Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Молекулярные и клеточные механизмы функционирования мужской репродуктивной системы в условиях экстремальных и фоновых воздействий различной природы и интенсивности

На правах рукописи

Галимова Эльмира Фанисовна

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ И КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ МУЖСКОЙ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ В УСЛОВИЯХ ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ И ФОНОВЫХ ВОЗДЕЙСТВИЙ РАЗЛИЧНОЙ ПРИРОДЫ И ИНТЕНСИВНОСТИ

14.03.03 — патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук ] 1 НОЯ 2015

005564541

Москва - 2016

005564541

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Павлов Валентин Николаевич Официальные оппоненты:

Порядин Геннадий Васильевич, доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАН, заведующий кафедрой патофизиологии и клинической патофизиологии лечебного факультета ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Коган Михаил Иосифович, доктор медицинских наук, профессор, Заслуженный деятель науки РФ, заведующий кафедрой урологии и репродуктивного здоровья человека с курсом детской урологии-андрологии ГБОУ ВПО «Ростовский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Морозова Ольга Леонидовна, доктор медицинских наук, доцент, профессор кафедры патофизиологии ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М.Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Ведущая организация: ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов» Министерства образования и науки Российской Федерации

Защита состоится «_»_2016 г. в_часов на заседании Диссертационного совета Д 208.040.08 в ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова Минздрава России по адресу: 119992, г. Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова Минздрава России по адресу: 119034, г. Москва, Зубовский б-р, 37/1 и на сайте www.mma.ru

Автореферат разослан /» 2015 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор

Калюжин Олег Витальевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Охрана мужского здоровья — относительно новая и активно развивающаяся область медицины, сфера интересов которой не ограничивается эректильной дисфункцией и заболеваниями предстательной железы. Здоровье мужчины в XXI веке подразумевает широкое осмысление всех сторон его существования, включая выбор образа жизни, взаимодействие с окружающей средой и отношение к медицине (Garfield С., 2008; Levant R., Wimer D., 2014). Эта новая парадигма следует из факта, что более высокий социальный статус мужчин практически не отражается на их здоровье, они имеют более высокие показатели смертности, чем женщины, и продолжают отставать от них в продолжительности жизни и использовании услуг здравоохранения (Williams D., 2008).

Большинство публикаций о состоянии здоровья современного мужчины имеет ярко выраженную минорную тональность. Приведем лишь наиболее драматические дефиниции: «вымирающий пол» (Meryn S., Jadad А., 2001), «хрупкий мужчина» (Kraemer S., 2008), «кризис сперматозоида» (Aitken R., 1999). Одной из первых научных публикаций, заставивших признать остроту проблемы мужского здоровья, была работа Carlsen Е. et al. (1992), в которой было продемонстрировано ухудшение параметров спермы у мужчин Западной Европы и Северной Америки за последние 50 лет. Несмотря на то, что немедленно появились как опровержения, так и подтверждения гипотезы об утрате способности мужчин к зачатию в ближайшей исторической перспективе, споры о существовании феномена «кризиса сперматозоида» не угасают до сих пор (Cocuzza M., Esteves S., 2014).

Результаты эпидемиологических исследований свидетельствуют о снижении фертильности мужчин в самых разных регионах, особенно в странах Восточной Европы (Lopez Teijon M. et al., 2007; Le Moal J. et al., 2014; Agarwal A. et al., 2015). Отмечено уменьшение показателей репродуктивной функции у мужчин в Индии, Японии и, подчеркнем особо, в Китае, причем скорость этого процесса оказалась даже выше, чем у европейцев (Gao J. et al., 2007; Iwamoto T. et al., 2013). Аналогичные явления характерны и для российских мужчин, у которых обнаружено не только изменение качества эякулята, но и дефицит андрогенов (Галимов Ш.Н. и др., 2002; Калинченко С.Ю., Тюзиков И. А., 2009).

Дисфункция сперматозоидов — это самая частая причина бесплодия, которое затрагивает приблизительно одного из 15 мужчин (Kashanian J., Brannigan R., 2015). Это более высокая доля населения по сравнению с другими распространенными заболеваниями, такими, как например, сахарный диабет. По расчетам экспертов РАМН, мужская инфертильность явилась причиной нерождения примерно 3,5-4,0 млн. детей в России за последние 15-20 лет (Артюхин A.A., 2007). В срав-

нении с успехами в терапии женского бесплодия лечение мужчин остается малоэффективным и носит эмпирический характер с непрогнозируемым результатом (Ко Е. et al., 2012). Таким образом, мужская субфертильность представляет собой серьезную глобальную проблему.

В настоящее время особое внимание привлечено к различным аспектам воздействия стресса на репродуктивное здоровье. Экстремальные воздействия различной природы оказывают выраженное негативное влияние на репродуктивную функцию (Потемина Т.Е. 2008; Гуторова Н.В. и др., 2012; Nirupama М. et al., 2012 и др.), которое ассоциировано с повреждением ДНК сперматозоидов (Божедомов В.А. и др., 2012; Aitken R. et al., 2013). Генез этих нарушений связан в первую очередь с патологией конденсации хроматина герминативных клеток, инициацией в них апоптоза и свободнорадикальных процессов.

Способность генерировать АФК — фундаментальное свойство сперматозоидов и основная причина окислительного стресса, ответственного за нарушение их функции (Борисов В.В., 2014; Lavranos G. et al., 2012; Raheem A. et al., 2012). Результатом гиперпродукции АФК является повреждение нуклеиновых кислот и митохондрий, вследствие чего сперматозоиды теряют подвижность и жизнеспособность. Этот путь приводит к экстернализации фосфатидилсерина, который способствует фагоцитозу сперматозоидов после оплодотворения, что предопределяет иммунный ответ на спермальные антигены и прогноз фертильности (Barroso G. et al., 2006). Несмотря на чувствительность к окислительному стрессу, функция сперматозоидов критически зависит от АФК, необходимых для активации сигнальных путей, связанных с капацитацией (Ferramosca A., Zara V., 2014).

Одной из первостепенных причин увеличения частоты мужского бесплодия является химическое загрязнение биосферы (Lange A. et al., 2009). Наибольший интерес вызывают диоксины, полибром- и полихлорбифенилы, фталаты, бисфе-нол А и целый ряд соединений с доказанной или потенциальной репро- и спермо-токсичностью (Delbes G. et al., 2010; Vandenberg L. et al., 2012). Например, бром- и фторпроизводные дифенилов используются как пламегасители в промышленной и бытовой электронике, а хлорпроизводные — как диэлектрики, что обусловило ежедневный контакт с ними практически всей человеческой популяции. Фталаты и бисфенолы нашли применение при производстве пластиковой посуды, парфюмерии, детских игрушек и т.д. Действуя совместно, эти вещества активны даже в том случае, если концентрация отдельных из них меньше предельно допустимой, т.е. для них характерен «эффект коктейля» (Birnbaum L., 2013). Между тем молекулярные и метаболические механизмы спермотоксического действия многокомпонентных смесей СОЗ, а также особенности накопления и распределения от-

дельных конгенеров в репродуктивных органах, особенно в сравнительном аспекте в мужском и женском организме, охарактеризованы недостаточно полно.

Таким образом, правомерно выделение двух основных механизмов увеличения частоты репродуктивной патологии у современного мужчины, которая скрывается под маской т.н. идиопатического бесплодия: экстремальных (стрессов различной природы) и фоновых воздействий (поступления экополлютантов в пороговых и субпороговых концентрациях). Многие аспекты влияния этих факторов на мужскую репродуктивную систему, связанные, в первую очередь, с состоянием регуляторных систем, молекулярными механизмами повреждения сперматозоидов, гормональным, метаболическим и цитокиновым профилем эякулята практически не исследованы.

Отсутствует интегральная схема метаболических изменений при бесплодии неизвестного происхождения, обобщающая динамическое состояние всех известных маркеров плодовитости на различных уровнях организации гипоталамо-гипофизарно-тестикулярной оси.

Не установлен вектор взаимодействий многочисленных соединений белковой, липидной и углеводной природы, содержащихся в семенной плазме, их взаимосвязь с морфофункциональными свойствами сперматозоидов и место в общей картине дезадаптации репродуктивной системы при этой патологии, что и предопределяет необходимость дальнейших изысканий в этой области.

Цель и задачи исследования. Целью исследования является выявление молекулярных механизмов повреждения и адаптации мужской репродуктивной системы в условиях стресса и экологического неблагополучия, разработка и обоснование патогенетически обоснованных методов повышения эффективности лечения мужского бесплодия.

Для достижения поставленной цели сформулированы следующие задачи:

1. Изучить морфофункциональные, биохимические и гормональные показатели эякулята, про- и антиоксидантный статус спермоплазмы, степень окислительной модификации ДНК и белков сперматозоидов при идиопатическом бесплодии.

2. Выявить уровни специфических маркеров фертильности (гликоделин, инги-бин В, лептин, адипонектин, грелин, мелатонин, акрозин и др.) в сыворотке крови и/или сперме на фоне стрессовых воздействий.

3. Дать оценку роли цитокинов различных классов - про- и противовоспалительных, хемокинов, ростовых факторов в развитии идиопатического бесплодия у мужчин.

4. Исследовать накопление и распределение галогенированных производных дифенилов в половых органах самцов и самок крыс.

5. Определить содержание приоритетных поллютантов класса бром- и хлор-дифенилов в эякуляте инфертильных мужчин. Оценить наличие связи между развитием патоспермии и уровнем загрязнителей окружающей среды в эякуляте.

6. В эксперименте на животных обосновать возможность использования дозированной физической нагрузки для предупреждения патоспермии, вызванной активацией процессов свободнорадикального окисления в репродуктивных органах при стрессе.

7. Охарактеризовать влияние препаратов с различным механизмом действия -Ь-карнитина, убихинона, биофлавоноидов прополиса — на показатели сперматогенеза у мужчин из бесплодных семейных пар.

8. Оценить значение изменений метаболического профиля, активности узловых ферментов обмена веществ, уровня молекулярных факторов фертилизации семенной плазмы, карбонильного и редуктивного стресса сперматозоидов в механизмах развития идиопатического бесплодия.

Научная новизна. Осуществлено комплексное углубленное исследование молекулярных и клеточных механизмов нарушения оплодотворяющих свойств эякулята и их ассоциаций с уровнем локальных и системных регуляторов фер-тильности, а также свободнорадикальным статусом мужчин, подверженных воздействию фоновых интоксикаций приоритетными загрязнителями окружающей среды и стресса различной природы.

Получены новые сведения об особенностях состава спермальной плазмы в норме и патологии. Проведена сравнительная оценка ее биохимического состава у фертильных и инфертильных мужчин, обнаружены множественные корреляционные связи между отдельными параметрами метаболизма и морфофункциональ-ными характеристиками сперматозоидов, их концентрацией.

Представлена обобщенная патохимическая модель метаболического профиля семенной плазмы как нутритивного и протективного окружения сперматозоидов, объединяющая индикаторы энергетического статуса, оксидативного повреждения, состояния пиридин- и тиолзависимых систем, обмена биополимеров, адипокинов, цитокинов и других модуляторов фертилизации.

Установлена ведущая роль многофункциональных соединений различного происхождения — мелатонина, гомоцистеина, лептина, грелина, активина, лактата, холестерина в перепрограммировании метаболических процессов в эякуляте при идиопатическом бесплодии.

Показано, что при инфертильности неясного генеза в семенной жидкости формируется количественный дефицит и нарушение соотношения факторов роста и хемокинов (ЗОБ-1а, ТвБ-Р и 1Ь-7), принимающих непосредственное участие в

регуляции пролиферативных процессов и иммунного ответа в репродуктивной системе, детерминируя тем самым снижение оплодотворяющей способности сперматозоидов.

Уточнены и подробно охарактеризованы особенности состояния процессов перекисного окисления липидов и оксидативного повреждения белков и нуклеиновых кислот в эякуляте, обусловленные преимущественно угнетением глутати-онзависимого звена антиоксидантной защиты на фоне интенсификации образования активных форм кислорода, с последующим увеличением уровня патологических белковых/пуриновых дериватов и возникновением карбонильного стресса сперматозоидов.

Впервые продемонстрировано, что эмпирическая антиоксидантная терапия может приводить к развитию гипервосстановленного состояния редокс-систем эякулята, т.е. явлений редуктивного стресса как зеркального отражения окислительного стресса с аналогичными негативными последствиями для детородной функции. На базе этих данных сформулирована концепция управляемой перокси-дации и адекватной контролируемой терапии окислительного стресса сперматозоидов, согласно которой применение антиоксидантов, а также корректировка дозы и режима их назначения, должны сопровождаться обязательным динамическим мониторингом спермограммы и молекулярного профиля семенной плазмы.

Впервые выполнен анализ содержания в биологических жидкостях мужчин с идиопатическим бесплодием (сыворотке крови и сперме) наиболее актуальных поллютантов, обладающих гонадотоксическими свойствами — конгенеров поли-хлорированных диоксинов, фуранов и дифенилов, а также полибромированных дифениловых эфиров. Контаминация эякулята бесплодных мужчин полихлориро-ванными дибензо-пара-диоксинами/фуранами подтверждает гипотезу о взаимосвязи состояния окружающей среды и репродуктивной патологии.

Теоретическая и практическая значимость работы. Установлены закономерности обменных превращений в спермоплазме и их дизрегуляции при репродуктивных нарушениях неустановленной этиологии, охарактеризованы молекулярные и клеточные основы возникновения патологических и компенсаторных реакций при инфертильности. Определены ключевые гормонально-метаболические детерминанты дисфункции сперматозоидов, что открывает перспективы мишеньориентированной коррекции идиопатического бесплодия.

Выделены наиболее информативные лабораторные маркеры оценки степени тяжести и прогноза развития мужского бесплодия: определение индекса тератозо-оспермии (Т21), концентрации гомоцистеина в сперматозоидах, лептина, грелина и активина в семенной жидкости.

