Автореферат и диссертация по медицине (14.00.11) на тему:Эффективность системной антимикотической терапии осложненных форм онихомикозов, обусловленных Trichophyton rubrum, с учетом данных анализа клеточного и гуморального иммунитета

На правах рукописи

АЙРАПЕТЯН 1 3 А В Г 2009 Наринэ Рубеновна

ЭФФЕКТИВНОСТЬ СИСТЕМНОЙ АНТИМИКОТИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ ОСЛОЖНЕННЫХ ФОРМ ОНИХОМИКОЗОВ, ОБУСЛОВЛЕННЫХ TRICHOPHYTON RUBRUM, С УЧЕТОМ ДАННЫХ АНАЛИЗА КЛЕТОЧНОГО И ГУМОРАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА

14.00.11 - кожные и венерические болезни 14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2009

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении Высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научные руководители:

доктор медицинских наук, МАТУШЕВСКАЯ профессор Елена Владиславовна

старший научный сотрудник СВИРЩЕВСКАЯ кандидат биологических наук Елена Викторовна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, МАСЮКОВА профессор Светлана Андреевна

доктор медицинских наук, СЕМЕНКОВ профессор Виктор Фадеевич

Ведущая организация: ГОУ ВПО Московская Медицинская Академия им. И.М.Сеченова

Защита диссертации состоится 22 сентября 2009 г. в 14.00 на заседании диссертационного совета Д 215.009.02 при Государственном институте усовершенствования врачей Министерства обороны Российской Федерации (107392, г. Москва, ул. Малая Черкизовская, д. 7).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного института усовершенствования врачей МО РФ.

Автореферат разослан 22 июля 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Бакулин И.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

В настоящее время уровень заболеваемости онихомикозом различной этиологии, клинической формы и локализации повышается ежегодно на 5% [Сергеев А.Ю. и др., 2002]. На долю онихомикозов приходится около 30% всех кожных грибковых инфекций. Заболевание существенно снижает качество жизни и социальную адаптацию больных. Эти больные могут быть источником инфекции в семье и в закрытых коллективах. Наличие хронически текущей микотической инфекции кожи предрасполагает к сенсибилизации иммунной системы антигенами гриба. Тем самым онихомикозы могут как провоцировать, так и утяжелять течение различных аллергодерматозов иного генеза. Среди возбудителей онихомикозов стоп Т. rubrum занимает первое место в странах Европы, в том числе и в России, где на его долю приходится 80% выделенных культур дерматомицетов [Сергеев А.Ю. и др., 2003]. За рубежом среди дерматологических больных у 9% выявляют сопутствующий онихомикоз [Elewski В. et al., 1997]. Расширенные обследования, проведенные в 2003 г. и включившие 70 тыс. обследованных из 16 стран Европы, показали, что у 35% наблюдались микозы, из которых онихомикозы встречались наиболее часто [Burzykowski Т. et al, 2003].

Считается, что микозы стоп являются одной из основных причин развития экзематозных реакций. Известны работы по изучению антигенных свойств Т. rubrum. По данным ряда авторов отмечаются специфические кожные аллергические реакции с грибковыми аллергенами [Сергеев Ю.В. и др., 2004; Woodfolk J. et al., 2005]. Экзема микотического генеза осложняет течение микозов стоп и составляет, по разным источникам, 20-30% от всех дерматозов. Исследований по ассоциации грибных инфекций с аллергическими реакциями проводится мало [Schwartz Н. et al., 1995; Брусиловская Д.А., 1970]. Однако известно, что онихомикозы зачастую являются семейными заболеваниями. С большой вероятностью имеются факторы генетической предрасположенности к данному заболеванию, которые на настоящий момент не идентифицированы [Faergemann J. et al., 2005]. Одной из возможных причин, предрасполагающих к онихомикозу, может являться дефект барьерной функции кожи, в частности

нарушение бактерицидное™ кожного сала. В пользу того, что при онихомикозах может иметься такой дефект, свидетельствуют данные об иммунокомпетентности больных, что было показано как в зарубежных исследованиях, так и нами [Koga, Т., 2003; Elewski В. et al., 2002; Свирщевская E.B. и др., 2008]. С другой стороны, нарушение дефекта барьерной функции кожи считается основным патогенетическим механизмом атопического дерматита [Sugarman J., 2008; Elias Р., 2008]. Соответственно, интересно оценить возможную связь между двумя патологиями. Следует отметить, что при атопическом дерматите значительную роль играет ответ по типу Т-хелперов 2, тогда как при онихомикозах имеющиеся данные свидетельствуют о преимущественной активации при ответе на грибы Т-хелперов 1-го типа [Koga Т., 2003; Elewski В. et al., 2002]. Роль микотической инфекции при аллергодерматозах и их взаимосвязь изучены недостаточно. Особенности течения осложненных форм онихомикозов требуют новых подходов к лечению таких пациентов. Анализ состояния иммунитета у этих больных на современном уровне позволит оптимизировать лечение больных онихомикозами, осложненными аллергодерматозами.

Цель работы: оценить эффективность терапии больных осложненными формами онихомикоза системным антимикотическим препаратом Румикоз на основании изучения особенностей иммунитета больных с использованием антигенов гриба Т. rubrum.

Задачи исследования:

1. Изучить клиническую эффективность системного антимикотического препарата Румикоз при лечении больных осложненными формами онихомикоза.

2. Разработать метод культивирования грибов T.rubrum для получения антигенов и охарактеризовать их.

3. Определить уровень IgG и IgE, специфичных к антигенам гриба, а также общий IgE в сыворотке крови больных осложненными формами онихомикоза.

4. Оценить функциональную активность макрофагов и нейтрофилов крови больных осложненными формами онихомикоза и доноров.

5. Изучить фенотип и функции Т и В лимфоцитов из периферической крови больных осложненными формами онихомикоза и доноров.

Научная новизна

Впервые проведено клиническое исследование эффективности системного антимикотика Румикоза при осложненных формах онихомикоза. Получены, фракционированы и охарактеризованы антигены гриба Т. rubrum. Впервые у больных онихомикозом проведено изучение специфичности IgG- и IgE- антител и выявлены доминантные антигены. Не было выявлено антител Е класса к антигенам гриба, что свидетельствует об отсутствии сенсибилизирующего действия микотической инфекции на иммунную систему больного. С другой стороны, показано, что у больных онихомикозом формируется иммунный ответ на антигены гриба, о чем свидетельствует активация Т-клеток и формирование IgG антител. Показали, что большинство сывороток больных онихомикозом распознают белки массой 70-80 кДа, 30% сывороток распознают белок массой 50 кДа, 15% - белки массой 17-20 кДа. Впервые в России в рамках клинического исследования у больных онихомикозом изучена фагоцитарная активность макрофагов и нейтрофилов. Не было выявлено дисфункции фагоцитарного звена у больных онихомикозом. Впервые определен цитокиновый профиль иммунокомпетентных клеток больных онихомикозом и выявлена склонность к формированию клеточного ответа по типу Т-хелперов 2 (Тх2) с повышенной продукцией интерлейкинов 4, 5, 10. Наличие Тх2 ответа подтверждено повышенным уровнем общего IgE у 40% больных, а также наличием IgE к раличным аллергенам стандартной панели у 45% больных. Впервые показано, что онихомикоз не является причиной аллергодерматоза и не вызывает дополнительной сенсибилизации организма к антигенам гриба. Однако наличие микотической инфекции провоцирует обострение независимо от онихомикоза возникшего аллергодерматоза за счет миграции активированных Т-клеток (CD3+HLA-DR+). Практическая значимость

Проанализирована клиническая эффективность системного аншмикотического препарата Румикоз при лечении больных осложненными формами онихомикоза по методу пульс-терапии. Клинико-этиологическое излечение больных осложненными формами онихомикоза позволяет поддерживать состояние клинической ремиссии аллергодерматозов. Разработан протокол наращивания биомассы и выделения антигенов из T.rubrum, что позволяет в дальнейшем создать

тест-систему для идентификации сенсибилизации к антигенам грибов. Идентифицирована ассоциация онихомикоза с Тх2-типом ответа Т-клеток на поликлональную стимуляцию, а также выявлена склонность к аллергическим реакциям у 60% больных онихомикозом.

Реализация результатов исследования Результаты работы внедрены в клиническую практику КВКД № 1 Департамента Здравоохранения г. Москвы. Материалы исследования используются в учебном процессе на кафедре дерматовенерологии лечебного факультета ГОУ ВПО «РГМУ Росздрава». Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Румикоз эффективен и безопасен при лечении больных осложненными формами онихомикоза по схеме пульс-терапии.

