Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Эффективность неспецифической ингаляционной иммунотерапии Рузамом при атопической бронхиальной астме

00500783а

На правах рукописи

ТЕРЕХОВ Дмитрий Валентинович

ЭФФЕКТИВНОСТЬ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ИНГАЛЯЦИОННОЙ ИММУНОТЕРАПИИ РУЗАМОМ ПРИ АТОПИЧЕСКОЙ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЕ

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 6 янвта

Москва-2012

005007839

Работа выполнена в ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Минзравсоцразвития России

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

профессор НЕНАШЕВА Наталья Михайловна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор ГАРИБ Фируз Юсупович доктор медицинских наук ОСИПОВА Галина Леонидовна

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет» Минзравсоцразвития России

Защита состоится «15» февраля 2012 г. в 10:00 на заседании диссертационного совета Д.208.071.04 при ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Минзравсоцразвития России по адресу: 123995, г. Москва, ул. Баррикадная, д. 2/1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ДПО РМАПО Минзравсоцразвития России (125445, г. Москва, ул. Беломорская, д. 19/3 8).

Автореферат разослан «&)> ^ЛЪ^лЛЛ 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета д. м. н., профессор

ЛУГОВСКАЯ С. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Бронхиальная астма (БА) - глобальная проблема мирового здравоохранения: в мире насчитывается около 300 млн. лиц, страдающих данной патологией [GINA, updated 2009]. Частота встречаемости БА в разных странах мира составляет от 1 до 18% населения. За последние два десятилетия произошло много научных открытий, которые расширили наши представления о патогенезе и механизмах развития БА, а также факторах, усугубляющих течение заболевания. В 90-е годы на основании многочисленных исследований в рамках проекта «Геном человека» была доказана генетическая обусловленность атопии [Armandola Е.А., 2003], повышения синтеза иммуноглобулина Е (IgE) [Meyers D.A., 1999], феномен бронхиальной гиперреактивности (БГР) [Чучалин А.Г., 2001]. Выявлена хромосомная локализация (в 5-й хромосоме) генов, отвечающих за выработку важнейших интерлейкинов (ИЛ) -3, 4, 5, 9, 13, являющихся маркерами аллергического воспаления [Meyers D.A., 1999], обнаружено 9 мутаций гена р2-адренорецептора [Чучалин А.Г., 1999; Meyers D.A., 1999], мутации гена 5-липооксигеназы [Lamdercht D.N. et al., 1998], лежащих в основе фармакогенетики и фармакотерапии астмы.

Современная терапия БА основывается на данных генетики, иммунологии, теории хронического аллергического воспаления и включает профилактическое и патогенетическое направления. Не умаляя достижения мировой фармакологической науки в процессе контроля аллергического воспаления, на первый план выходят проблемы профилактики аллергии, связанные с поиском биологических маркеров, отражающих ранние стадии воспалительного аллергического процесса и возможности их коррекции. Эти исследования тесно связаны с определением протеомной карты человека. Наука «протеомика», изучающая структуру, функции и взаимодействие внутриклеточных белков, занимает ведущее место в постгеномной фармакологии. Пептиды рассматриваются, с одной стороны, как биомаркеры патогенеза, с другой, как возможные терапевтические молекулы. Иммунотерапия с использованием регуляторных эндогенных и экзогенных пептидов -новое, быстро развивающееся направление в терапии БА [Holgate S., 2000; Kay A.B., 2003; Lärche M., 2003]. К препаратам группы экзогенных пептидов относится российский противоаллергический

препарат Рузам, экстрагированный из термофильного активного штамма Staphylococcus aureus С2, прошедший термическую стадию обработки и оказывающий противоаллергическое и противовоспалительное действие на некоторые клеточные (эозинофилы, нейтрофилы, тучные клетки) и гуморальные (Ig Е, ингибирование реакции пассивной кожной анафилаксии) мишени аллергического воспаления [Колганова Н.А., 2002; Чучалин А.Г., Ковалева B.JL, Колганова Н.А.,2003].

До недавнего времени Рузам вводился только подкожно и интраназально, что имело определенные недостатки. Введение препарата подкожно требовало постоянного контроля врача и временных затрат, а применение Рузама интраназально показано для лечения больных аллергическим ринитом. В связи с этим представляется актуальным изучение нового пути введения препарата Рузам, который был бы безопасен, эффективен, не требовал много времени на курс лечения и по возможности сокращал количество визитов пациента к врачу. Таким методом лечения может быть ингаляционная терапия Рузамом. В связи с этим актуальным является проведение открытого рандомизированного, плацебо-контролируемого проспективного исследования

противоаллергической и противовоспалительной активности ингаляционной формы препарата Рузам в терапии БА.

Цель исследования. Оценить эффективность и безопасность противоаллергического и противовоспалительного действия ингаляционной формы препарата Рузам в терапии больных бронхиальной астмой, используя комплексную оценку с включением клинико-функциональных показателей и маркеров воспаления.

Задачи исследования:

1. Оценить клинико-функциональную эффективность лечения Рузамом (ингаляционной формы) в комбинации с ингаляционными глкжокортикостероидами (ИГКС) по сравнению с плацебо+ИГКС больных неконтролируемой атопической БА легкого и среднетяжелого течения.

2. Определить влияние неспецифической иммунотерапии Рузамом в комбинации с ИГКС по сравнению с плацебо+ИГКС на аллергическое воспаление в нижних дыхательных путях, используя неинвазивные методы оценки воспаления: уровень неспецифической БГР и оксида азота в выдыхаемом воздухе (NOex), и инвазивные

методы: определение IgE в сыворотке крови и маркеров воспаления (интерферона-гамма (ЙФН-у), эозинофилъного катионного протеина (ЕСР), нейтрофильной эластазы (НЭ), ИЛ-4, клеточного состава) в сыворотке крови и индуцированной мокроте.

3. Изучить влияние ингаляционной формы препарата Рузам на частоту ОРВИ и уровень ИФН-у в сыворотке крови и индуцированной мокроте.

