Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:ДНК-специфичные противоопухолевые препараты (платиновые комплексы и аналог актиномицина D) как модификаторы клеточного иммунитета

РГб од

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК 2 О СЕВ "¡Ь ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

Иа правах рукописи УДК 616-006.04:616.1Б5.32

ОАХАРЬЕЕИЧ Наталия Глебовна

ДНК- (ШВДФИЧНЫЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ ПРЕПАРАТЫ (ПЛАТИНОВЫЕ КОМПЛЕКСЫ И АНАЛОГ АКТИНОМЩИНА Ю) КАК КВДШШОРЫ КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА.

14.00,14- онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертациии иа соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва- 1993

СУ

Работа выполнена в Онкологическом научном центре Российской академии медицинских наук

Научные руководители:

доктор медицинских наук Г.К.Герасимова кандидат медицинских наук А.А.Пименов Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Вядро М.М.

доктор биологических наук, профессор Горбачева Л.Б.

Ведущее учреждение-Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена МЗ РВ.

Зашита состоится " $ 4 " ^ К/иА^^^ЛЧЯ3 г в /'/ часов на заседании Специализированного Совета (К.001.17.01) в Онкологическом научном Центре РАМН по адрессу; 115478, Москва, Каширское шоссе 24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Онкологического научного Центра РАМН.

Автореферат разослан " 4 1983

Г.

Учёный секретарь специализированного Совета доктор медицинских наук

профессор В.С.Турусов

- 1 -АКТУАЛЬНОСТЬ ТШЭ

Эффект химиотерапии на течение и прогноз онкозаболеваний определяется двумя основными факторами: (1) прямым ингибирузощим действием прег/чрата на чувствительные к нему опухолевые клетки и (2-) состоянием системы противоопухолевого иммунного надзора.

Известно, что многие цитостатюад являются иммуносупрессанта-ын. Однако исследования последних лет показали, что ряд препаратов, основной мишенью действия которых является ДНК, при определенных концентрациях и схемах введения могут оказывать иммуностимулирующие эффекты. Таким действием обладают цисплатин, актинош-цин Б, антрациклиновые антибиотики, циклофосфан, 5-фторурацил, и др. (СеЬпапЛ В., 1089). Эти данные позволили рассматривать некоторые противоопухолевые препараты как своеобразные модификаторы биологических реакций организма ( Новашин С.М., ■ Вядро М.М. 1989; Ши.е1тап А., 1988). Учитывая сложную организацию противоопухолевого иммунологического надзора, исследования последнего времени направлены на детальное изучение влияния химиотерапевтических средств используемых в онкологии на функции различных эффекторных клеток этой многокомпонентной системы.

Схеш химиотерапии различных опухолей часто включают такие препараты как цисплатин и актиномицин 0. (Переводчикова н.И.. 1993).' При лечении некоторых заболеваний они используются в комбинации. Оба препарата обладают широким спектром противоопухолевой активности, но побочные токсические эффекты ограничивают их применение. Это стимулировало исследования по созданию новых аналогов этих лекарственных веществ с большей эффективностью и меньшей токсичностью, а также совершенствование схем их применения, в частности; путем комбинирования с биологическими модификаторами, позволяющими снизить терапевтическую дозу цитостатикоз.

В последние годы разработано два новых отечественных препарата из группы комплексных соединений платины: платин и шклопла-гам. Платин разрешен к практическому применению, циклоплатам проходит II фазу клинического изучения (Копоуа1оуа АЛ., 1992). Продолжаются исследования по созданию нового поколения аналогов ак-"иноыицина 0. среди которых в ОНЦ РАМН отобран для углубленного изучения препарат Н 2020988. Действие этих новых препаратов на иыыунокомпетентные клетки, а также возможности их сочетэнного1 применения с иммуномодификатораыи практически не изучены.

- г -

цга ш шш шздоемш.

Ceses жж нолями работы являлась идентификация типов шмуно-компетентпнк клеток, наиоолее чувствительных к платину и циклоп-латаму, а-угяяе оценка возможности комбинированного применения циклоплатача и препарата N 2020988 с модификаторами биологических реакций организма.

В ходе работы решались следующие задачи': -

1. выг.ейть особенности действия платина и циклоплатама в сравнении с цисплатином и карбоплатином на пролиферацию лимфоцитов, образование и цитотоксическую активность Т-киллеров и лимфо-кин-активкрованньх киллеров (ЛАК), активность натуральных киллеров (НК), продукцию перитонеальными макрофагами свободных форм кислорода. . .;

2. Оценить эффективность' комбинированного применения циклоп-латама с курашлдипептидом (МДП) и липополисахаридом (ЛПС).

3. Исследовать влияние фактора некроза опухолей-альфа (ОТО) на китотоксичность' платиновых препаратов. '..

4. Провести сравнительную оценку актиномицина D и его аналога препарата N 2020988 по критериям торможения синтеза РНК и синергизма противоопухолевого действия в сочетании с ФНО.

научная ювшзна иссвдованю!.

Впервые показано, что новые отечественные препараты платиновой группы платин и циклоплатам, также как и их варуоежные аналоги, оказывает, модифицирующее действие на функциональную активность эффекторных клеток системы противоопухолевого иммунитета. Характер воздействия (угнетение или активация) определяются концентрацией препаратов, стадией дифференцировки и пролиферативным потенциалом субпопуляиий иммуннокомпетентных клеток.

Установлено, что препарат N 2020988. также как и его прототип актиномицин D. подавляет синтез РНК и проявляет синергизм при комбинированном применении с ФНО.

Экспериментально, в условиях in vivo, подтверждена возможность комбинирования платиновых препаратов, с иммуностимуляторами. Показана эффективность комбинации циклоплатама с ЛПС и МЛП на молили мшиного лейкоза Р-388. ■

научно- практическая ценность работы.

Установлена низкая токсичность платиновых соединений для им-мунокс-мпетентннх клеток при кратковременном воздействии концент-рацнл, с-оотгетствуших максимально достигаемым в крови при введе-

нии их терапевтических доз. О учетом этого, с целью сохранения функциональной активности кимунокоьшэзентных клеток более предпочтительными являются режимы однократного введения высоких доз препаратов перед их едедневнш i в течении 5 дней) применением.