Дано теоретическое обоснование вероятности развития осложнений эмпирической терапии мужского бесплодия в форме редуктивного стресса. Для контроля антиоксидантной терапии инфертильных пациентов в случаях ее низкой эффективности целесообразно включение в стандартный алгоритм диагностики определения окислительно-восстановительного статуса глутатиона в спермоплаз-ме как чувствительного предиктора вероятности редуктивного повреждения сперматозоидов.

Получены прямые доказательства причастности полихлорированных диоксинов и фуранов к механизмам возникновения идиопатической инфертильности. Феномен их наличия в эякуляте пациентов позволяет рекомендовать использование этого теста в качестве неинвазивного индикатора экспозиции ксенобиотиками и для профилактики интоксикации.

Результаты работы будут востребованы не только в научных целях для расшифровки природы идиопатического бесплодия на молекулярном и субклеточном уровнях, но и могут быть использованы для создания инновационных методов диагностики и патогенетически обоснованного лечения этого недуга.

Внедрение результатов исследования в практику. Результаты и основные положения диссертационной работы включены в педагогическую практику и учебный процесс кафедр патологической и нормальной физиологии, гистологии, лабораторной диагностики ИДПО, урологии с курсом ИДПО, репродуктивного здоровья человека ИДПО с курсом иммунологии, гигиены труда и профессиональных болезней ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации; кафедр патофизиологии и биологической химии Первого Московского государственного медицинского университета имени И.М. Сеченова; кафедр общей патологии и биохимии ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации; кафедр патологической физиологии и патологической анатомии ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации; кафедры биологической химии и клинической лабораторной диагностики ГБОУ ВПО «Дальневосточный государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, используются в работе ГБУЗ «Республиканский перинатальный центр» Республики Башкортостан.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Идиопатическое бесплодие в большинстве случаев сопровождается развитием патологии сперматозоидов в виде олиго-, астено- и тератозооспермии (61,4%). Однако значительную долю составляют пациенты без отклонений стан-

дартной спермограммы, т.е. с нормоспермией, частота которой в структуре заболевания достигает 38,6%.

2. Вектор изменений метаболического статуса и структурно-функционального состояния сперматозоидов и семенной плазмы указывает на их угнетение. Сдвиги концентрации абсолютного большинства молекулярных маркеров фертильности предшествуют отклонениям рутинных параметров спермограммы, что диктует возможность их использования в диагностических и прогностических целях.

3. Важная роль в патогенезе идиопатического бесплодия у мужчин принадлежит, наряду с окислительным стрессом, процессам карбонильной модификации биополимеров эякулята, в частности, накоплению карбонилированных протеиновых производных, которое сопряжено с ограничением подвижности и увеличением количества морфологически измененных сперматозоидов.

4. Серьезным побочным эффектом антиоксидантной терапии инфертильно-сти является развитие неописанного ранее феномена редуктивного стресса сперматозоидов, сопровождающегося резким ухудшением качественных и количественных характеристик эякулята и изменением биохимического состава семенной жидкости.

5. Диоксины являются одной из превалирующих форм ксенобиотиков, детектируемых в эякуляте. Сравнительно высокий уровень этих загрязнителей окружающей среды в данной биологической среде свидетельствует о том, что этот путь представляет собой один из основных способов элиминации чужеродных соединений из организма. Индивидуальный спектр экополлютантов в семенной жидкости зависит от места проживания, профессионального маршрута и характера питания мужчины.

Личный вклад автора

Автором самостоятельно сформулированы цель и задачи исследования, проведен анализ отечественной и зарубежной литературы, лично разработаны программа и план исследования, осуществлен подбор адекватных методов достижения поставленных задач. Автор принимала непосредственное участие в отборе образцов биологических жидкостей у пациентов и их исследовании на содержание биохимических аналитов и молекулярных маркеров репродуктивной функции, ею выполнены статистическая обработка и анализ результатов диссертационной работы, написание статей, сформулированы научные положения и выводы. Лабораторные эксперименты выполнены лично или под руководством автора. Отдельные исследования проведены в сотрудничестве со специалистами Республиканского перинатального центра и клиник вспомогательных репродуктивных

технологий г. Уфы, а также Башкирского республиканского научно-исследовательского экологического центра.

Соответствие паспорту специальности

Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.03.03 — патологическая физиология. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно - пунктам 7, 9 и 10 паспорта специальности.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на Международном конгрессе «Профилактика нарушений репродуктивного здоровья от профессиональных и экологических факторов риска» (Волгоград, 2004); II, III, VI, IX, X, XII Российских научных форумах «Мужское здоровье и долголетие» (Москва, 2004, 2005, 2008, 2011, 2012, 2014); Всероссийских научно-практических конференциях «Проблемы риска здоровья населения России от воздействия факторов окружающей среды» (Москва, 2004), «Уралэкология, природные ресурсы — 2005» (Уфа, 2005), «Труд и репродуктивное здоровье работающего населения Северо-Запада России» (Апатиты, 2007); IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); V Всероссийском форуме «Здоровье нации — основа процветания России» (Москва, 2009); V, VII и VHI Российских конгрессах «Мужское здоровье» (Кисловодск, 2009; Ростов-на-Дону, 2011; Ереван, 2012); VII Международном научно-практическом конгрессе «Человек в экстремальных условиях: клинико-физиологические, психологические и санитарно-эпидемиологические проблемы профессиональной деятельности (Москва, 2010); XXI и XXII Международных конференциях Российской ассоциации репродукции человека «Репродуктивные технологии сегодня и завтра» (Санкт-Петербург, 2011; Геленджик, 2012); VII Международном Конгрессе Профессиональной ассоциации андрологов России (Сочи, 2012); Всероссийской конференции «Фармакологическая коррекция процессов жизнедеятельности. Доклинические и клинические исследования новых лекарственных препаратов» (Уфа, 2012); XII Международном форуме "НСН & Pesticides" (Киев, 2013); II Международной научной конференции "European Applied Sciences: modern approaches in scientific researches" (Штутгарт, 2013); Международном симпозиуме «Биохимия — основа наук о жизни» (Казань, 2013); V Российской научно-практической конференции «Здоровье человека в XXI веке» (Казань, 2013); Российско-Азиатском Уро-Андрологическом Конгрессе (Санкт-Петербург, 2014); Международной научной конференции «Токсикология, эпигенетика и репродукция» (Москва, 2014); Первом республиканском Форуме отцов «Отец — опора семьи» (Уфа, 2014); Республиканской научно-практической конференции «Роль природных факторов

в лечении урологических заболеваний, репродуктивного здоровья мужчин» (Башкортостан, санаторий «Якты-Куль», 2014); VII Всероссийской конференции «Иммунология репродукции: теоретические и клинические аспекты» (Ростов-на-Дону, 2015); XV Всероссийском форуме с международным участием «Дни иммунологии» им. академика В.И.Иоффе (Санкт-Петербург, 2015). Апробация состоялась на заседании проблемной комиссии «Морфология и общая патология» ГБОУ ВПО Башкирского ГМУ 09.09.2015.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 56 работ, из которых 27 статей в журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации для публикации основных результатов диссертации на соискание ученой степени доктора наук, в том числе 6 статей в журналах, входящих в международные базы цитирования.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 247 страницах машинописного текста, содержит 8 рисунков, 42 таблицы и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, который включает 456 источников, из которых 59 отечественных и 397 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Дана оценка состояния репродуктивной системы мужчин из семейных пар с идиопатическим бесплодием, обратившихся в ЛПУ г. Уфы (перинатальный центр, клиники ВРТ). Всего обследовано 510 человек. Пациенты состояли в бесплодном браке от 1 до 10 лет. Критериями включения в исследование явились: отсутствие беременности у супруги пациента более 1 года при регулярной половой жизни без контрацепции, возраст от 20 до 45 лет, патология спермограммы, продолжительность проживания в данном районе не менее 5 лет, возраст супруги пациента 1840 лет. Критерии исключения — тяжелая соматическая патология, заболевания яичек и придатков, оперативные вмешательства на органах мошонки, паховых каналах и сосудах яичка, эпидемический паротит в анамнезе, хронический алкоголизм, курение, генетические аномалии, оценка эректильной функции по шкале МИЭФ менее 10 баллов, репродуктивная патология у супруги пациента.

По итогам целенаправленного отбора была сформирована группа соматически здоровых сексуально активных пациентов с мужским фактором бесплодия (360 человек), которая явилась объектом углубленного клинико-лабораторного обследования. Группу контроля составили 86 мужчин с доказанной фертильно-стью, имеющих от 1 до 3 здоровых детей в семье. Контрольная группа была со-

поставима по возрасту, материально-бытовым условиям, обеспеченности медицинской помощью, структуре экстрагенитальной патологии, продолжительности проживания в данном районе и социальному положению.

У всех пациентов было проведено комплексное клинико-лабораторное обследование с общеклиническим анализом эякулята, определением гормонального фона и содержания биохимических маркеров фертильности, оценкой метаболического, энергетического, цитокинового и свободнорадикального статуса сыворотки крови и спермы, а также концентрации некоторых распространенных загрязнителей окружающей среды в семенной жидкости.

Активность ферментов и содержание гормонов, цитокинов, метаболитов и других биологически активных соединений в сыворотке крови и спермоплазме определяли с помощью стандартных тест-систем в соответствии с прилагаемыми инструкциями производителей (табл. 1).

Таблица 1

Перечень использованных диагностических систем

Соединение Наименование Производитель

набора

ингибин В ACTIVE™ Inhibin В DSL (США)

гликоделин Glycodelin ELISA Bioserv (ФРГ)

акрозин AcroScreen Fertility Technology Resources

Inc (США)

адипонектин Adiponectin ELISA Bio Vendor (Чехия)

грелин Ghrelin EIA RayBiotech Inc (США)

лептин Leptin Sandwich EIA DRG Int (США)

фибронектин Fibronectin ELISA Kit Technoclone (Австрия)

мелатонин Melatonin ELISA IBL Int (ФРГ)

активин А Activin A ELISA BCM Diagnost (США)

глутатион-Б-трансфераза GST Assay Kit Immundiagnostik (ФРГ)

глутатионпероксидаза Gpxl ELISA kit Bio Vendor (Чехия)

супероксиддисмутаза Cu/ZnSOD Platinum Bender MedSystems (Австрия)

ФНОа TN Fa Bender MedSystems (Австрия)

интерлейкины 1р, 2, 4, 5-8, 10, IL-lß, 2,4, 5-8, 10, 11, Bender MedSystems (Австрия)

11,13, 17, 18 13,17, 18

фактор стромальных клеток а SDF-la BCM Diagnost (США)

трансформирующий фактор ро- TGF-P BCM Diagnost (США)

ста р1

8-гидрокси-2-дезоксигуанозин DNA Damage BCM Diagnost (США)

карбонилированные белки Carbonylproteine Immundiagnostik (ФРГ)

ELISA

ТБК-активные продукты ТБК-Агат Агат-Мед (Россия)

общая антиокислительная Total antioxidant status Randox Laboratories (Велико-

активность британия)

цАМФ cAMP BCM Diagnost (США)

АТФ ATP Bioluminescent Sigma-Aldrich Corp

Assay Kit

гомоцистеин Homocysteine EIA Axis-Shield (Великобритания)

При биохимическом исследовании в семенной жидкости определялись основные субстраты энергетического и пластического обмена. Уровень гидроперок-, сидов липидов (LPx) определяли по Nourooz-Zadeh J. et al. (1994); содержание глутатиона по Rahman I. et al. (2006). Концентрацию цитрата в семенной плазме определяли с помощью фотометрического метода (CitricScreen, «БиоХимМак»).

Концентрацию альбуминов, креатинина, лактата, мочевины и кальция, активность ЛДГ, ACT, АЛТ, ЩФ, а-глюкозидазы, ос-амилазы, ГР, КФК, МДГ, Г6ФДГ, каталазы исследовали на анализаторе «Stat Fax 1904+» (США).

Лабораторное исследование эякулята заключалось в определении физико-химических свойств и клеточного состава. Перед сдачей анализа пациенты были проинформированы о времени воздержания, отсутствии тепловых процедур, приеме антибиотиков, больших доз алкоголя.

Каждому обследуемому была дана письменная инструкция по получению эякулята. Период воздержания составил в среднем 3-4 дня. Эякулят получали путем мастурбации в стерильный нетоксичный пластиковый контейнер одноразового использования с широкой горловиной и крышкой. На контейнере отмечали индивидуальный номер пациента, дату и время получения спермы. Доставка биоматериала в лабораторию осуществлялась в течение 1 часа при температуре от 20° до 37° С. Образцы хранили в термостате при 37° С. Процедуру исследования проводили через 30-60 мин после эякуляции и полного разжижения коагулята.

Анализ семиологических образцов выполняли согласно «Руководству ВОЗ по лабораторному исследованию эякулята человека и взаимодействия сперматозоидов с цервикальной слизью» (1999), «Руководству ВОЗ по лабораторному исследованию и оценке человеческой спермы» (2010) и рекомендациям ведущих российских специалистов (Брагина Е.Е., 2014). Для сопоставимости данных, полученных ранее, все заключения по анализам, выполненным в 2003-2009 гг., были пересмотрены согласно нормам ВОЗ (2010).

Оценку состояния свободнорадикальных процессов и антиокислительной активности эякулята, наряду с биохимическими методами, проводили также с помощью хемилюминесцентного анализа.

В качестве дополнительного критерия качества эякулята подсчитывали индекс тератозооспермии (teratozoospermia index — TZI), который показывает среднее количество дефектов на 1 аномальный сперматозоид и считается по формуле: TZI = (а + b + с + d) / Е,

где а — количество сперматозоидов с дефектами головки; b — с дефектами шейки; с — с дефектами жгутика; d — с цитоплазматическими каплями; Е — общее количество аномальных сперматозоидов.