4.0пределить длительность эффекта неспецифической иммунотерапии Рузамом (ингаляционной формы) в комбинации с ИГКС путем изучения частоты обострений БА, объема базисной терапии, динамики клинико-функциональных и лабораторных показателей через 6 месяцев после окончания терапии 5. Изучить безопасность иммунорегуляторного препарата Рузам для ингаляционного применения с помощью регистрации нежелательных побочных эффектов.

Научная новизна. Впервые в отечественной практике на достаточном клиническом материале проведено открытое рандомизированное, плацебо-контролируемое проспективное исследование и показано противоаллергическое и противовоспалительное действие ингаляционной формы препарата Рузам в комплексе с ИГКС у больных неконтролируемой атопической БА.

Впервые показана эффективность и безопасность новой формы доставки отечественного препарата Рузам для ингаляционного применения по сравнению с плацебо у больных неконтролируемой атопической БА.

Показано влияние неспецифической иммунотерапии Рузамом в комбинации с ИГКС на аллергическое воспаление в нижних дыхательных путях, характеризующееся снижением уровня неспецифической БГР, >Юех, эозинофилов и ЕСР в сыворотке крови и индуцированной мокроте.

Впервые показано влияние терапии Рузамом на продукцию ИФН-у, уровень которого в индуцированной мокроте больных увеличился с 48(28,5-84,5) пг/мл до 268(127,8-385,3) пг/мл, р=0,011, что сопровождалось уменьшением частоты ОРВИ у пролеченных пациентов в 2,5 раза (р=0,0034) и связанных с ними обострений БА в 3 раза (р^О,000027).

Проведение исследования клинико-функциональных и лабораторных показателей через 6 месяцев после лечения Рузамом+ИГКС выявило сохранение достигнутого клинико-функционального контроля, дальнейшее снижение ЕСР в сыворотке крови и индуцированной мокроте.

Практическая зпачимость работы. Выявленная в результате исследования эффективность и безопасность комбинированной терапии Рузамом (раствор для ингаляций)+ИГКС у больных неконтролируемой атопической БА легкого и среднетяжелого течения, позволяет рекомендовать этот метод лечения в реальную клиническую практику.

Комбинированная терапия Рузам (раствор для ингаляций)+ИГКС позволяет лучше контролировать симптомы аллергического воспаления, снижает количество обострений БА, уменьшает объем симптоматической терапии, снижает частоту ОРВИ.

Внедрение в практику более удобной для врача и пациента новой лекарственной формы препарата Рузам позволит повысить эффективность лечения больных персистирующей бронхиальной астмой и сократить временные затраты на лечение, что приведет к экономии ресурсов здравоохранения.

Доказана целесообразность исследования уровня N0^ у больных атопической БА для определения эффективности проводимой противоастматической терапии.

Показана высокая информативность АСТ-теста и АСС)-вопросника, коррелирующих между собой и с клинической оценкой, функциональными показателями, маркерами воспаления.

Комплексное обследование, а также оценка состояния в динамике на фоне комбинированной терапии (ИГКС+Рузам - раствор для ингаляций) у пациентов с легкой персистирующей и среднетяжелой атопической БА должны дополняться оценкой воспаления, что обеспечит индивидуальный и более объективный подход к пациенту и оптимизирует достижение контроля БА. Основные положения, выносимые па защиту 1. Препарат Рузам (раствор для ингаляций) в комбинации с ИГКС эффективен при лечении неконтролируемой атопической БА легкого персистирующего и среднетяжелого течения, что подтверждает положительная динамика клинико-функциональных

показателей и маркеров воспаления в сыворотке крови и индуцированной мокроте.

2. Комбинированная терапия Рузамом (раствор для ингаляций)+ИГКС приводит к значимому снижению обострений БА за счет достижения более стабильного контроля БА, повышения содержания ИФН-у в индуцированной мокроте и уменьшения частоты ОРВИ у пролеченных пациентов.

3. Анализ эффективности комбинированной терапии Рузам+ИГКС атопической БА легкого персистирующего и среднетяжелого течения должен быть комплексным и включать клинико-функциональные параметры и маркеры аллергического воспаления, что позволяет проводить более объективную оценку состояния БА и эффективности противоастматической терапии.

4. Рузам в дозе 2,5 мл 1 раз в день в течение двух недель хорошо переносится и безопасен в терапии пациентов с атопической БА.

Внедрение в практику: Результаты исследований внедрены в практику работы аллергологического отделения ГКБ №52 и поликлинического консультативного аллергологического центра на базе ГКБ №52 г. Москвы, а также включены в материалы лекций, практических и семинарских занятий на кафедре клинической аллергологии РМАПО.

Апробация диссертации. Основные результаты диссертации доложены на конференции молодых ученых РМАПО (Москва, 27 апреля 2011 г.), XI Международном конгрессе: «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии» (Москва, 7 июля 2011 г.).

Апробация диссертационной работы проведена на совместной научной конференции кафедры клинической аллергологии ГБОУ ДПО РМАПО и сотрудников Городской клинической больницы №52 г. Москвы (21.09.2011).

Публикации результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них 2 работы в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ; 1 работа в журнале Allergy Европейского общества аллергологов и иммунологов.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 168 страницах машинописного текста, содержит 22 таблицы, иллюстрирована 19 рисунками и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов

собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложения. Библиографический указатель содержит 241 источник литературы, из которых 68 - в Российской и 173 - в зарубежной печати.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Клиническая характеристика больных. В настоящем открытом рандомизированном, плацебо-контролируемом проспективном исследовании проведена оценка эффективности и безопасности ингаляционной формы препарата Рузам у больных персистирующей атопической (БА) легкого и среднетяжелого неконтролируемого течения. Дизайн исследования представлен на рис. 1.

Препарат Рузам ингаляционная форма по 2.5 мл 14 днем

ИГКС

Вбодныи период (1 неделя}

Плацебо (0,9% NaCI ингаляционно} по 2,5 ил 14 дней

-не 1елп 2 БПЗИТ

Ч E.I13I IX

Рис. 1. Дизайн исследования.

Критерии включения в исследование:

1. Возраст 18 - 65 лет.

2. Наличие установленного диагноза персистирующей атопической БА легкой и средней степени тяжести течения (GINA, 2006) в течение не менее 2 лет.

3. Наличие клинических проявлений БА в период исследования с общим показателем симптомов не более 8 баллов за сутки.