Показано, что при длительном воздействии платин и карбоплатин обладают менее выраженным антипролифератизным действием на имму-нокомпетентные клетки, чем цисплатин и карболлатии, что важно учитывать при использовании схем ежедневного применения препаратов и при комбинировании их с другими цитостатиками и модификаторами биологических реакций организма.

Повышение эффективности противооопухолевого действия шклоп-латама при его сочетании с икмуномодуляторами является серьезные аргументом в пользу рекомендации таких комбинаций для дальнейшего изучения.

АПРОБАЦИЯ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация апробирована иа совместной научной конференции отдела экспериментальной химиотерапии опухолей, лаборатории биологических модификаторов п/о иммунитета. лаборатории фармакоцитокинетики, лаборатории по созданию нетоксичных иммуномодульторов НИИ аЛиТО, лаборатории противоопухолевого sas-sy-нитета НИИ канцерогенеза и отдела молекудярно-биологических и оа-диоизотопных методов исследования" ОНИ РАИН.

ПУБЛИКАЦИИ. Основные пододення диссертации опубликованы в печатных работах.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 143 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзооа литературы. описания материалов и методов иследовзякя. результатов собственных исследований, обсуждения и вызодоэ. Библиография включает 156 источников. Работа иллюстрирована 25 рисунком и 7 таблицами. .

иатшшы и tsrogu тхщтт^.

Животные. В работе использованы швд инбредных линий, полученные из питомника "Столбовая" РАМН и из разведения ОВД.

Опухоли. ЛшФолейкоз Р-383 поддерживался регулярными пассажами на мышах линии DBA/2.

Неточные линии YAC-1, M0LT-4 и К-562. чувствительные к НК Iслеткам, фийробласты L-'ЗСЗ - мишени для цитотоксических Т-лимФо-цитов *ПТЛ) и Фактооа некроза опухолей поддерживались in vitro в

среде RFMI 1640. Чувствительная к ЛАК-клеткаи человека линия MEL-1, (меланома) культивировалась в среде MEM.

Реактивы и лекарственные с; детва. Субстанция актиномицина D (Calbiochep). препарат N 2020938 синтезирован в С-Петербургскои Технологическом Институте Е.Н.Глибинш. . цкеплатин, карбоплатин (Lachem. Чехия), циклоплатам синтезирован П.А.Чельцовыы в Институте обшей и неорганической химии им. Курнакова РАН. плагин получен для исследований из лаборатории хим-фары. анализа НИИ ЗДиТО РАМН. ФНО-й (AsaM. Япония). ЛПС (DlfCO,США), ЩП (Sigma США). ИЛ-2 (Cetus, США), набор реактивов для определения активности протеинкиназы С (ПКС) подучен от Serva. Германия и Amrsham. Англия.

Основные иммунологические методики.

Реакцию бласттрансформацин диыфоцитов человека учитывали по включению клетками эН-тишщина в ответ на митогены фитогеыагелю-тинин (ФГА) или ЛПС. Синтез РНК лимфоцитами селезенки мышей оценивали по включению 3Н-уридина в РНК в ответ на митоген конкана-валин А (Кон А).

Для индукции ЦТЛ против антигенов гистосовыестишсти иммунизацию произволшш в однонаправленной смешанной культуре лимфоцитов (СКЛ). различающихся по антигенам Н-2 комплекса, где стимулирующие клетки предварительно обрабатывались г-излучением.

Активность ИЛ-2 измеряли по усилению пролиферации КонА-индуцированных бластов. Степень экспрессии рецептора ИЛ-2 на клетках определяли по интенсивности клеточной пролиферации в ответ на экзогенный ИЛ-2/

ЛАК-кяетки получали из лимфоцитов периферической крови чело-зека инкубацией in vitro в течение трёх суток с рекомбинангнш ИЛ-2 в дозе 100 Ед/мл.

Степень активации макрофагов определяли: по усилению их способности продуцировать активные фарш кислорода (метод хешшоыи-несценции). .Измерения проводили 'на жидкостном сцинтилляционноа счетчике LB 9500 (Berthold, Германия):. Хемилшинесцентный ответ макрофагов индуцировался адгезией к стеклу или фагоцитозом опсо-низированных частиц зимоэана.

Ци^отоксшескую активность препаратов и их' комбинаций с ФНО определяли в биологическом тесте с использованием трансформированных фибробласгов линии L-929. После отмывки от убитых клеток монослой окрашивали кристаллическим фиолетовым. Оптическую плотность красителя в пробе определяли фотометрически.

Тумо'ришдную активность ЦТЛ. ЛАК и НК-клеток определяли стан-

дартнши методами по высвобождению из убитых клеток-мишеней мече ного хрома 51Сг (Brunner et al.. 1976).

Определение активности протеинкииазы С (ПКС).

Для получения in vivo ЦТЛ. специфичных к антигенам гистосов-ыестимости, мышей однократно иммунизировали внутрибрюлшнной инъекцией 2хЮ7 клеток аллогенной опухоли.

Активность ПКС определяли по включению 32Р- фосфата из (dZP) АГР и гистон Н2Ь методом Zllber-Kat2 Е. 1985.

Проведение и оценка экспериментов по химиотерапии опухолей.

Лейкоз Р-388 перевивался сингенным ыыяаы подкожно в дозе бхЮБ-106 клеток. Терапию начинали на 6-7 день после перевивки, когда опухоли у животных достигали размера до 8-Ю мм в диаметре. Препараты или их комбинации вводили несколькими курсами внутриб-рюяинно. Терапевтический эффект исследуемых препаратов оценивали по торможению роста опухоли и увеличению продолжительности диэни животных.

Статистическая обработка результатов.

В настоящей работе приведены средние данные из повторенных 2-3 раз экспериментов. В каждой эксперименте средний результат вычислен с учетом не менее 3-х параллелей. Достоверность различий между группами оценивали с помощью t-критерия Стьюдента, Разброс, представленный на графиках, охарактеризован доверительним интервалом для с* 0.05.