2. У 50% больных онихомикозом в сыворотке крови выявляются антитела класса С к антигенам гриба Т.гиЬгит и отсутствуют антитела класса Е, выявляемые методом ИФА. У 36% больных также выявляются Т-клетки, специфичные к антигенам гриба.

3. При онихомикозе не наблюдается снижения фагоцитарной активности нейтрофилов и моноцитов периферической крови.

4. При онихомикозе не наблюдается дефицита Т и В-систем иммунитета, но имеются две особенности: наблюдается сдвиг в сторону Тх2 клеточного ответа, а также повышено число активированных Т-клеток среди лимфоцитов периферической крови.

Апробация диссертации

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: заседаниях кафедры кожных и венерических болезней лечебного факультета РГМУ и совместных научно-практических конференциях кафедры дерматовенерологии лечебного факультета ГОУ ВПО РГМУ Росздрава и КВКД №1 ДЗ г. Москвы (20062008); 1023-м заседании Московского научного общества дерматовенерологов им. А.И. Поспелова (20 марта 2008 г.); IV научно-практической конференции, посвященной памяти профессора М.М. Желтакова, «Хронические дерматозы: новые аспекты патогенеза и терапии. Инфекции, передаваемые половым путем» (Москва, 7 декабря 2007 г.); XII Сибирской межрегиональной научно-практической

конференции с международным участием «Дерматовенерология Сибири: наука и практика» (Новосибирск, 13-14 марта 2008 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 5 научных работ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 124 страницах компьютерного текста и состоит из введения, 5 глав (обзор литературы, описание материала и методов исследования, собственные результаты и их обсуждение), заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы из 245 источников (135 отечественных и 110 зарубежных авторов). Работа иллюстрирована 10 таблицами и 14 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика больных

В настоящее исследование было включено 86 амбулаторных больных (51 мужчина и 35 женщин) в возрасте от 16 до 60 лет, наблюдавшихся в КВКД № 1 и № 29 г. Москвы с диагнозом онихомикоз стоп и/или кистей, вызванный Т. rubrum. Диагноз устанавливался в каждом отдельном случае на основании клинического, микроскопического и культурального исследований.

Онихомикоз стоп и кистей мы констатировали у 10 (12%) пациентов, только стоп - у 76 (88%) пациентов. Количество пораженных ногтевых пластинок от 1 до 3 отмечалось у 6 (7%) больных, от 4 до 6 - у 34 (40%), от 7 до 10 - у 46 (53%). Выраженность гиперкератоза и площади поражения ногтевых пластинок стоп оценивали по состоянию ногтевой пластинки большого пальца стопы. Так, дистально-латеральный тип поражения без гиперкератоза отмечен у 9 (10%) пациентов, дистально-латеральный с гиперкератозом - у 47 (55%), тотальный - у 30 (35%). У 17 (20%) больных выявлено нормотрофическое поражение ногтевых пластинок (гиперкератоз не более 1 мм). У остальных 69 (80%) больных -гипертрофическая или смешанная форма поражения.

Среди предрасполагающих к развитию онихомикоза факторов нами были отмечены следующие: у 75 (87%) больных - проживание в сырых, плохо

проветриваемых помещениях; у 54 (63%) - ношение резиновой обуви (военнослужащие, сантехники, спортсмены).

В ходе исследования больные были разделены на две группы: 1-30 больных неосложненными формами онихомикоза, II - 56 больных онихомикозом, осложненным аллергодерматозами. Осложнения в виде дисгидротической экземы отмечены у 38 (68%) пациентов, микробной экземы - у 18 (32%) с числом рецидивов не менее 4 раз в год. Больные в обеих группах были идентичны по тяжести клинических проявлений онихомикоза, продолжительности заболевания, возрасту, общему состоянию. Контрольная группа - доноры (здоровые лица).

У больных I группы с неосложненными формами онихомикоза процесс носил относительно доброкачественное течение. Микоз как на стопах, так и на кистях, на гладкой коже подошвенной и ладонной поверхностях протекал в обычной для него форме с легким отрубевидным шелушением (поверхностые борозды), слабо выраженным шелушением в межпальцевых складках между III, IV и V пальцами. Лишь у 2 (7%) больных были отмечены трещины и поверхностные эрозии. Выраженных экссудативных форм микоза стоп или осложненных вторичной инфекцией не было. Больные 1 группы получали системную антимикотическую терапию.

II группу составили 56 больных осложненными формами онихомикоза: 2 страдали онихомикозом стоп и кистей (4%), 54 - онихомикозом стоп (96%). У больных II группы течение экземы отличалось особой тяжестью клинических симптомов. У 48 (86%) пациентов с экзематозно-микотическими поражениями стоп микоз предшествовал экземе. У 8 (14%) больных экзема предшествовала микозу. Микробная экзема протекала с более выраженными воспалительными явлениями, значительной отечностью, гиперемией, инфильтрацией, трещинами кожи в очагах, пузырьками и пузырями, мацерацией, эрозиями, более грубыми чешуйко-корками. Высыпания распространялись за пределы кожи подошв и захватывали голени, где располагались типичные очаги экземы с наличием мелких папул, сгруппированных микровезикул, точечного мокнутия, экзематозных колодцев и серозных корочек с отрицательным анализом на грибы. У больных онихомикозом, осложненным дисгидротической экземой, процесс локализовался только на коже подошв и межпальцевых складок, характеризовался наличием

везикулярных высыпаний, мелкопластинчатым шелушением. Процесс носил вялое течение без аллергидов. В обоих случаях больные жаловались на зуд, жжение, выраженную болезненность.

Пациенты с онихомикозом в I и II группах получали системную антимикотическую терапию с применением отечественного препарата Румикоз, выпускаемого ОАО «Щелковский витаминный завод», прошедшего регистрацию в Фармкомитете Министерства здравоохранения и социального развития (23.09.02 №001739/01-2002). Лечение осложнений онихомикоза осуществляли по общепринятым принципам лечения больных экземой, с учетом клинической картины, остроты процесса, его распространенности, переносимости и эффективности применяемого препарата, индивидуализировали их с учетом возможной висцеральной патологии.

Клинические методы исследования

Схема приема препарата

Румикоз назначали по 200 мг 2 раза в день в режиме пульс-терапии (1-5-9 недели). Перед применением препарата у всех больных были взяты следующие биохимические показатели крови: AJIT, ACT, ГГТ, общий билирубин, прямой билирубин, щелочная фосфатаза. У всех больных определяли наличие антител к ВИЧ, РПР, HbS, HCV и проводили общий анализ крови и мочи. При выраженном гиперкератозе ногтевых пластин проводилась однократная чистка ногтевых пластин с предварительным наложением уреапласта.

Терапию осложнений онихомикоза во II группе осуществляли по общепринятым принципам лечения больных экземой и онихомикозом. Применяли антигистаминные, десенсибилизирующие препараты, витаминотерапию, комбинированные наружные глюкокортикостероидные мази. При мокнутии применяли примочки с 2% борной кислотой и аэрозоль Полькорталон ТС. По мере стихания симптомов переходили на применение индифферентных средств.

Результаты эффективности лечения оценивали по следующим параметрам: разрешение (уменьшение активности) аллергического процесса, сроки разрешения патологического процесса, балльная оценка.

Балльная оценка симптомов:3 балла - признак выражен максимально; 2 балла -средняя степень выраженности; 1 балл - минимальная выраженность; 0 баллов -нет симптомов.

Учет результатов проводили на 1, 3, 5, 7, 10,14 и 21-й дни лечения.

Анализ иммунологических параметров

Для анализа изменений иммунологических параметров в результате проведенного лечения от больных дерматомикозом получали образцы сыворотки крови и венозной гепаринизированной крови. Сыворотка крови использовалась для определения уровня общего ^Е и антигенспецифичных ^Е и а образцы венозной гепаринизированной крови - для выделения нейтрофилов и лимфоцитов периферической крови с последующим анализом их функции.

Оптимизация наращивания биомассы гриба проведена с использованием сред различного состава с добавками флотирующих агентов; различных режимов (стационарные или ротационные культуры) и времени инкубации в целях получения быстрорастущей культуры гриба со стабильными антигенными свойствами. В процессе работы проведена селекция клонов от примесей других грибов и по скорости роста.

