Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Эффективность использования методов проточной цитофлюориметрии, хемилюминесценции и клеточного электрофореза сперматозоидов для тестирования мужского бесплодия

ГОСУДАРСТВЕННИК КОШЕТ САНИТШЮ-5ШадЕ»ЯОГИЧйСКОГО НАБОРА РОССИЙСКОЙ ВДЕРАЦЦЧ

Российский научно-исследователоский противгч;гмный ингтиту"* ".¿'.кроб"

• На правах рукописи

* ' *

МЕЖ^ЕНКО Андрей Богдмович

Ё'К?ЫШ!ВН0С1Ъ ИСШЛЬ£ОВАНШ ЖГОДОВ ПРОТОЧНОЙ ЦИТ0ФЛЮСН1.ЕГРШ, ХЕлй1Ю;.йНЕСЦЕ1ЩИИ И МЕТОЧНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА СПЕРМАТОЗОИДОВ ДЫ ТЕСТИРОВАНИЯ ЖШТй БЕСПЛОДИЯ

14.00.16 - патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание учеиой стзг.лни ' кандидата медицинских нау..

Саратов 1993

Работа выполнена в Российском н^учи о-и с следователь с I ом противочумной институте 'Микроб"

Научный руководитель: доктор медицинских наук М.Ю.ЛВДВАНОВ

О^ицлал! чне оппоненты: доктор медицинских наук, профессор К.Л.икотш, доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАЕН В И.Глубин.

Ведущая орх-аниэация: Саратовский медицинский институт

Еащита диссертаций состоится 12 марта 1993 г. в 13.00 часов на раседании специализированного совета К 074.32.01 по присужце ученой степени кандидата наук при Российском научно-иследовате гч'ом противочумном институте "Микроб" (410071, г'.С^ратов, ул.Университетская, 46). • . " ' .

С дчсс-рташей можно ознакомиться в научной библиотеке института "^кпоб"

Ученый секретарь специализирован"ого совета кандидат медицинских наук, старший научлый сотрудник

5? .Л,Девдариани

ОЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТ!

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Проблема цукского бестодля в последние годы приобретав" особую медицинскую и сошадьнуь ¿наччмость как у-нас в стране, так и sa рубежом (Бенедиктов И.И., 1962; ;.1иха.1личенко В.В., 1987, 1990; Цветков Д.П., 1°89; Шахов' Е.В., ' • 1990; Храстие Г.Л., 1986; Roas L.s., 1965). Это связано с увеличением частоты заболеваний половых органов у мужчлц, ростом аноматий развития, обусловленных влиянием факторов внешней среды, сллергкеацией населения, широким и бесконтрольным применением лекарственных средств и другими факторами (Кирпатовский И.Д., 1990; Камараускас В., 1990; Дахно Í.B. с соавт., 1990; Лихелашвили Я.Х с соавт., 1990; Селезнев Г.Г., Шевченко С.11., Т990; Okuyama А., 1989; Yarbough U.a., 1989; Brode: ick G.А., 1989; Fiegel G., 1990)..

3 диагностике мужского бесплодия любой этиологии первостепенное значение имеет лабораторное исследование семенной жидкости (Юцца ИЛ-., Куширук Ю.И., 1973; Хддсон В. с соавт., 1983). Несмотря на довально обширный с.1вктр методов исследования эякулята, применяемых в клинике, в рначитгльном «геле случаев их информативность оказывается недос татсгнон для установления факта нарушений сперматогенеза. Очевидно, не дяя всех патогенетических механизмов нарушений формирования полноценных половых клеток рагработань' в настоящее время корректные методы лабораторного тестирования. '

В последние годы наибольшим признанием пользуется ::роточная цитофлюориметрия (Полетаев А.И., 1989), позволяющая осуществлять количественное измерение интенсивности флворесценти каждой ир f те .-ок. находящихся в суспении. Метода .-ает возможность опредепить количественные и структурные изменения в хро-

матине эукариотических клеток. Скорость анализа составляет 1000 кчеток в секуццу. Измерения могут осущестрляться как в фиксированных, трк и в яивых клетках. Для получения результата, начиная с момента окраски, необходимо всего несколько минут. Несмотря на очьви,пчые преимущества протонной иитофтоориметрии, осооенностн распределения сперматозоидов эягуяята по фасам клеточного шкла 4 содержанию ДНК) при мужском оесплодии остаются во шогом не изученными. Не разработаны в отношении данной патологии конкретные сценовдиз и прогностические цитофлюориметри-чеекие кркгерки. В отечественной сперматологии этот метод до настоящего времени практически не применялся.