гезугыап! оествмщ шншкщеа й ISX ОВСУЯДВКЕ.

1. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ИШУНШОДУЛИРУКЖЩ ЗМЕКТОВ ДИСПЛАТИНА, ПЛАТИНА. КАРБОПЛАТИНА И ДИКЛОПЛАТАМА.

Эксперименты были выполнены In vitro (добавление препаратов непосредственно в среду культивирования изучаемых эффекторов) и in vivo (введение препаратов мышам с последующим выделением клеток-эффекторов). Использовались две системы клеток: (1) лимфоциты периферической крови человека (здоровых доноров): (2) мышиные епленоциты и клетки перитонеалыгаго экссудата.

1.1. Подавление пролиферативной активности лимфоцитов в ответ на митоген ФГА

Мы оценили влияние четырех платиновых препаратов на пролифе-ративную активность лимфоцитов донорской крови в ответ на специфический Т-клеточный митоген - фитогемагглютинин. Препараты вносили в культуральную среду в эквнмоля'рных концентрациях КГ5.

- в -

¿о'6.и 10~7 М. Установлено, что при 48 часовой инкубации изучаемые платиновые соединения во всех концентрациях угнетают пролифе-ративную активность лимфоцитов (рис.1). Наиболее выраженным ан-

платин_ _ _

СИ -I Q-« ЕЗ-9

Рис.1 Угнетение платиновыми препаратами пролиферации лимфоцитов донорской крови в ответ на Т-клеточный митоген фи-тогемапшотинин. По оси ординат-индекс стимуляции ( имп.в мин в опыте/имп.в мин в контроле (клетки без митогена)): 1.2,3 -препараты в концентрациях Ш_5М. 10_6M, 10"7М.

тилролиферативным действием обладал цисплатин, который в концентрации 10"5М снижал пролиферативный ответ на ФГА по сравнению с контролем более чем в 11 раа. Остальные препараты по степени их антипролиферативного действия в этой концентрации располагались в ряду: циклоплатам > карбоплатин > платин (снижение пролиферации относительно не обработанного контроля в 3.23. 2.07. 1.6 раа соответственно/.

Действие платиновых препаратов четко зависело от их концентрации в культуральной среде. При снижении концентрации до 10~6-10"7М антипролиферативный эффект ослабевал и был минимальным для карбоплатина.

1.2. Влияние платиновых препаратов на образование ЦТЛ и ИЛ-2.

Аналогом ответа на чужеродный антиген In vitro является смешанная культура лимфоцитов ( ОТО. распознавание антигена в которой проявляется в виде двух реакций: пролиферации . и генерации HTJ1. Эта система позволяет оценить влияние препаратов на генерацию ИТЛ и синтез интерлейкина 2 (ИЛ-2) Т-хелперами. '

В смешанной однонаправленной культуре лимфоцитов In vitro исследовалось влияние цисплатина. циклоллатама. карйоплатина и платина на генерацию цитотоксических Т-лимфоцитов.

Рис.2 Влияние платиновых препаратов на генерацию цитотоксических Т-лимфоцитов In vitro (инкубация с препаратами в течение Б суток). По оси ординат - относительный индекс цитотоксичности (отношение цитотоксичности клеток культивировавшихся с платиновыми препаратами, к цитотоксичности клеток,культивировавшихся в чистой среде, принятой за единицу). 1.2.3- препараты в концентрациях Ю_5М. 10_6М. 1СГ7М

Было показано (рис. 2). что добавление в культуральную среду цисплатина, циклоплатама и карйоплатина на все время культивирования (б суток) в дозе 1СГ5 М приводит к значительному подавлению генерации цитотоксических Т-лимфоцитов. Питотоксическая активность лимфоцитов, культивируемых с этой же дозой платина, практически не меняется по сравнению с контрольными вариантами. Подавляющими остаются концентрации 10~б М цисплатина и циклоплатама. а такае 10~7М цисплатина. Диклоплатам в дозе 10"7М оказывал минимальное ингибирущее действие, а карбоплатин м платин в дозах 1СГ6 и Ю-7 М стимулировали генерации ЦТЛ.

Обработка платиновыми препаратами мышиных лимфоцитов в течение первых суток с последующим культивированием с аллогенными стимуляторами без препаратов не действовала на генерацию цитотоксических Г-лимфоцитов.

Учитывая ведущую роль ИЛ-2 в активации предшественников цитотоксических Т-лимфоцитов и исходя из дплных. свидетельствующих об

отсутствии влияния на генерацию ДТЛ препаратов, добавленных в среду только на первые сутки культивирвания, изучалось влияние платиновых препаратов на продукцию ИЛ-2. Изучаемые препараты подавляли синтез ИЛ-2 только в дозе 10_СМ. Внесение препаратов в дозах 10~° и Ю'7 практически не отражалось на уровне ИЛ-2. хотя некоторая тенденция к подавлению отмечалась при обработке лимфоцитов цисплатином и циклоплатамом.

Зашзчая данный раздел работы модно сделать вывод о том. что все изучаемые нами соединения в высоких концентрациях (10-5М) обладают угнетающим действием на Т-клеточные реакции . Наиболее выраженное угнетение оказывали цисплатин и циклоплатам. которые значительно ингибировали реакцию бласттрансформации в ответ на •1ГА и генерацию ЦТЛ. Платин и карбоплатин в меньшей степени угнетали пролиферативный ответ, а на образование ПТЛ в зависимости от концентрации оказывали прямо противоположное действие: 10"^М -/гнетение образования ЦТЛ in vitro из предшественников (минимальное для платина), 10"6 и 10"7М- стимуляция образования этой субпопуляции Т-киллеров.

1.3. Влияние платиновых препаратов на образование ЛАК-клеток и пролиферацию в ответ на экзогенный ИЛ-2.