Выделение антигенов гриба проводили после предварительного тестирования пулированных антител больных онихомикозом по способности связываться с исходным экстрактом грибов на мембране (блотирование). После идентификации основных белков по молекулярной массе провели фракционирование белков с помощью гель-фильтрации и элюции из геля. Полученные фракции использовали для дальнейшего типирования индивидуальных сывороток на наличие ^Е- и антител к антигенам гриба.

Выделение фракции нейтрофилов осуществляли с помощью седиментации с 3% желатином по стандартному методу.

Определение фагоцитарной активности моноцитов и нейтрофилов крови осуществляли по разработанной нами методике с использованием спор гриба А. fumigatus, меченных РГГС. Анализ проводили с помощью проточного цитометра.

Проточная цитометрия

Анализ фагоцитоза нейтрофилами и моноцитами, а также фенотипа лимфоцитов периферической крови (ЛПК) проводили на приборе РАСБсап. Для

анализа фенотипа ЛПК использовали прямо меченые антитела против маркеров лимфоцитов CD3+-PE, CD4+-FITC, CD8+-FITC, CD19+-PE, CD16+-FITC, CD56+-PE, HLA-DR+-FITC («Сорбент», Москва).

Анализ цитокинов, продуцируемых ЛПК больных

Определение цитокинов ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-10, ИФНу и ФНОа проводили с помощью набора СВА (BD, США) методом проточной цитометрии по протоколу производителя.

Иммуноферментный анализ

Общий уровень IgE определяли по стандартной методике. Реакцию проявляли тетраметилбензидином. Данные приведены в виде единиц оптической плотности (ОП450).

Пролиферация ЛПК больных in vitro в ответ на CD3/CD28 стимуляцию и

антигены гриба

Для анализа пролиферативного ответа использовали бусы к CD3/CD28. Клетки инкубировали в присутствии различных разведений фракций гриба или бус. Пролиферацию оценивали радиоактивным методом.

Статистические методы исследования

В том случае, когда данные эксперимента укладывались в нормальное распределение, оценка статистической значимости показателей и достоверности различий сравниваемых выборок производилась с использованием t-критерия Стьюдента и пакета статистических программ Excel. В случае распределений, отличающихся от нормального, использовали непараметрическую статистику (пакет программ ANOVA и парный критерий Манна-Уитни).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Клиническая эффективность румикоза при дерматомикозах

В результате проведенного лечения в I и II группах полное клиническое и этиологическое излечение онихомикоза отмечено у 80 (93%) больных. Эти больные получили 3 курса пульс-терапии. При микологическом исследовании в конце лечения мицелия и роста грибов не получено. Шести (7%) больным (2 пациента I группы и 4 - II группы) потребовался дополнительный курс терапии, который

проводили на 13-й неделе (табл. 1). Наблюдение велось около 2 лет. За это время с рецидивом онихомикоза обратилось 14 (16%) больных.

Более 93% пациентов оценили переносимость препарата на «отлично», 6,6% -на «хорошо», что выражалось в появлении побочных эффектов в виде тошноты, рвоты, диареи, болей в эпигастрии и правом подреберье, которые купировались сами собой в течение нескольких дней и не требовали отмены препарата. У 100% пациентов биохимические показатели крови оставались в пределах нормы.

На фоне терапии онихомикоза препаратом Румикоз эффективным оказалось лечение его осложнений. Результаты эффективности лечения осложнений у больных II группы представлены в табл. 1, 2.

Таблица 1. Эффективность лечения больных онихомикозом, осложненным микробной экземой (II группа)

Начало Клиническое

Клинические признаки разрешения (дни) разрешение (дни)

Эритема 1-2 10-14

Отек 1-2 5-7

Мокнутие 1-2 2-3

Инфильтрация 3-4 14-21

Пустулизация, гнойные 2-3 4-6

корки

Зуд, жжение 1-2 3-7

Клинический эффект у больных онихомикозом, осложненным микробной экземой,

достигался достаточно быстро и выражался в уменьшении степени отека, эритемы,

прекращении мокнутия (1-2-й день). Явления пиококковой инфекции стихали на 2-3-

й день лечения, а разрешались на 4-6-й день.

Таблица 2. Эффективность лечения больных

онихомикозом, осложненным дисгидротической экземой

(II группа)

Начало Клиническое

Клинические признаки разрешения разрешение

(дни) (дни)

Эритема 1-2 2-4

Отек 1-2 1-3

Везикулы 1-2 1-2

Инфильтрация 1-3 3-5

Серозные корки 1-2 2-3

Зуд 1-2 1-2

Клиническое выздоровление отмечалось к концу 2-й, началу 3-й недели. Быстрее всего разрешались явления мокнутия, отека, а инфильтрация кожи, сопровождающаяся легким шелушением, сохранялась дольше всего (14-21 дней). Первые признаки клинического ответа на лечение у больных онихомикозом, осложненным дисгидротической экземой, отмечались на 1-2-е сутки и выражались в стихании островоспалительных явлений (везикулы, отек, эритема). Клиническое изменение процесса достигалось в течение одной недели лечения (4-7 дней). Серозные корки отпадали на 2-4-й день лечения, а инфильтрация разрешалась на 35-й день.

Характеристика грибов T.rubrum

Клинические изоляты были получены из КВКД №1. Использовали жидкие среды Сабуро, Сабуро с глюкозой, Чапека, а также агары Сабуро, Сабуро-глюкозный, картофельно-декстрозный и ряд других. На чашках с агаром проводили клонирование и отбирали чистые клоны грибов ТР. Идентификацию проводили по справочникам. На рис.1,А,Б приведены микрофотографии мицелия грибов с характерными булавовидными микроконидиями (отмечены овалом). В итоге проведенной работы был получен быстрорастущий штамм. Первичную культуру грибов из данного штамма наращивали в среде Сабуро с 1% глюкозы со свекловичным жмыхом в течение 3 дней. Полученную биомассу центрифугировали и из нее выделяли белки описанным ниже методом. Выделение белков проводили с помощью размельчения мицелия в жидком азоте. Полученную пудру инкубировали в 0,1% SDS буфере, супернатанты концентрировали, диализовали,

доводили концентрацию до стандартной (1 мг/мл), аликвотили, замораживали и хранили при -20°С до использования. Анализ состава белков гриба из разных культур показал некоторые различия, хотя основной пул антигенов выявлялся во всех случаях (рис.2).

И

0

О

Рис. 1. Морфология грибов Т. rubrum при росте на Сабуро агаре (А и Б) и жидкой среде Сабуро со свекловичным жмыхом в ротационных культурах (В-Е). А и Б - мицелий гриба отличается тонкими гифами, формирующими небольшое количество тонких булавовидных микроконидий (отмечено овалом на Б). При росте в ротационной культуре гриб формирует колонии разного размера (В), не имеющие пушистой поверхности (Е). При большем увеличении видно, что колония состоит из ядра и боковых отростков мицелия, возникающих из-за вращательного момента (Д). При переводе такой культуры в стационарную через сутки появляется пушистая поверхность (Г), характерная для грибов Т. rubrum типа «downy».

Для оценки распознавания различных белков гриба Т. rubrum требовалось фракционирование пула всех белков на отдельные фракции в соответствии с молекулярным весом. Для этого использовали гель-фильтрацию экстракта грибов. На входе в колонку запускали 20 мг тотального белка в 4 мл. Всего собрали 5 фракций по 20 мл. Фракции концентрировали в 10 раз. Количество белка в каждой фракции определяли по Брэдфорду, а молекулярную массу белков в данной фракции определяли гель-электрофорезом. На рис.3 приведены суммированные данные по результатам гель-фильтрации.

130

Рис. 2. Гель-электрофорез в 10% акриламидном геле белков из экстрактов гриба Т. rubrum. На 50 дорожках №1 и 2 приведены форезы экстрактов антигенов из двух разных культур. Справа приведен маркер 27 молекулярных весов (Хеликон, Москва). Веса соответствуют фосфолипазе В (130 кДа), бычьему сывороточному альбумину, яичному альбумину, ингибитору трипсина из соевых бобов, лизоциму (17 кДа).

№1№2М

10-30 5

20-50 4

30-70 3

40-90 2

50-130 1

0

ММ Фракции

10

20

%

30

40

Рис. 3. Распределение белка по фракциям гель-фильтрации. Полученные фракции содержали спектр белков указанных масс (слева гистограммы, молекулярные массы (ММ) приведены в кДа). Доля белков в каждой из фракций указана в процентах.