Наряду с исследованием физиологических и морфологических

свойств клеаок важгым для понимания патологии сперматогенеза

является исучение биохимии эякулята и метаболизма сперматозоиг

дов. Известно, что данные клетки характеризуются активным

метаболизмом. Прс^екепгцие в сперматозоидах ферментативные окггплтельно-восстановительныа процзссй сопряжение синтезом

раеличных активных радикалов кислорода, генерация которых зависит от сбалансированности работы ферментативных и но£ермен- • тативных систем, инактивирующих их ССидор-.гк Е.Л. с соаьт., 1989).

Н числу налоолев ..эффективных методов определения продукции -активных »лдикалов кислоо.-а в клетках (Владимиров В. А., Шерст-нев М.П., 1989) относится ыетчд хемилюминесценши'. Он характеризует равновесие ме<с^у интенсивностью свободно радикальны.: окислительных процессов и <штивностью биоантиоксидантных систем, поепятствующих аутокаталитическо..у ускорен » свободно радикальных реакщй. Это позволяет предполагать эффективность использования метода хедалюминэсценши при данной патологии. Известно, что при значительной актепации свободно радикального

окисления возможно повреждение различных структур клетки и в

и

первую очередь ДНК. Роль антиоксидалтных систем яаключартся в защите тетки от позревдения. Соотношение активности процес- . сов в этих двух системах может характеризовать потнос^нмость метабо^чческого обеспечения структурной целостности сперматозоидов. В современной литературе сведения о раоотах, проводимых в данном направлении, отсутствуют.'

Сперматозоиды,как и все зукариотические клетки,не^ут на 'своей поверхности в тсй или иной степени вираяен/нлй отрицательный элзктрический горяд (Ленеел Г.Л., 1979), Для'нормального функционирования сперматозоидов это имеет особое значение. Отрицательный электрический заряд способствует их подвижности, препятствует столкновению и слипаний спермиев в густом эякуляте (Михайличенко В.В. с ссавт., 1337). Высокая подвижность . сперматозоидов может быть компенсирующим фактором у ,мужчин с малым количеством сперм;:ев в эякуляте. Свободный распределительный клеточный.электрофорез позволяет не только оценить электрофоретическута подвижность (ЭФП), не и получить различающиеся по ЭФД с чищенные'фракции сперматозоидов, которые можно учесть количественно. В сперматологин данный мртоц до настоящего времени не применялся.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ изучить диагностическую аначи .юсть комплекса патогенетически обоснованных инструментальных методов - проточной 1411 тофлмориметрлн, хажлюыинесценции и клеточного распределительного электрофореза сперматозоидов ,чля тестирования мужского бесплодия.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ: .

I. Изучить эффективность ис юльпования унифицированных (общепринятых) лабораторных методов исследования для лиагности- . кн мужского бесплодия, у жителей Сапатовскай области, обратив-

шихся в областную консультацию "Врак и семья".

2. Провести сравнительный анализ изменений в структуре ДНК сперматозоидов, соотношении свободно радикального окисления и активности антиоксидангных систем в эякуляте, а также Олбктр'-ческого заряда поверхностных мембран сперматозоидов у здоровых и страдающих бесплодием мужчин»

3. Оценить эффективность использования метода проточной од-тофлюориметрии ДНК сперматозоидов для диагностики л<ужского бесплодия. ,

4. Опредечит! возможности применения метода хемилюминесцен-ции и свободного распределительного клеточного электрофореза сперматозоидов для диагностики мужского бесплодия.