Методы определения диоксинов, полихлорбифенилов и полибромиро-ванных бифениловых эфиров в биологических средах

Содержание загрязнителей окружающей среды было определено в эякуляте и фолликулярной жидкости супружеских пар — пациентов клиник ВРТ с диагностированным бесплодием. Перед определением поллютантов индивидуальные аликвоты эякулята или фолликулярной жидкости во всех группах были объединены, для анализа использовалось 100 мл или в отдельных случаях 50 мл суммарного пула. Все образцы были заморожены и хранились при —18° С.

Определение содержания нолихлорированных дибензо-п-диоксинов и по-лихлорированных дибензофуранов (ПХДД/ПХДФ)

Пробоподготовка эякулята включала стадии экстракции, очистки и концентрирования. Экстракция липидов осуществлена смесью гексан / диэтиловый эфир / этанол. Содержание липидов определяли гравиметрически. Далее в образцы вносили изотопно меченные 13С-ПХДД/ПХДФ и экстрагировали ПХДД/ПХДФ смесью ацетон : гексан = 2:1. Экстракты объединяли, отфильтровывали и подвергали очистке на многослойной колонке с силикагелем, основной окисью алюминия и адсорбентом Carbopack-C/Celite 545.

Разделение ПХДД/ПХДФ производилось с помощью комбинации высокоэффективной газожидкостной хроматографии с хроматомасс-спектрометрией высокого разрешения. Система измерения HRGC/HRMS состояла из хроматографа «Carlo Erba 8035» (Италия), хроматомасс-спектрометра «Autospec-Ultima VG» (Великобритания) и колонки DB-5 MS 0,5x60 м («J&W Scientifical»),

Контроль степени извлечения, очистки и калибровки выполнен по методике Агентства США по охране окружающей среды (USEPA Method, 1994). Для расчета токсических эквивалентов пользовались шкалой TEF-2005 (Van den Berg М. et al., 2006). Поскольку суперэкотоксиканты накапливаются в липофильных матрицах, все результаты даны в пересчете на содержание липидов в образцах. Определение содержания полихлорбифенилов (ПХБ) В образцы вносили изотопно-меченые стандарты ПХБ, гомогенизировали, полученной массой заполняли стеклянную колонку. Элюцию проводили 5-6-кратным объемом смеси хлороформ/гексан = 2:1. Липидный экстракт концентрировали и подвергали очистке с помощью SiC>2, А12Оз и графитированной сажи. Для очистки экстрактов от полимеров, сополимеров, белков, природных смол, стероидов и высокомолекулярных соединений использована препаративная колонка 300x19 мм Envirogel™ GPC Cleanup фирмы "Waters" с пористыми диви-нилбензолстирольными частицами размером 15 мкм диаметром пор 100 Ä. Хро-матографическое разделение проводили в режиме постоянного потока при скоро-

сти подвижной фазы 4000 мкл/мин, рабочем давлении колонки 1,2-1,3 МПа. Перед вводом пробы в колонку ее фильтровали через фторопластовый диск (диаметр пор 425 мкм). Хроматомасс-спектрометрия низкого разрешения выполнена на системе Fisons MD800, использовалась колонка DB-5ms 60 м х 0,25 мм х 0,1 мкм («J&W Scientific»). Групповая идентификация ПХБ проведена по характеристическим ионам соответствующих молекулярных масс (Erickson М., 1997).

Определение содержания полибромдифениловых эфиров (ПБДЭ)

Пробоподготовка и анализ проводился по методике «Исследование броми-рованных дифенилэфиров в воде, почве, донных отложениях и тканях с использованием газовой хроматографии и масс-спектрометрии высокого разрешения» (USEPA Method, 2007). Количественную оценку нативных изомеров проводили по внутреннему стандарту, который добавлялся перед пробоподготовкой.

В исследуемую жидкость вносили смесь изотопно меченных стандартов тетра-, пента- и гептабромированных дифенилэфиров (13C-TBDE-47, 13C-PeBDE-99, 13C-HeBDE-139). Экстракцию проводили смесью гексан/диэтиловый эфир = 1:1. Дополнительную очистку для удаления примесей проводили на комбинированной колонке (кислотный, нейтральный и основной силикагель + флорисил). ПБДЭ элюировали смесью гексана, хлористого метилена и этилацетата. Анализы экстракта выполнены на хромато-масс-спектрометре MD800 (VG MassLab, Великобритания). Сбор и обработка данных производилась с помощью пакета программ MassLab ver. 1.4, сопровождающего хромато-масс-спектрометр.

Экспериментальные модели

Экспериментальная часть работы включала проведение морфологических, биохимических, гормональных, физиологических и токсикологических исследований. Всего использовано 260 белых беспородных половозрелых крыс репродуктивного возраста массой 200-260 г. (210 самцов и 50 самок).

Статистические группы состояли из 9-12 особей. Животные содержались в одинаковых условиях на стандартной диете вивария при 12-часовом световом дне в контролируемых условиях, со свободным доступом к пище и воде. Эксперименты проводились с соблюдением международных рекомендаций по использованию животных в биологических и медицинских исследованиях (Генин A.M. и др., 2001), а также методических рекомендаций № 1744-77 «Методы экспериментального исследования по установлению порогов действия промышленных ядов на генеративную функцию с целью гигиенического нормирования» (1978). Животные были использованы в нескольких сериях экспериментов.

В одной из них было дана оценка метаболического профиля спермоплазмы при воздействии полихлорированных бифенилов, в другой — изучено накопление

и распределение ПХБ в репродуктивных органах самцов и самок крыс в сравнительном аспекте и их влияние на фертильность, в следующей серии моделировалась патология сперматогенеза в тестах плавательной нагрузки и иммобилизаци-онного стресса, а также исследовано влияние дозированной физической нагрузки на параметры эякулята и свободнорадикального гомеостаза сперматозоидов.

Интоксикацию ПХБ моделировали путем затравки животных составом «Со-вол», содержащим 26% тетра-, 65% пента-, 9% гексахлорбифенилов и остаточные количества гептахлорбифенилов (Тутельян В.А. и др., 1995).

Животные были разделены на три группы: в первую группу входили крысы, которым вводили препарат из расчета 3,75 мг/кг массы, доза для животных второй группы составила 37,5 мг/кг массы, контрольной группе давали растительное масло. По истечении срока экспозиции животных забивали путем декапитации с соблюдением правил эвтаназии согласно п. 12 Хельсинкской декларации Всемирной Медицинской Ассоциации о гуманном отношении к животным.

В экспериментах по анализу накопления и распределения ПХБ в репродуктивных органах и жировой ткани крыс была использована пороговая доза 37,5 мг/кг массы. В эксперименте использовались самки после двух последовательных 4-5 дневных эстральных циклов. Содержание отдельных конгенеров находили в образцах яичек, их придатков (эпидидимисе), спермы, яичников и жировой ткани, полученных путем объединения материала, отобранного не менее чем у трех животных. Количественный анализ ПХБ производился с помощью комбинации газовой хроматографии и хроматомасс-спектрометрии низкого разрешения.

Экспериментальные модели стресса

Для моделирования патологии сперматогенеза использовали острый иммо-билизационный стресс по Г. Селье (1980) и тест плавательной нагрузки, который воспроизводили по методике МйщоЦ в. е1 а1. (2003). Влияние физической нагрузки на параметры эякулята и маркеры окислительного стресса изучали в отдельной серии экспериментов. Объектом исследования служили 60 половозрелых самцов белых крыс массой 200-260 г. Животные были разделены на 4 группы по 15 особей. Животных 1-й группы для воспроизведения иммобилизационного стресса держали в положении брюшком кверху 6 часов в 1 -е сутки эксперимента. Животные 2-й группы (престрессовый тренинг) находились в условиях дозированной физической нагрузки — плавательный тест по 15 мин в сутки в течение 5 дней — с последующей иммобилизацией. У животных 3-й группы (постстрессовый тренинг) вызывали принудительную иммобилизацию, после чего моделировали плавательный тест по описанной методике. Все животные наблюдались в течение 1 месяца с мониторингом показателей эякулята и окислительного стресса.

Статистическая обработка результатов исследования проводилась с использованием методов описательной, параметрической и непараметрической статистики при помощи пакета прикладных программ «STATISTICA 8.0 for Windows» (StatSoft, Inc.). Анализ соответствия вида распределения случайных величин закону нормального распределения проводили с помощью критерия согласия Шапиро-Уилка. Вычисляли средние арифметические значения (М), средние квадратичные отклонения (а), ошибку средних и достоверность различий между двумя средними с использованием t-критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при р < 0,05. Для оценки степень взаимосвязи между признаками и сопряженности процессов использовали корреляционный анализ по Спирмену с определением коэффициентов корреляции и их достоверности.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Одним из наиболее обсуждаемых аспектов репродуктивной биологии остается вопрос реальности феномена уменьшения концентрации сперматозоидов. По нашим данным, контингент мужчин с бесплодием неустановленной этиологии дифференцируется на две категории в зависимости от наличия патологии спермо-граммы. Нарушения были найдены у 61% обследованных, а у значительной доли пациентов — 39% индивидов — статистически значимых отклонений количества и качества сперматозоидов выявить не удалось. По результатам исследования показателей спермограммы было выделено три группы мужчин (табл. 2).

Первую составили фертильные доноры, вторую и третью — пациенты с идиопатическим бесплодием. Во вторую группу вошли 139 мужчин, у которых не было найдено статистически значимых изменений эякулята (нормоспермия), в третью — 221 индивид с патоспермией (олиго-, астено-, тератозооспермией).

Таблица 2

Параметры спермограммы обследованных мужчин (М±ш)

Показатель Фертильные доноры (п=86) Бесплодные мужчины

Нормоспермия (,п=139) Патоспермия (п=221)

объем эякулята, мл концентрация сперматозоидов, млн/мл патологические формы, % прогрессивно подвижные сперматозоиды, % индекс тератозоосиермии (Т21) 3,6±0,2 69,6±3,9 34,2±2,2 49,3±2,5 1,45±0,03 3,4±0,3 59,2±5,1 39,1±2,4 47,0±3,2 1,67±0,03* 3,5±0,2 17,4±2,0*'** 67,1±5,1*'** 28,8±1,9*'** 1,73±0,04**

Примечать, здесь и в табл. 3, 4, 8, 9 и 11 - * р<0,05 по сравнению с фертильными донорами

** р<0,05 по сравнению с нормоспермией

Пациенты второй группы имели показатели стандартной спермограммы, не отличающиеся от параметров фертильных доноров, за исключением концентрации сперматозоидов, которая обнаруживала тенденцию к снижению (до 85% контрольных величин). У индивидов третьей группы, напротив, были установлены выраженные отклонения концентрации сперматозоидов, которая составляла 25% от значения контрольной группы (р<0,05). Кроме того, у них было зафиксировано почти 2-кратное превышение уровня патологических форм сперматозоидов и значительное, в 1,7 раза, падение содержания прогрессивно подвижных клеток.

Это свидетельствует о том, что традиционный спермиологический анализ несет ограниченную диагностическую и прогностическую информацию, поскольку очень часто он не способен предсказать истинный потенциал фертильности. Более плодотворным оказался подход с использованием расчетных значений, например, определение индекса тератозооспермии - TZI (множественного индекса аномалий). Мы констатировали достоверное увеличение его величины у всех бесплодных мужчин независимо от степени патоспермии.

Анализ частоты морфологических аномалий сперматозоидов продемонстрировал наличие широкого спектра нарушений в группе бесплодных мужчин с патоспермией — дефектов головки, шейки, жгутика и присутствие остаточной ци-топлазматической капли. Последний признак как изолированное явление был обнаружен также у пациентов с нормоспермией, следовательно, сохранение резиду-альной цитоплазмы является характерным симптомом неполноценных половых клеток при всех формах инфертильности.

Полученные результаты позволяют рекомендовать применение методов определения остаточной цитоплазмы сперматозоидов, а также индекса тератозооспермии, не только в научно-исследовательских целях, но и в клинической практике. Кроме того, если ранее эти параметры рассматривались как дополнительные критерия качества эякулята, то, по нашему мнению, существует необходимость их внедрения в качестве диагностических тестов у всех бесплодных мужчин, а не только в случаях оценки оплодотворяющего потенциала у мужчин с очень низким количеством нормальных сперматозоидов (Bjorndahl L. et at., 2010).

Ситуацию в современной сперматологии можно охарактеризовать как методологический тупик, когда классические подходы, основанные на микроскопии и рутинных анализах, практически себя исчерпали и подвергаются обоснованной критике (Sanchez V. et al., 2013), а инновационные разработки на базе геномики и протеомики еще очень далеки от совершенства (Barazani Y. et al., 2014). Тривиальный анализ спермы, который более 50 лет представлял собой краеугольный камень верификации оплодотворяющей способности, потерял былое значение, он

дает минимум информации при идиопатическом бесплодии, доминирующей формы репродуктивной патологии. Одной из причин замедления темпов прогресса в области диагностики мужского бесплодия является то, что понимание базисных механизмов жизнедеятельности зрелых сперматозоидов все еще ограничено. Главным образом это касается молекулярных основ фертильности, расшифровки всей совокупности химических соединений и взаимодействий между ними, которые вовлечены в реализацию функции воспроизводства. В частности, список белков, специфичных для сперматозоидов, объединяет более 6 тыс. структур, 30% которых экспрессируется в яичках (Ашага1 А. е1 а1., 2014). Эти белки относятся к различным клеточным процессам, включая основные метаболические пути, апоптоз, клеточный цикл, мейоз и трансмембранный перенос.