Идентификация основных белков, распознаваемых /#<7 и /<,'£ из пула сывороток больных онихомикозом

Для идентификации белков, распознаваемых и 1§Е- антителами из

сывороток больных онихомикозом, проводили блотирование экстракта гриба на нитроцеллюлозную мембрану. Для первичного анализа использовали пулированную сыворотку от 20 больных и 5 доноров. Показали, что в сыворотках больных выявляются антитела, распознающие антигены гриба. Однако ^Е-антител в пулированной сыворотке даже при разведении 1:10 выявлено не было (рис.4). Поскольку пул сывороток распознает все возможные белки экстракта, а индивидуальные сыворотки могут распознавать только часть из них или вообще не распознавать белки гриба, то мы проанализировали этим методом часть

индивидуальных сывороток. Первичный скрининг провели методом иммуноферментного анализа. Для выявления антигенов, распознаваемых сыворотками отдельных больных, провели блотирование экстракта на нитроцеллюлозную мембрану и стрипирование. Каждую полоску инкубировали с индивидуальной сывороткой больных. Показали, что сыворотки отдельных больных распознают разный набор антигенов, часть из которых являются доминантными. В качестве группы сравнения использовали сыворотки здоровых доноров. Анализ индивидуальных сывороток показал, что у 50% больных выявляются антитела к антигенам гриба (рис.5).

Рис. 4. Распознавание антигенов гриба Т. rubrum иммуноглобулинами G и Е из пула сывороток больных онихомикозом. Сыворотки были пулированы от 20 больных. Экстракт гриба после гель-электрофореза (А) переносили на нитроцеллюлозную мембрану и добавляли пулированную сыворотку больных в разных разведениях (1:10; 20; 40; 80 и 160). Проявляли антителами к IgG (Б) и IgE (В) человека и конъюгатом с щелочной фосфатазой. Стрелками указаны полосы, соответствующие распознаваемым белкам. Не выявили полос, распознаваемых IgE-антителами.

Рис. 5. Индекс IgG-антител к антигенам гриба Т. rubrum в сыворотках больных онихомикозом (черные столбики) и здоровых доноров (серые

столбики). Сыворотки разводили в 100 раз.

Так, большинство сывороток распознавали белок массой около 70-80 кДа (рис.6). Около 30% сывороток распознавало белок массой около 50 кДа (отмечено стрелкой). Все наши попытки выявить IgE- антител к антигенам гриба методом иммуноблотинга оканчивались негативными результатами.

Онихомикоз п=14 Доноры п=1-4

Рис. 6. Распознавание белков гриба Т. rubrum IgG- антителами из сывороток больных онихомикозом (ОМ) и доноров (Д). Экстракт гриба после гель-электрофореза переносили на нитроцеллюлозную мембрану и инкубировали с сыворотками больных онихомикозом или доноров в разведении 1/30. Реакцию проявляли щелочной фосфотазой. Стрелками отмечены доминантные антигены.

Общий уровень IgE антител в сыворотке крови больных онихомикозом и чувствительность к распространенным аллергенам

Поскольку у части больных онихомикоз развивался на фоне дерматоза, для

которого характерно повышение общего IgE в сыворотке крови, то нам было

интересно оценить уровень общего IgE в сыворотках крови больных осложненной

и неосложненной формой онихомикоза. Анализ проводили методом

иммуноферментного анализа с использованием коммерческих антител. Данные

приведены также в виде индекса IgE- антител. Показали, что у 40% больных

повышен общий уровень IgE в сыворотке крови (рис.7). Для определения

концентрации IgE- антител использовали метод хемилюминесценции с

I I ! - I . . 1 ■ | I

использованием стандарта ^Е. Сыворотки тестировали выборочно. Показали, что повышение уровня общего ^Е незначительно и превышает норму в 1,5-2 раза. Наблюдалась положительная корреляция между повышенным уровнем ^Е в сыворотке крови и наличием онихомикоза, осложненного аллергодерматозом. Кроме определения общего ^Е в сыворотках крови провели также анализ антител к антигенам стандартной аллергической панели. Показали, что часть больных имела также гиперчувствительность к различным аллергенам. При этом прямой корреляции между аллерген-специфическим ^Е и общим ^Е не было.

3,5

3,0

с

2,5

ГС 2,0

1,5

и

V tt 1,0

0,5

0,0

■ом

-Серая зона

<Ъ & & <£>

* 4

Рис. 7. Уровень общего IgE в сыворотке крови больных онихомикозом (ОМ), вызванным

грибами Т. rubrum. Серую зону определяли с использованием пула сывороток 12 здоровых доноров. Сыворотки больных разводили в 10 раз.

Распознавание антигенов гриба Т-клетками больных онихомикозом

Известно, что переключение B-клеток на синтез IgG и IgE зависит от Т-клеток и происходит при их непосредственном участии. Поэтому анализ активации Т-клеток в ответ на антигены гриба покажет участие клеточного звена в распознавании трихофитона. Для анализа использовали фракционированные антигены гриба, полученные методом гель-фильтрации. Культуру ставили с лимфоцитами периферической крови больных. Для сравнения использовали поликлональную стимуляцию Т-клеток антителами к CD3 и CD28, нанесенными на магнитные бусы. Пролиферацию оценивали по включению радиоактивно меченого тимидина.

Показали, что Т-лимфоциты части больных распознают и отвечают пролиферацией на антигены гриба (рис.8). Фракции гель-фильтрации указаны сверху гистограмм. Стрелками отмечены данные, достоверно отличающиеся от значений, полученных для лимфоцитов доноров. У 2 больных из 19 наблюдался сниженный ответ на стимуляцию CD3/28. У остальных ответ находился в норме. Полученные данные показали, что лимфоциты распознают различные антигены. При этом клетки одного больного могут распознавать 2 и более фракции. У части больных ответ отсутствовал. В среднем Т-клеточный ответ выявлялся в 34%

63369502

случаев, а В-клеточный - в 50%, что объясняется длительным циркулированием антител в крови.

Оценка функциональной активности нейтрофилов и макрофагов больных дерматомикозом

Для анализа фагоцитоза использовали меченные БИС споры гриба A.fumigatus. Анализ провели методом проточной цитометрии для выборки больных двух групп и доноров. Для анализа фагоцитоза нейтрофилами клетки выделяли соответственно их размеру и гранулярности (окна на рис.9,А). Идентификацию пятна гранулоцитов ранее проводили по экспрессии маркера СБ 14.

Распределение по БИС нейтрофилов без спор гриба и при добавлении спор, меченных Р1ТС, показано на гистограмме (рис.9,Б). В результате поглощения спор гриба нейтрофилы окрашивались Р1ТС, что приводило к сдвигу гистограммы вправо (рис.9,Б). Добавление аутологичной сыворотки приводило к дополнительному усилению фагоцитоза. Суммарные данные по фагоцитозу для 26 больных и 10 доноров приведены в табл. 3. Эти данные показывают, что у больных онихомикозом, вызванным грихофитоном, нет значительного дефекта фагоцитоза. Наблюдается некоторая тенденция к снижению фагоцитоза у части больных, что непараметрическими методами оценивается как достоверное различие. Разброс данных по фагоцитозу для больных колеблется от 16 до 84%, а для группы доноров - от 60 до 72%.

Рис. 8.

Пролиферативный ответ ЛПК больных онихомикозом на антигены гриба Т. rubrum. Пролиферацию измеряли на 5-е сутки инкубации по включению ЗН-тимидина. По оси абсцисс приведены импульсы в минуту. Стрелками отмечены данные, превышающие значения, полученные для доноров. Римскими цифрами вверху рисунков отмечены фракции гель-фильтрации.

Ю'

Рис. 9. Фагоцитоз конидий А^ИС нейтрофилами и макрофагами периферической крови больного осложненной формой онихомикоза: А - популяция, выделенная овалом, соответствует популяции нейтрофилов; популяция, отмеченная красным прямоугольником, соответствует пятну макрофагов; отмеченная серым прямоугольником - пятну лимфоцитов; Б - светорассеяние нейтрофилами (представлены данные по региону Я2, соответствующего нейтрофилам) в контроле до добавления конидий показано красной линией. Свечение нейтрофилов после инкубации с конидиями в соотношении 1:1 в течение 30 мин показано зеленым цветом.

Таблица 3. Фагоцитоз нейтрофилами от больных онихомикозом конидий гриба А. fu^nigatus без и в присутствии 20% аутологичной сыворотки

Число больных Без сыворотки, % Сыворотка 20%, % Разница

Онихомикоз 26 59±20 70±20 12±14

Доноры 10 69±4 75±5 4,7±3,5

Мев^ Р 0,06 0,13 0,07

М\У** Р 0,04 0,06 0,05

*Оценка параметрическим (-тестом Стьюдента.