НАУЧНАЯ Г9ВИ2НА. Вьервыз в результате всестороннего комплексного исследования метаболических, структурных и функциональных сдвигов в сперматозоидах бесплодных мужчин были установлены закономерности, отражающие важные патогенетические ыехжизмн возникновения и развития нарушений сперматогенеза и функциональной неполноценности половых клеток. Новыми являются данные об увеличении в эякуляте бесплодных мужчин числа сперматозоидов с содержанием ДНК 1С, коррелирующим с уменьшением их подвижности, и ДНК свидетельствующем о появлении не-

ерельсе, морфологически измененных клеток. Впервые обнаружено в сперме о'ееплоднъх мужчин увзличение продукции свободных радикалов кислорода и выявлены нарушения в антиоксидангных системах. Установлена прямая корреляция между уровнем гиперпродукции свободных радикалов кислорода и количеством сперматозоидов с измененной структурой ДНК. Новыш являйте., также данные о элачительном снижении электоофоретической подвижности сперматозоидов бесплодных мужчин. Впервые отмечено, что спергато-еоиды С измененной структурой ДНК и::ели низкую электрофоре-

тичеокую подвижность. -о

Количество сперматозоидов с пониженным отрицательным зарядом коррелиропло о числом половых клеток с нарушенной двигательной активностью. Результаты впервые проведенного комплексного исследования с применением проточной цитофшоориметрии, хемилюминесценции и клеточного электрофореза позволили б^вить

у мужчин с относительным бесплодием начальные патогенетические механизмы нарушений функциональной активности сперматозоидов, возникающие еще до развития микроскопически гзидимых из!, энений.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЕНАЧШОСТЪ РАБОТЫ. Изучение 'патофизиологических характеристик сперматозоидов отвечало задаче определения диагностической значимости комплекса инструментальных методов для тестирования мужского бесплодия, . В результате-разработаны новые информативные критерии оценки нарушений сперматогенеза <? испгяьзованием методов проточной щтофлюориметрии, хем:-люминесценции и клеточного электрофореза. Применение данного ком« лекса тестов совместно со стандартными общепринятыми методами изучения эякулята позволило у большинства лиц с относительным бесплодием диагностировать те или иные отклонения от■нормы, обусловливающие функциональную неполноценгэсть сперматозоидов, Е1ЩРЕНИЕ В ПРАКТИКУ." В результате проведенные исследований оптимизирован метод проточной импульсное цитофлюориметрии сперматозоидов человека. Метод опубликован в журнале "Лабораторное

- 4 * *

дело" * 2 (1991), применяется в практическсй работе областной консультации "Брак и семья", о.чем имеются соответствупщие. акты о внедрении. ( - • ' '

¿¿ьтериаль: диссертационного исследования используются ппи . • чтении лекци'1 по урологии студентам Саратовского медицинского института.

нПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. д!атериалы диссертации доложены и обсуждены на: I. 2-ом международном симпоеиуме "Реабилитация иммунной системы", Цхелтубо, 1990.

2. 7-ом Всесоюзном съезде урологов. Москва., 1990.

Диссертация обсуждена и одсбрена на расширенной научной

конференции лаборатории клеточной иммунологии РШ1ЧИ "¡шкроб" с участием клиники урологии Саратовского медицинского института.

ПУБЛИКАЦИИ. По материала« диссертации опубликовано 3 работы.

ОБ'ЬЕЫ К СТРУКТУРА РАБОТ!. Диссертация кг ложе на па 130 страницам мбшичописгэго текста к содержит: введение! шесть глав, евключение, выводы и библиографический указатель, который включает 124 отечественных и 135 иностранных источников. Работа ил-люстрироьаш. 22 рисунка!« и I таблицей.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОИЕНИН,. ВЫНОСИ,.ЫЕ НА. ЕАЩШ.

1. Установление патогенетических мех^лирмов формирования функциональной неполноценности сперматозоидов у бесплодных мух 1ин методами проточной цитофлюориметрии, хеми дамнэоченции и клеточного электрофорезе.