4. Наличие информированного согласия пациента и разрешения этического комитета.

5. Женщины, обладающие детородной способностью, должны иметь отрицательный результат анализа мочи на беременность.

Критерии исключения:

1. Терапия системными кортикостероидами в течение 6 месяцев до включения в исследование.

2. ОРВИ и клинически значимые обострения хронических воспалительных заболеваний дыхательных путей в течение 3 недель до включения в исследование.

3. Декомпенсированные соматические заболевания.

4. Постоянное использование антигистаминных препаратов

5. Стаж курения более 10 пачек-лет.

6. Обострение хронических заболеваний.

Обследовано 102 пациента с верифицированным диагнозом бронхиальной астмы. Критериям включения/исключения соответствовали 63 пациента с атопической БА легкого персистирующего (п=30) и среднетяжелого (п=33) неконтролируемого течения.

Группы больных, включенных в исследование, были сопоставимы по основным характеристикам. Все пациенты, включенные в исследование, имели атопическую форму БА, у абсолютного большинства больных выявлялась полисенсибилизация к неинфекционным аэроаллергенам. Наследственный анамнез по БА и атопии был отягощен у 31 (49%) и 9 (14%) больных соответственно.

План исследования предусматривал период включения в исследование (1 неделя), рандомизационный визит, промежуточный визит 2 (через 1 неделю лечения), контрольный визит 3 (через две недели лечения), во время которого проводилась оценка эффективности и безопасности проведенного лечения, и заключительный визит (через 6 месяцев) для оценки отдаленных результатов.

После завершения недельного вводного периода пациенты были рандомизированы в две группы методом случайной выборки: первая группа получала лечебный курс препарата Рузам, вторая группа пациентов (группа контроля) получала, в качестве плацебо, 0,9% раствор ИаС1. Лечебный период составил 2 недели, в течение которого проводились ингаляции раствора Рузама или №С1 через небулайзер по 2,5 мл один раз в день. Выбор схемы терапии основывался на рекомендациях фирмы-производителя ООО «Рузам-М». Все больные получали базисную терапию ИГКС в виде моно-или комбинированной терапии (ИГКС и длительно действующий (32-агонист (ДДБА), в соответствии с рекомендациями США 2006. Фармакотерапия оставалась постоянной во время вводного и лечебного периодов исследования. Для купирования симптомов

астмы использовался короткодействующий (32-агонист (Сальбутамол). Группы больных не отличались по тяжести БА и объему терапии (табл. 1).

Показатель Больные, получающие Рузам+ИГКС Больные, получающие плацебо+ИГКС

Пол (мужчины/женщины 17/14 22/10

Возраст 36,3±13,3 33,3±14,9

Легкая персистирующая БА 17 13

Среднетяжелая БА 14 19

Длительность БА (лет) 14,03±11,41 13,4 ±10,04

Возраст дебюта БА 21,03±12,5 19,0±11,8

Характеристика препарата. Препарат Рузам был разработан на базе НИИ пульмонологии и представляет собой фильтрат культуры термофильного штамма Staphylococcus aureus, получаемый по оригинальной технологии (патент № 2641293 а/с 873684 и 43320 38/28-14 1978 и 1987 гг.). Методом ионообменной хроматографии установлено, что по химической структуре Рузам является липопротеином (пик в зоне пептидов с молекулярной массой от 6000 до 13000 Дальтон). Препарат Рузам представляет собой прозрачную бесцветную жидкость, с содержанием белка 0,02-0,04 мг/мл, рН от 6,5 до 7,5, стерилен и нетоксичен. Разрешение Фармакологического Комитета на проведение клинического исследования ингаляционной формы Рузама№ 020706 получено 10.07.2009. Исследование проведено по протоколу, утвержденному на заседании локального комитета по этике ГОУ ДПО РМАПО от 02.06.2009. Методы исследования

1. Общеклиническое обследование включало изучение жалоб, анамнеза, методы объективного и инструментального исследования (общий анализ крови, мочи, биохимический анализ крови, ЭКГ).

2. Специфическое аллергологическое обследование включало: аллергологический анамнез; кожные аллергические пробы с неинфекционными аллергенами.

и

3. Оценка клинических симптомов. На протяжении вводного и лечебного периода исследования, а также в течение одной недели через 6 месяцев после лечения все пациенты вели дневник самоконтроля, где отмечали выраженность симптомов БА (приступы удушья, пробуждения, вызванные симптомами БА; потребность в ß2-агонистах; фиксировались значения утренних и вечерних измерений пиковой скорости выдоха (ПСВ). Степень выраженности симптомов оценивали по четырехбалльной шкале, учитывая отдельно ночные и дневные симптомы.

4.Функциональные методы обследования. Для изучения функции внешнего дыхания (ФВД) использовали спирометрию. Исследование проводили на приборе «MASTER SCREEN BODY» фирмы «JAGER» с определением дыхательных объемов и расчетом скоростных показателей по кривой «поток-объем». При динамическом исследовании основным показателем был выбран объем форсированного выдоха за первую секунду (ОФВ] (% от должного)) как наиболее легко воспроизводимый и высокочувствительный при БА.

Оценку ПСВ и ее мониторирование проводили с помощью пикфлоуметра фирмы «Clement Clarke International».

Для определения порога неспецифической БГР проводился тест с метахолином (Acetyl-ß-methycholine chloride, SIGMA). Применяли дозовый метод с помощью компрессорного небулайзера фирмы «Пари». Тест выполнялся в соответствии с рекомендациями Европейского респираторного общества (ERS). Тест считался положительным при снижении ОФВ]На 20% от базового значения, и концентрация раствора метахолина, приведшая к такому снижению, считалась пороговой концентрацией (ПК20).

5. Определение NOex. Измерения NOex производили с помощью портативного прибора NIOXMINO; AerocrineAB, производства Швеции. Прибор рекомендован к применению Европейским респираторным и Американским торакальным обществами. Прибор функционирует на основании электрохимического анализа выдыхаемого воздуха. В качестве контрольной группы было обследовано 7 здоровых лиц (4 мужчин и 3 женщины). Уровень NOex у них составил Ме=10 (5-И 7) ppb.