Изучение эффектов цисплатина. платина, карбоплатина и циклоп-.лагама на опосредованную ИЛ-2 индукцию цитотоксичности и пролиферация ЛАК проводилось на мононуклеарах периферической крови здоровых доноров.х Выделенные клетки культивировали в течение четырех дней в полной среде, содержащей 100 Ед/мл рекомбинантного ИЛ-2 и ;жвимолярные концентрации Q0"5, 10~б. 10~7М) платиновых препаратов. D качестве контррля использовали лимфоциты, культивируемые и среде, содержащей 100 Ед-ИЛ-2.

Установлено, что все изучаемые препараты (цисплатин. платин. глрОоплатин и циклоплатам) • в концентрации 10_ЬМ ингибируют образование ЛАК.in vitro (рис. 3). Наиболее сильный ингибирующий эффект оказывал циклоплатам. который уменьшал цитотоксичность культивируемых с препаратом клеток в 7.8 раз по сравнению с контролем, Возможно это связано с более выраженным, по сравнению с остальными соединениями платиновой группы, воздействием на рецепто-ри к ИЛ-2. Цисплатин. платин и карбоплатин снижали цитотоксичность приблизительно одинаково в 1.2-1.3 раза . При концентрации lCr'H наблюдались различия в результатах экспериментов при использовании крови от различных доноров. • Эффект колебался от нез-

начительного угнетения до незначительной стимуляции. Цисплатин, карбопдатин и платин в концентрации 10~7Ы не только не угнетали генерацию ЛАК клеток, но и оказывали некоторое стимулирующее

--í

' - ¡ „ ^ ц t

ММ № ffci

Рис. 3 Эффект Ш-ИМ цисплатина (А), платина (Б), карбоплати-

на (В) и циклоплатама (Г) на образование ЛАК клеток in vitro. i-контрсхль: 2-иэучаемый препарат. По оси абсцисс-соотношение эффектор-.мишень; По оси ординат-цитотоксический индекс.в х.

действие. в то время как циклоплатам при этой концентрации все eme оказывал ингибируший эффект.

Исследовалось также влияние длительности совместного культивирования лимфоцитов с платиновыми препаратами на уровень цито-токсичности ЛАК клеток. Обработка мононуклеарных клеток цисплати-ном, циклоплатамом и платином в течении 1 часа с последующей отмывкой от препаратов и культивированием в среде содержащей 100 Ед/мл ИЛ-2 в течении 4 суток не оказывала отрицательного рффекта на их штотоксичность даже при высоких концентрациях ( 10~5 и

ю'^Ш. Добавление препаратов на последние 24 часа культивирования также не влияло на цитотоксичность ЛАК клеток.

Пролиферация лимфоцитов, вызванная ИЛ-2. при действии шспла-тина. платина, карбоплатина и циклоплатама угнеталась больше чем цитотоксичность во всех изучаемых дозах (Ю"в. 10~&,Ю~7М). По степени их антипролиферативного действия на лимфокинактивирован-ные клетки они располагались в следующем ряду цисплатин > циклоп-латам > карбоплатин - платин (снижение индекса стимуляции в дозе lo'*5 - в 2.6, 2.2. 1.4 раза соответственно').

1.4. Активация НК-клеток и макрофагов - один из возможных путей реализации противоопухолевого действия платиновых препаратов.

Из данных литературы известно, что цисплатин. родоначальник класса платиновых соединений, может осуществлять свое противоопухолевое действие несколькими путями. В частности, он может оказывать активирующее действие на клетки системы противоопухолевой защиты организма-натуральные киллеры и макрофаги 4Llchtensteln А.К...Pende D..1986. Sodhl A., et al. 1991).

Сравнительное изучение влияния цисплатина. платина, карбоплатина и циклоплатама на цитотоксическу» активность НК клеток проведено нами как в экспериментах In vitro (на клетках периферической крови человека), так и In vivo (при введении препаратов мышам).

В экспериментах In vitro изучалась зависимость эффекта препаратов на НК-клетки от их концентрации в культуральной среде и времени воздействия. Для изучения влияния времени инкубации с препаратами на цитотоксичность лимфоцитов периферической крови здоровых доноров, выделенные клетки обрабатывались 10_5М платиновых соединений в течении 1, б и 24 часов. Добавление в культу-ральную среду цисплатина. карбоплатина и платина приводило к за-ьисимому от времени, обработки повышению цитотоксичности по сравнению с контролем (цитотоксичность» клеток, культивировавшихся в чистой среде). Максимальный стимулирующий эффект наблюдался при 24 часовой инкубации с препаратами. Циклоплатам в концентрации JO"'0М активирующего действия на цитотоксичность НК-клеток не оказывал. ■ -

Степень активации НК-клеток зависела также и от концентрации препаратов в культуральной среде. По. этому признаку они распола-, .гпта в следующем порядке: цисплатин •> карбоплатин. > плйтин -

при дозо 10 (увеличение цитсжжсичности в 3.5. 3.1. 2.1 раз соответственно), и карболлатин -> ллатин > цисплатин- при дозе 10-бМ. Концентрация КГ' М не вызывала значительного увеличения

4

11

»

м

i

II

I

е.»

»

еонгро/а цио- платим карбоплатин цикла-

плмин _ __платвя

СЭ- i ЕЗ -« ЕЗ- »

Рис.4 Влияние платиновых препаратов на цитотоксическую активность натуральных киллеров in vitro. По оси ординат - относительный цитотоксический индекс, 1,2,0 - препараты в концентрациях 10'%. 10_бМ, 10~7М,

цитотоксичности. однако литический потенциал клеток, обработанных этой дозой, оставался все яе выше, чем у клеток, культивировавшихся в чистой среде.

Циклоплатам практически не влиял на цитотоксичность ни в одной из изученных концентраций, хотя с уменьшением концентрации препарата наблюдалась некоторая тенденция к увеличению цитотоксичности обработанных лимфоцитов.

Изучалось также действие платиновых препаратов на натуральные киллеры In vivo. Для этого препараты вводили мышам однократно в дозах, близких к терапевтическим за 48 часов до исследования. Цисплатин, платин. карбоплатин после единичной интраперитонеаль-ной инъекции активировали спленоциты мышей.' в то время как цик-лоплатам статистически достоверного увеличения цитотоксичности не ьызывал.