'¿. Увеличение в эякуляте бесплодных мужчин числа сперыатогск идоа с содержанием ДНК ¿10 й Корреляция мевду числом

сперматозоидов с ЛИК ¿1С л.количеством половых клеток с низкой подвижностью. - •• •

I

3. Увеличение в эякул :те бесплодных мужчин концентрации свободных радикалов кислорода и снижение активности антискси-дантньос систем. Корреляция гиперпродутции свободных радикалов кислорода в эякуляте с нарушением структуры ДШС сперматозоидов.

4. Пнигение поверхностного отрицательного электрического заряда у сперматозоидов бвоплодиых мужчин. Меньшая двигательгая активность подовых клеток, обладающих нирким электрокине"ич9-ским потенциалом. Корреляция числа .¡гтерматог садов с пониженной

эдш'лрофоретической подвижностью с нарушениями в струтурв ДО',.

5, Докогатцяьзтва эффективности исподы-ования методов про— точной иитофлюориметрии, хеш.люминесценции и клеточного электрофореза для тестировании мужского бесплодия.

СОДЕРЖИ РАБОТЫ

ШЕШЛ; И ЖТОда ИССЩОЗЛН^. Для решения поставленных задач было обследовало 200 мужчин, обратившихся пр поводу бесплодного брака в Саратовскую обЛастнуй консучьтагадо "Брак и семья" с 1989 по 1901 гг. 14 человек составил:; контрольную группу, имели 2-3 детей в возраста от I до 5 лет. Показатели спермограмм у них были в пределах нормы.'

Обратившиеся в консультация мужчины состояли й бездетном брак от-2 до 10 лет. Диагноз бесплодия устанавливался на осно-. ванкч комплексных исследований с испольвованием данных анамнеза, клинического обследования, результатов-стандартных лабораторных методой. Посте гинекологического обследования жен обратившихся пациентов женский фехтор бесплодия у отобранного контингента мужчин бьи пслностью исключен.

В соответствии с действующими методическими рекомендациями (.Лих&йличенко В.В., Скрябин Г.Н., 1987) изучались следуйте показатели: объем эякулята, вязкость, pH концентрация и подвижность сперматозоидов, их морфология, исследовалось наличие анти^гьрмальных антител, ставилась биологическая проба (проба на совместимость и пенетрашонную способность епершзвК •

Содержание ДНК в сперматозоидах определялось методом про-' точней штоб '.юериметрии (Otto et al., 197°) на приборе iOP-2.¿. (PHíWB ). Хечи'поминесцентный анализ спермы осуществляли согласно методике, описанной 0.Г.Архиповой (1966), на згемилюмино-метре >'J1-11U-0I.

Клеточный электрофорез сперматозоидов проводился в соответствии с рекомендациями Г.Л.Иенсен (1979) с использованием аппарата для свобогяого распределительного клеточного электрофореза ;.'!:■'

Полеченные данною обрабатывались статистически i Вычисляли среднюю арифметическую («О, среднюю ошибку средней арифметической ( и), коэффициент достоверности (t), уровень вероятности (Р), коэффициент корреляции (г) по П.Ф.Рокицкому (1973). Определение доверительных интервалов (мд1л -ыгаах ) проводили по методу, ог.дсанн^ М.Я.Велеиьким (1959).

ресУльтаи и их ошутдаиЕ. ' „

Применение общепринятых унифицированных методов диагностики мужского бесшщгип позволило охарактеризовать &ффектквность их использования применительно у контингенту лиц, обращающихся в Саратовскую областную консультеш'") "Брак и семья" по поводу , бесплодия. У 200 бесплодных мужчин были определены следующие показатели! объем, вязкость и рН вякулята, концентрация сперматозоидов, их морфология ч подвижность, наличие в сперме лейкоцитов и эпителиальных клеток. По какому показателю (за исключением величины рН) у разного числа обследованных были отмечены отклонения от нормы. Наиболее часто.нарушалась подвижность спер-зтозоидов. t большинства'(32 f).находившихся под наблюдением бесплодных мужчин обнаружено в еякуляте более 30 % непод-вижньк сперматозоидов. Изменения в морфологии данных клеток отмечались значительно река (6 % пациентор). Также достаточно ррцко Тестировалось повшение количества лейкоцитов в сперме. С рас-эй частотой встречались сдвиги по остальном показателям (от 16 до 60 55).