6. Исследование индуцированной мокроты. Индуцированную мокроту получали с помощью 3-4-5% раствора NaCl по методу

Попова. Для индукции мокроты нами использовался ультразвуковой небулайзер фирмы Omron Micro AIR с мощностью распыления от 0,25 мл/мин, средним размером распыляемых частиц менее 5 мкм. Образцы мокроты собирались в стерильные контейнеры. Исследование мокроты проводилось не позднее чем через два часа после ее получения. Затем готовились мазки для изучения клеточного состава мокроты. Полученный материал подвергали гомогенизации с использованием раствора дитиотреитола (DTT) 0,1%. Полученную смесь взбалтывали в течение 15 минут на водяной бане при комнатной температуре для отделения слизи. Далее добавляли 4 объема фосфатно-солевого буфера, встряхивание было продолжено в течение 5 мин. Смесь фильтровали через нейлоновую марлю и центрифугировали в течение 10 минут при 1 ООО оборотах в минуту. Полученный супернатант сохраняли при температуре -70°С для последующего определения ЕСР, ИФН-у.

7. Лабораторные методы. Уровень IgE в сыворотке крови определяли иммуноферментным методом с помощью диагностических наборов «IgE общий-ИФА-БЕСТ» производства компании Вектор-Бест в соответствии с инструкцией производителя. Нормальные показатели IgE в сыворотке крови у взрослых, по данным лаборатории, составляют от 15 до 140 МЕ/мл.

Определение уровня ИФН-у в супернатанте индуцированной мокроты проводилось методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием наборов моноклональных антител («Вектор Бест», Новосибирск). Анализ был проведен в парных образцах. Все процедуры по определению и выделению образцов были проведены согласно рекомендациям и ограничениям производителя. В качестве контрольной группы уровень ИФН-у в индуцированной мокроте определялся у 5 здоровых лиц (2 мужчин и 3 женщины) и составил Ме=37(17-63) пг\мл.

Определение содержания ЕСР в сыворотке крови и супернатанте индуцированной мокроты пациентов проводили иммунохемилюминесцентным методом на приборе «UniCAP 100» («Phadia», Швеция) с применением реагентов для определения ЕСР, согласно инструкции производителя. Содержание ЕСР в сыворотке крови здоровых лиц составляет до 15 мюг/л, а в индуцированной мокроте до 12 мкг/л (по данным лаборатории Фидес Лаб).

В совместном исследовании с доцентом кафедры биохимии РМАПО Е.А. Нешковой проводилось определение активности НЭ в сыворотке крови спектрофотометрическим методом с использованием синтетического субстрата BOC-Ala-ONp (N-тетр-бутокси-карбонил-аланин-нитрофениловый. Нормальный уровень активности НЭ у здоровых доноров составляет 200±34 мЕ/мл.

Определение активности Алъфа-1 -антитрипсина (al-AT) в сыворотке крови выполнялось по унифицированному методу В.Ф. Нартиковой и Т.С. Пасхиной с помощью спектрофотометра любого типа. Активность al-AT в норме для сыворотки крови взрослого человека равна 29.9 ±1.2 ИЕ/ мл.

8. Оценка контроля бронхиальной астмы. Вопросник «АСТ» (Asthma Control Test) - тест по контролю БА. Тест состоит из 5 вопросов, ответы на которые представлены в виде пятибалльной оценочной шкалы. Результатом теста является сумма ответов в баллах. Вопросник по контролю астмы (ACQ - Asthma Control Questionnaire), включает 5 пунктов. Оценка выраженности симптомов происходит по визуально-аналоговой балльной шкале от 0 баллов (симптом отсутствует) до 6 баллов - максимально выраженный симптом. Вопросники заполнялись больными самостоятельно до начала лечения, сразу после лечения и через 6 месяцев после курса лечения Рузамом.

9. Оценка безопасности терапии. Безопасность терапии определялась путем выявления нежелательных побочных явлений с помощью опроса пациентов на плановых визитах с оценкой контроля жизненно важных функций, проведения клинического и биохимического анализов крови до и после лечения, исследования общего анализа мочи и ЭКГ до и после лечения.

Ю.Методы статистической обработки. Статистическая обработка данных производилась с помощью пакета «Statistica» версии 6.0. компании «StatSoft 1пс». Качественные переменные описывались отношением шансов. В случае ненормального распределения признаков использовали непараметрические методы (описательная статистика проводилась с помощью Me[Ql; Q3]. Для сравнения показателей в независимых группах использовался тест Манна-Уитни, для сравнения показателей внутри группы — тест Вилкоксона). Различия в группах считались значимыми при р< 0,05. Анализ связей между группами проводили с помощью ранговой

корреляции по Спирмену. В случае нормального распределения использовались параметрические методы (описательная статистика проводилась с помощью M±s).

Результаты собственных исследований

Оценка эффективности и безопасности проводимого лечения основывалась на динамике следующих параметров: клинических симптомов БА, данных функциональных и лабораторных показателей. Критерием эффективности терапии являлась также оценка уровня контроля БА.

Через 2 недели лечения у больных, получавших ингаляционную терапию Рузам+ИГКС, отмечена значимая положительная динамика дневных (исходно Мс=1,3(0,5+2,0), сразу после лечения Ме=0,6(0-1,5), р=0,0018) и ночных (исходно Ме= 1,1 (0,5+2,0), сразу после лечения Ме=0,86(0-1,7), р-0,022) симптомов. В группе плацебо+ИГКС также отмечалась значимая положительная динамика дневных (исходно Ме=1,35(0,5+2,0), сразу после лечения Ме=0,4(0,24,0), р-0,006) и ночных (исходно Ме= 1,18(0,55-1,95), сразу после лечения Ме=0,6(0,2-1,2), р-0,003) симптомов. Уменьшение выраженности симптомов в группе плацебо+ИГКС объясняется, по-видимому, эффектом «плацебо». Подтверждением данного факта является то, что в этой группе снизились только субъективные показатели, объективные же показатели (ПСВ, ОФВь БГР и др.) остались без динамики (табл. 3), в отличие от больных, получавших Рузам+ИГКС.