** Оценка по непараметрическому критерию Манна-Уитни (М^/).

При оценке параметрическими методами достоверных различий в целом по группам нет (р>0,05). Более гомогенные данные по фагоцитозу для группы доноров могут быть связаны с тем, что в качестве доноров использовали людей в возрасте от 23 до 45 лет, тогда как среди больных преимущественно были люди пожилого возраста. Достоверного различия также не наблюдается при анализе эффекта опсонизации спор гриба аутологичной сывороткой (р=0,13). Достоверного различия также нет и по разнице между фагоцитозом спор без и в присутствии аутологичной сыворотки.

Анализ фенотипа лимфоцитов периферической крови больных онихомикозом

Анализ фенотипа ЛПК больных проводили методом проточной цитометрии. Лимфоциты выделяли на градиенте фиколла. Определяли общее количество Т- и В-клеток (маркеры CD3 и CD 19 соответственно), CD4- и CD8- клеток, соответствующих хелперным и цитотоксическим Т-лимфоцитам, долю натуральных киллеров (CD16 и CD56), а также долю активированных Т-клеток, экспрессирующих молекулу ГКГС II класса HLA-DR. Данные суммировали отдельно для больных без осложнений (группа I) и больных осложненной формой онихомикоза (группа II). В качестве доноров использовали добровольцев -студентов РГМУ. Анализ данных различных групп показал достоверное снижение числа CD8+ Т-клеток по сравнению с контролем и снижение общего числа Т-клеток (CD3+) в группе с осложненными формами микоза (рис.10,А). В результате наблюдается достоверное увеличение отношения CD4/CD8, которое в норме равно 1,7±0,7, а в группах с микозом - 2,6 (группа I) и 3,1 (группа И) (рис. 10,Б). Кроме того, у больных обеих групп увеличена доля активированных Т-клеток, экспрессирующих HLA-DR (рис. 10,В). Далее определяли долю натуральных киллеров (НК) и В-клеток и показали, что доля НК клеток достоверно увеличивается, а доля В-клеток не отличается от контроля. Увеличение доли CD4+-клеток, доли CD3+HLA-DR+-^eTOK при нормальном количестве В-клеток соответствует гиперреактивному статусу по клеточному типу.

Анализ продукции цитокинов при поликлональной и антиген-специфической стимуляции in vitro

Для изучения продукции цитокинов при поликлональной и антиген-специфической стимуляции in vitro использовали новый метод полиплексного анализа цитокинов методом проточной цитометрии. Анализ нестимулированых надосадков или надосадков, стимулированных антигенами гриба, показал наличие только ФНО-а. Концентрация остальных цитокинов была ниже порога чувствительности данного метода. Поэтому все остальные измерения проводили в надосадках поликлонально активированных ЛПК. Данные суммировали отдельно для больных без осложнений и больных с онихомикозом, осложненным аллергодерматозами. Полученные данные показали, что при онихомикозе наблюдается повышение продукции Тх2 цитокинов (ИЛ-4 и ИЛ-5) и снижается продукция Тх1 цитокинов (ИФН-г). ИЛ-2 и ИЛ-10 практически находятся в норме, а уровень продукции ФНО-а повышен (рис.11).

■ Доноры Ш группа 1 группа II

I

о г-и

о

СОЗ СЭ4

, >. СР4/СР8

Т ■

НИ и

Доноры группа I группа II 15 Ш Н1_А-01УС03

10

I 1

Доноры группа Г группа II

Рис. 10. Анализ фенотипа Т-клеток больных

онихомикозом и доноров. Группа 1 соответствует группе больных без осложнений, а группа II -больным осложненной

формой онихомикоза.

Статистически значимые различия (р<0,05) отмечены перекладинами.

Дшры группа! груша II

Доноры группа I труппа И

2500 2000 | 1500 Г 10(Х1

Доноры фуппа I

Рис. 11. Продукция цитокинов лимфоцитами периферической крови больных онихомикозом без (группа I) и с осложнениями (группа II) по сравнению со здоровыми донорами. Цитокины обозначены на каждой гистограмме. Достоверные отличия (р<0,05 по критерию Манна-Уитни) отмечены перекладинами.

Поскольку доля тех или иных клеток в крови является качественным параметром, то для получения более объективных данных учитывали также общее количество лимфоцитов в 1 мл крови. Значительных отличий по этому параметру между больными онихомикозом без осложнений и донорами не было, а у больных с осложненной формой онихомикоза наблюдалась тенденция к снижению числа лимфоцитов в крови (р<0,05).

Полученные в работе данные показали, что в группе осложненного онихомикоза все показатели, характерные для неосложненной формы заболевания, обостряются в еще большей мере: растет число активированных НЬА-ОЯ+СОЗ+ Т-лимфоцитов, отмечается более высокий уровень Т-2 цитокинов, распознается большее количество белков гриба. Эта взаимосвязь не является результатом сенсибилизации организма на антигены гриба Т.гиЬгит, так как специфичных 1§Е выявлено не было. Соответственно, мы можем сделать вывод, что атопическая реакция и онихомикоз являются ассоциированными, но независимо возникающими событиями. Независимость ассоциации онихомикоза и аллергодерматозов подтверждают полученные нами данные о повышенном уровне общего ^Е в сыворотке крови, а также наличии ^Е к респираторным и бытовым аллергенам при отсутствии ^Е к антигенам гриба Т. гиЬгит. Наличие одной инфекции приводит к реактивации Т и В клеток памяти, специфичных к другим антигенам. Такие Т-клетки мигрируют в воспалительные очаги, отмеченные повышенной экспрессией молекул адгезии на клетках эндотелия. Соответственно, излечение одного их хронических процессов будет снижать тяжесть течения имеющихся других. Поскольку аллергодерматозы являются конституционным состоянием (понижены барьерные функции кожи, повышено поступление через кожу чужеродных веществ, распознаваемых иммунной системой как патогены), то его лечение не всегда эффективно. С другой стороны, онихомикоз вызывается патогеном, элиминация которого, вполне возможна. Именно поэтому лечение онихомикоза положительно отражается на ассоциированных с атопией кожных проявлениях, позволяя достигать более длительной ремиссии, что и было показано в данной работе.

24

ВЫВОДЫ

1. Показана высокая эффективность (у 80 больных (93%) клинико-этиологическое излечение), безопасность (хорошая переносимость) и фармакоэкономичность Румикоза по методу пульс-терапии при лечении больных онихомикозом с осложненными и неосложненными формами. Положительный клинико-этиологический эффект у 53 больных онихомикозом (96,6%), осложненным экзематизацией, позволяет поддерживать длительно состояние клинической ремиссии аллергодерматозов - от 6-12 мес.

2. Разработана методика культивирования Т. rubrum, получен и охарактеризован экстракт гриба.

3. Показано, что у 50%) больных онихомикозом, вызванным Т. rubrum, выявляются IgG-антитела к белкам гриба, белок с массой около 70 кДа распознается большинством сывороток. IgE-антител, специфичных к антигенам гриба, не выявлено. У 40% больных онихомикозом наблюдается повышенный уровень содержания общего IgE в сыворотке крови. У 45% больных наблюдается сенсибилизация к распространенным аллергенам.

4. Функциональная активность клеток врожденной системы иммунитета (нейтрофилов и макрофагов) у больных онихомикозом находится в пределах нормы.

5. Среди лимфоцитов снижено число CD8+ Т-клеток и увеличено число натуральных киллеров и активированных Т-клеток, что соответствует хроническому иммунному процессу. У 35% больных также выявляется клеточный ответ на антигены гриба. Анализ цитокинового профиля показал сдвиг в сторону Тх2 ответа.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для оптимизации терапии и удлинения сроков ремиссии пациентам с осложненными формами онихомикоза показано применение системной антимикотической терапии для поддержания клинической ремиссии ал л ергодерм атозов.

2. Больным осложненными формами онихомикоза рекомендуется терапия Румикозом по следующей схеме: по 200 мг 2 раза в день в режиме пульс-терапии (1-5-9 недель).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Иммунный статус у больных рубромикозом ногтей/ Свирщевская Е.В., Айрапетян H.P., Матушевская Е.В., Карпенкова С.В., Скрипкина П.А., Григорьев B.C. //Рос. журн. кожн. и венерич. бол. - 2008. - №2. - С.43-48.