При анализе изменений всего комплекса перечисленных показателей у кечиого обратившегося в консультацию в отдельности бы-

ла выявлена группа лиц из 30 человек (15 %), у которых не уда-, лось обнарушть отличий от средней нормы ни по одному тестов. При тщатечьном повторно!., анализе жен данных о'ольньгх какой-либо гинекологической патологии выявлено также не было.

Бесплодие п супружестве в настоящее время рассматр<таетля пак болезнь но одного из супругов, а как заболегАше пари. По-этоглу особое значение приобретает исследование иммуночсгичесюй совместимости супругов. В '-вязи с этим у 30 человек (у которых не обнаружены изменения в цокоаать^пх.стандартных спермогпамм) • были проведены исследования спермиммобилияирующей активности сыворотки крови жен при использования матера микроагг-готинации но Басккну и пробы на пенетрациокную способность сперматозоидов. Лишь у к, человек обнаружена положительная проба т Бабкину - отмечено значительное снижение кинезиса спермиев мужей в присутствии сывороток жен.

Таким оброс ом, в результате проведенных исследований у со % обратившихся по поводу бесплодия мужчин выявлялась те ¡¡ли иные изменения в организме, которые можно было предположить в качестве причпни инфертильности. У 15 % мужчин никаких видимых причин бесплодия обнаружить не удалось. Эти пациент в соответствии с общепринято., классификацией (кихайличенко Б.Б., 1290) были отнесены в группу так называемого относительного бесплодия. Выявленный начи процент относительного бзеплодия соответ-ствпгл данным, получаемы в других медицинекнх .учрежденаах (Вида И.Ф., 1961), л то'1 числе, и за рубеиол ( ЭаНбЪигу й.'д. ег ах., 19?7). Данная группа больных находилась в центре внимания при поел едуккцих исследованиях С использованием.совпеме"-ных инструментальных методов. .

При опенка патологических изменений в сперматозоидах особый интерес представляя анализ сдвигов ДИК, являющийся основным

структурным компонентов хропосом - носителей наследственной информации в клетка.:. Кукяеопротеидние комплексы (хроматин),-обрг-зуелыо ДНК совместно с гистонат и другими белками, обеспечивают проявление''ее.функций. Изменения в структуре хроматина и содеркагии ДНК могут быть связаны с серьезными нарушениями сперматогенеза.

Иг учение содержания ДИК в сперматозоидах методом проточной цитофтаориметрш позволило зарегистрировать, что в сперме здоровых фергильных доноров содержится, как правчло, более 70 % гаплоида1« спепматоеолдов, способных к оплодотворению. В 10$ клеток эякулята здоровчх мужчин встречались незрелые сперматозоиды с числом ДНК более 1С. Полученные нами пэулматы исследование ¡здоровых лужчик-согласуются с современными представлениями о том, что стабильность содьржания ДНК (равная 1С) в функционально полноценных слерматоооидах определяется гаплоидным количеством хромосом в этих клетках ( Сагапо а.v. ег а1., ¡077. ХоЬЪие В. Ь. вг а1., 1987; Магэ^Ла Т. вг -»X., 1°89).

У бесплодных мужчин дпчь^е цитофлюориметрии характеризовались (рис.1) значительным нарастанием процента клеток с содержанием Дг11< /1С (рагруиенные патологически измененные спермьтозо-иды) й соответственным ;гденьаением числг. гаплоидных сперматозоидов. У большинства пациентсз кол"чество сперматозоидов с

. »

ДНК ДО гесно коррелировало с числом.сперматозоидов, обладающих сниженной подвижностью.' Мент-иие различия у ферти'лььых и ин$ер-тйльньэс мужчин обнар/хсивались в отношении количества незрелых сперматозоидов (/¿¡К ^1С). Однако и эти отличия были статистически достоверны.

