Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Зависимость противоопухолевой активности от структуры в ряду новых производных актиномицина D

/л

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР им. H.H. БЛОХИНА

На правах рукописи УДК 615.277.3; 616-006-092.4/.9

ГОЛУЕЕВА ИРИНА СЕРГЕЕВНА

ЗАВИСИМОСТЬ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ ОТ СТРУКТУРЫ В РЯДУ НОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ АКТИНОМИЦИНА о

(14.00.14 - онкология)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: д.м.н. Г.К. Герасимова д.х.н. профессор E.H. Глибин

Москва, 1998 год

- 2 -ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..................................................стр. 4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Актиномицин D..................................стр. 8

1.2 Противоопухолевые свойства.....................стр. 10

1.3 Фармакокинетика и метаболизм...................стр. 11

1.4 Механизм действия..............................стр. 12

1.5 Производные актиномицина D.....................стр. 17

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Выбор основной модели для исследования противоопухолевых свойств аналогов актиномицина D........стр. 23

2.2 Экспериментальные модели опухолевого роста.....стр. 25

2.3 Использованные препараты......;................стр. 27

2.4 Режимы введения и дозы препаратов..............стр. 27

2.5 Оценка результатов.............................стр. 34

ГЛАВА 3. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ СВОЙСТВ АНАЛОГОВ

АКТИНОМИЦИНА D.................................стр. 35

3.1. Исследование противоопухолевых свойств производных

актиномицина D на модели Са-755................стр. 37

3.2 Исследование противоопухолевых свойств производных актиномицина D с остатками аминоспиртов и аминоуг-леводов на модели Са-755.......................стр. 44

3.3.1 Исследование противоопухолевых свойств амидов акти-ноцина с заместителями, содержащими катионоидные центры и амфолит, на модели Са-755.............стр. 4£

3.3.2 Исследование противоопухолевых свойств соединения XXI: из серии производных с катионоидными центрами на моделях Р-388, В-16, LLC, РШМ-5................стр. 5е

- з -

3.4.1 Исследование противоопухолевых свойств липидоинтер-каляторов на основе актиноцина на Са-755..... стр. 59

3.4.2 Исследование противоопухолевых свойств липидоинтер-каляторов на Р-388, В-16, LLC, РИМ-5......... стр. 65

3.5.1 Полифункциональные производные на основе актиноми-цина D....................................... стр. 67

3.5.2 Исследование противоопухолевых свойств полифункциональных производных актиноцина............... стр. 70

ГЛАВА 4 ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ СВОЙСТВ ПРОИЗВОДНЫХ АКТИНОЦИНА С ФРАГМЕНТАМИ КРАУН-СОЕДИНЕНИЙ.

4.1 Краун-соединения............................. стр. 75

4.2 Исследование противоопухолевых свойств производных актиноцина, содержащих краун-фрагменты, присоединенные к амидным группам хромофора на Са-755.. стр. 81

4.3 Исследование противоопухолевых свойств производных актиноцина с краун-фрагментами, отделенными от хромофора остатками аминокислот, на Са-755...... стр. 84

4.4 Исследование противоопухолевых свойств соединения

XLI на Р-388, В-16, LLC, РШМ-5............... стр. 87

ГЛАВА 5. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ СВОЙСТВ АМИДОВ КСАН-ТОНКАРБОНОВЫХ КИСЛОТ.

5.1 Кеантоны..................................... стр. 89

5.2 Исследование противоопухолевых свойств амидов ксан-тонкарбоновых кислот на Са-755............... стр. 92

5.3 Исследование противоопухолевых свойств амидов ксан-тонкарбоновых кислот на В-16, LLC, РШМ-5..... стр. 94

ГЛАВА 6. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ............ стр. 98

ВЫВОДЫ ................................................. стр.113

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ....................................... стр.115

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Наиболее активные из известных противоопухолевых веществ относятся к агентам, воздействующим на наследственный аппарат клетки - ДЕК. Среди них агенты, действие которых связано с нарушением матричной функции ДНК в результате блокирования различными комплекс ообразователями. К числу таких препаратов, нашедших практическое применение, принадлежит актиномицин 0.

В настоящее время актиномицин Б является одним из важных компонентов, используемых в комбинированной химиотерапии опухолевых заболеваний и входит в состав 15 комбинаций.