Через 6 месяцев после окончания курса лечения Рузам+ИГКС, несмотря на сохранение снижения дневных (р=0,65) и ночных (р=0,95) симптомов, данные утеряли статистическую значимость по сравнению с показателями, полученными сразу после лечения. В группе плацебо+ИГКС отмечалось статистически незначимое повышение суммарной балльной оценки дневных (р=0,22) и ночных (р=0,5) симптомов, по сравнению с показателями, полученными сразу после лечения.

Снижение балльной оценки дневных и ночных симптомов сопровождалось значимым (р=001 ) снижением потребности в симптоматической бронхолитической терапии, по сравнению с исходными данными в группе Рузам+ИГКС. На фоне терапии плацебо+ИГКС не произошло статистически значимого (р=0,37) снижения потребности в ингаляциях Сальбутамола. Через 6 месяцев

после окончания курса лечения Рузам+ИГКС отмечалось незначимое (р=0,47) увеличение потребности в быстро действующих р2-агонистах. В группе плацебо+ИГКС у больных произошло значимое (р=0,036) увеличение потребности в препаратах для купирования приступов БА (рис. 2).

Рис. 2. Динамика потребности в р2- агонистах.

При оценке показателей пикфлоуметрии, сразу после окончания курса терапии Рузам+ИГКС отмечалось значимое увеличение утренних значений ПСВ (исходно Ме=406(317+500), сразу после лечения - Ме=425(345+493), р=0,042) и тенденция (р=0,072) к увеличению вечерних значений ПСВ. В группе плацебо+ИГКС не отмечалось повышения ПСВ как в утренние, так и вечерние часы. Через 6 месяцев показатели ПСВ у больных обеих групп остались без существенных изменений.

При проведении спирометрии выявлено значимое увеличение ОФВ1 в группе больных, лечившихся Рузамом+ИГКС, исходно Ме=91(81-^-101), сразу после лечения - Ме=94(88+105), р=0,015. В группе плацебо+ИГКС увеличения ОФВ1 не произошло. Спустя 6 месяцев после лечения показатель ОФВ, существенно не изменился в обеих группах и составлял более 80% от должного значения.

Для оценки эффективности достижения контроля БА применялись два стандартизированных международных вопросника по оценке контроля БА (ACT и ACQ) с целью определения их взаимной валидности и корреляции. Оценка АСТ-теста - 25 баллов, а ACQ-вопросника — 0 баллов соответствует полному контролю БА. После лечения общий балл АСТ-теста статистически значимо вырос в обеих группах: в группе пациентов, получавших Рузам+ИГКС, до лечения Ме=17(14+20), после лечения Ме=21(20-23), р=0,00011, в группе пациентов, получавших плацебо+ИГКС, до лечения

Ме=17(13-20), после лечения Ме=20( 16-22,5), р=0,00037. Через 6 месяцев сохранялась тенденция (р=0,1) к повышению суммарного балла АСТ-теста в группе пациентов, получавших Рузам+ИГКС. В группе плацебо+ИГКС количество баллов АСТ-теста осталось без динамики (р=0,32).

Сразу после лечения общий балл АС<3-вопросника статистически значимо снизился как в группе Рузам+ИГКС (до лечения Ме=8(8-Ч0), после лечения Ме=4(2-7), р=0,000026), так и в группе плацебо+ИГКС (до лечения Ме=7(5-И2), после лечения Ме=6(3^8), р=0,0035 ). Через 6 месяцев сохранялась тенденция (р=0,41) к снижению суммарного балла АСО-теста в группе пациентов, получавших Рузам+ИГКС. В группе плацебо+ИГКС отмечалась тенденция к повышению количества баллов по АС(3-вопроснику (р=0,57; рис. 3).

9 --

группа, получавшая препарат группа, получавшая плацебо

1--

о -I-

исходно через 2 недели через б месяцев

Рис. 3. Изменение уровня контроля БА по вопроснику ACQ.

Повышение уровня контроля заболевания по АСТ-тесту сопровождалось снижением суммарного балла ACQ-вопросника на фоне терапии Рузам+ИГКС, что подтверждается наличием тесной обратной корреляционной зависимости между общим баллом вопросника ACQ и результатами АСТ-теста. Данная связь прослеживается на всех этапах наблюдения, что свидетельствует о равнозначности применяемых вопросников и высокой степени их взаимной корреляции (исходно г=-0,69, р=0,003, через 2 недели лечения г=-0,66, р=0,005, через 6 месяцев г=-0,68, р=0,007).

В качестве критерия эффективности проведенной терапии Рузам+ИГКС был проанализирован объем базисной терапии ИГКС в обеих группах через 6 месяцев после активной терапии. В группе больных, получивших ингаляционную терапию Рузам+ИГКС,

произошло значимое снижение общей дозы ИГКС с 661(290,4) до 465(413,4) мкг/сут (р=0,001) в пересчете на Бекламетазон дипропионат (БДП), что свидетельствует о достигнутом стабильном контроле БА у этих пациентов. У 11 больных этой группы, в результате достижения стойкого контроля БА, ИГКС были вообще отменены (согласно рекомендациям С1ЫА 2009). У больных группы плацебо+ИГКС, напротив, объем общей суточной дозы ИГКС был значимо увеличен с 756(474,3) до 863(502,1) мкг/сут (р=0,028) в пересчете на БДП, что говорит о нестабильном течении БА у пациентов этой группы.

Для изучения влияния препарата Рузам на частоту ОРВИ была проведена оценка этого показателя за год до лечения и в течение года после лечения. Как видно из рис. 4, у пациентов, получавших Рузам+ИГКС, значимо снизилась частота ОРВИ (до лечения М=3,9(1,8) на одного пациента в год, в течение 1 года после лечения М= 1,96(0,94), р=0,00034). У этих же пациентов отмечается значимое повышение содержания ИФН-у в индуцированной мокроте (до лечения - 55(28,5-84,5)пг/мл, после лечения - 268(128-385)пг/мл, р=0,011; табл. 2). В группе плацебо+ИГКС частота заболеваний ОРВИ не изменилась (до лечения М=2,3(1,7) в год, в течение 1 года после лечения М=2,15(1,19), р=0,44; рис. 4). Содержание ИФН-у оставалось без значимого изменения (табл. 2). Через 6 месяцев после лечения в индуцированной мокроте пациентов, получавших Рузам+ИГКС произошло значимое снижение содержания ИФН-у. В группе плацебо+ИГКС - без динамики.