Не меньшее внимание уделяется другим аспектам физиологии и патологии эякулята, связанным с углеводным, липидным, энергетическим обменом в семенной плазме и сперматозоидах (Коуас е1 а1., 2013). Однако простое механическое изучение молекулярного пейзажа эякулята без учета особенностей взаимодействия множества химических веществ в норме и патологии, представляющее собой серьезную и еще далеко не решенную задачу, вряд ли способно приблизить нас к пониманию истинных предпосылок развития бесплодия неясного генеза.

Опираясь на эти соображения, мы исследовали в семенной плазме и сперматозоидах здоровых и инфертильных мужчин более 100 индивидуальных соединений — метаболитов, ферментов, гормонов, цитокинов, хемокинов, адипокинов, ростовых факторов, нуклеотидов, макроэргов, катионов, вторичных мессенджеров, ксенобиотиков и др. с определением их содержания и анализом характера и направления взаимосвязей между ними.

Основными особенностями метаболического профиля микроокружения сперматозоидов явились снижение концентрации общего белка на фоне увеличения уровня мочевины и креатинина как отражение катаболической перестройки реактома, энергодефицит, проявляющийся в убыли глюкозы, пирувата, цитрата, АТФ и гипервосстановленном состоянии никотинамидных нуклеотидов, избыток гомоцистеина, лактата и свободного холестерина, изменения активности большинства ферментов и медиаторных систем передачи внутри- и межклеточной информации, дисбаланс адипокинов и цитокинов, недостаточность молекулярных факторов фертильности — гликоделина, ингибина, мелатонина, грелина и др.

Абсолютное большинство перечисленных признаков проявлялось у пациентов с документированными нарушениями эякулята, т.е. при патоспермии. Однако наиболее полезным с диагностической и прогностической точек зрения было обнаружение метаболических отклонений у бесплодных мужчин без явной патоло-

гии спермограммы, т.е. в наиболее сложных случаях. Одной из таких переменных величин является биоэнергетический статус спермы как чувствительный предиктор ее качества. Прежде всего, речь идет о субстратах и ферментах энергетического обмена, а также о регуляции их содержания и активности.

Интегральным показателем метаболического и энергетического состояния клеток и тканей считается соотношение [НАД+]/[НАДН]. У фертильных мужчин это отношение поддерживается на очень высоком уровне, что указывает на существование в норме аэробного фенотипа эякулята (табл. 3). При бесплодии обнаружено резкое падение значения этого параметра, т.е. переход системы пиридин-нуклеотидов как интерфейса метаболических процессов в гипервосстановленное состояние, соответствующее анаэробной инверсии окислительных превращений и дезадаптации обмена веществ (Ока 8. е1 а!., 2012). Это может повлечь за собой множество негативных последствий, поскольку степень восстановленности нико-тинамидных нуклеотидов является важнейшим физиологическим инструментом поддержания гомеостаза и индикатором интенсивности обмена веществ, а также регулятором передачи внутриклеточных сигналов в ответ на стресс (СИг^епвеп С. е1 а1., 2014).

Таблица 3

Содержание некоторых метаболитов в спермоплазме обследованных мужчин (М±т)

Фертильные Бесплодные мужчины

Показатель доноры

(п=41) Нормоспермия Патосиермия

(л=70) (и=/09)

общий белок, г/л 41.5±3,4 37,3±2,7 30,1±2,5**

альбумин, г/л 2,10±0,15 2,16±0,14 2,58±0,19

мочевина, мМ/л 24.2±2,3 23,5±2,2 34,0±3,1*'**

креатинин, мкМ/л 748±65 762±58 995±76*'**

гомоцистеин, мкМ/л 4,34±0,19 4,21±0,13 4,13±0,12

глюкоза, мМ/л 0,56±0,07 0,46±0,05 0,27±0,03*'**

фруктоза, мМ/л 12,4±1,7 11,7±1,5 12,0±1,6

лактат, мМ/л 4,51±0,32 6,38±0,43* 9,04±0,67*'**

пируват. мМ/л 2,14±0,11 2,02±0,12 1,26±0,09*'**

пируват/лактат 0,45±0,09 0,33±0,07 0,16±0,05*'**

[НАД+]/[НАДН] 4274±33 2852±21* 1394±15*'**

цитрат, мМ/л 52,0±4,4 48,1±4,2 41,5±3,3*

холестерин, г/л 0,48±0,05 0,75±0,08* 0,84±0,08*

кальций, мМ/л 5,15±0,42 4,36±0,29 2,28±0,18*'**

фибронектин, мг/л 434±41 328±39* 573±45*'**

мелатонин, нг/л 3,94±0,18 2,01±0,15* 2,23±0,13*

Осцилляции [НАД+]/[НАДН] сопряжены с контролем количества и качества митохондрий, активности ионных каналов, экспрессии ферментов репарации ДНК и ацетилирования. белков, которые связаны с окислительным стрессом и жизненным циклом клеток (КЛАэП Р. е1 а1., 2013). НАД+ используется как субстрат по-ли(АДФ-рибоза)-полимеразами и сиртуинами, чьи мишени и конечные продукты регулируют рост и продолжительность существования клеток (Магси Я. е! а1., 2014). Таким образом, содержание пиридиннуклеотидов отражается на выживаемости и гибели сперматозоидов через несколько тесно связанных механизмов.

Одна из таких возможностей реализуется через ЛДГ, посредством которой поддерживается стабильный поток глюкозы в гликолизе и стационарные уровни лактата и пирувата. Дисбаланс в этой системе имел место при обоих вариантах инфертильности и был обусловлен приростом лактата. ЛДГ принадлежит первостепенная роль в реакциях окисления глюкозы и биосинтеза АТФ в сперматозоидах. Уменьшение активности этого фермента (табл. 4) свидетельствует об ограничении использования лактата на энергетические цели. Подавление ЛДГ сопровождается блокадой гликолиза из-за сбоя механизма отрицательной обратной связи и ингибирования регенерации НАД+, кофактора глицеральдегидфосфатдегид-рогеназы, центрального энзима гликолитической оксидоредукции. Спермспеци-фическая ЛДГ(С) ассоциирована с белками, большинство из которых участвует в обмене АТФ, т.е. этот фермент представляет собой часть комплекса, контролирующего гомеостаз макроэргов (Ос1е1 Б. й а!., 2011).

Таблица 4

Содержание некоторых ферментов и нуклеотидов в спермоплазме обследованных мужчин (М±ш)

Показатель Фертильные доноры Бесплодные мужчины

(п=45) Нормоспермия Патоспермия

(п=61) (п=92)

ЛДГ, нМ/мин/мг белка 212+19,4 181+13,4 126+11,3*'**

МДГ, нМ/мин/мг белка 10,5+1,2 10,4+1,0 4,9+0,6*'**

Г6ФДГ, пМ/мин/мг белка 43,6±3,7 38,1±3,4 27,1±3,2*

КФК, нМ/мин/мг белка 304±42,7 811±47,5* 938+61,1*

ACT, иМ/мин/мг белка 125±9,7 137±9,9 159+11,8*

AJ1T, hM/miiii/мг белка 33,7+2,7 41,8±2,8* 52,2+6,1*

а-амилаза, нМ/мнн/мг белка 6,2+0,5 9,4+0,7* 13,6+0,9*'**

ЩФ, нМ/мин/мг белка 230±12,5 245±13,8 314+21,7*'**

а-глюкозидаза, Ед/л 332+26,4 206±19,2* 219±26,4*

АТФ, нМ/мл 52,3±7,1 54,1±6,0 35,0±4,2*'**

цАМФ, пМ/мл 27,9±2,4 24,6±2,2 14,6+1,8*'**

В норме пнруват в сочетании с глюкозой ускоряет гликолиз и стимулирует синтез АТФ автономно от митохондриального дыхания, способствуя капацитации сперматозоидов человека (Hereng Т. et al., 2014). Окисление пирувата в митохондриях активируется манатом, однако нами установлено угнетение МДГ и снижение пирувата при бесплодии, что ограничивает осуществление этого сценария.

Вместе с тем, однозначная интерпретация смещения равновесия в паре лак-тат — пируват, обнаруженного в нашей работе, не вполне правомерна. В настоящее время происходит ревизия классических воззрений, в соответствии с которыми лактат рассматривался как метаболический тупик (Gladden L., 2008).

Лактат инициирует дыхание в сперматозоидах и поддерживает их прогрессивную подвижность путем переноса в митохондрии, где он интенсивно окисляется (Hashimoto Т., Brooks G., 2008). Поэтому неудивительно, что молочная кислота является предпочтительным субстратом для митохондрий сперматозоидов даже в присутствии пирувата, глюкозы и фруктозы (Miki К., 2007). Повышение содержания молочной кислоты в спермальной плазме при идиопатическом бесплодии является результирующей влияния множества системных и локальных факторов, и может отражать либо его отток из яичек, где он вовлекается в усиление окислительного фосфорилирования, либо участвует в контроле количества сперматозоидов путем апоптоза или их качества посредством АФК. Очевидно, на определенном этапе развития патологического процесса накопление лактата утрачивает адаптационный потенциал и приобретает повреждающий характер.

Другая эссенциальная энергетическая молекула для сперматозоидов — цитрат. Уровень этого стартового метаболита цикла Кребса у бесплодных мужчин снижался, несмотря на общность путей его окисления с лактатом. Лимонная кислота необходима для целого ряда биохимических превращений в гаметах как поставщик углерода и НАДФН для биосинтеза жирных кислот, стеролов и ацетили-рования гистонов (Ferramosca A., Zara V., 2014). Кроме того, цитрат совместно с глюкозой стимулирует капацитацию за счет повышения секреции инсулина в сперматозоидах. Из представленных сведений следует, что недостаток цитрата, равно как глюкозы и пировиноградной кислоты, может иметь серьезные последствия для жизнеспособности мужских половых клеток.

Естественным итогом этих событий становится дефицит АТФ, который приводит к активации некроза и торможению апоптоза, подобно действию аномальных концентраций свободных радикалов или лактата, наиболее вероятных кандидатов на роль переключателей между этими состояниями (Erkkila К., 2006). Поэтому убыль высокоэнергетических фосфатов может вызвать срыв естественных механизмов элиминации дефектных сперматозоидов при идиопатическом

бесплодии. Очевидно, в мужском репродуктивном тракте АТФ выполняет защитную функцию, определяя интенсивность апоптоза герминативных клеток. В прикладном смысле это значит, что нормализация метаболизма адениннуклеотидов или введение экзогенного АТФ могут улучшить оплодотворяющую способность. Действенность такого подхода была продемонстрирована в модельных экспериментах, целью которых было совершенствование методов экстракорпорального оплодотворения (Rodriguez-Miranda Е. et al., 2008).

Метаболизм АТФ интимно сопряжен с превращениями цАМФ, непосредственно причастным к большинству физиологических процессов, детерминирующих фертильность эякулята (Wertheimer Е. et al., 2013). Развивающийся при бесплодии неясной этиологии дефицит цАМФ в семенной жидкости может внести существенный вклад в нарушение детородной функции, тем более что этому посреднику принадлежат неизвестные ранее ауто- и паракринные функции во внеклеточном пространстве (Osycka-Salut С. et al., 2014).

При рассмотрении значения отдельных молекул в возникновении бесплодия стоит упомянуть о таком распространенном мессенджере как ионы кальция. Уменьшение его уровня в семенной плазме практически полностью совпадало с динамикой изменений цАМФ, а по амплитуде колебаний и темпам возникновения даже опережало их. Ионы кальция и циклический АМФ выступают как синерги-сты, запускающие каскад реакций фосфорилирования флагеллярных белков в процессе созревания и приобретения сперматозоидами способности к активным движениям, и, наряду с АТФ, прямо или косвенно вовлечены в управление апоптозом в эпидидимальных и эякулированных гаметах (Mendoza F. et al., 2012).

Следует учитывать также участие в фертилизации гликоделина, мелатони-на, фибронектина, ингибина, активина, гомоцистеина и других низкомолекулярных регуляторов, которые могут отчасти дублировать друг друга, но чаще имеют неодинаковые механизмы действия, например, активируют разные изоформы аденилатциклазы или модифицируют химический состав мембран сперматозоидов и др. (Muratori М. et al., 2009).

Так, рецепторы мелатонина обнаружены в яичках у многих млекопитающих, в том числе у человека (Rossi S. et al., 2012), где этот гормон принимает участие в андрогенопоэзе и сперматогенезе, причем его концентрации сильно зависят от репродуктивной активности индивидов, что предполагает актуальность изучения этого ранее слабо охарактеризованного механизма расстройства функции воспроизводства. По нашим данным, содержание мелатонина в спермоплазме статистически значимо уменьшалось у всех пациентов почти в 2 раза, что оказывает мощный проапоптозный и прооксидантный эффекты.

Следующий маркер плодовитости, гликоделин S (спермальный), поддерживает гаметы в иекапацитированиом состоянии до проникновения в канал шейки матки, где он обычно удаляется. Гликоделин S реализует свои эффекты благодаря контролю агрегатного состояния мембран сперматозоидов, подавляя выход холестерина (Seppala М. et al., 2009). Удаление холестерина приводит к росту отношения фосфолипиды/холестерин, увеличению подвижности интегральных белков, модификации микрорельефа сперматозоидов и повышению текучести и проницаемости мембран, запуская капацитацию.

Акцептором стеринов является альбумин, который присутствует в высокой концентрации в матке и фолликулярной жидкости, но находится на низком уровне в сперме. Оптимальным для оплодотворения считается содержание глико-делина в спермоплазме в пределах 50-150 мкг/мл, что выше величин, найденных нами у больных с патологией эякулята. Снижение его концентрации ассоциировано с достоверным приростом холестерина и выраженным трендом к увеличению альбумина. Следовательно, можно констатировать ослабление гликоделино-вого надзора в цепочке «альбумин — холестерин — вязкость мембран — капацита-ция», что является одним из атрибутов перезрелых или «старых» сперматозоидов. Холестерин как целевой молекулярный объект капацитации может быть самостоятельным диагностическим тестом, поскольку является превалирующей липидной фракцией спермоплазмы, а его девиации обнаружены нами при обоих вариантах идиопатического бесплодия.