Механизм противоопухолевого действия обусловлен его воздействием на ДНК, с.которой он образует устойчивые обратимые комплексы, препятствующие продвижению ферментов вдоль ДНК-матрицы.

Существенным недостатком актиномицина Б является узкий диапазон терапевтических доз, что проявляется в довольно высокой токсичности препарата.

По этой причине во многих исследовательских центрах ведутся работы по синтезу аналогов актиномицина 0 с целью получить более эффективные соединения с улучшенными терапевтическими и фармакологическими свойствами [85,86,116,120,132,133,134,135].

Несмотря на многочисленные исследования, вопросы о связи структуры аналогов актиномицина Б с их противоопухолевой активностью и токсичностью остаются открытыми. До настоящего времени не удалось получить аналога, превосходящего актиномицин Б по своим свойствам.

Некоторые природные и синтетические биологически активные соединения, образующие комплексы с ДНК, содержат группировки, способ-

ные координировать катионы металлов. В настоящей работе предполагалось выяснить роль краун-группировки в составе комплексонов ДНК в противоопухолевой активности. До настоящей работы систематического исследования влияния краун-группировки в составе комплексона ДНК на взаимодействие с ДНК и биологическую активность не проводилось.

На кафедре органической химии Санкт-Петербургского государственного технологического института ССПбГТЮ ведутся оригинальные работы по направленному синтезу производных актиноцина ("аналогов актиномицина 0"), содержащих в качестве заместителей группировки различной природы: алкильные заместители, фрагменты аминокислот и их эфиров, диалкиламиноалкильные группы, фрагменты полиолов и краунсоединений, а также группировки антибиотиков дистамицинового и блеомицинового рядов, ответственные за взаимодействие с ДНК.

Исследование противоопухолевой активности этих групп веществ должно было выявить влияние той или иной группы заместителей, вводимых в состав актиноцина, на противоопухолевый эффект получаемых соединений. Анализ полученных данных о противоопухолевой активности этих соединений даст возможность использовать активные заместители при конструировании противоопухолевых препаратов на основе других хромофоров, способных к комплексообразованию с ДНК, например, ксантона. Изучение биологической активности 53 новых соединений составило предмет настоящего исследования.

Цель и задачи исследования.

Цель данного исследования - изучение зависимости противоопухолевой активности новых аналогов .актиномицина 0 от изменения структуры хромофора или пептидлактонных колец, как основы для создания новых противоопухолевых препаратов.

Для достижения вышеуказанной цели необходимо было решить

следующие задачи:

1) Выбрать модель для изучения противоопухолевой активности новых соединений - аналогов актиномицина 0.

2) Провести сравнительное изучение биологической активности 53 новых производных, в том числе:

- 9 производных актиноцина с простейшими радикалами

- 7 с полиолами

- 4 с алкильными и аралкильными радикалами

- 10 с катионоидными центрами

- 6 липидоинтеркаляторов

- 4 полифункциональных производных

- 6 с краун-фрагментами

- 7 производных ксантона с краун-фрагментами

3) Провести анализ полученных результатов с целью установления зависимости активности от структуры изучаемых соединений, их физико-химических свойств.

Научная новизна.

1. Впервые проведен анализ и установлена зависимость между структурой молекулы и противоопухолевой активностью производных актиномицина 0, представленных в данной работе.

2. Впервые выявлены производные актиноцина с противоопухолевой активностью, превышающей на некоторых экспериментальных опухолях противоопухолевую активность актиномицина 0, и со спектром действия, отличным от актиномицина Б: среди них липидоинтеркаля-торы, содержащие в амидных группах хиноидного и бензоидного ядер различные по природе заместители - алкильные радикалы различной протяженности, радикалы с катионоидными центрами, и производные актиноцина, содержащие в обеих амидных группах краун-фрагменты.

Научно-практическая значимость.

Полученные результаты могут быть использованы как основа для дизайна новых противоопухолевых препаратов с более высокой специфической активностью, меньшей токсичностью, иным спектром действия.

Представленные в диссертационной работе данные свидетельствуют о целесообразности дальнейшей разработки данного направления исследований.

ГЛАВА I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Противоопухолевое действие антибиотиков впервые было обнаружено С.Hackmann в 1952 году в опытах на животных с актиномицином С, выделенным S.Waksman и Н.Woodruff в 1940 году из культураль-ной жидкости лучистого грибка Streptomyces antibioticus [1423.