Особый интерес представляет результаты обследования группы лиц с относительным бесплодием. Гак из 30 человек с оттситель -яки бесплодием у 14 было обнаруко; ~> отклонения показателей со-

держания.ДНК в сперматозоидах от средних величин нормы- В основном эти отклонения касались увеличения числа сперматозоидов с количеством ДНК /1С. > &МЙЮК с

"1

65-

6а

55 5о+ А]

4а,

Зо 25 2о-15-<о-

5-

--^ Б

Рис.1. Содеряание (в £) количества сперматозочдор с ¿1С'ДНК в . злкуляте фертильных (А) и бесплодны: (Б) мужчин.

Обозначения:. данные одного обследованного;

■ ~ средние пначеиия й доверительные интервалы. ■

ицеыгвая значение представленных данных для понимания патогенеза мужского бесплодия,важно подчеркнуть, что ньрастание з эякуляте клеток с числом ДН1{ 1С и та ¿10 свидетельствует'о кг: рушении сперматогенеза и снижении эорпгности оплодотворения

яйцеклетки t Otto F.J. et al., . 1У/У). В результате - инфертиль-ность мужчин. Более того, это может отражать сдвиги в процессе мейоза о неправильным расхождением хромосом, что лежит в основе возникновения различных форм наследственной патологии (Аад-сон В. с соавт., 1906; Uatsuda т. et al., 1969). Поэтому регистрация сперматозоидов с различит содержанием ДНН находящихся в разных фазах мейоза), осуществляемая с использованием проточьоя цит осулта ори ме i'p и и является информативным и адъективным метода.! выявления патологии сперматогенеза у мужчин и может применяться в клинической практике.

Иефходшыл ур^аень ^ункшоцальной активности сперматозоидов обеспечивается процессами метаболизма, интенсивно протекающими в этих клетках и, естественно, связанными со сдвигами в обменных реакциях спермы. Одним из важных интегральных показателей, характеризую^« аффективность (» нарушения) метаболических процессов, является соотношение меяду свободно радикальным окислением Спри условии которого созмогкно повреждение различных структур клетки, в первую очередь ДНК) н активностью антиокси-дантных систем, saupaiasnpix клетки от этого. Исследование показателей данных процессов было проведено с использованием метода хемилдаинесценции эякулята,-

Показано, тлтр у бесплодных мужчин уровень продукции квантов 'света был значительно вше, чем у здоровых (рис.2). Д<лный факт свидетельствовал о пыерпродукции радикалов кислорода в сперматозоидах инфертиальних муэтин. Уровень хемилюиинесценции сперматозоидот находился в прямой корреляции с количеством слабоподвижных л неподвижных клеток, а тш.ле с количеством клеток с ,;аруЕ:енной (¿1С) структурой ДВК. Полученные материалы свидетельствуют о значительной роли гипе^продукции активных форм ' ш.одсрсда в сперматозоидах в процессах почревдения внутриклеточной ДНК.

' ш/ш* • «

• X • •

г • • •

• -j—1— •

t : J !:

• • t • * *

• ...»

А Б

Рис.2. Хемилюминесыенция (имп/лян сперматозоидов ра 10 сек) спермы рдоровых доноров (А) и инфертильных мужчин (В)

Обозначения: - денные одного обследованного;

- средние еначёния и доверительные интервалы.

При сравнительном анализе хемилюминесценции спермы пациентов с другими клин1.1\0" лабораторными данными чанбольшая продукция • активных радикалов кислорода обнаруживалась в группе мужчин, у которых диагнзстировались воспалительные изменения в половых органах. Усиление процессов свободно радикального окисления в сперме бесплоди'лс мужчин о воспалительными изменениями в половых органах, очевидно, было связано с миграцией в очаг воспаления активированных лейкоцитов. Функционирование кислородзавиои-Мых бактерицидных систем последних сопряжено с г-одукцией активных цитоцидных соединения, таких пак синглетный кислород, супероксид анион-радикал, гвдроксильный радикал, пероксид водорода, гипохлорк?-исн и др.(Владимиров P.A., Иерстне" ¡И.П., 1989), инициирующих хэшлюминесценцио. Продуцируемые лейкоцитами кислор дине высокоактивные метаболиты могут стать источником повреждения внутриклеточной ДНК. Игучекие интегральной функции онтиоксидантнмх систем в сперматозоидах также покатаю ез нарушение у бесплодных мунчин.