Фибронектину принадлежит важная роль не только в разжижении семени, но и в стимуляции акросомальной реакции, регуляции выживаемости сперматозоидов в женских половых путях и межгаметных взаимодействий (Zhang X. et al., 2013). Его функциональное состояние зависит от размера и химической природы углеводного фрагмента (Ferens-Sieczkowska М. et al., 2013), поэтому противоположный вектор сдвигов фибронектина при нормо- и патоспермии объясняется различной степенью его гликозилирования и затруднениями белок-белковых и белок-углеводных контактов в условиях нарушенного обмена веществ.

Ингибин-активиновый профиль сыворотки крови и семенной жидкости также претерпевал изменения. Ингибин В избирательно блокирует освобождение ФСГ и является информативным маркером гаметогенеза, т.к. синтезируется гонадами. В то же время его уровень, в отличие от ФСГ, прямо не зависит от секреции эстрадиола и других стероидов, и не имеет циклических флуктуаций. Мы обнаружили статистически значимое уменьшение ингибина только в спермоплазме (табл. 5), поэтому полагаем, что при бесплодии неустановленного генеза предпочтительно его определение именно в этой среде, но не крови.

Содержание молекулярных маркеров фертильности в биологических жидкостях обследованных мужчин (М±ш)

Показатель Фертильные доноры Бесплодные мужчины

(п=60) («=S2)

ингибин В 211±23,9 188,5+12,1

(сыворотка крови), иг/мл

ингибин В 641±73,9 115±10,6*

(спермоплазма), иг/мл

активин А 152±11,5 217±9,9*

(сыворотка крови), пг/мл

активин А 693±30,7 864±48,2*

(спермоплазма), пг/мл

ингибин/активин 1,34±0,09 0,81±0,06*

(сыворотка крови)

ингибин/активин 0,87±0,08 0,14±0,02*

(спермоплазма)

гликоделин 9,7±0,43 8,8±0,24

(сыворотка крови), нг/мл

гликоделин 103±7,4 41,4±5,3*

(спермоплазма), мкг/мл

акрозин, мкМЕ/106 сперматозоидов 125+11,7 161+14,1

Увеличение содержания другого представителя суперсемейства лигандов трансформирующего фактора роста ß (TGF-ß) — активина А — было зафиксировано и в сыворотке крови, и в семенной жидкости. Этот антагонист ингибина обладает более широким диапазоном биологического действия (Bernard D., Tran S., 2013) и, возможно, большей диагностической ценностью, особенно при углубленном анализе эякулята в спорных ситуациях. Важное значение в патогенезе бесплодия имеет баланс этих белков, который выступает необходимым условием координации гомеостатических сигналов и носит универсальный характер, независимо от типа клетки (Aleman-Muench G., Soldevila G., 2012). Нами продемонстрировано уменьшение величины коэффициента ингибин/активин в сыворотке крови и семенной плазме, т.е. изменение динамического равновесия в их продукции, что может внести весомую лепту в прогрессирование функциональных нарушений в яичках с последующей блокадой сперматогенеза и синтеза андрогенов.

Активин имеет широкий набор компетенций, включая контроль воспаления, фиброза и иммунитета. В клетках Сертоли активин связан с сигнальными путями, которые сопряжены со стрессовыми реакциями, пересекающимися с гормональными путями, опосредованными ФСГ. Иммунорегуляторные свойства активина также предполагают, что он может быть вовлечен в поддержание привилегиро-

ванного иммунного статуса тестикул. Следовательно, высокий уровень активина, выходящий за физиологические рамки, способствует аутоиммунному повреждению яичек и пролиферации в них соединительной ткани.

Особняком стоят данные о сохранности акрозиновой активности сперматозоидов. Интактность этого звена акросомального матрикса может указывать на актуализацию компенсаторных механизмов, препятствующих утрате фертилиза-ционого потенциала. В литературе имеется тенденция к переоценке места акрози-на в общей схеме оплодотворения, где ему сегодня отводится факультативная роль в гидролизе связей между клетками лучистого венца яйцеклетки. Новые факты говорят о том, что биогенез акросомы и содержание акрозина у человека четко коррелируют с отдельными стадиями сперматогенеза, т.е. акрозин выступает преимущественно чувствительным и высокоспецифичным индикатором степени дифференциации клеток семяродного эпителия и может быть использован для прогноза результативности процедуры ЭКО (Мшласаа В. е1 а1., 2013).

Группу независимых маркеров репродуктивной функции формируют ин-терлейкины, хемокины и ростовые факторы. Большинство известных цитокинов экспрессируется в зрелом яичке в отсутствие воспаления или иммунных событий, т.е. функции цитокинов не ограничены регулированием иммунитета.

Таблица 6

Содержание некоторых цитокинов в сыворотке обследованных мужчин (пг/мл, М±ш)

Показатель

Группа

Контроль (п=20) Бесплодие (п=54)

1Ь1р

1Ь-2

1Ь-4

1Ь-5

1Ь-6

1Ь-7

16,7±2,3

1,6±0,3

1,4±0,1

1,6±0,2

4,7±0,8

3,0±0,4

2,2±0,3

4,2±0,5

12,4±1,0

13,2±1,4

7.5±1.4

18,6±2,7 1,5±0,3 1,6±0,2 1,7±0,2 4,3±0,7 3,3±0,5 2,1±0,2 4,6±0,6 14,8±1,9 14,3±1,2 8,2±1,3 84,1±6,4 17,8±1,9 2847±176 1364±201

1Ь-8

1Ь-10 1Ы1 1ЫЗ И-17 И-18 ЮТи БОИ-1а

тси-р

16,1±1,7

2652±134

1228±195

88,3±9,6

Содержание некоторых цитокинов в спермоплазме

обследованных мужчин (пг/мл, М±ш)

Показатель Группа

Контроль (n =20) Бесплодие (n-54)

IL-ip 3,3±0,5 4,7±0,6

IL-2 4,8±0,6 5,2±0,5

IL-4 12,2±0,9 4,1±0,3*

IL-5 49,4±7,1 57,3±9,0

IL-6 8,9±1,0 10,5±1,4

IL-7 1929±185 1490±152*

IL-8 1312±168 1625±297

IL-10 3,5±0,4 3,9±0,5

IL-11 66,3±7,6 72,8±8,8

IL-13 5,2±0,5 4,7±0,5

IL-17 7,1±0,9 8,6±1,1

IL-18 52.6±4.1 47,1±3.0

TNFa 1,6±0,2 1,8±0,2

SDF-la 5787±240 2715±182*

TGF-P 80358±6374 57206±3319*

Противоспалительные цитокины (IL-4, IL-10 и пептиды семейства TGFP), наряду с их антагонистами IL-1, IL-6 и TNFa, причастны к процессам дифферен-цировки половых клеток, а также биосинтеза андрогенов. Поэтому экспрессия цитокинов при патологических состояниях сопровождается изменениями скорости стероидо- и сперматогенеза. Кроме того, в сперме найдены высокие концентрации хемокинов, например, фактора стромальных клеток SDF-la, одного из ключевых инициаторов сперматогенеза и взаимодействия гамет (Wang J., Knaut H., 2014).

У фертильных мужчин обнаружен выраженный градиент цитокинов между кровью и семенной плазмой (табл. 6 и 7). Преобладание хемокинов, факторов роста и ТЬ2-цитокинов (IL-4, 5, 7, 8, SDF-la и TGF-P), очевидно, необходимо для создания привилегированного иммунного положения сперматогенного эпителия. При идиопатическом бесплодии в спермоплазме развивается недостаточность и дисбаланс хемокинов и факторов роста (IL-7, SDF-la и TGF-P), регуляторов иммунных и пролиферативных процессов в гаметах, а также молекулярных и клеточных изменений в эндометрии при имплантации. Обеднению спермоплазмы по SDF-la принадлежит важная роль в развитии инфертильности, поскольку высокое содержание этого хемокина является условием колонизации и выживания при-мордиальных зародышевых клеток, предшественников сперматозоидов (Farini D. et al., 2005).

TGF-p, наряду с гликоделином, был идентифицирован как главный имму-нодепрессивный фактор эякулята человека (Ochsenkuhn R. et al., 2006), определяющий толерантность к спермальным антигенам. В женских половых путях он оказывает провоспалительное действие, способствуя секреции GM-CSF и IL-6, что позволяет рассматривать его как потенциальный фактор защиты от инфекций (Sharkey D, et al., 2012). Устранение этих эффектов при низком содержании TGF-P означает ослабление иммунного контроля на разных этапах оплодотворения.

Полученные результаты свидетельствуют о диагностической ценности определения цитокинов в семенной плазме. Учитывая собственные и литературные данные, можно предположить, что изучение репертуара цитокинов спермы способно выявить минимальные нарушения оплодотворяющей способности, не обнаруживаемые другими известными методами.

Одним из основных регуляторов репродуктивной функции является пищевой статус (Comninos A. et al., 2014). Недостаточное питание, так же как переедание или ожирение, могут привести к бесплодию. В группу коннекторов репродукции и пищевого статуса входят лептин, адипонектин, грелин и другие биологически активные субстанции. Анализ результатов исследования (табл. 8 и 9) выявил недостаток адипонектина и избыток лептина в сыворотке крови и эякуляте на фоне нарушения их соотношения, которое является индикатором снижения чувствительности тканей к инсулину, важному регулятору обмена веществ и энергии в сперматозоидах. Этому гормону принадлежит особая роль в капацитации, он выступает и как паракринный регулятор окисления глюкозы в сперматозоидах, обеспечивая их энергетические потребности (Aquila S. et al., 2005). Дисбаланс адипонектина и лептина с последующим развитием инсулинрезистентности, наряду со сдвигами цитокинового профиля и обмена глутатиона, может быть основой формирования гормонально-метаболических предпосылок репродуктивной патологии.

Таблица 8

Содержание адипокинов и грелина в сыворотке крови _обследованных мужчин (М±т)_

Показатель Фертильные доноры (л=26) Бесплодные мужчины

Нормоспермия (п=30) Патоспермия Сп=46)

адипонектин, мкг/мл лептин, нг/мл адипонектин / лептин, 103 грелин, пМ/л 5,62 ± 0,34 3,43 ± 0,32 1,76 ±0,18 416,3 ±27,5 5,23 ±0,36 3,67 ±0,28 1,58 ±0,14 392,3 ± 33,0 4,54 ± 0,24* 4,45 ±0,41 1,17± 0,13*'** 439,5 ± 22,7

Содержание адипокинов и грелина в спермоплазме обследованных мужчин (М±т)

Показатель Фертильные доноры 0ч=26) Бесплодные мужчины

Нормоспермия (п=30) Патоспермия (п=46)

адипонектнн, мкг/мл лептин, нг/мл адипонектнн / лептин, 103 грелин. пМ/л 3,13±0,16 1,24 ±0,15 2,79 ±0,21 127,1 ± 11,2 3,26 ± 0,25 3,18 ±0,21* 1,15 ± 0,12* 123,5 ± 12,9 2,68 ±0,14*'** 3,52 ± 0,26* 0,80 ±0,11*** 88,6 ± 10,1*

Концентрация грелина в семенной плазме у мужчин с патозооспермией статистически значимо снижалась, в сыворотке крови отмечена тенденция к повышению его уровня.

Грелин является самым известным членом большого семейства альтернативных пептидов, вовлеченных в регуляцию энергетического баланса, секреции гормонов, воспаления, питания и др. (ОаЬеСе М. е1 а1., 2013). Дисфункция отдельных компонентов системы грелина может влиять на развитие или прогрессию сердечно-сосудистых, воспалительных, нейродегенеративных заболеваний, эндокринно-зависимых опухолей и иной патологии, не исключая нарушения фертильности. Анализ содержания и соотношения различных элементов этой системы в перспективе может использоваться в диагностических и прогностических целях, а также как основа для разработки т.н. прицельной или мишень-направленной терапии мужского бесплодия.

В настоящей работе выполнен также детальный анализ состояния процессов перекисного окисления липидов и оксидативного повреждения белков и нуклеиновых кислот в эякуляте при идиопатической инфертильности (табл. 10).

Таблица 10

Показатели свободнорадикального гомеостаза

Показатель Фертильные доноры (п =58) Бесплодные мужчины (п=80)

ТБК-РП, нМ/мг белка ЬРх, нМ/л ОАА, нМ/мл СОД, Е/мг белка каталаза, мЕ/мг белка 0,31±0,04 16,3±1,7 2,68±0,23 349±20,1 5.19±0,56 0,55±0,07* 29,8±1,9* 1,28±0,11* 215±14,2* 2,03±0,15*

Совокупность полученных данных позволяет утверждать, что при этой патологии развивается практически неуправляемый процесс тотальной активации свободнорадикальных явлений с гиперпродукцией первичных и вторичных продуктов окисления липидов — гидропероксидов, акролеина, 4-гидроксиноненаля, ТБК-реагирующих продуктов, и др. Эти соединения весьма агрессивны и реагируют с аминогруппами белков и нуклеиновых кислот, образуя межмолекулярные сшивки, что сопровождается нарушением структуры макромолекул и дезорганизацией их функционирования.

Выявлено также угнетение ферментативного и неферментативного звеньев антиоксидантной защиты: СОД, каталазы, общей антиокислительной активности. Учитывая важность СОД в оборонной стратегии, неудивительно, что яички содержат не только стандартные цитоплазматические Си!7ж и митохондриальные Ре/Мп формы фермента, но и оснащены необычной внеклеточной разновидностью (БОБ-Ех) (Мгик Б. ^ а!., 2002), причем в относительно высокой концентрации по сравнению с другими органами. Экспрессия и форсированный синтез БОБ-Ех в клетках Сертоли, стимулируемый 1Ь-1р, является неотъемлемой частью реакции на всплеск свободнорадикальной активности. Элементом этой реакции можно считать тенденцию к повышению 1Ь-1р в спермоплазме практически в полтора раза, что, судя по низкому содержанию общей СОД, не дает значимого эффекта.