2. Исследование IgG и IgE антител к антигенам T.rubrum у больных онихомикозом/ Свирщевская Е.В., Матушевская Е.В., Айрапетян Н.Р., Лещенко B.M. //Международный научно-практический журнал Иммунопатология, аллергология, инфектология. - 2009. - №2. - С.95-97.

3. Оптимизация методов лечения осложненных форм онихомикозов/ Матушевская Е.В., Карпенкова С.В., Айрапетян H.P., Свирщевская Е.В., Лещенко B.M. // II Поволжская науч.-практ. конф.: Актуальные вопросы дерматовенерологии. -Казань, 2007. - С.72-73.

4. Активация Т-хелперов и повышение IgE у больных онихомикозом, вызванного грибом Trichophyton rubum/ Свирщевская Е.В., Айрапетян Н.Р., Матушевская Е.В., Карпенкова С.В., Лещенко B.C. //Современная микология в России: Тез. докл. - M., 2008.-Т. 2.-С.449.

5. Сенсибилизация к распространенным аллергенам при онихомикозе, вызванном грибом Trichophyton rubum/ Свирщевская Е.В., Матушевская Е.В., Айрапетян Н.Р., Лещенко В.М., Павлова Г.В. //Тез. докл. Межрег. науч.-практ. конф. дерматовенеролов и врачей смежных спец.: Дерматовенерология - итоги первого этапа реформирования и перспективы развития. - Екатеринбург, 2008. - С.117-118.

Заказ № 24-а/07/09 Подписано в печать 20.06.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 649 83 30 www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

В настоящее время регистрируется высокий уровень заболеваемости дерматомикозами, особенно осложненными формами. Присоединение грибковой инфекции при различных заболеваниях кожи наблюдается особенно часто на фоне снижения общей иммунной резистентности больного. Наличие хронически текущей микотической инфекции- кожи предрасполагает к сенсибилизации иммунной системы антигенными* структурами клетки гриба. В этом случае возможно параллельное развитие атопической реакции макроорганизма и формирование аллергодерматозов. Известны работы по изучению антигенных свойств возбудителей микозов стоп и кистей, особенно широко распространенного гриба Trichophyton rubrnm. Считается, что микозы стоп — одна из основных причин развития экзематозных реакций. В то же время экзема микотического генеза. осложняет клинические проявления микозов стоп и составляет, по разным источникам, от 20% до 30% от всех дерматозов. Для такой формы экземы характерны острое течение процесса с наличием1 экзематидов и высокой1 частотой рецидивов. Роль микотической инфекции при аллергодерматозах и их взаимосвязи изучены, однако, все еще недостаточно. Особенности течения* осложненных форм дерматомикозов, требуют новых подходов к лечению таких пациентов. Анализ состояния иммунитета у этих больных на современном уровне позволит оптимизировать лечение больных с микозами, осложненными аллергодерматозами.

Патогенезу онихомикоза как ранее, так и сейчас уделяется недостаточное внимание. В большой мере заболевание рассматривается как косметологическое как врачами, так и больными. Лечение, дорогое и длительное, часто приводит лишь к временной ремиссии и может вызывать побочные эффекты. Для разработки успешной тактики ведения таких больных требуется понимание причин возникновения онихомикоза. Следует отметить усилия русских исследователей и врачей, которые активно занимались изучением особенностей патогенеза микозов, вызванных грибами

Trichophyton rubrum, в 70-90x годах прошлого века. Анализ литературы показал, что за последние 20 лет получено не так много новых данных по патогенезу заболевания. Это объясняется, по-видимому, тем фактом, что не было выявлено какого-либо значительного отклонения в функционировании разных систем организма при онихомикозе. Можно предположить, что ключевым предрасполагающим фактором является снижение бактерицидности кожи в районе ногтевого ложа, что приводит к удержанию мицелия гриба и его прорастанию в ткань ногтя. Особенности роста и структура мицелия трихофитона помогает ему колонизировать ногтевую пластину, куда нет доступа клеткам иммунной системы. Даже при наличии распознавания антигенов гриба клетками адаптивной* и врожденной системы иммунитета элиминация гриба возможно только из мягких тканей, снабженных кровеносными сосудами. Однако механизмы резистентности кожи к различным патогенам пока изучены плохо.

Известно, что кожа формирует эффективный барьер между окружающей средой и организмом, предупреждающий инвазию патогенов, защищающий от химических и физических воздействий среды, контролирующий потерю воды, солей и микроэлементов [Proksch, 2008]. Физический барьер локализуется, главным образом, в роговом слое и состоит из слоя безядерных клеток с ороговевшим остовом и элементами цитоскелета, соединенных десмосомами с соседними клетками, а также с межклеточным пространством, заполненным липидными молекулами, имеющими цитотоксическую активность. Эти липиды синтезируются кератиноцитами в процессе дифференцировки и транспортируются во внеклеточное пространство, где формируют ламиллярные тела. Оболочка ороговевшей клетки вместе с липидами формирует плотный полимер, к которому ковалентно присоединены церамиды А и В, на которые далее садятся свободные церамиды, жирные кислоты и холестерол из рогового слоя. Белок филаггрин перекрестно связывается с нитями кератина, формируя макрофибрилы. Формирование барьерной функции зависит также от цитокинов, циклического аденозиимоиофосфата и кальция. Известно, что нарушение барьерной функции кожи важны в патогенезе контактного дерматита, ихтиоза, псориаза и атопического дерматита. С большой вероятностью, именно нарушение состава секрета кожи является также предрасполагающим фактором онихомикоза. Изучение этого вопроса является делом будущего. Цель данной работы — определить особенности изменений в функционировании иммунной системы у больных с онихомикозом, используя все современные методы. Кроме того, мы провели клиническое исследование эффективности интраканазола (румикоза) для лечения онихомикозов, осложненных аллергодерматозами.

ВЫВОДЫ

1. Показана высокая эффективность (80 больных (93%), клинико-этиологическое излечение), безопасность (хорошая переносимость) и фармакоэкономичность румикоза по методу пульс-терапии при лечении больных онихомикозом, осложненными и неосложненными формами. Положительный клинико-этиологический эффект у 53 больных онихомикозом (96?6%), осложненным экзематизацией, позволяет поддерживать длительно состояние клинической ремиссии аллергодерматозов - от 6-12 месяцев.

2. Разработана методика культивирования T.rubrum, получен и охарактеризован экстракт гриба.

3. Показано, что у 50% больных онихомикозом, вызванным T.rubrum, выявляются IgG антитела к белкам гриба, белок с массой около 70кДа распознается большинством сывороток. IgE антител, специфичных к антигенам гриба, не выявлено. У 40% больных онихомикозом наблюдается повышенный уровень содержания общего IgE в сыворотке крови. У 45% больных наблюдается сенсибилизация к распространенным аллергенам.

4. Функциональная активность клеток врожденной системы иммунитета (нейтрофилов и макрофагов) у больных онихомикозом находится в пределах нормы.

5. Среди лимфоцитов снижено число CD8+ Т-клеток и увеличено число натуральных киллеров и активированных Т-клеток, что соответствует хроническому иммунному процессу. У 35% больных также выявляется клеточный ответ на антигены гриба. Анализ цитокинового профиля показал сдвиг в сторону Тх2 ответа.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Уровень заболеваемости онихомикозом различной этиологии, клинической формы и локализации повышается ежегодно на 5% [104]. На долю онихомикозов приходится около 30% всех кожных грибковых инфекций. Заболевание существенно снижает качество жизни и социальную адаптацию больных. Эти больные могут быть источником инфекции в семье и в закрытых коллективах. Наличие хронически текущей микотической инфекции кожи предрасполагает к сенсибилизации иммунной системы-антигенными структурами гриба. Тем самым онихомикозы могут как провоцировать, так и утяжелять течение различных аллергодерматозов иного генеза. Среди возбудителей онихомикозов стоп Trichophyton rubrum занимает первое место в странах Европы, в том числе и в России, где* на его долю приходится 80% выделенных культур дерматомицетов [105].

Считается, что микозы стоп являются' одной из основных, причин развития экзематозных реакций'. Известны работы по изучению антигенных свойств Trubrum. По данным* ряда авторов, отмечаются специфические кожные аллергические реакции с грибковыми аллергенами. Экзема микотического генеза осложняет течение микозов стоп и составляет, по разным источникам, 20-30% от всех дерматозов. Исследований по ассоциации грибковых инфекций с аллергическими реакциями» проводится мало. Следует отметить, что при аллергодерматозах значительную роль играет ответ по типу Т-хелперов 2, тогда как при онихомикозах имеющиеся данные свидетельствуют о преимущественной активации при ответе на грибы Т-хелперов 1-го типа [150, 185]. Роль микотической инфекции при. аллергодерматозах и их взаимосвязи изучены недостаточно. Особенности течения осложненных форм онихомикозов требуют новых подходов к лечению таких пациентов. Анализ состояния иммунитета у этих больных на современном уровне позволит оптимизировать лечение больных с онихомикозами, осложненными аллергодерматозами.