С этого момента начались направленные поиски противоопухолевых антибиотиков, которые к настоящему времени стали одними из наиболее активных средств химиотерапии рака.

К настоящему времени в клинике кроме актиномицина D используются более 10 антибиотиков - продуктов жизнедеятельности грибов, подавляющих синтез нуклеиновых кислот, действуя на уровне ДНК-матрицы. К ним относятся: антрациклиновые антибиотики (рубо-мицин, доксорубицин, карминомицин), антибиотики группы оливомици-на, образующие с ДНК комплексы, препятствующие продвижению ферментов вдоль ДНК-матрицы; брунеомицин и блеомицин, вызывающие одиночные разрывы ДНК; митомицин, образующий сшивки ДЕК, препятствующие ее репликации и др.

1.1 Аитиномицин D (дактиномицин, актиномицин Ci, АМД) - наиболее известный и широко используемый противоопухолевый антибиотик. Он является представителем большой группы хромопептидов, отличающихся составом пептидлактонных колец.

Большинство актиномицинов по химическому составу не являются однородными веществами, а представляют смеси близких между собой полипептидов. Все актиномицины распределяют на несколько типов ак-тиномициновых комплексов (A,B,C,D,E,F,Y,X,K и т.д.). Так, актиномицин С - антибиотический комплекс, содержащий в качестве одного из компонентов актиномицин D.

По своему строению актиномицины являются хромопептидами с феноксазоновой хромофорной группой, одинаковой у всех представителей этих веществ, которая представляет собой 2-амино-4,6-диме-тил-3-феноксазон-1,8-дикарбоновую кислоту, и двумя депсипептидны-ми цепями, аминокислотный состав которых может варьировать в известных пределах (рис.1).

В разных странах, в том числе и в России, вместо многокомпонентных актиномицинов, используется актиномицин D (дактиномицин), полученный S.Waksman в 1954 году, и наиболее однородный по своему составу.

В 1957 году A.W.Johnson и T.A.Vilok выяснили строение антибиотика. Его молекула состоит из хромофора (актиноцина) и двух пен-тапептидных лактонных колец, в состав которых входят аминокислоты: треонин, валин, пролин, саркозин и L-N-метилвалин [60].

-5

L-N-MeVal—I

4

Sar

1 - L-треонин

О 3

L-Pro О

2 - D-валин

D-Val

3 - L-пролин

1

L-Tre

4 - саркозин

€0

СО

5 - L-N-метилвалин

СН3

СН3

Рис Л Структура актиномицина D.

В ряде работ, посвященных отдельным представителям из группы актиномицинов, описаны результаты изучения их биологического действия на рост микроорганизмов, на ткани животных, большое внимание

уделялось изучению противоопухолевого действия в опытах на животных с экспериментальными опухолями и в клинике [4,5,65,66,96,1261.

1.2 Противоопухолевые свойства.

Дактиномицин обладает цитотоксическим действием, тормозит развитие различных опухолей у лабораторных животных, подавляет рост грамположительных и не действует на грамотрицательные бактерии, что объясняется малой проницаемостью их клеточной оболочки С4,663.

Большое внимание уделялось изучению противоопухолевого действия актиномицина D в опытах на животных с экспериментальными опухолями. Антибиотик оказывает сильное цитотоксическое действие на клетки мышиных опухолей С5]. В обзоре А.С.Бондарева дала ретроспективу экспериментальных исследований. Так, на аденокарциному молочной железы мыши Са-755 и меланому S-91 актиномицин D оказывает сильное противоопухолевое действие: торможение роста опухоли (ТРО) составляет 80-90%. На карциноме Эрлиха торможение роста опухоли достигает 50-100%, а на асцитной форме саркомы S-180 - от 50% до 100% [51. Значительно слабее эффект (ТРО 30%) проявлял антибиотик на солидной форме саркомы S-180 [96]. Не выявлено эффекта в отношении лейкоза L1210. На крысиной карциносаркоме Уокера выявлено тормозящее действие актиномицина D на процесс метастази-рования, с полным предотвращением метастазирования в отдельных случаях С5].