Продукт СОД-реакции перекись водорода легко проникает в спермии, увеличивая вероятность окислительной деструкции биополимеров и мембранных структур. Ликвидация Н2О2 осуществляется специфическими акцепторами катала-зой либо ГПО, которые составляют вторую линии антиоксидантной защиты. Эффективное разложение перекисей возможно только в случае синхронного изменения активности всех трех энзимов, однако степень ингибирования каталазы и ГПО (табл. 11) была намного больше, что создает предпосылки для накопления Н2О2 выше порогового уровня.

ГПО разрушает, помимо перекиси водорода, и другие органические перекиси даже при незначительном увеличении их концентрации, поддерживая клеточный гомеостаз. ГПО также способна метаболизировать макромолекулы, поврежденные свободными радикалами. Вследствие этого ГПО формирует и первый ответ при окислительном стрессе, и выполняет функцию скэвенджера при утечке АФЬС и развитии цепных неуправляемых процессов. Недостаточность ГПО, наряду с другими особенностями состояния системы глутатиона, вносит заметный вклад в ослабление клеточной резистентности к экстремальным воздействиям.

Некоторые показатели системы глутатиона в эякуляте обследованных мужчин (М±т)

Показатель Фертильные доноры (п=19) Бесплодные мужчины

Нормо-спермия (п=21) Пато-спермия 0п=37)

GSH. мкМ/л 7,8 ±0.6 7,0 ± 0,5 6,8 ± 0,5

GSSG, нМ/л 83,5 ± 7,2 103 ± 8,4 109 ±9,7*

[GSH]/[GSSG] 90,1 ±9,6 65,2 ± 4,0* 60,7 ± 3,4*

ГР, нКат/мг белка 22,3 ± 1,7 20.5 ± 1,6 16,4 ± 1,6*

у-ГГТ, нМ/мин/мг белка 288 ±30,1 312 + 38,3 462 ± 49,8*

ГПО, Е/мг белка 322 ± 23,7 140 ±9,5* 131 ±9,3*

ГСТ, нМ/мин/мг белка 18,4 ± 1,3 5,6 ± 0,4* 6,9 ± 0,8*

Еще один фермент, активность которого статистически значимо убывала при обеих формах идиопатического бесплодия, ГСТ, представляет собой семейство белков, катализирующих конъюгацию глутатиона с разнообразными субстратами в процессе их подготовки к экскреции из клетки (Tang М. et al., 2012). Эта активность имеет решающее значение в детоксикации гидроперекисей липи-дов, а также метаболизме ксенобиотиков в тканях, в том числе в яичках.

Дуэт восстановленный/окисленный глутатион (GSH-GSSG), наряду с пири-диннуклеотидами, рассматривается как основной регулятор окислительно-восстановительного баланса, выполняющий функцию редокс-буфера (Appenzeller-Herzog С., 2011). В физиологических условиях баланс GSH/GSSG сильно сдвинут в сторону восстановленной формы, что обеспечивает сохранность сульфгидрильных групп и определяет чувствительность клетки к окислительному стрессу. Исходя из этого, уменьшение отношения [GSH]/[GSSG] можно интерпретировать как свидетельство нарушения функционирования редокс-цикла тио-лов в репродуктивной системе при идиопатическом бесплодии.

Нарушение деятельности тиолзависимых ансамблей — центральная особенность окислительного стресса, спутника аномалий сперматогенеза. Система глутатиона как молекулярный сенсор гомеостаза является исполнительным звеном сигнальной системы Keapl/Nrf2/ARE, назначение которой — поддержание постоянства внутренней среды при стрессовых, апоптоз-индуцирующих и канцерогенных стимулах (Medzhitov R., 2012). ARE (антиоксидант-респонсивный элемент) контролирует гены практически всех глутатионзависимых ферментов антиокси-дантной защиты и биотрансформации ксенобиотиков. В настоящее время харак-

тер модуляции доменов Кеар1/№£2/АМ1 при бесплодии у мужчин находится вне поля зрения исследователей и, несмотря на признание ведущей роли стресса в ге-незе репродуктивных потерь, терапия этой патологии не дает желаемого эффекта. Поиск путей фармакологической регуляции Кеар1/№£2/А11Е открывает новые перспективы профилактики и лечения бесплодия неясного происхождения.

Метаболизм глутатиона тесно сопряжен с гомоцистеином, содержание которого в спермоплазме мужчин с инфертильностью неизвестной природы несколько снижалось. Вместе с тем, в сперматозоидах его уровень значительно возрастал. Согласно Мепего У. е1 а1. (2014), гомоцистеин является эпицентром основных биохимических проблем, связанных с АФК-патологией. Переход гомоци-стеина в гаметы тормозит синтез глутатиона, вызывает нехватку цистеина, провоцирует выброс АФК и фрагментацию ДНК, препятствует нормальному течению реакций метилирования с утратой эпигенетического контроля экспрессии генов и активацией апоптоза, как это было показано для иных патологических состояний (БсЬаНпзке К., 8шага1 А., 2012). Поэтому утилизация гомоцистеина представляется одной из первостепенных задач рациональной терапии идиопатического бесплодия и профилактики расстройств импринтинга и спонтанных абортов.

Таблица 12

Некоторые показатели окислительной модификации ДНК

Показатель Фертильные Бесплодные

доноры мужчины

(.п=42) (п=82)

карбонилы, нМ/мг 25,2±3,1 45,3±3,4*

8-охосЮи, нг/мл 39,8±2,3 72,0±6,2*

а-глюкозидаза, Ед/л 332±26,4 206+21,7*

Мы наблюдали также манифестацию патогномоничного признака деструкции ДНК — образование аберрантных пуриновых оснований типа 8-гидрокси-2'-дезоксигуанозина (8-охосЮи), что является доказательством деконденсации хроматина сперматозоидов (табл. 12). На это указывает и угнетение индикатора фрагментации ДНК — а-глюкозидазы.

Вопреки классическим представлениям, в условиях окислительного стресса атаке АФК подвергаются в первую очередь не липиды или нуклеиновые кислоты, а белки плазматических мембран, которые карбонилируются с утратой биологической функции (Губский Ю.И. и др., 2005). Окисленные модифицированные белки продуцируют свободные радикалы, истощают пул антиоксидантов и инициируют процессы ПОЛ. Нами показано, что уровень карбонильных белковых

дериватов в сиермальной плазме бесплодных мужчин возрастал почти в 2 раза, т.е. фактически возникало состояние, которое в литературе обозначается термином «карбонильный стресс».

Низкомолекулярные альдегиды, образующиеся в процессе карбонильного стресса при аутоокислении глюкозы (глиоксаль, метилглиоксаль, 3-дезоксиглюкоза) более реакционно способны, чем альдегиды, образующиеся при свободнорадикальном окислении липидов при окислительном стрессе (малоновый диальдегид, 4-гидроксиноненаль) (Панкин В.З. и др., 2007). Липопротеиды и другие белки, модифицированные глиоксапем, агрегируют со значительно большей скоростью и эффективнее захватываются макрофагами, чем соединения, модифицированные малоновым диальдегидом, а частичное «сшивание» молекул белка под действием метилглиоксаля облегчает перекисное окисление ненасыщенных липидов наружного слоя клеточных мембран. Между тем, проблеме карбонильного стресса сперматозоидов не уделяется должного внимания, публикации по этой тематике отсутствуют, приоритет отдается исключительно окислительному стрессу, что, на наш взгляд, не вполне оправдано.

Для проверки гипотезы об экологической обусловленности репродуктивной патологии нами был определен уровень некоторых актуальных ксенобиотиков в биологических жидкостях мужчин и женщин, страдающих идиопатическим бесплодием (табл. 13).

Таблица 13

Содержание ПХДД/ПХДФ в сперме мужчин (пг/г липидов)

Конгенер Фертильные доноры (п=49) Бесплодные мужчины

Нормоспермия (п=бЗ) Патоспермия 0п=105)

ТХДД 19,1 31,9 58,5

ПНХДД 28,7 59,0 47,6

ГКХДЦ 18,3 16,8 22,1

ГПХДЦ+ОХДД 13,5 38,6 33,9

ТХДФ+ПнХДФ 98,4 294,5 279,4

ГкХДФ 22,'6 16,5 19,4

ГпХДФ+ОХДФ 11,9 9,3 21,2

ВСЕГО 212,5 466,6 482,1

Наиболее токсичным глобальным экотоксикантом является 2,3,7,8-тетрахлордибензо-п-диоксин (ТХДД), Величина летальной дозы для этого вещества составляет порядка Ю-6 г на 1 кг массы, что примерно в тысячу раз меньше аналогичной величины для боевых отравляющих веществ типа зомана и зарина.

ТХДД и его гомологи детектируются практически во всех биосредах человека и ассоциированы с патологией различных органов и систем.

Сперматогенный эпителий защищен от экзо- и эндогенных токсических влияний гематотестикулярным барьером, который относится к гистогематиче-ским барьерам изолирующего типа. Как следует из полученных данных, диокси-ны/фураны способны преодолевать эту преграду, о чем свидетельствует их обнаружение в эякуляте в концентрациях, сопоставимых с таковыми в сыворотке крови. Обращает на себя внимание то обстоятельство, что содержание диоксинов в сперме бесплодных мужчин оказалось выше, нежели у американских ветеранов войны во Вьетнаме, пострадавших от гербицида "Agent Orange" (Schecter А., 1996).

Учитывая высокую биологическую активность ПХДД/Ф и причастность системы диоксинового рецептора AhR, отвечающей за их биорецепцию, к обеспечению функции воспроизводства (Brokken L., Giwercman Y., 2014), правомерно предположение, что диоксины прямо или опосредованно, как «эндокринные разрушители», вовлекаются в цепочку событий в репродуктивных органах, следствием которых становится нарушение оплодотворяющей способности сперматозоидов.

Что касается фолликулярной жидкости, то уровень диоксинов в ней был минимальным; вероятно, эти поллютанты не играют существенной роли в генезе репродуктивных расстройств у женщин.

Среди стойких органических загрязнителей выделяются широким распространением и конверсией в родственные диоксины соединения класса ПХБ. При исследовании характера распределения ПХБ в органах экспериментальных животных выявлена избирательная кумуляция наиболее токсичных тетра-, пента- и гексахлорпроизводных в эпидидимисе и семенниках, но не в яичниках.

Закономерным следствием контаминации репродуктивных органов стало угнетение оплодотворяющей способности самцов крыс. Количественная оценка гонадотоксического действия ПХБ на основе определения индексов фертильно-сти, гестации и плодовитости позволила сделать заключение о высоком противозачаточном потенциале этих ксенобиотиков, поскольку в условиях эксперимента резко падало число беременностей в группе подопытных животных, в то время как способность к вынашиванию и рождению снижалась в меньшей степени.

Метаболические эквиваленты этих нарушений при интоксикации ПХБ и идиопатической инфертильности, несмотря на всю условность подобных параллелей, по структуре и вектору изменений были очень близки и заключались в ка-

таболической перестройке обмена веществ с элементами гипоэнергетического состояния как молекулярной основы репродуктивной патологии.

Анализ на ПХБ биологических жидкостей семейных пар, состоящих в бесплодном браке, дал неожиданные результаты. Концентрации этих поллютантов в эякуляте здоровых и бесплодных мужчин практически не отличались и были сопоставимы с уровнем (и спектром) отдельных конгенеров в фолликулярной жидкости женщин, хотя по общему содержанию и несколько превосходили его (36,4 пг/г липидов против 32,5 пг/г).

Аналогичная картина констатирована и для еще одних повсеместно распространенных продуктов цивилизации — антипиренов класса полибромированных дифениловых эфиров (ПБДЭ), которые не были идентифицированы нами ни в эякуляте, ни в фолликулярной жидкости обследованных пациентов. На наш взгляд, существует по меньшей мере три версии обнаруженного феномена, ни одна из которых не является исчерпывающей: недостаточная чувствительность использованного метода детекции; низкая проницаемость гистогематических барьеров для этого класса ксенобиотиков и невозможность их накопления в сперме или фолликулярной жидкости в сколь-нибудь определяемых концентрациях; минимальное потребление в данном регионе рыбы и морепродуктов как доминантных источников полибромированных ароматических соединений (Lyche J. et al., 2015).

Реальные концентрации ПБДЭ, найденные другими авторами в эякуляте китайских мужчин, проживающих в прибрежной зоне с высокой долей рыбы в рационе, были сравнительно невелики, и составили в среднем 31,3 пг/г, что примерно в 2 раза меньше, чем в сыворотке крови тех же индивидов (Liu P-Y. et al., 2012), и в тысячи раз меньше, чем уровень ПХБ у наших пациентов. Отсюда следует, во-первых, что опасность бромированных эфиров несколько преувеличена, во-вторых, вероятность их репротоксического действия ограничена географическими и алиментарными особенностями среды обитания.

Итак, согласно результатам наших исследований, в сперме бесплодных мужчин присутствуют загрязнители окружающей среды, из которых наибольшая роль принадлежит диоксинам и фуранам. Тем не менее, нельзя полностью игнорировать факты наличия, по нашим и литературным сведениям, даже минимальных концентраций ПХБ, ПБДЭ и других чужеродных соединений, поскольку для них характерен синергетический эффект, т.е. усиление токсичности при совместном попадании в организм, как это было показано на мультиполлютантной модели глобальной оценки взаимосвязи состояния окружающей среды и мужского репродуктивного здоровья (Lenters V. et al., 2014).