Доказательством тому, что лизис опухолевых клеток является следствием активации именно НК-клеток служат следующие факты.

Во-первых, используемые эффекторные клетки не прикрепляются к покрытой сывороткой поверхности пластика (т.е. не относятся к системе мононуклеарных-фагоцитов) и во-вторых, происходит лизис мишеней, чувствительных только к натуральным киллерам. При попыт-

ках использовать в качестве мишеней линии Р-815. Е1-4. L-929. устойчивые к действию этой субпопуляции киллеров, цитотоксичности не обнаружено.

Рис.5 Влияние платиновых препаратов на хемидюминесценшоо макрофагов при фагоцитозе <А>. при адгезии к стеклу (Б) (вре-. мя инкубации 6 часов); по оси ординат-индейсг хемилзоыи-несценции; 1,2.3 - препараты в концентрациях lCT^M. 10~Ч|. Ю"7М.

1.5. Изменение активности перитонеальных мышиных макрофагов после воздействия платиновых препаратов.

Из данных лиуературы известно, что цисплатин может усиливать туморицияные свойства макрофагов за счет увеличения продукции этими клетками различных цитолитических факторов, в частности активных форм кислорода (Sodhl A. et al, 1S88).

Одной из стоявших пёред нами задач было определение степени усиления респираторного взрыва под действием сравниваемых в работе платиновых препаратов. При изучении влияния препаратов на продукцию активных»форм кислорода мы использовали два варианта постановки реакции: а) добавление препаратов к клеткам перитонеаль-иого экссудата in vitro; б) одноразовое введение препаратов мышам

48 часов до исследования. Все изучаемые препараты в разной степени увеличивали продукцию активных форм кислорода in vitro г рис.5). С увеличением времени инкубации от 1 до б часов эффект усиливался и достигал максимума при 6 часовой обработке . Эффекты шюплапша, платина и циклоплатама на продукцию свободных радикалов ююлооода макрофагами были сопоставимы как между собой, так и с действием ЛПС. известного агента активирующего макрофаги. Кар-

боплатин во всех исследованных концентрациях вызывал менее выраженное увеличение хемшпоминесценцни..

Подобные результаты были получены и при оценке уровня хемилю-шшесценции клеток леритонеального экссудата мышей, которым препараты вводились внутрибрюшинно га 48 часов до исследования в близких к терапевтическим дозах.

Таким образом, платиновые препараты, увеличивают активность натуральных кидлериых клеток, а такав индуцированную фагоцитозом и адгеаией к стеклу .продукцию активных Форм кислорода как in vitro ( при обработке лимфоцитов и клеток перитонеального экссудата) , тек и in vivo ( при введении препаратов ыышам).

1.1.4. Слияние платиновых препаратов на активность протеинкиназы С спленоцитов мыши.

В этом разделе работы мы попытались оценить биохимические аспекты механизма действия платиновых препаратов на функциональную активность спленоцитов.

ИКС или Са ++фосфолипвд - зависимая протеинкиназа является ключевым звеном в механизма* антигенной активации Т-клеток,индукции рецепторов ИЛ-2 (Nishlzuka Y..1088. Kvanta et al., 1989).

У&1 изучали влияние платиновых препаратов иа активность растворимой и мембраносвязанной форм ПКС спленоцитов интактных мыаей, а также влияние платиновых препаратов на активность мембранной Формы ПКС спленоциТой мыией, предварительно иммунизированных живыми аллогенными опухолевыми клетками, в ходе цитотоксической реакции. На момент эксперимента ( 10 день после' иммунизации) в селезенке таких животных происходит 10-кратное увеличение антигенс-пецифических Т-килллеров.

При исследовании вл'кяния платиновых препаратов на активность ПКС в покоящихся клетка*" быЗо показано (таблада 1), что ни цисп-латия, ни циклоллатам, в течение трехчасового инкубирования о клетками, не игибируют активность растворимой и мембраносвязанной форм ПКС. Активность мембраносвязанной ПКС даже несколько увеличивалась.

С другой серии опытов мы оценили действие препаратов на активность фермента в ходе цитотоксической реакции.

Оказалось, что и в этой системе платиновые препараты не угнетают активность фермента < таблица 2).

Таблица 1

Влияние платиновых препаратов на активность цитозольной и мембранной формы ПКС мышиных спленоцитов.*

активность : имппульсы / минуту

ИКС )«знтроль цисплатин : циклоплатам

цитозольная: форма (А) : 14000+ 1000 13500 + 500 14500+ 1000

мембранная : форма (Б) : 7650+ 600 8100 v 600 8100+ 600

'¡'летки (107кл для (А) и 50x10° кл для СБ) инкубировали в 20 мл среды Игла (А) или раствора Хенкса (Б) с платиновыми препаратами ( 10~ö М) в течении 1 (Б)-3 (А) часов при 37° с. Активность ПКС выражена в имп/мин/ 0,5х 10°(А) или 5xlOö(D)

Таблица 2

Измерение активности мембранной ПКС спленоцитов ь ходе цитотоксической реакции*.

Активность: имппульсы / минуту

ПКС : контроль цисплатин циклоплатам

2100» 300 С900+ ООО 3000+ 300

"Активность ПКС Гимп/мин /5х 10° клеток) определялась

через 2 часа после начала реакции.

Из исследований по фармакокинетике цисплатина и циклоплатама известно, что концентрация 10_5М сохраняется в крови только несколько минут после внутривенного введения препаратов (СингинА.С.. 1992).

Нави данные показывают, что при кратковременном воздействии платиновыми препаратами на спленоциты мышей в дозе Ю'Ч). ингиби-ции ПКС. фермента, участвующего в реализации цитотоксической ак-

тивности иммунокомпетентных клеток, не происходит. Измеряемая на ми активность ИКС является усредненным ответом всей системы эф-фекторных клеток. Поскольку спленоциты представляют собой вьюоко-готерогенную клеточную систему, то нельзя исключить того, что в ней имеются популяции клеток, в которых ПКС ингибируется или активируется.

Известно также, что при различных процессах, которые происходят в клетках с участием ПКС. происходит ее перемещение из цито-золя в мембрану. Мы наблюдали некоторое увеличение активности мембранной протеинкиназы под воздействием платиновых препаратов.