Таблица 2. Динамика изменений показателей ИФН-у в индуцированной мокроте больных БА, получавших терапию Рузам+ИГКС У8 плацебо+ИГКС._

Показатель Ме[25%-75%] Пациенты, получавшие Рузам+ИГКС Пациенты, получавшие плацебо+ИГКС

Показатели ИФН-у в индуцированно мокроте (пг/мл) Исходно 55(28,5-84,5) 64(29,0-88,4)

Через 2 недели 268(128-385) 160(117-268)

Через 6 месяцев 88(30-107) 80(43-106)

Р1-2; Р2-3 Р=0,01; р=0,012 р=0,09; р=0,2

PI-2 - по сравнению с исходными данными через 2 недели лечения Р2-3- по сравнению с данными сразу после лечения и через 6 месяцев Р<0,05 - статистически значимо

Результаты многочисленных исследований (Nicholson et al, 1994; Johnnston et al, 1995; Busse, 1994) свидетельствуют, что ОРВИ являются наиболее частой причиной обострений БА. В частности, у взрослых до 65% обострений БА вызываются ОРВИ. Поэтому снижение частоты ОРВИ является важным компонентом достижения стабильного контроля БА и предотвращения обострений._

исходно та год через год

1,2

1

0,8 / i

0,6

0,4 /

0,2 f ¡дм J

0 /3 pifeli ы

» группа, получавшая препарат

г группа, получавшая плацебо

нсходно за год через год

Рис. 4. Изменения частоты ОРВИ и обострений БА в результате терапии Рузам+ИГКС Ув плацебо+ИГКС.

У пациентов, получавших Рузам+ИГКС, до лечения среднее количество обострений БА на пациента в год составляло 1,05(0,35), через 1 год после лечения - 0,29(0,46), р=0,000027: у 8 пациентов -среднетяжелые обострения, у одного пациента отмечено тяжелое обострение, которое требовало стационарного лечения. В группе плацебо+ИГКС частота обострений БА не изменилась - до лечения среднее количество обострений на пациента составляло 0,94(0,48) в год, через 1 год - 0,9(0,46), р=0,79: у 26 пациентов - среднетяжелые обострения, у троих пациентов отмечены тяжелые обострения, которые требовали стационарного лечения (Рис. 4). Было установлено, что у пациентов, получавших терапию Рузам+ИГКС сокращается риск развития обострения БА в 23 раза (ОШ=23 (ДИ=9,4-35,6)) (в подгруппе пациентов с легкой персистирующей БА в 105 раз (ОШ=Ю5 (ДИ=32-226), в подгруппе пациентов со среднетяжелой БА- в 4,1 раза(ОШ=4,1 (ДИ=2,3-14,7).

Для оценки противовоспалительного эффекта препарата Рузам проводилось изучение БГР в качестве неинвазивного маркера

воспаления у всех пациентов (п=63). После лечения отмечалось значимое повышение порога БГР (р=0,01) у пациентов, получавших Рузам+ИГКС, что свидетельствует о влиянии препарата Рузам на степень метахолин-индуцированной БГР. В группе пациентов, получавших плацебо+ИГКС, повышение порога БГР отмечено не было (р=0,86). Было установлено, что у пациентов, получивших Рузам+ИГКС, повышается вероятность снижения БГР в 2,1 раза по сравнению с группой плацебо+ИГКС (0111=2,1 (ДИ=1,2-12,3).

Через 6 месяцев у больных обеих групп отмечено значимое повышение порога БГР, по сравнению с показателями, полученными сразу после лечения (табл. 3). Повышение порога БГР у больных в группе плацебо+ИГКС вероятно объясняется тем, что за б месяцев наблюдения отмечалось увеличение общего объема базисной терапии ИГКС, тогда как в группе пациентов, получивших Рузам+ИГКС данная положительная динамика была отмечена на фоне снижения общего объема базисной терапии ИГКС.

Таблица 3. Изменения результатов провокационного бронхокоистрикторного теста с раствором метахолина на фоне терапии Рузам+ИГКС уя плацебо+ИГКС.___

Показатель Ме[25%-75%] Пациенты, получавшие Рузам+ИГКС Пациенты, получавшие плацебо+ИГКС

Показатели БГР (мг/мл) Исходно 1,0(0,25-4,0) 2,0(0,18-4,0)

Через 2 недели 1,0(0,5-2,0) 2,0(0,5-4,0)

Через 6 месяцев 2,0(1,0-8,0) 4,0(2,0-8,0)

Р1-2; Р2-3 р=0,01; р=0,045 р=0,86; р=0,005

Р1-2 - по сравнению с исходными данными через 2 недели лечения Р2-3- по сравнению с данными сразу после лечения и через 6 месяцев Р<0,05 - статистически значимо

Еще одним неинвазивным маркером воспаления, который оценивался в исследовании, был МОех, который также определялся у всех пациентов. На момент включения в исследование уровень ]\Юех у больных обеих групп был выше значения МОех у здоровых лиц (ЫОех у здоровых взрослых не превышает 25 ррЬ), что является показателем неконтролируемого течения воспаления у исследуемой

группы больных. После лечения Рузам+ИГКС уровень 1ЧОсх у больных значимо снизился (исходно Ме=25(19+61), сразу после лечения Мс=24(15+58), р=0,03). В группе пациентов, получавших плацебо+ИГКС, отмечалась лишь тенденция к снижению уровня >Юех (р=0,48). Через 6 месяцев после лечения уровень КЮех у пациентов обеих групп не изменился и остался выше нормальных значений.

При корреляционном анализе выявлена статистически значимая обратная корреляция между показателями N0^ и степенью БГР (г=-0,32, р=0,0094), что свидетельствует о тесной взаимосвязи данных маркеров воспаления, которые должны учитываться для определения уровня контроля атонической БА.

Для оценки противовоспалительного эффекта препарата Рузам применялись инвазивные методы определения маркеров воспаления. Уровень эозинофилов в периферической крови у пациентов, получавших Рузам+ИГКС, несколько (р=0,02) снизился: до лечения он составил 5(4+6)%, после лечения - 4,5(3+6)%. В группе плацебо+ИГКС - без выраженной динамики: до лечения - 4(3+5)%, после лечения - 4(3+5)%, (р=0,17).