Для оцеики диагностической значимости метода особый интерес лредставияли данные хемилкм-инесценции, йолученные у пациентов с относительным бесплодием, у которых не удалось обнаружить никаких иэмелений со стороны рутинных спермограмм. У 5 ив 16 таких пациентов уровень спонтанной и ицдуцироганной хе-ми поминесценцил был выше показателей средней нормы, что явилось основанием предположить наличие хронического воспалительного процесса, впос. эдствии подтвержденного при более тщательном (комплексном) обследовании.

Таким образом, используя метод хемки'линосценци! , была выявлена ванная закономерность, характерная для бесплодные мужчин. У них обнаруживались изменения ХЛ спермы, связанные с гн ■ перпродукцией свободных радикамв кислорода и снижением активности антиоксидантных сис.тем. Устаноэленные нарушения соотноахе-ний мевду двумя процессами кислорсдзависимо.'о метаболизма могу указывать на один из возможных патогенетических механизмов, связанных с явлениями воспаления в половых органах и приводя^: к нарущеш-чы сперматогенеза и формированию функциональной неполноценности половых клеток. Метод ХЛ в ряде случаев мелет оказаться более чувствительным и информативным, чем общепринятые способы исследования спермы, направленные на обнаружение вослалительных "процессов ь половых-органах и определение их последствий для сперматозоидов.

Следующая одна из наиболее важных характеристик функциональней полноценности сперыатозоидов связана с оценкой состояния их Мембран, показателем ч^го является электрический заряд, который они насут на своей поверхности.

Исследование электрофореъ.чесной подвижности (5411) сперматозоидов, зависящей от величины поверхностного потенциала и отражающей состояние мембран клеток,-позволило выявить следую-

щие закономерности.

С помощью распределительного клеточного электрофореза было показано, что во фракциях, содержащих ¡.летки, несущие высокий отрицательный электрический заряд, концентрировались активно подвижные сперматозоиды (до 67+9 % активно подвижных), при этом количество клеток с нарушенной структурой дНК {¿ 1С) бьио минимальным. В популяции сперматозоидов со средней Э5П количество активно подвижных клетс : снижалось (45+1? %). Во фракгнях сперматозоидов, низкоподвижных в электрическом поле (несущих низкий отрицатель::ый заряд), высокоподвижные сперматозоиды практически отсутствовали. Уровень ЭШ сперматозоидов находился в прямой корреляций i их активной подвижностью vt в обратной зависимости с нарушениями в сперматозоидах структуры ДНК. Изучение средних значений Э£П сперматозоидов бесплодных мужчин показало (рис.3) значительное снижение ЭФП основной массы половых клеток, по, сра лени» с контролем (cfepr ильными донорами). При исследовании лиц с относительным бесплодием (30 человек) с нор-• мальнымй показателями рутинных тестов отмечено, что у 25 человек наблюдалось снижение сШ сперматозоидов.

При оценке патогенетического значения снижения отряца.ельно-' го потенциала сперматозоидов и уменьшения их ЭФП у бесплодных мужчин нёобхцдимо подчеркнуть связь этих сдвигов с ослаблением активной поделжности и, следовательно, оплодотворяющей способности этих клеток. Отрицательный электрический зарод имеет важное значение дл" подвижности сперматозоидов. Благодаря ему, по данным В.В.Лих-.йличенко с соавт. (1^/77), не происходит столкновения и слипания спермиев в густом эякуляте.