Кроме того, обнаружение в сперме различных ксенобиотиков свидетельствует о том, что этот биологический материал может быть использован как не-инвазивная матрица для оценки техногенной нагрузки организма человека и предупреждения развития соответствующей патологии.

Эти данные свидетельствуют также о неблагоприятном влиянии экополлю-тантов на репродуктивный статус, что может служить основанием для формирования более рациональной политики в области регулирования производства и оборота химических веществ на основе принципа предосторожности.

Стратегической целью мероприятий по преодолению бесплодия является сохранение или достижение эугонадного состояния, которое может быть реализовано путем устранения причин его возникновения, что практически неосуществимо, либо коррекцией основных синдромов через влияние на ключевые патологические звенья и молекулярные мишени, исходя из понимания механизмов повреждения и адаптации процесса фертилизации. Ведущая роль окислительного стресса в генезе расстройств детородной функции предопределяет необходимость восстановления баланса про- и антиоксидантных систем, и подразумевает избирательное воздействие на липидный, белковый и нуклеотидный домены субклеточных структур и макромолекул.

Мы оценили антиоксидантные характеристики коэнзима Q (убихинона), L-карнитина и биофлавоноидов прополиса, входящих в число наиболее эффективных, по литературным данным, средств нормализации окислительного статуса эякулята. Все три препарата практически не влияли на объем эякулята, в отношении других параметров спермограммы установлены определенные различия. Так, биофлавоноиды статистически значимо повышали концентрацию и долю прогрессивно подвижных сперматозоидов, а также уменьшали количество патологических форм. Убихинон был активен только в отношении кинетических свойств гамет, прием L-карнитина не сопровождался достоверными сдвигами стандартных показателей спермограммы. Тем не менее, все препараты при тестировании in vitro демонстрировали высокий антиокислительный потенциал, который имел до-зозависимый характер, вплоть до полного подавления липопероксидации.

После курса антиоксидантной терапии нормализовались почти все показатели свободнорадикального гомеостаза эякулята, за небольшим исключением для биофлавоноидов и убихинона. При этом универсальное защитное действие было присуще только L-карнитину, который существенно ограничивал повреждение макромолекул эякулята при окислительном стрессе. Это проявлялось в угнетении карбонилирования белков, переокисления липидов и дезинтеграции ДНК сперматозоидов. Тем не менее, эти факты, так же как подтверждение связи окислитель-

ных модификаций биополимеров спермы с нарушениями фертильности при экстремальных воздействиях, не дают существенных практических результатов, кроме симптоматических фармакологических подходов, которые не устраняют причину, а могут лишь смягчить, а в отдельных случаев у некоторых пациентов даже усугубить течение патологического процесса.

По нашим данным, антиоксидантная терапия у части пациентов сопровождалась развитием осложнений в виде патологии спермограммы, усиления дезинтеграции белков и липидов эякулята и накопления восстановительных эквивалентов в семенной плазме, что соответствует картине редуктивного стресса сперматозоидов, вплоть до настоящего времени подробно не охарактеризованного, но о возможности развития которого имеются упоминания в литературе (Chen S. et al., 2013). Проблема состоит в том, что любое отклонение от равновесия, т.е. нарушение окислительно-восстановительного статуса в ту или иную сторону, приводит к окислительным повреждениям. Не исключено, что именно с этим явлением связана невысокая эффективность антиоксидантной терапии (наступление беременности у супруги), которая по нашим и литературным данным составляет не более 23% (Busetto G. et al., 2012).

С этих позиций представляют интерес способы немедикаментозного воздействия на репродуктивный статус, апробированные нами в эксперименте на модели иммобилизационного стресса. Ограничение двигательной активности крыс сопровождалось нарушениями количественных и качественных характеристик эякулята, дисбалансом про- и антиоксидантных систем в семенной плазме и повышением содержания индикатора окислительного повреждения ДНК 8-oxodGu. Дозированная физическая нагрузка приводила к нормализации параметров спермограммы и свободнорадикального гомеостаза сперматозоидов. Наибольшим протективным эффектом обладала предварительная тренировка, которая способствовала более раннему восстановлению изученных показателей. Полученные результаты раскрывают молекулярные механизмы защитного действия регулярных упражнений при активации свободнорадикальных процессов в эякуляте, что может являться дополнением или альтернативой лекарственной терапии.

Резюмируя изложенные сведения, считаем возможным утверждать, что патогенетической основой инфертильности неизвестной этиологии является универсальный характер структурно-функциональных нарушений, заключающийся в вовлечении в патологический процесс различных регуляторных и гомеостатиче-ских механизмов, полиморфизме метаболических сдвигов, снижении окислительно-восстановительного потенциала тиол- и пиридинзависимых ферментативных систем семенной плазмы, активации свободнорадикального и карбонильного

окисления биополимеров эякулята, которые результируются в незавершенности сперматогенеза. Взаимосвязь и взаимообусловленность большинства выявленных изменений, мозаицизм и неодинаковая степень их экспрессии, противоположная направленность и приспособительное значение отдельных симптомов бесплодия дают основания для вывода о существовании предпосылок для их компенсации.

Результаты исследования морфофункционального состояния сперматозоидов и биохимического состава семенной плазмы и их ассоциаций на фоне антиок-сидантов позволили сформулировать концепцию адекватной контролируемой терапии окислительного стресса сперматозоидов. Она не противоречит общепринятой практике назначения антиоксидантов при репродуктивной патологии, а дополняет и уточняет принципы ее применения, мониторинга и профилактики осложнений, в первую очередь, возникновения редуктивного стресса. Она является также основой для пересмотра устаревших и формирования новых представлений о ведущих патохимических и патофизиологических механизмах развития идиопатического бесплодия, поскольку по-прежнему в трактовке причинно-следственных отношений в запутанной цепи событий, приводящих к утрате оплодотворяющей способности, преобладают неверные предположения и неэффективные решения. При этом не представляется возможным однозначно вычленить основное звено патогенеза инфертильности, поскольку окислительный стресс является, очевидно, лишь одним наиболее изученным из множества пусковых факторов и звеньев этого заболевания.

Комплекс изменений метаболической активности спермоплазмы и сперматозоидов во взаимосвязи со сдвигами химического состава и функционального состояния эякулята при бесплодии обобщен в виде схемы на рисунке.

Патологические явления в эякуляте, обусловленные нарушениями строения и реакционной способности большинства соединений, причастных к фертилиза-ции, происходят синхронно и склонны как к взаимному усилению, так и ослаблению. Повреждения биополимеров семенной жидкости и сперматозоидов, индуцированные стрессорами химической или иной природы, выступают причиной тотальных изменений гомеостаза с развитием бесплодия. Учитывая существование системы многоуровневного контроля и множественного дублирования молекулярных посредников акта оплодотворения, можно заключить, что его недостаточность имеет мультикаузальный характер, а центральное положение в его возникновении занимают сдвиги метаболического статуса и структурно-функциональной активности сперматозоидов и их окружения.

Адипонектин | Лсптин t Грелин I

Гликоделин I Акрозин /V ФибронектинЦ\

Cortex !

гипоталамус

I

►GnRH

IL-7. SDF-lct i TGF-ß

t IL-6-»GM-GSF

/ \

~ ТЫ Th2

Y

ЛАТФ I I цитрат

Связывание с 2опаРе11иас1а акросомная реакция слияние клеток

Спермоппазма

| увеличение концентрации | уменьшение концентрации концентрация не изменилась

0 активирование 0 ингибирование

Рисунок. Роль и место изменений метаболического статуса эякулята в патогенезе щшопатического бесплодия

выводы

1. Центральное место в патофизиологических и патохимических механизмах развития мужской инфертильности неизвестной этиологии занимают изменения метаболической активности семенной плазмы и сперматозоидов, сопряженные с нарушениями их морфофункционального состояния и способности к оплодотворению.

2. Отклонения метаболического статуса эякулята — дефицит белка и основных молекулярных факторов фертилизации, гипоэнергетическое состояние, гипервосстановленность глутатиона и пиридиновых нуклеотидов, увеличение концентрации активина, гомоцистеина и лактата, снижение активности ключевых ферментов промежуточного обмена, дисбаланс адипокинов и цитокинов различных классов — не во всех случаях были ассоциированы со степенью патоспермии, что свидетельствует о невысокой диагностической ценности традиционного анализа спермограммы при идиопатическом бесплодии.

3. Ведущую роль в снижении оплодотворяющей способности сперматозоидов играет недостаточность гликоделина, ингибина, хемокинов (БЭР-1а), ростовых факторов (ТвБ-Р, 1Ь-7), грелина, адипонектина, мелатонина, сопровождающаяся ослаблением иммуносупрессорных и антиоксидантных свойств спермоплазмы с последующей дизрегуляцией процессов гаметогене-за и андрогенопоэза.

4. Ключевым патогенетическим звеном дезинтеграции структурных компонентов мужской репродуктивной системы на разных уровнях ее организации и повреждения биополимеров эякулята, наряду с активацией процессов перекисного окисления, является карбонильный стресс, что нашло отражение в множественной карбонильной альтерации и утрате нативных свойств специфических пептидов и белков семенной плазмы и сперматозоидов.

5. Эффективными и перспективными средствами коррекции идио-патических нарушений сперматогенеза и преодоления бесплодия являются препараты на основе Ь-карнитина, убихинона и природных биофлавоноидов, монотерапия которыми в течение не менее 3 месяцев в суточных дозах 1000, 200 и 40 мг, соответственно, приводила у большинства пациентов к улучшению отдельных качественных и количественных показателей эякулята, восстановлению равновесия про- и антиоксидантных систем спермоплазмы, ограничению химической модификации макромолекул — пероксидации ли-

пидов, карбонилирования белков, окислительной деструкции ДНК сперматозоидов.

6. Недостаточная чувствительность значительной части больных к антиоксидантной терапии обусловлена трансформацией оксидативного стресса и индукцией, как побочного эффекта стандартных схем назначения препаратов, т.н. редуктивного стресса сперматозоидов, который характеризуется падением редокс-потенциала тиол- и пиридинзависимых систем, нарастанием явлений деградации и инактивации биологически активных соединений эякулята.

7. На модели иммобилизационного стресса выявлено протективное действие предварительной дозированной физической нагрузки на параметры спермограммы и свободнорадикального гомеостаза сперматозоидов, что позволяет рассматривать умеренные физические упражнения в качестве альтернативного способа немедикаментозного лечения и профилактики репродуктивной патологии.

8. В эксперименте на животных продемонстрирована кумуляция наиболее токсичных конгенеров широко распространенных экополлютантов класса полихлорированных бифенилов преимущественно в эпидидимисе и семенниках, но не в органах женской репродуктивной системы, что предопределяет высокий риск возникновения расстройств детородной функции у мужского пола.

9. Повышенный уровень полихлорированных дибензо-пара-диоксинов и фуранов в эякуляте бесплодных мужчин по сравнению с фер-тильными донорами указывает на существование непосредственной взаимосвязи загрязнения окружающей среды и нарушений функции воспроизводства. Доказательством техногенной природы контаминации спермы является обнаружение характерного профиля индивидуальных изомеров диокси-нов/фуранов, который соответствует особенностям современного промышленного производства.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Круговых Н.Ф., Абдуллина А.З., Галнмова Э.Ф., Галимов Ш.Н. Нарушение сперматогенеза полихлорбифенилами: эндокринные и паракринные механизмы повреждения // Авиакосмическая и экологическая медицина. 2004. Т. 38. №6. С. 51-56.

2. Абдуллина А.З., Галимова Э.Ф., Галимов Ш.Н. Контаминация спермы ПХДД/ПДДФ: результаты обследования жителей промышленных городов //

II Всероссийская конф. по проблемам диоксинов. Уфа: НИИ БЖД РБ, 2004. С. 257-258.

3. Галимов Ш.Н., Мухамедзянов P.M., Громенко Д.С., Галимова Э.Ф., Аглетдинов Э.Ф. Лечение мужского бесплодия: новый взгляд на старую проблему // Мужское здоровье и долголетие: 2-й Российский науч. форум. М., 2004. С. 33-34.

4. Галимов Ш.Н., Абдуллина А.З., Галимова Э.Ф. Проблемы мужского здоровья: вызовы XXI века // Здравоохранение Башкортостана. 2004. Спецвыпуск № 4. С. 69-72.

5. Галимов Ш.Н., Амирова З.К., Галимова Э.Ф. Кризис сперматозоида и техногенное загрязнение окружающей среды: факты и гипотезы // Проблемы репродукции. 2005. № 2. С. 19-22.

6. Галимов Ш.Н., Галимова Э.Ф. Вымирающий пол — иллюзия или реальность? // Управление здравоохранением. 2005. № 1-2. С. 35-41.

7. Галимов Ш.Н., Фархутдинов P.P., Викторова Т.В., Амирова З.К., Громенко Д.С., Галимова Э.Ф., Исхакова Г.М. Репродуктивное здоровье и окружающая среда: новые подходы и технологии // Мужское здоровье и долголетие: 3-й Российский науч. форум. М„ 2005. С. 47-48.

8. Галимов Ш.Н., Абдуллина А.З., Галимова Э.Ф. Особенности биохимического состава спермы при воздействии экополлютантов класса ПХБ // Мужское здоровье и долголетие: 4-й Российский научн. форум. М., 2006. С. 30.

9. Камилов Ф.Х., Галимов Ш.Н., Аглетдинов Э.Ф., Галимова Э.Ф., Хабиров Р.Э. Гормонально-метаболические нарушения репродуктивной функции в условиях отравления хлорорганическими соединениями // Медицинский вестник Башкортостана. 2007. Т. 2. № 3-4. С. 42-46.

10. Громенко Д.С., Галимов Ш.Н., Амирова З.К., Абдуллина А.З., Галимова Э.Ф. Гонадотоксическое действие полихлорбифенилов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2008. Т. 146. № 7. С. 76-79.