Первые клинические испытания актиномицина D были начаты S.Farber в 1956 году. Эффект наблюдался при опухолях Вилмса и раб-домиосаркоме [96,100]. Дактиномицин в клинике был эффективен в монотерапии также при хорионэпителиоме матки, вызывая регрессию опухоли и метастазов у 50% больных [48] и саркоме Юинга, с эффек-

том у 60% больных [98]. Ограниченное самостоятельное применение актиномицин D имеет при лимфогранулематозе и других лимфомах, хотя по некоторым данным объективный эффект можно получить у 40-50% больных [114].

В настоящее время антибиотик является одним из важных компонентов, используемых в комбинированной химиотерапии злокачественных опухолей (входит в состав 15 комбинаций). Так при рабдомио-саркомах детей актиномицин D в комбинации с винкристином, цикло-фосфаном и лучевой терапией вызывает полную регрессию продолжительностью до 5 лет у 60% больных с неоперабельными опухолями или отдаленными метастазами [52]. Эффективна комбинация актиномицина D с винкристином при ангиосаркоме Калоши и саркомах мягких тканей [98,114,144]. Применяют актиномицин D в комбинации с метотрекса-том при опухолях яичка смешанного строения [111]. При дисеемини-рованных меланомах объективный эффект достигается у 40% больных при одновременном использовании актиномицина D, винкристина и нитрозометилмочевины [45]. В предоперационной терапии опухолей Вилмса первой стадии вместо облучения в 50% случаев используют комбинацию винкристина с актиномицином D, что оказалось столь же эффективным, как лучевая терапия [109]. Эти токсические проявления при лечении актиномицином D дали импульс к поиску новых аналогов с меньшими побочными эффектами.

1.3 Фармакокинетика и метаболизм.

По экспериментальным данным дактиномицин через несколько минут после внутривенного введения исчезает из кровотока, в неизмененном виде выводится из оганизма желчью (50%) и мочой (10%). Препарат накапливается в печени, в почках, селезенке и слюнных железах, в незначительных количествах проникает в семенники и го-

ловной мозг [681. При лечении актиномицином D проявляются побочные эффекты препарата на организм в виде желудочно-кишечных расстройств: наблюдаются тошнота и рвота (до 40% больных), боли в животе и диарея (до 30% больных). Угнетение кроветворения проявляется лейкопенией (у 15% больных), тромбоцитопенией (у 8-15% больных), а также анемией. Дерматологические осложнения наблюдаются в виде обратимой алопеции (у 5-8% больных), а также эритемы и гиперпигментации кожи, часто появляющейся на участках ранее облученной кожи. Токсические проявления полностью исчезают в течение 3 недель после окончания лечения [521.

По некоторым данным актиномицин D значительно усиливает токсичность лучевого воздействия на нервную ткань с возникновением постлучевых миелитов после комбинированного применения антибиотика и лучевой терапии [113]. Эти токсические проявления при лечении актиномицином D дали импульс к поиску новых аналогов с меньшими побочными эффектами.

1.4 Механизм действия.

Зависимость противоопухолевого действия актиномицина D от способности образовывать комплекс с ДНК потребовала подробного изучения структуры этого комплекса.

Этому вопросу посвящены десятки публикаций. Было предложено несколько моделей комплекса дактиномицина с ДНК.

В одной из первых работ в 1963 году L.Hamilton с соавторами было предположено, что молекула актиномицина D располагается в малой бороздке ДНК, таким образом, что в связывании участвуют и хромофор и пептидные кольца антибиотика. При этом молекула актиномицина должна заполнять малую бороздку ДНК на расстоянии, соответствующем примерно трем парам оснований [103]. В 1968 году

W.Muíler и D.Crothers была предложена другая модель, в которой плоский хромофор актиномидина интеркалирован между соседними парами оснований ДНК [1163.

В 1969 году Г.В Гурский предложил модель, в которой хромофор и пептидные кольца молекулы дактиномицина располагаются в малой бороздке ДНК, а раскручивание спирали определяется действием пептидных колец. При этом один пептидлактон укладывается в бороздку, а другой входит в нее при раскручивании спирали [68].

И, наконец, последняя модель, принадлежащая H.M.Sobell с соавторами: хромофор антибиотика интеркалирует между двумя парами оснований ГГ ДНК. Комплекс образуется за счет межплоскостных взаимодействий с остатками гуанина по обеим сторонам хромофора, 2-аминогр