Целью исследования являлась оценка эффективности терапии больных осложненными формами, онихомикоза системным антимикотическим' препаратом Румикоз на основании изучения особенностей иммунитета больных с использованием антигенов гриба Т.rubrum.

В настоящее исследование было включено 86 амбулаторных больных (51 мужчина и 35 женщин)-в возрасте 16-60 лет, наблюдавшихся!в КВКД!№ 1 и № 29 г. Москвы с диагнозом онихомикоза стоп и/или кистей, вызванного T.rubrum. Диагноз устанавливался в каждом отдельном случае на основании клинического, микроскопического и культурального исследований: В ходе исследования больные были разделены на две группы. 1 группу составили 30 больных неосложненными формами онихомикоза, II группу— 56 больных онихомикозом, осложненным аллергодерматозами. Двое (4%) больных страдали онихомикозом стоп и кистей, 54 (96%) страдали онихомикозом стоп. Осложнения в виде дисгидротической экземы отмечены у 38 (68%) пациентов, микробной экземы - у 18 (32%) с числом рецидивов?не менее 4 раз в год. Больные в обеих группах были идентичны tпо тяжести'клинических проявлений онихомикоза, продолжительности > заболевания, возрасту, общему состоянию. Третья контрольная группа — доноры (здоровые лица):

Пациенты с онихомикозов1 в I и П< группах получали- системную антимикотическую терапию с применением отечественного препарата Румикоз по методу пульс-терапии. Лечение осложнений' онихомикоза осуществляли по общепринятым принципам лечения больных экземой, с учетом клинической картины, остроты процесса; его распространенности, переносимости и эффективности применяемого препарата, индивидуализировали их с учетом возможной висцеральной патологии.

В результате проведенного лечения в I и II группах полное клиническое и этиологическое излечение онихомикоза отмечено у 80 (93%) больных. Эти больные получили 3 курса пульс-терапии. При микологическом исследовании в конце лечения'мицелия и роста грибов не получено. Шести (7%) больным (2 пациента I группы и 4 пациента II группы) потребовался дополнительный курс терапии, который проводили на 13-й неделе. Наблюдение проводили около 2 лет. За это время с рецидивом онихомикоза обратилось 14 (16%) больных.

Более 93% пациентов оценили переносимость препарата на «отлично», 6,6% - на «хорошо», что выражалось в появлении побочных эффектов в виде тошноты, рвоты, диареи, болей в эпигастрии и правом подреберье, которые купировались сами собой в течение нескольких дней» и не требовали отмены препарата. У 100% пациентов биохимические показатели крови оставались в пределах нормы.

На фоне терапии онихомикоза препаратом Румикоз эффективным оказалось лечение его осложнений. В последующем, после излечения грибкового поражения стоп, экзема обычно протекала мягче, обострения были реже, ремиссии длительнее. За время нашего наблюдения в течение 612 мес обострение наблюдалось у 3 (3,4%) больных.

Исследование особенностей иммунитета больных онихомикозом представляет собой интересную и актуальную задачу. Работ, посвященных, изучению патогенеза заболевания, значительно меньше. За прошедшее десятилетие изменились методы анализа параметров иммунной системы, накоплены новые данные о функционировании иммунной системы. Поэтому мы провели определенную ревизию ранее полученным данным и перепроверили в свете новых данных ранее полученные результаты.

Один из очевидных вопросов в патогенезе микозов связан с участием фагоцитирующих клеток в защите от микотической инфекции. С одной стороны, есть данные, показывающие снижение количества клеток Лангерганса в очагах микотического поражения [198]. С другой стороны, показано, что в дерме больных онихомикозом увеличено число клеток Лангерганса и Т-клеток [223]. В литературе достаточно глубоко освещены выявленные у больных онихомикозом нарушения фагоцитоза, коррелирующие с тяжестью, длительностью течения и распространенностью микотического процесса [17, 62, 72, 88, 114, 121]. Поэтому одной из первых задач данного исследования была оценка количества и качества фагоцитов. Поскольку нарушения фагоцитоза должны наблюдаться в целом по организму, то мы провели анализ фагоцитирующей способности нейтрофилов и макрофагов крови и не выявили грубых нарушений фагоцитоза, осуществляемого этими клетками. Определенное снижение наблюдали на уровне тенденции (р^О, 12-0,06). Отсутствие значительных дефектов фагоцитоза у больных онихомикозом говорит о том, что эти^клетки могут выполнить свою функцию в тканях, однако не выполняют. Причин этого может быть несколько. Например, фагоциты плохо попадают в ткани, питающие ногтевую пластинку, из-за снижения экспрессии эндотелиальными клетками молекул воспаления и адгезии, привлекающих нейтрофилы! и макрофаги в эти ткани. Второй причиной локальной дисфункции фагоцитов может явиться увеличенная по сравнению с нормой микотическая нагрузка из-за снижения фунгицидной активности кожного сала. Третьей причиной) отсутствия фагоцитов в нужном месте может явиться наличие других хронических инфекционных заболеваний, отвлекающих на себя клетки, иммунной системы. У разных больных дебют заболевания может быть связан с одной или несколькими причинами-дисфункции фагоцитов. Однако только у больных с распространенными микозами не только ногтей, но и гладких тканей можно ожидать серьезного нарушения функции фагоцитов.

Вторым часто выявляемым дефектом у больных онихомикозом является дисфункция Т-клеток. По данным большинства авторов, у больных микозами, в том числе онихомикозами, наблюдается снижение относительного и абсолютного количества Т-лимфоцитов [62, 72, 121, 145, 161, 193, 201]. С другой стороны, также сообщается об отсутствии выраженных изменений количества Т-лимфоцитов и их субпопуляций у обследованных больных, что связывают с ограниченностью поражения и коротким сроком течения микотической инфекции [226].

О нарушении функциональной активности Т-лимфоцитов свидетельствует угнетение реакции бласт-трансформации и снижение индекса торможения миграции лейкоцитов как с неспецифическим (ФГА), так и со специфическим митогеном* (аллерген интердигитального и красного^ трихофитона) [121, 145, 201]. Следует отметить, что наиболее выраженное снижение функциональной активности Т-клеток наблюдается у больных экссудативной формой микоза с микидами или экзематизацией, при множественном онихомикозе [37, 120]. По данным В.А. Федотова (1991), иммунодепрессия Т-лимфоцитов, обнаруженная- у 75% больных, преимущественно генерализованным микозом кожи и ногтей, экссудативными формами микоза, характеризовалась низким уровнем ТРОК, недостаточным бластообразованием в присутствии ФГА и грибкового антигена, продукцией медиатора клеточного иммунитета, тормозящего миграцию лейкоцитов, отрицательными!замедленными кожными реакциями, на специфический аллерген и аппликации ДНХБ, а также уменьшением включения в ядра лимфоцитов НЗ-тимидина.

Под нашим наблюдением находились, больные, у которых микотическая инфекция, ограничивалась, поражением ногтевых пластинок. Для этой группы больных не было выявлено снижения пролиферации, вызванной поликлональным стимулированием (реакция бласт-трансформации). Более того, мы выявили у 38% больных ответ на антигены гриба, тогда как у доноров этот ответ отсутствовал. Естественно, что с распространенностью процесса нагрузка на иммунную систему возрастает, что может приводить к истощению ее резервов.

Типирование различных иммунных заболеваний на Txl- и Тх2-ассоциированные помогает понять основной тип распознаваемого антигена. Так, при преимущественном ответе по Txl типу следует ожидать наличие хронических вирусных инфекций, а при ответе по Тх2 типу — паразитарных, бактериальных и аллергических. Для онихомикоза* серьезных работ по определению типа Т-клеточного ответа не проводилось. В литературе есть ряд данных, показывающих, что у больных дерматомикозами в коже осуществляется полноценный Txl ответ с высокой продукцией ИФН-г и ИЛ

8, продуцируемого Т-клетками и нейтрофилами, соответственно [185]. В дерме и эпидермисе наблюдается-увеличение числа" клеток Лангерганса и Т-клеток [223]. Кератиноциты кожи продуцируют высокий уровень, гуморальных факторов в ответ на антигены трихофитона [185]. Сохранение лимфокиносинтезирующей активности Т-лимфоцитов у больных микозами, вызванными Т.гиЪгит, сообщается и другими, авторами [48]. Полученные нами данные дали совершенно другой результат. Основной» тип ответа на поликлональный стимул у этих больных больше походил на ответ Тх2 клеток с повышенной^продукцией ИЛ-4 и -5 и снижением ИФН-г.