Уровень эозинофилов в индуцированной мокроте у пациентов, получавших Рузам+ИГКС, значимо (р=0,007) снизился: до лечения он составил 9(8+9)% после лечения - 7(6+7)%. В группе больных, получавших плацебо+ИГКС, уровень эозинофилов оставался без существенных изменений (р=0,54). Через 6 месяцев после лечения уровень эозинофилов в мокроте больных обеих групп без существенных изменений.

ЕСР, являющийся признанным маркером аллергического воспаления, значимо снизился после лечения Рузам+ИГКС. Как видно из рис. 5, сразу после лечения в сыворотке крови произошло снижение ЕСР с 19(2,25+33,3)мкг/л до 9(6+12,7)мкг/л, р=0,04, в индуцированной мокроте - с 598(394+1261)мкг/л до 352(255+708)мкг/л, р=0,02. В группе больных, получавших плацебо+ИГКС, показатели ЕСР оставались без существенных изменений. Определение этого маркера через 6 месяцев выявило его дальнейшее значимое снижение только в группе больных, получивших лечение Рузам+ИГКС (в сыворотке крови Ме=1,9(1,3+5,8)мкг/л, р=0,037, в индуцированной мокроте Ме=216(168+394)мкг/л, р=0,014). В группе плацебо+ИГКС снижение данного показателя оказалось

незначимым как в сыворотке крови, гак и в индуцированной мокроте (рис.5).

Снижение ЕСР в сыворотке крови и индуцированной мокроте через 6 месяцев после активного лечения свидетельствует о пролонгированном противовоспалительном эффекте препарата Рузам в комбинации с ИГКС.

■ группа, получавшая препарат «группа, получавшая плацебо

исходночер« 2 кед. через 6 м?с.

в группа, получавшая препарат

«группа, получавшая плацебо

исходно через 2 нед через 6 мес

Рис. 5. Динамика ЕСР в сыворотке крови и индуцированной мокроте больных на фоне терапии Рузам+ИГКС плацебо+ИГКС.

При корреляционном анализе была выявлена значимая корреляционная связь между показателями ЕСР в крови и ЕСР в индуцированной мокроте (г=0,9; р=0,03).

Многими исследованиями наряду с эозинофильным воспалением было показано наличие нейтрофильного компонента в случае более тяжелого течения БА. Влияние терапии Рузам+ИГКС/плацебо+ИГКС на активность НЭ изучалось у 15 пациентов, распределенных в терапевтические группы, получавшие ингаляционную форму препарата Рузам+ИГКС (п=10) или плацебо+ИГКС (п=5). Пациенты для исследования были отобраны методом случайной выборки. Из 10 пациентов, получавших Рузам+ИГКС, у 6 БА имела среднетяжелое течение, у 4 - легкое течение. В группе плацебо+ИГКС у всех 5 пациентов БА имела среднетяжелое течение.

У всех пациентов исходно, сразу после лечения и через 6 месяцев после лечения определяли уровень активности НЭ и а1-АТ в сыворотке крови. Исходный уровень НЭ у пациентов, получавших Рузам+ИГКС, составил 435(348-491,2)мЕ/мл, у получавших плацебо - 485(478-568)мЕ/мл и значимо (р<0.05) превышал границы

нормальных значений данного показателя у здоровых доноров (200±34 мЕ/мл). Это может косвенно свидетельствовать о том, что при атонической БА наряду с эозинофильным воспалением выявляется нейтрофильный компонент, характеризующийся повышением активности НЭ в сыворотке крови больных с легким персистирующим (4 пациента) и среднетяжелым течением заболевания (11 пациентов). Нами ранее определялся уровень активности НЭ у пациентов легкой неконтролируемой БА, которые не получали ИГКС, а использовали только симптоматическую терапию в режиме по «требованию». Исходный уровень НЭ также превышал границы нормальных значений и составлял 575,3±260 мЕ/мл (Ненашева Н.М., Терехов Д.В. 2010). Проведенный на фоне терапии анализ уровня НЭ в сыворотке крови показал, что у пациентов обеих групп не наблюдалось снижения НЭ (р=0,7 и р=0,68 соответственно). Определение этого маркера через 6 месяцев выявило его незначимое снижение в обеих группах, что может свидетельствовать об отсутствии влияния препарата Рузам, равно как и фармакотерапии низкими и средними дозами ИГКС на активность НЭ в сыворотке крови.

У всех включенных в исследование пациентов не было выявлено недостаточности а1-АТ, и средний уровень активности составил 38,9 (43,7*51,4)мЕ/мл. Данный показатель не отличался ни в одной из выделенных групп пациентов. Лечение Рузам+ИГКС/плацебо+ИГКС не привело к значимым изменениям а1-АТ. Через 6 месяцев также не было выявлено значимых изменений данного показателя в обеих группах.

В предыдущих исследованиях по изучению эффективности инъекционной и интраназальной форм препарата Рузам в работах Е.С. Пыжевой, НА (1997), Колгановой (2001), ГЛ. Осиновой, (2002), Е.В. Шуваловой (2004), Т.Н. Антоновой (2009) было выявлено снижение ^Е в сыворотке крови на фоне лечения Рузамом. Мы также изучили влияние ингаляционной формы Рузама на уровень Показатели ^Е в сыворотке крови у больных, включенных в исследование, были значительно выше нормального уровня. В группе пациентов, получавших Рузам+ИГКС, исходно уровень ^Е был 510(158*783) МЕ, в группе пациентов, получавших плацебо - 405(121*780) МЕ. Сразу после лечения анализ уровня 1§Е в сыворотке крови показал, что у пациентов обеих групп, наблюдалось незначимое снижение 1§Е

(в группе Рузам+ИГКС Мс=482(260-676), р=0,15, в группе плацебо+ИГКС Ме=3 82(96+784), р=0,4). Через 6 месяцев после активной терапии нами не было выявлено каких-либо значимых изменений этого показателя у больных обеих групп.