Таким образом не исключено, что усиление цитотоксичности под действием препаратов платины реализуется через мембранную ПКС.

" 2. ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ АКТИВНОСТЬ КОМБИНАЦИИ ЦИКЛОПЛАТАМА С ЛИПОПОЛИСАХАРИДОМ И МУРАМИДДИПЕПТИДОМ.

Из приведенных выше результатов видно, что циклоплатам оказывает иммуносупрессивный эффект на Т-клеточное звено иммунитета, а также в большей степени, чем остальные изучаемые препараты инги-бирует генерацию ЛАК клеток.

В то же время, препарат существенно не влиет на активность НК клеток и вызывает увеличение продукции активных форм кислорода клетками мононуклеарно-Фагоцитарной системы.

Данные факты послужили предпосылкой для разработки комбинированной химиотерапевтической схемы, включающей иммуностимуляторы. Мы предполагали, что применение иммуностимуляторов липополисаха-рида и мурамилдипептида позволит снизить токсические эффекты препарата на Т-клеточное звено и потенцировать его прямое противоопухолевое и активирующее действие на клетки мононуклеарно-фагоци-тарной системы.

Для химиотерапевтических экспериментов мы использовали мышей линии ВО^ с лимфолейкозом Р-388 перевитым подкожно. Лечение проводилось по следующим схемам: (1) циклоплатам-30 мг/кг. пятикратно, с, интервалом 48 ч.: (2) МДП-1 мг/кг. пятикратно, с интервалом 1С ч.: (3) МДП-1 мг/кг. пятикратно, с интервалом 48-72 ч. в сочетании с циклоплатамом 30 мг/кг через 24 часа после каждого введения МЯЛ; (4) МПП (1 мг/кгНЛПС (0.5 мг/кг). пятикратно, с интервалом 48-?2ч с циклоплатамом I 30 мг/кг) через 24 часа после каждого введения комбинации иммуномодуляторов.

Противоопухолевый эффект оценивали по трем параметрам: скорости роста.опухолевого угла, увеличению продолжительности жизни

животных, выживаемости на разные сроки после трансплантации опухоли.

При изучении противоопухолевой активности МШ1 и его комбинации с циклоплатамом были получены следующие результаты. МШ1 при

Увеличение продолжительности ж. из ни ------------ иишег--- -----

Таблица 3

Лечение Ср«дк» ПроДоиМГМЛ» -к чет» «мяк У««лкч«ю» продолжит««-коет* жкакж (» процентах)

ьэлеченни»' 27.4- <.0? -

ШЗП 33.4- 3.7 гг

лпс+мяп 39.2— 4.8 44

циклопдатам 4».»- а.21 «7

циклоп/хатам млп : 4Э.&+ ав5 «в

циклоппатвм лпс+мдп «М+ИЧТ 110

ионотерапии не проявлял заметного противоопухолевого действия. Комбинация циклоплат^ма с ВДП вцзрвала торможение роста опухоли в большей степени, чем монотерапед иивдоплатамом, однако средняя продолжительность жизни эксперимента^^ животных и в том, и в другом случае была приблизительно одинакова (таблица 3).

Более сильный прртцвоопухолевый эффект был достигнут при комбинации циклоплатадз с ЩП и ЛПС. Терапия цжлоплатамом на фоне действия комбинации иммуностимуляторов способствует большему торможению роста опухоли, чем лечение одним препарате«.

Противоопухолевая активность комбинации ЛПС и ЩП была различна в разных экспериментах и зависела, по всей видимости, от иммунного статуса мцшей . Наиболее сильный суммарный эффект от комбинации циклоплатама с имуунсфюдуляторами наблюдался у мышей с меньшей скоростью роста опухоли « р менее выраженным ответом (по критерию торможения роста опунещ) ЦА ЛПС + МДП. О целесоообраз-ности комбинированна цитостзэдкЗ с иммуномодуляторами можно судить и по увеличению продолжатель носги жизни экспериментальных даодецх (таблица 3).Так, ЛПС+МДП увеличивали продолжительность эдэвд ца 44Х, да;' юплата^ на 67Х, а комбинация этих агентов на

и'о г .

Так}Ш стразом, на модели лимфолейкоза Р-388, перевитого подкожно ишац 1, да экспериментально подтвердили целесообразность комбивирор/шия дитостатика циклоплатама, обладающего антип-ролиФеративным действием на клегкй иммунной системы, с чммуности-

- it -

мудяторами.

Из исследований по фармакоютнетике платиновых препаратов известно. что их максимальная концентрация сохраняется в крови в течение короткого промежутка времени и колеблется в пределах 10~4-1(Г5М. На протяжение последующих нескольких суток препараты платины находятся в организме в гораздо более низких концентрациях 1(Гб - 10_9М ( Сингин A.C.. 1992). Таким образом, диапазон выбраных нами для исследования концентраций препаратов приближается к реальной ситуаций1, возникающей в организме больных после введения им соединений' этого класса.

Из наших данных следует, что цисплатин. платин. карбоплатии и циклоплатам значительно ингибируют генерацию цитотоксических Т-лимфоцитов и лимфокин-акгивированных клеток только в сравнительно высоких концентрациях (10-5Ш и при длительном времени совместного культивирования. Дозы 10~Ö - 10"7 М карбоплатина и платина не только не угнетают, но и вызывают некоторую стимуляцию образования ЦТЛ и ЛАК. Также нами было отмечнно усиление платиновыми препаратами (во всем диапазоне исследованных концентраций) активности натуральных киллеров и макрофагов.