Таким образом, в итоге Есестороннего обследования по общепринятым тестам, а также с использованием более.сложных.биохимических и физико-химических методоп, у £00 мужчин, страдающих

бесплодием, былиг установлены закономерности, отражающие важные патогенетические механизмы возшкновения и развития нарушений; в сперматозоидах, которые мохут явиться причиной потери ими о.хлодотворяющей способности. Результаты исследований сложной цепи процессов, обеспечиваю1Цих сперматогенез и функцию данных клеток, помогут выявить гвено, на уровне которого локализовано повреждение, что будет иметь аначение для определения наиболее рациональных*путей ь терапии цужского бесплодия.

Рис.3. Гистограмма средних значений электрофоретической под-важности сперматозоидов фертильнкх (I) и инфертиальньк . - мужчин '•-.-.',

Комплексный аналцз .данных, получв!.ных при изучении количества и структуры да сперматозоидов, их э^ектрокине/ического потенциала, а т-кже продукции в вякупяте активных форм кислорода и интегральной функции антиоксвдантных систем позволил

разработать новые критерии лабораторной оценки функциональной полноценности сперматозоидов. Применение данного комплекса тестов совместно со стандартными общепринятыми методами изучекля эякулята рекомендуется для диагности-и патологии сперматогенеза у лиц с относительным бесплодием.

вывода ■"■

1. У большинства бесплодных мужчин обнаруживаются иэменилия концентраций, подвижности, морфологии сперматозоидов, оогема, вязкости эякулята, наличие в нем лейкоцитов и эпителиальных клеток. Наиболее часто нарушается подви.шость сперматозоидов. У 15 % обследованных бесплодным "уясчин никаких отклонений от нормы по данным показателям не выявлено.

2. В эякуляте бесплодных мужчин увеличено число сперматозоидов с количеством ДШС / 1С й ДНК ^ 1С, по сравнен,по с фер-тильными, у ко»орых основная масса пологих клеток содержит

1С да. .

С. У бесплодных мужчин увеличена концентрация свободных радикалов кислорода и снижена активность енгиоксидантных систем в сперм".

4. Поверхностный электрический заряд сперматозоидов бесплодных мужчин понижен, что выражается в уменьшении электрической подвижности клеток.

5 Обнаружена количественная взаимосвязь между показателями структурных, метаболических и функциональных сдвигов в сперматозоидах бесплодных мужчин. Прямая корреляция установлена между количеством сперматозоидов с измененной структурой ДНК и числом ю.зточ с пониженной электрофоретичаской подспжностью, а также с уровнем гиперпродукции свободных радикалов кислорода, в-сперме. Количество сперматозоидов с пониженным отрицательно

электрическим аарядом коррелирует с числом половых клеток с нартенной дьигательной активностью.

6. У бесплодKux мужчин, в сперме которых по общепринятым тоетам отклонений, от нормы обнаружить не удалось, методами проточной цитофлюориметрии, хемилюминесценции и клеточного электрофореза выявленj сдвиги, свидетельствующие о функциональной неполноценности сперматозоидов.

7. Применение комплекса инструментальных тестов, включающих метод проточной цитофлюориметрии, хеиилшинесценции, клеточного распределительного электрофореза, совместно со стандартными общепринятыми методами игучекия еякуллта позволяет учучадть . диагностику патоопермии у лиц с относительным бесплодием.

Список рйбдт, опубликованных по теме диссертации

1, Лелещенко A.B., Кравцов А.Л., Лаэовсгий Ю.В. Изменения иммунного статуса людей с патологией сперматогенеза JJП Международный симпозиум, реабилитации именной системы (Цхалтубо, 1990): Тег,докл. П Менщунеродного симпозиума реабилитации иммунной системы. - Цхалтубо, 1990. - С.Зо. •

2, Мелещенко A.B., Кравцов А,Л., Ледванов ¡О. Проточная иммунная цитсфлаориметрия спэрматоэ0"дов человека //Лаборато-ное дело. - 1992. - № 2. - С.25-27.

3, ¡¿еловднко A.B., Кравцов А.Л., Ледванов М.Ю. Лучение ДНК сперматозоидов человека методом импульсной иитофлюоримет-рпи //1У Воес.зъеэд урологоа (Москва, 10-12 октября, 1990): Тез.докл. 1У Всёс.сьевда урологов. - д|., 1990. - С.609.