11. Галимов Ш.Н., Громенко Д.С., Абдуллина А.З., Галимова Э.Ф. Спермо-токсические свойства приоритетных загрязнителей окружающей среды класса полихлорбифенилов // Медицина труда и промышленная экология. 2008. № ю. С. 31-33.

12. Гайнуллина М.К., Сивочалова О.В., Бакиров А.Б., Фесенко М.А., Денисов Э.И., Павлов В.Н., Викторова Т.В., Галимова Э.Ф. Влияние неблагоприятных производственных факторов на репродуктивное здоровье работающих: пособие для врачей. М.: ГУ НИИ медицины труда РАМН, 2008. 81 с.

13. Абдуллина А.З., Галимова Э.Ф., Амирова З.К., Галимов Ш.Н. Накопление приоритетных загрязнителей окружающей среды класса полихлорбифе-нилов в жировой ткани и органах мужской репродуктивной системы // Мужское здоровье и долголетие: 6-й Российский науч. форум. М., 2008. С. 7.

14. Абдуллина А.З., Галимов Ш.Н., Галимова Э.Ф. Влияние поллютантов класса полихлорбифенилов на содержание АТФ, кальция и цАМФ в спермо-плазме // IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск, 2008. С. 418.

15. Галимов Ш.Н., Гизатуллин Т.Р., Фархутдинов P.P., Галимова Э.Ф., Си-вочалова О.В. Молекулярные маркеры фертильности эякулята у сотрудников спецподразделений МВД в условиях боевого стресса // Медицина труда и промышленная экология. 2009. № 10. С. 36-39.

16. Галимов Ш.Н., Бондарчук Е.А., Юлдашев B.JL, Галимова Э.Ф. Медико-социальные, организационные и культурно-образовательные аспекты охраны мужского здоровья как фактора национальной безопасности // Здоровье нации — основа процветания России: V Всеросс. форум. М., 2009. С. 208-209.

17. Галимова Э.Ф., Фархутдинов P.P., Галимов Ш.Н., Гизатуллин Т.Р. Влияние экстремальных факторов на мужскую репродуктивную систему // Проблемы репродукции. 2010. № 4. С.60-65.

18. Галимов Ш.Н., Галимова Э.Ф. Мужчина в зеркале эволюции, экологии, экономики и эмансипации // Экология и жизнь. 2010. № 5. С. 78-83.

19. Фархутдинов P.P., Галимов Ш.Н., Галимова Э.Ф. Свободнорадикапьное окисление в норме и патологии // Практикующий врач сегодня. 2010. № 2. С. 54-62.

20. Галимов Ш.Н., Галимова Э.Ф. Азбука мужского здоровья // Андрология и гепптальная хирургия. 2011. № 2. С. 126-127.

21. Галимов Ш.Н., Галимова Э.Ф. Молекулярные механизмы нарушения мужской репродуктивной функции при экстремальных и средовых воздействиях // Андролопя та сексуальна медицина. 2011. № 1-2. С. 48.

22. Галимова Э.Ф. Химические коктейли и мужское здоровье // Мужское здоровье и долголетие: 9 Российский науч. форум. М., 2011. С. 27-28.

23. Галимова Э.Ф. Химический стресс как фактор репродуктивного здоровья мужчин // Мужское здоровье: VII Всеросс. конгр. Ростов н/Д, 2011. С. 1819.

24. Галимов Ш.Н., Фархутдинов P.P., Галимова Э.Ф., Громенко Д.С., Моча-лов К.С., Баймурзина Ю.Л. Молекулярные механизмы антиокислительного

действия Ь-кариитииа при мужском бесплодии // Репродуктивные технологии сегодня и завтра: XXI Междунар. конф. СПб, 2011. С. 121-122.

25. Галнмова Э.Ф. Загрязнение окружающей среды и репродуктивное здоровье мужчин // Андрология и генитальная хирургия. 2011. № 2. С. 127.

26. Галимов Ш.Н., Громенко Д.С., Галнмова Э.Ф., Громенко Ю.Ю., Исхаков И.Р. Влияние Ь-карнитина на показатели эякулята у мужчин из бесплодных пар // Урология. 2012. № 1. С.47-51.

27. Галнмова Э.Ф. Метаболический профиль спермоплазмы крыс при воздействии загрязнителей окружающей среды класса полихлорбифенилов // Проблемы репродукции. 2012. № 5. С. 18-21.

28. Павлов В.Н., Галнмова Э.Ф., Мочалов К.С., Петрова И.В., Баймурзина Ю.Л., Галимов Ш.Н. Оценка влияния Ь-карнитина на репродуктивную функцию мужчин с идиопатической патоспермией // Медицинский вестник Башкортостана. 2012. Т.7. № 4. С. 36-40.

29. Галимов Ш.Н., Галнмова Э.Ф., Павлов В.Н. Цитокиновый спектр сыворотки крови и спермоплазмы при идиопатическом бесплодии // Пермский медицинский журнал. 2012. Т.29. № 6. С. 58-63.

30. Галимова Э.Ф., Абдуллина А.З., Мещерякова С.А., Галимова С.Ш., Катаев В.А. Метаболическая терапия мужского бесплодия // Мужское здоровье и долголетие: 10-й Российский науч. форум. М., 2012. С. 31.

31. Галимов Ш.Н., Павлов В.Н., Галимова Э.Ф. Ь-карнитин как средство метаболической терапии мужского бесплодия // Репродуктивные технологии сегодня и завтра: XXII Междунар. конф. Геленджик, 2012. С. 44-45.

32. Галимова Э.Ф. Коррекция окислительного стресса как основа метаболической терапии мужской инфертильности // Сб. тез. VII Междунар. Конгр. Профессиональной ассоциации андрологов России. Сочи, 2012. С. 16.

33. Галимова Э.Ф., Павлов В.Н., Абдуллина А.З., Галимов Ш.Н. Особенности ферментативного профиля и энергетического статуса спермальной плазмы при идиопатическом бесплодии // Проблемы репродукции. 2013. № 1. С. 66-69.

34. Галимова Э.Ф. Характеристика метаболизма глутатиона при идиопатическом бесплодии у мужчин // Проблемы репродукции. 2013. № 3. С. 51-53.

35. Галимова Э.Ф., Павлов В.Н., Галимов Ш.Н. Протективное действие дозированной физической нагрузки при окислительном стрессе сперматозоидов // Андрологня и генитальная хирургия. 2013. № 1. С. 40-43.

36. Галимова Э.Ф. Механизмы протективного действия коэнзима Q10 при мужском бесплодии // Дальневосточный медицинский журнал. 2013. № 3. С. 40-42.

37. Галимов Ш.Н., Абдуллина А.З., Кидрасова P.C., Галимова Э.Ф. Содержание диоксинов и состояние системы глутатиона в эякуляте при мужском бесплодии // Казанский медицинский журнал. 2013. Т.94. № 5. С.658-661.

38. Галимов Ш.Н., Павлов В.Н., Галимова Э.Ф. Влияние биофлавоноидов прополиса на антиоксидантный потенциал эякулята и окислительное повреждение ДНК сперматозоидов // Андрология и геиитальная хирургия. 2013. № 4. С. 65-68.

39. Павлов В.Н., Галимова Э.Ф., Катаев В.А., Фархутдинов Р.Р., Мочапов С.К., Баймурзина Ю.Л., Галимов Ш.Н. Сравнительный анализ антиоксидант-ных эффектов коэнзима Q и L-карнитина у мужчин с идиопатической пато-спермией // Медицинский вестник Башкортостана. 2013. Т. 8. № 6. С. 161163.

40. Галимова Э.Ф., Абдуллина А.З. Социально-экономические и экологические детерминанты здоровья мужского населения // Территория здоровья -Башкортостан. 2013. № 2. С. 11-13.

41. Galimova Е., Mochalov К., Baymurzina J., Galimov Sh. Evaluation of the effect of propolis bioflavonoids for antioxidant status of ejaculate. Europaische Fachhochschule. 2013. № 1. C. 136-137.

42. Галимова Э.Ф., Кидрасова P.C., Галимов Ш.Н. Антиоксидантный потенциал эякулята и окислительное повреждение ДНК сперматозоидов при бесплодии неясного генеза // Здоровье человека в XXI веке: V-я Российская научно-практ. конф. Казань: Отечество, 2013. С. 742-746.

43. Галимова Э.Ф. Оценка влияния убихинона на процессы свободноради-кального окисления в эякуляте // Мужское здоровье и долголетие: 11 -й Российский науч. форум. М., 2013. С. 19-20.

44. Галимов Ш.Н., Галимова Э.Ф. Убихинон ограничивает степень окислительного повреждения ДНК сперматозоидов при идиопатической патоспер-мии // Биохимия — основа наук о жизни: Междунар. симп., посвящ. 150-л. кафедры биохимии Казанского ун-та. Казань, 2013. С. 68-69.

45. Галимова Э.Ф. Содержание лептина и адипонектина в сыворотке крови и эякуляте при идиопатическом бесплодии // Проблемы репродукции. 2014. № 1. С.65-67.

46. Галимова Э.Ф., Ахмадуллина Г.Х., Травников О. Ю., Мочалов К.С. Гре-лин в патогенезе идиопатического бесплодия у мужчин // Вестник Уральской медицинской академической науки. 2014. № 3 (49). С. 202-204.

47. Галимова Э.Ф., Ахмадуллина Г.Х., Галимов Ш.Н. L-карнитин и карбо-нилирование белков эякулята при бесплодии // Врач. 2014. № 7. С. 40-41.

48. Павлов В.Н., Галимова Э.Ф., Ахмадуллина Г.Х., Галимов Ш.Н. Медико-биологические, социальные и культурно-образовательные аспекты охраны мужского здоровья // Профилактическая и клиническая медицина. 2014. №2(51). С. 5-13.

49. Galimova Е., Abdullina A., Achmadullina G., Galimov Sh. The role of Men and their Health in modern World // Europaische Fachhochschule. 2014. № 1. С. 26-28.

50. Галимова Э.Ф. Дисбаланс адипокинов у мужчин при идиопатическом бесплодии // Мат. 9-го Российско-Азиатского Уро-Андрологического Конгр. СПб., 2014. С. 39-41.

51. Галимов Ш.Н., Галимова Э.Ф. Идиопатическое бесплодие у мужчин: проблемы и перспективы // Мужское здоровье и долголетие: 12-й Российский науч. форум. М., 2014. С. 7.

52. Galimova E.F., Amirova Z.K., Galimov Sh. N. Dioxins in the semen of with infertility // Environmental Science and Pollution Research. 2015. Vol. 22, № 19. P. 14566-14569.

53. Галимова Э.Ф., Муталова Э.Г., Ахмадуллина Г.Х., Травников О. Ю., Баймурзина Ю.Л. Новая парадигма антиоксидантной терапии идиопатического бесплодия у мужчин // Медицинский вестник Башкортостана. 2015. № 3. С. 264-266.

54. Галимов Ш.Н., Ахмадуллина Г.Х., Травников О.Ю., Абдуллина А.З., Галимова Э.Ф. Влияние липоевой кислоты на цитокиновый профиль спермо-плазмы при идиопатическом бесплодии // Российский иммунологический журнал. 2015. Т. 9(18). № 1(1). С. 41-43.

55. Галимова Э.Ф., Ахмадуллина Г.Х., Булыгин К.В., Мочалов К.С., Галимов Ш.Н. Гликоделин S в сыворотке крови и эякуляте при идиопатическом бесплодии // Медицинская иммунология. 2015. Т. 17, № 3s. С. 178.

56. Галимова Э.Ф., Ахмадуллина Г.Х., Булыгин К.В., Мочалов К.С., Галимов Ш.Н. Ингибин В и активин А в патогенезе идиопатического бесплодия у мужчин // Казанский медицинский журнал. 2015. Т. 96. № 5. С. 749-752.

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ

АФК активные формы кислорода

ГГТ у-глутамилтрансфераза

ГПО/GPx глутатионпероксидаза

ГР глутатионредуктаза

ГСТ, GST глутатион-8-трансфераза

Г6ФДГ глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа

ГкХДД гексахлордибензо-пара-диоксин

ГпХДЦ гептахлордибензо-пара-диоксин

ГпХДФ гептахлордибензофуран

ИЛ/IL интерлейкнны

ИФА иммуноферментный анализ

КФК креатинфосфокиназа

МДГ малатдегидрогеназа

НАД никотинамидадениндинуклеотид

НАДФ никотинамидадениндннуклеотидфосфат

ОАА общая антиокислительная активность

охдц октахлордибензо-пара-диоксин

ОХДФ октахлордибензофуран

пхдд полихлорированный дибензо-п-диоксины

ПХДФ полихлорированные дибензофураны

ПнХДЦ пентахлордибензо-п-диоксин

ПнХДФ пентахлордибензофуран

СОД/SOD супероксиддисмутаза

СОЗ стойкие органические загрязнители

T3/TEQ токсический эквивалент

T<I>Pp/TGF трансформирующий фактор роста р

ТБК тиобарбитуровая кислота

ТБК-РП ТБК-реагирующие продукты

ТХДД 2, 3, 7, 8-тетрахлордибензо-пара-диоксин

ФНОа/TNF фактор некроза опухоли

ЩФ щелочная фосфатаза

цАМФ циклический аденозинмонофосфат

AhR рецептор ароматических углеводородов

ARE антиоксидантчувствительный элемент

GSH окисленный глутатион

GSSG восстановленный глутатион

8-oxodGu 8-гидрокси-2'-дезоксигуанозин

Keapl ингибитор Nrf2

LPx гидропероксиды липидов

Nrf2 ядерный связанный фактор, индуктор ARE

SDF фактор стромальных клеток

TZI индекс тератозооспермии

Подписано в печать 21.10.2015 г. Формат А5 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 100 Экз. Заказ № 5361-4-15 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.28 Тел. 8-495-782-88-39