Клетки иммунной системы обладают способностью к самоподдержа-иию. которое достигается за счет активной клеточной пролиферации и возможности дифференцироваться в разных направлениях. Пролифе-ративный потенциал и направление дифференшровки зависят от стадии созревания, постоянной кооперации с другими клетками иммунной системы и регулирующего влияния факторов микроокружения. На более ранних стадиях дифференцировки клеток их пролиферативный потенциал Выше и. по этой причине, как мы полагаем, они более чувствительны к ингибирующему действию платиновых препаратов. В то же время, функциональная активация зрелых предшественников иммуно-1сомпетентных клеток в меньшей степени зависит от клеточной пролиферации и воздействие платины на такие клетки может приводить к становлению компетентности . т.е. к терминальной дифференцировке. что выражается в усилении их функциональной активности, становление компетентности осуществляется через активацию ПКС. Мы не выявили угнетения платиновыми препаратами.активности этого, фермента в период пика иммунного ответа на антигенный стимул.

Результаты нашей работы позволяют предположить способность платиновых препаратов, при определенных концентрациях, быть индукторами дифференцировки иммунокомпетентных клеток. Реализация их действия на иммунную систему возможно происходит через внут-

риклеточные коммуникационные пути, в частности через Саг+ фосфо-липид-зависимую протеинкиназу.

з. модиаикАЦИя дитотиксичЕСКОГО действия'актиномицина D,

ЕГО АНАЛОГА И ПРЕПАРАТОВ ПЛАТИНОВОГО КОМПЛЕКСА ПРИ ИХ КОМБИНАЦИИ С ФНО-АЛЬФА IN VITRO.

Из данных литературы известно, что актиномицин D обладает синергизмом действия с ФИО In vitro, однако высокая токсичность такой комбинации ограничивает ее применение In vivo.

В С-Петербургском Технологическом институте синтезирован новый аналог актиноыицина D (препарат N2020983). Терапевтические концентрации аналога примерно в 100 раз вше. чем у исходного препарата. По критерию подавления синтеза РНК и возможности действовать синергично с ФИО препарат изучен не был. Целью данного раздела.работы было ответить на вопросы:

1) является ли аналог, также как и актиномицин D, ингибитором синтеза РНК*.

2)есть ли корреляция между ингибированием синтеза РНК и цитотоксичностыо in vitro;

3)обладает ли аналог синергизмом с №0.

На первом этапе исследования нами было проведено сравнительное изучение препаратов по их влиянию на синтез РНК опухолевых клеток и селезеночных мышиных лимфоцитов. Установлено . что 501 подавление синтева РНК в клетках L 929 после 48 часов инкубации с препаратами наблюдалось при концентрации 0,03 шг/мл для актино-мицина D и 0.12 мкг/мл для его аналога. Полное подавление синтеза РНК отмечено при концентрации 2 мкг/мл для актиномицина D и 8 мкг/мл для его аналога.

Чувствительность селезеночных мышиных лимфоцитов к действию этих препаратов оказалась в 100 раз выше, чем чувствительность к ним опухолевых клеток L 929. Концентрация, вызывающая полное прекращение синтеза РНК лимфоцитами, составляет 0.01 мкг/мл актиномицина D и 0.05 мкг/мл его аналога .

Тагам образом, аналог, также как и актиномицин D. является ингибитором синтеза РНК, однако его ингибирувдее действие, в условиях нашего эксперимента, в равных концентрациях примерно в 4 раз ниже чем у актиномицина D. Полученные данные мы учитывали при выборе диапазона концентраций препаратов для оценки их влияния на цитотоксичность $hJ.

Дятогоксический эффект актиномицина D ( диапазон концентраций 0.08-4 мкг/мл) и его аналога (0.5 -32 мкг/мл) в условиях 18 часо-

дого культивирования был очень низким в начальных концентрациях и в максимальных приближался к 50% (рис. 6).

Гис.б Цитотоксическая активность актиномицина D (А) и его аналога (Б) в присутствии (1) или отсутствии (2) ШО (1ЕД/мл).

По оси абсцисс-концентрация вещества,в мкг/мл;

По оси ординат-единицы оптической плотности.

Предварительно была оценена цитотоксичность ФИО для опухолевых клеток L 929 в диапазоне концентраций 1000-10000 ед. Отмечена незначительная гибель опухолевых клеток, начиная с концентрации ФИО 2000 ед/мл, и при концентрации 10000 ед/мл гибель не превышала 20Х.

Для изучения влияния препаратов на цитотоксический эффект ФНО опухолевые клетки культивировались в течение 18 часов в среде содержащей 1 ед/мл.ФНО и различные концентрации сравниваемых препаратов. Комбинированное применение ФНО как с актиномицином D. так и его аналогом, значительно снижают концентрацию монокина. вызывающую гибель опухолевых клеток чувствительной к ФНО линии трансформированных мышиных фибробластов L 929.

Характер эффекта можно оценить как синергизм, поскольку цитотоксичность комбинации намного превышает цитотоксичность каждого препарата в отдельности.

Известно, что актиномицин D в низких концентрациях является мощным индуктором дифференцировки опухолевых клеток (Robert С.. 1981) . Недавно установлено, что ФНО « и ФНО в спосоствуют становлению компетенции в лейкозных миелобластах человека (линии ML-1), а индукторы дифференцировки воздействуют уже на компетент-

- го-

лые клетки и способствуют их созревайша ( Bloch А.. 1990). при этой требуются солее низкие концентрации препаратов индукторов дифференцировки, чем это необходимо для их цитототоксического действия.

Эти данные свидетельствуют в пользу перспективности дальнейшей разработки режимов комбинированного воздействия на опухоль используя низкие концентраций акткномицина D, его аналогов и рэ-1сомбинантного ФНО.

Цитотоксический эффект платиновых препаратов на опухолевые клетки и его модификация рекомбинантным ФНО. Исходя из наших результатов по активации перитонеальных макрофагов платиновыми препаратами и данных литературы, свидетельствующих об усилении продукции макрофагами как свободных, так и ыембраносвязанных фори ФИО под действием цисплатина. представлялось целесообразна-« оценить цитотоксическое действие комбинации ФНО н платиновых соединений ь отношении опухолевых клеток In vitro.

На первом этапе мы изучили вдтотоксичность сравниваемых препаратов в отношении опухолевых клеток линии L929. в отсутствии ¡НЮ. Было показано С рис. 7). что все изучаемые препараты обладают токсическим эффектом по отношению к клеткам мышиных трансформированных фибробластов L 929. По степени выраженности этого эффекта препараты располагались в ряду цисплатин > циклоплатаы > платил > карбоплатин (гибель 5QX опухолевых клеток при концентрации препарата р кудьтурадьной среде 10~*М, ЭКЮ"4»!. 6xl0"4l соответственно) .