Данные литературы о количестве В-лимфоцитов при микозах противоречивы, что, вероятно, связано с различным контингентом* обследованных лиц. Снижение количества В-лимфоцитов наблюдается1 преимущественно у больных с распространенным, длительно текущим микотическим процессом^ [88, 120], повышение - при эксудативных формах микоза с длительностью заболевания не более 5 лет, ограниченным^ онихомикозом- [37, 121]. Одним из наиболее интересных для нас вопросов' было изучение, наличия гиперчувствительности' I типа к. антигенам гриба: Литературные данные показали, что реактивность такого типа- выявляется только методом кожных проб [154, 230], тогда как методом ИФА не было выявлено IgE к антигенам трихофитона у больных онихомикозом [166]. Сообщалось также о случае астмы, вызванной, гиперчувствительностью к трихофитону [151]. Лечение противомикотическими препаратами привело к разрешению астмы, и собственно микоза. В литературе есть, описания отдельных клинических случаев, когда у больных наблюдается-формирование IgE к антигенам гриба [155, 200]. Таким образом, можно было ожидать наличия сенсибилизации к грибам у больных онихомикозом. Полученные ранее отрицательные данные по* выявлению IgE-антител методом ИФА могли быть связаны с плохими экстрактами, используемыми для анализа. Мы провели отдельный поиск статей, в которых бы был приведен форез или блот белков трихофитона. Из двух статей результаты лучшей приведены в обзоре литературы. В связи с этой ситуацией мы провели работу по получению и характеристике антигенов гриба трихофитон.

В процессе анализа гуморального ответа на антигены гриба было показано, что сыворотки больных распознают их за счет связывания JgG. IgE к этим антигенам нам выявить не удалось. Выделение антигенов гриба показало, что его мицелий содержит достаточно малое количество цитоплазмы, и сам процесс выделения представляет значительную трудность. Это означает, что, находясь в ногтевой пластинке, гриб выделяет мало белков, которые могли бы распознаваться иммунной системой. В этом смысле такое «тихое» поведение позволяет избегать, внимания со стороны иммунитета больных.

Анализ литературных данных показал, что при онихомикозах обнаруживают множественные нарушения в функционировании различных органов и систем, включая иммунную систему. Совершенно очевидно, что< причиной возникновения большинства инфекционных заболеваний, в равной степени это относится и к микозам, является не просто возбудитель, а взаимодействие возбудителя и организма. Патогенность возбудителя и восприимчивость организма рассматриваются как факторы, определяющие это- взаимодействие [9, 13]. Патогенность грибов-дерматомицетов проявляется в их способности выживать и расти в ткани» ногтей при снижении защитных сил организма либо при наличии врожденного дефекта барьерных тканей, к которым относятся кожа и ногти. Наличие врожденного дефекта эпителиальных тканей у части больных онихомикозом можно предположить по ассоциации микоза с различными заболеваниями желудочно-кишечного тракта [40, 58, 64, 94, 120] и атопическими заболеваниями [61, 221, 222]. Стигмы атопии рассматриваются как фактор, способствующий развитию микотического процесса, и регистрируются у взрослых больных микозами в 5 раз чаще, а у детей в 3 раза чаще, чем у лиц, их не имеющих [Sveagaard S., 1982]. Микозы нередко встречается у лиц с такими кожными заболеваниями, как гипергидроз, ладонно-подошвенный кератоз, аллергодерматоз, ихтиоз, инволюционный гипогидроз, пустулезный бактерид Эндрюса и др. [26, 29, 45, 55, 59, 61, 95, 125]. На настоящий момент данных о состоянии кожного барьера (его бактерицидность, проницаемость для воды, рН, уровень сала) при онихомикозе, да и при других кожных заболеваниях нет. Нам кажется, что именно состояние кожного барьера с его неспецифическими факторами защиты играет решающую роль в фирмировании первичного очага микоза.

Онихомикоз, вызванный колонизацией ногтей грибами Т.rubrum, часто имеет ограниченный характер и протекает хронически. Многие больные рассматривают заболевание как косметический дефект и не обращаются к врачу. Однако в ряде случаев заболевание начинает прогрессировать, инфекция переносится на соседние ногти, иногда переходя на кожу. У некоторых больных наблюдаются осложненные формы онихомикоза, при которых не ясна связь между онихомикозом и кожными проявлениями. Возможно, что грибковая* инфекция вызывает сенсибилизацию иммунной системы на антигены гриба, что и приводит к аллергическим проявлениям на коже. С другой стороны, онихомикоз может чаще развиваться у людей с предрасположенностью к аллергическим реакциям на коже. Проведенное нами исследование отвечает на ряд этих вопросов. Так, мы показали, что у больных онихомикозом наблюдается активация Тх2 клеток, повышена продукция IgG, распознающих антигены гриба, в 30-40% случаев несколько повышен общий IgE крови, выявляются IgE-антитела к аллергенам стандартной панели. Все это означает, что даже при отсутствии кожных осложнений иммунная система реагирует на имеющуюся инфекцию, но не может полностью элиминировать патоген. Как и в случае с другими инфекциями, когда иммунная система не справляется, происходит локализация инфекции за счет создания ограниченного барьера: изменяется структура ногтя, вокруг инфицированного ногтя* концентрируются иммунные клетки. Наличие только одного пораженного ногтя означает, что иммунная система справляется с функцией контроля- инфекции в остальных ногтевых пластинках. Снижение иммунных показателей неизбежно приведет к распространению^ процесса. Поэтому противогрибковая терапия; уменьшающая патогенную нагрузку, позволяет, во-первых, разгрузить иммунную5 систему, а, во-вторых, предотвратить/замедлитьfраспространение' инфекции. В настоящий момент эффективная противогрибковая терапия возможна только при применении системных препаратов, что связано^ с недостаточной* эффективностью доставки наружных препаратов в «плотную ткань ногтя. Системная противогрибковая^ терапия остается достаточно токсичной. Появление препаратов нового поколения на основе итраконазола позволило разработать схемы пульс-терапии, снижающие суммарную дозу получаемого* препарата при сохранении.- высокой клинической эффективности. Таким образом, полученные в данной работе' результаты показывают, что даже при неосложненных формах онихомикоза заболевание не является косметическим, оно приводит к постоянной* нагрузке на иммунную систему, что-снижает общий потенциал иммунитета в контроле за другими инфекциями.

Вторым неясным вопросом остается взаимосвязь онихомикоза и атопических проявлений на коже. Полученные в работе данные показали, что» в группе осложненного онихомикоза все показатели, характерные- для неосложненной формы заболевания, обостряются в. еще большей мере: растет число активированных HLA-DR+CD3+ Т-лимфоцитов, отмечается более высокий уровень Т-2 цитокинов, распознается, большее количество белков гриба. С другой стороны, эта взаимосвязь не является результатом' сенсибилизации организма на антигены гриба, так как специфичных IgE выявлено не было. Соответственно, мы можем сделать вывод, что атопическая реакция и онихомикоз являются ассоциированными, но независимо возникающими событиями. Независимость ассоциации онихомикоза и атопического дерматита подтверждают полученные нами данные о повышенном уровне общего IgE в сыворотке крови, а также наличии IgE к респираторным и бытовым аллергенам при отсутствии IgE к антигенам гриба T.rubrum. Наличие одной инфекции приводит к реактивации Т- и В-клеток памяти, специфичных к другим антигенам. Такие Т-клетки мигрируют в воспалительные очаги, отмеченные повышенной экспрессией молекул адгезии на клетках эндотелия. Соответственно, излечение одного их хронических процессов будет снижать тяжесть течения имеющихся других. Поскольку аллергодерматозы являются конституционным состоянием (понижены барьерные функции кожи, повышено поступление через кожу чужеродных веществ, распознаваемых иммунной системой как патогены), то его эффективное лечение на настоящий день невозможно. С другой стороны, онихомикоз вызывается патогеном, элиминация которого вполне возможна. Именно поэтому лечение онихомикоза положительно отражается на ассоциированных с атопией кожных проявлениях, позволяя достигать более длительной ремиссии, что и было показано в данной работе.

99