. В кн.: "Медиаторы иммунного ответа", с. 38. Тезисы докл. Всесоюзн. симпозиума, г.Горький -1983 г.(соавторы Р.С.Карпов, Н.В.Канская, В.А.Бейко).

2. Липопротеиды как регуляторы функций иммунокомпетентных клеток у больных хронической ишемической болезнью сердца и здоровых лиц. БУ ВИНИТИ - 1984 г.,6 N0 7 Б/292, N 1743-84, деп. от 29.03. (соавторы Р.С.Карпов, В.А.Бейко, Н.В.Канская).

3. Сравнительное изучение влияния сывороточных липопротеидов здорового и больного атеросклерозом с дислипопротеидемией на функциональную активность лимфоцитов. - Тез. докл. Всесоюзной конференции "Иммунология атеросклероза и ИБС" - Томск, 1985 г., с.44-45.

4. Иммуномодулирующая терапия больных атеросклерозом и ишемической болезнью сердца. Тез докл. Всесоюзной конференции "Иммунология атеросклероза и ишемической болезни сердца" - Томск, 1985 г., с.93-94 (соавторы В.А.Бейко, В.Ф.Мордовии, В.Х.Хавинсон, Р.С.Карпов).

5. Влияние липопротеидов отдельных классов на функциональную активность иммуннокомпетентных клеток у больных хронической ишемической болезнью сердца. Актуальные вопросы кардиологии . вып. 1, с. 32, Томск - 1986 -изд. Томского университета (соавторы Н.Е.Вишневская).

6. Клеточный и гуморальный иммунитет у больных ишемической болезнью сердца. БУ ВИНИТИ- 1986 г., N3 б/о 174, N 8534-1385, деп. от 11.12.85 г.

7. Иммунологические эффекты синтетических аналогов опиоидных пептидов. Тез. Всесоюзного симпозиума с участием иностранных специалистов "Структура иммуннорегуляторных пептидов". - 15-17 ноября 1988 г., г.Москва, с.117 (соавторы Е.Л.Насонов, В.А.Виноградова, Е.Н.Александрова, Е.В.Васильева, Н.И.Титов).

8. Нарушение иммунорегуляции и активации иммунной системы у больных дилятационной кардиомиопатии. Тер. архив. - 1988. - N7, стр.25-30 (соавторы Е.Л.Насонов, Л.З.Александрова, М.Ю.Самсонов, Е.Н.Александрова, М.Н.Корнеева, С.Г.Осипов).

9. Влияние натрийуретического пептида на митоген-индуцированную пролиферацию лимфоцитов человека. Тезисы 1-го Всесоюзного съезда иммунологов, т. 1, с. 33 - 1989 г.

10. Нарушение естественной цитотоксичности при дилятационной кардио-миопатии: роль интерлейкина-2 и интерферона. 1-ый Всес. съезд иммун., тезисы.- 1990. - том.2, стр.161 (соавторы Е.Н.Александрова).

11. 3-й компонент комплемента при гипертонической болезни и атеросклерозе. - Кардиология -1990- N7, с. 45 (соавторы Г.С.Курочкин, Г.Г.Арабидзе, С.Г.Осипов, А.А.Лякишев, Е.В.Ощепкова).

12. Иммуноглобулин Е при системной красной волчанке. - Клиническая медицина -1991- N6, с.32 (соавторы Л.М.Тарумова, З.С.Алекберова,

В.П.Масенко, Е.Л.Насонов).

13. Влияние атриального натрийуретического фактора на пролиферативный ответ и естественную цитотоксичность лимфоцитов человека. Бюлл. экспер. биол. и мед. - 1991- N 5, том С XI, с. 518 (соавторы Е.Н.Александрова, Е.Л.Насонов, Ж.Д.Беспалова, М.В.Овчинникова, В.А.Виноградова, М.И.Титов).

14. Иммуногенетика гипертонической болезни. - Тер.архив, 1991 г., N 4, с. 7 (соавторы С.Г.Осипов, Г.С.Курочкин).

15. Effect of lipoproteins and atrial natriuretic factor on proliferative response of lymphocytes and human B-cells with surface immunoglobulins. - 12th European congress of immunology 14-17 june 1994, Barselone.

16. Коррекция интерлейкином-2 нарушений иммунитета у больных хронической ишемической болезнью сердца и дилятационной кардиомиопатией - тезисы международного Конгресса "Человек и лекарство" - Москва, 6-13 апреля 1997 г., подано в печать.

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В АВТОРЕФЕРАТЕ СОКРАЩЕНИЯ

АГ - антиген

АТ - антитела

ак - аминокислота

В-ЛФ - В-лимфоциты

ВИЧ - вирус иммунодефицита

В-ХЛЛ - В-клеточный хронический лимфолейкоз

ВКЛ - волосатоклеточный лейкоз

ВЭБ - вирус Эпштейн-Барра

Г-КСФ - гранулоцит-колониестимулирующий фактор

ГМ-КСФ - гранулоцит-макрофаг-колониестимулирующий фактор

ГКГС - главный комплекс гистосовместимости

ДКМП - дилятационная кардиомиопатия

ЕК-клетки - естественные киллерные клетки

ЕЦТ - естественная цитотоксичность

ИБС - ишемическая болезнь сердца

ИЛ - интерлейкин

ИФН - интерферон

иммуноглобулин Кон-А - конканавалин-А ЛАК - лимфокинактивированные киллеры ЛИФ - лейкоз ингибирующий фактор ЛФ - лимфоцит

мДНК - матричная дизоксирибонуклеиновая кислота ММ - множественная миелома МН- моноцит

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота МФ - макрофаг НФ - нейтрофил

ОМЛ - острый миелобластный лейкоз ОЛЛ - острый лимфобластный лейкоз ПГЕг- простагландин Е2 Р ИЛ - рецептор ИЛ

СПИД - синдром иммунодефицита Т-ЛФ - Т-лимфоциты Тс. - Т-супрессоры Тх. - Т-хелперы

ТФР - трансформирующий фактор роста

ФГА - фитогемагтлютинин

ФНО - фактор некроза опухоли

ХЛЛ - хронический лимфолейкоз

ХМЛ - хронический миелолейкоз

ЦТ - цитокин

ЦТЛ - цитотоксические ЛФ

CD - кластер дифференцировки (фенотипические маркеры клеток) HTLV-I - ретровирус человеческой Т-клеточной лейкемии/лимфомы типа I. VCAM-I - vascular cell adhesion molecule -

молекулы адгезии сосудистых клеток ICAM - intracellular adhesion molecule - молекулы адгезии