Комбинированная обработка опухолевых клеток платиновыми препаратами и ФНО приводила к усилению цитотоксического эффекта. 0Ш добавляли к клеткам в 4 концентрациях 0,1.1,10 и 100Ед/ил. 1Ед/ил ФНО вызывала нееначительное усиление цитотоксичности. в то время

Доза МО 0,1 Ед/мл не только не усиливала цитотоксичность платиновых препаратов, но и оказывала стимулирующее действие на рост трансформированных фибробластов и увеличивала концентрацию платиновых препаратов, необходимую для их гибели.

• Проводя параллели с актиномицином 0 и его аналогом видно, что платиновые препараты уступают им по способности действовать си-пергично с ФНО. Если 1 Ец WO позволяв- снизить дозу актиномици-исч (CEsr») более чем в 10 раз. то в случае с платиновыми препаратами нужна большая концентрация ФНО (100 Ед). Однако и эта концентрация не токсична для опухолевых клеток в условиях нашего

экспергаонта. Достигаемое при этсм опасение концентрации платиновых препаратов в 3-5 раз ноже? ныеть значение . учитывая данные по пх слтппролкферативному действию на ишунокоипетентныэ клетки.

L 99 X 10

.с* а 10

и х 10

Pre. 7 Дйтотоксическая сктивкость цгазплаткна (А)0 платила (Б) кгрбоплатгаа (В) и цкклоплатеаа (Г) в отсутствии (1) п ' ' присутствии 1,ЕД (2) , 10 ЕД (3) и 100 Ед (4) ЗШ. По оси аСсцясс-концентрация вецества, в шлях; По оси ординат-еяшшцы оптической плотности.

Исгяо предположить, что токая комбинация ln vivo, позволит усилить продукций ФИО клеткаии мононукдеарно-фагоцитарной системы, и в то se время увеличить чувствительность опухолевых клеток к этому ьюнокину. что позволит использовать противоопухолевые возыоя-ности как эндогенного, так и экзогенного ФНО.

В последние годы покдазйо, что противоопухолевый эффект некоторых штостатиков косит д&о&ст&ййййй характер: непосредственное ловредденне различных структур иудетос-мивеней высокими концентрациями препаратов к воьарзнуевнв опухолевым клеткам спосоОностм к дифференцировке при более ннзких концентрациях (Белоусова А.К.. 1991, Bloch А., 1990).

Литературные данные, а такие результаты представленные в настоящей работе свидетельствуют о том. что сходные эффекты ДНК специфические препараты окаадазат # некоторые эффекторы клеточного противоопухолевого иммунитета: подавление их активности на лролиферативной стадии Формирования иммунного ответа и стимуляция активности на стадии вдооления специфической функции (дифференцировки). , .

ш S3 в о Д II

1. Новые рдатшювые препараты платин и цикдоплатам. также как и их аналоги цисплатин н карбоплатин. являются модуляторами клеточного щотдоета.

р. Цисплатин,платин.карбоплатин и циклоплатаы вызывают угнетение пролиферации лимфоцитов в ответ на митоген и экзогенный интерлей-кин 2 в диапазоне концентраций 10~5-10~7М. Цисплатин и циклопла-там превосходят по этоаау показателю платин и карбоплатин.

Э'. Цисплатин,платки,карбоплатин и циклоплатам в концентрации Ш_5М ингкбируют синтез интердейкина-2 и генерацию цитотоксичес-кнх Т-дямфоцитоз в смешанной культуре лимфоцитов In vitro. Уыень-вэние концентрации до 10~6-10~7М приводит к снижению этого эффекта цисплатша и циклоплатама и увеличению образования цитотокси-ческих Т-лимфоцитов под действием карбоплатина и платина.

4. Характер эффекта платиновых препаратов на образование лимфо-К1Ш-активированных киллеров In vitro зависит от их концентрации: при концентрации 10~5 М выявлено ингибирование образования ЛАК,максимальное для цикдоллатаыа. Бри уменьшении в культуральной среде концентрации цисплатина. платина, карбоплатина до Ю_еМ ин-гибйруюаий эффект исчезает, а при дозе t0~'M наблюдается стимуляция образования ЛАК .

5. Bcé изученные платиновые препараты усиливают продукцию активных форм кислорода перитонеальными макрофагами in vitro к Ir. vivo, что является показателем усиления их функциональной активности.,

6. Цисплатин, карбоплатин и платин, но не циклоплатам, усиливают цитотоксическую активность натуральных киллерных клеток in vitro и in vivo.

7. Применение цикдоплатама на фоне предварительного введения ком-Стации иммуномодуляторов липополисахарида и мурамилдипептида усиливает его противоопухолевый эффект в отношении лейкоза Р-388. Характер эффекта аддитивный.

8. Платиновые препараты, тагске как актиноиицин 0 н его аналог, проявляют синергизм при сочетанноы применении с фактором некроза опухолей-альфа In vitro.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Захарьевич Н.Г., Герасимова Г.К..Пименов A.A. Цитотоксичес-кий эффект нового аналога актиномицина .D и его комбинации с ФНО-а. Химиотерапия опухолей N . Москва 1993.

2. Захарьевич Н.Г., Герасимова Г.К..Пименов A.A. Противоопухолевые комплексные соединения Pt II как модификаторы биологических реакций организма Тезисы докладов XV Черняевского совещания по химии, анализу и технологии платиновых металлов, Москва, сентябрь 1993

' 3. Захарьевич Н.Г., Герасимова Г.Kg, Влияние платиновых препаратов на некоторые показатели клеточного иммунитета, рук.деп. в ВИНИТИ, 1.06.93 N 1533 / В/93.

4. Захарьевич Н.Г., Активация клеток системы естественной резистентности организма при воздействии платиновыми препаратами in vitro и in vivo, рук.деп. в ВИНИТИ. .N / В/93