С целью определения длительности эффекта ингаляционной терапии Рузам+ИГКС у пациентов с неконтролируемым течением БА были оценены клинико-функциональные показатели и маркеры воспаления у больных через 6 месяцев после лечения. Результаты, приведенные выше, позволяют заключить о наличии пролонгированного эффекта ингаляционной формы препарата Рузам, проявляющегося в сохранении достигнутого клинико-функционального контроля, значимого снижения объема базисной терапии ИГКС, а также снижения частоты обострений БА и ОРВИ. Анализ лабораторных показателей выявил дальнейшее снижение ЕСР в сыворотке крови и индуцированной мокроте больных.

Все пациенты, получавшие ингаляционную терапию Рузам+ИГКС, отметили хорошую его переносимость, однако у двоих пациентов (6%) отмечался сухой кашель на фоне ингаляций Рузама, который проходил самостоятельно через 20-30 минут и не требовал отмены препарата. В группе плацебо+ИГКС нежелательных явлений отмечено не было. В клинических и биохимических анализах крови, общем анализе мочи, данных ЭКГ изменений не наблюдалось, что свидетельствует о безопасности использования данного препарата по предложенной схеме и его хорошей переносимости.

ВЫВОДЫ:

1. Препарат Рузам в форме ингаляций в комбинации с ИГКС по сравнению с плацебо+ИГКС является эффективным видом терапии неконтролируемой атопической БА персистирующего легкого и среднетяжелого течения, что проявилось в значимом снижении потребности в симптоматической терапии бронходилататорами (р=0,01), повышении функциональных показателей легких: утренней ПСВ (р=0,042) и ОФВ! (р=0,015), а также достижении более высокого и стабильного уровня контроля БА (р=0,00011).

2. Комбинированная терапия Рузамом и ИГКС по сравнению с плацебо+ИГКС обладает влиянием на эозинофильное воспаление, проявляющимся значимым снижением числа эозинофилов (р=0,02) и ЕСР (р=0,04) в сыворотке крови.

3. Ингаляционная терапия Рузамом в комбинации с ИГКС по сравнению с плацебо+ИГКС оказывает топический противовоспалительный эффект, проявляющийся значимым снижением числа эозинофилов (р=0,007), ЕСР (р=0,02), повышением ИФН-у (р=0,013) в индуцированной мокроте, а также значимым снижением неинвазивных маркеров воспаления в дыхательных путях: NOex (р=0,03), БГР (р=0,01).

4. Комбинированная терапия Рузамом (ингаляционная форма) и ИГКС обладает пролонгированным эффектом на протяжении 6 месяцев, проявившимся уменьшением частоты ОРВИ у пролеченных пациентов в 2,5 раза и связанных с ними обострений БА в 3 раза, что обусловлено противовоспалительным эффектом Рузама.

5. Вопросники по оценке контроля БА: АСТ-тест и ACQ являются равнозначными, вследствие их высокой взаимной корреляции ( г=-0,69, р=0,003) и оба могут успешно применяться в клинической практике для оценки контроля БА, так как достоверно коррелируют с клинико-функциональными параметрами контроля БА и маркерами воспаления.

6. Отсутствие серьезных побочных эффектов при лечении ингаляционной формой Рузама в комбинации с ИГКС продемонстрировало безопасность применения препарата, назначаемого в дозе 2,5 мл 1 раз в день в течение 14 дней, у больных неконтролируемой атопической БА легкого и среднетяжелого персистирующего течения.

Список работ, опубликовапных по теме диссертации.

1. Ненашева Н.М., Терехов Д.В. Возможность достижения контроля атопической бронхиальной астмы с помощью антилейкотриенового препарата монтелукаст// Сборник трудов национальной конференции «Аллергология и клиническая иммунология - практическому здравоохранению» Москва. - 2011 -С. 129-130.

2. Terekhov D., Nenasheva N. The control of atopic bronchial asthma by using montelukast // Allergy. - Volume 65 (Suppl.92) XXIX Congress of the European Academy of Allergy Clinical Immunology Abstract Book. - London. - 2010 - 5-9 June. -p. 150. - abstr.364

3. Терехов Д.В. Эффективность неспецифической ингаляционной иммунотерапии Рузамом при бронхиальной астме// Труды межрегионального форума «Актуальные вопросы аллергологии и

иммунологии - междисциплинарные проблемы» Санкт-Петербург - 27-30 сентября - С. 289-290.

4. Терехов Д.В. Эффективность неспецифической ингаляционной иммунотерапии Рузамом при бронхиальной астме//Сборник материалов конференции молодых ученых, посвященных 80-летию РМАПО: Москва. - 2010г. - С. 128-130

5. Терехов Д.В. Эффективность неспецифической ингаляционной иммунотерапии Рузамом при бронхиальной астме// Сборник материалов конференции молодых .ученых РМАПО: Москва. -2011г. - С. 44-46 (доклад).

6. ТереховД.В., Ненашева Н.М. Эффективность неспецнфичсской ингаляционной иммунотерапии Рузамом при атопнческой бронхиальной астме // Российский Аллергологнческнй журнал. -2011. —№ 4. -С. 49-54.

7. Терехов Д.В., Ненашева Н.М. Отсроченные результаты неспецифической ингаляционной иммунотерапии Рузамом при атоппческой бронхиальной астме // Российский Медицинский журнал. - 2011. -№ 6. - С. 16-20.

8. Терехов Д.В., Ненашева Н.М. Эффективность неспецифической ингаляционной иммунотерапии Рузамом при бронхиальной астме// Сборник материалов XI Международного конгресса: «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии» Москва. - 2011г. - 5-8 июля. - С. 378-380.

Список сокращений

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

11.

12.

БА - бронхиальная астма

БГР - бронхиальная гиперреактивность

ИГКС - ингаляционные глюкокортикостероиды

ИФН-у - интерферон-гамма

ОФВ1 - объем форсированного выдоха за 1 секунду

ПСВ - пиковая скорость выдоха

ФВД - функция внешнего дыхания

ACT - тест по контролю астмы

ACQ - опросник по контролю астмы

ЕСР - эозинофильный катионный протеин

NOex - оксид азота в выдыхаемом воздухе

IgE - иммуноглобулин Е

Подписано в печать:

10.01.2012

Заказ № 6471 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru