Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Пути преодоления множественной лекарственной резистентности к доксорубицину с помощью биологических модификаторов

российская академия медицинских наук

онкологическии научный центр

( '( и С Л На правах пукописи

УДК 61й-006-085:б15.37

Боровкова Наталья Борисовна

ПУТИ ПРЕОДОЛЕНИЯ МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ К ДОКСОРУБИПИНУ с помощью БИОЛОГИЧЕСКИХ МОДИФИКАТОРОВ ( 14.00.14 - Онкология >

Автореферат диссертации яа соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель д.м.н. А.А.Шшенов

Москва - 1993

Работа выполнена в Онкологическом научном центре Российской академии медицинских наук

Научный руководитель

доктор медицинских наук А.А.Пименов

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Г,К.Герасимова

доктор медицинских наук М.М.Вядро

• Ведущее учреждение - Научно-исследовательский институт иммунологии Ш РФ

Завита диссе тации состоится " // " 1993 г.

в " /6 " часов на заседании Специализированного совета К.001.17.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук при Онкологическом научном центре РАМ ( Москва, 115478, Каширское шоссе, 24 )

Автореферат разослан " /Г " 1993 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Онкологического научного центра РАМН

Уч 1Ый секретарь Специализированного совета доктор медицинских наук

профессор В,С.Турусов

- 3 -

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕШ

Химиотерапия является одним из основных методов лечения онкологических больных, не только дополняющим традиционные хирургические и лучевые методы, ко и имеющим важное самост отельное значение.

Одной из причин неэффективности химиотерапии считают, развитие устойчивости опухолевых клеток к цитостатикам. Приобретение лекарственной устойчивости опухолевыми клетками снижает эффективность химиотерапии многих злокачественных новообразований человека и поэтому представляет серьезную проблеыу для клинической онкологии. Резистентность опухолевых клеток к действию цитостатиков макет обеспечиваться различными механизмами: инактивацией токсического соединения, модификацией репарации ДНК, изменениями ре-цепторных белков - мишеней или изменением количества препарата, проникающего в клетку.

Часто в результате применения какого - либо одного антрацик-лдаового антибиотика опухолевые клетки становятся резистентными к широкому кругу природных и синтетических противоопухолевых антибиотиков, не имевши сходства в структуре и различающихся по механизму действия. Этот феномен назван множественной лекарственной устойчивостью С ШУ ). Характерными особенностями опухолевых кле1 ток с. МЛУ являются амплификация т. юв семейства mdr, гиперзкс-ярессия их продукта - высокомолекулярного трансмембранного гли-копротеина (Р-гл), который, предположительно, осуществляет эффективный выброс цитостатиков из клеток и возможность отмены резистентности этих клеток к цитостатикам с помощью блокаторов кальциевых каналов ( финоптии - верапашл) шш ингибиторов кальмодулина (Beck, 1987; Pastan and Gottesman, 1988).

В настоящее время выявлено.большое'количество различных препаратов и соединений , блокирующих выброс цитостатика из клетга In vitro (Hamada and Tsuruo, " 1986; Safa et al., 1987). Изучение физико-химических свойств этих модификаторов позволило обнаружить сходство в структуре молекул (Zamora et al., 1988; Pears et al., .1989). Многие из них применяются в клинике как лекарственные средства с различными механизмами действия и могут использоваться как модификаторы МЛУ. ■ - -.

Представляется ос 'енно интересным комбинированное применение этих модификаторов с ци:. статкком для изучения их мияния на р<-зистентные опухолевые клетки в системе In vivo с целью повышения

эффективности химиотерапии злокачественных новообразований.

Поскольку в современной онкологической практике используется полихимиотерапия, применение модификаторов для преодоления устойчивости клеток к одним цитостатикаы может оказать влияние на метаболизм других комбинатов, изменяя эффективность лечения. Изучение влияния применяемых модификаторов МШУ на фармакологическое действие используемых для лечения цитостатиков необходимо для разработки новых схем комбинированной химиотерапии, позволявши преодолевать резистентность опухолетш клеток.

. Воздействие иммунных реакций на »слетки с фенотипом МЯУ практически не изучено. Не. ясно, связана дм гилерэкспрессиа Р-гликол-ротеина в опухолевых .клетках с изменением их ишуногенности и чувствительности к эффекторкым иыыунокомпетентным клеткам.

ЦЕЛИ й ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Основной цель» настоящего исследования является оценка эффективности применения биологических модификаторов для повыуйния эффективности лечения опухолевых клеток с фенотипом ШУ, а таете оценка влияния финоятина на метаболизм противоопухолевых препаратов, используемых а схемах подихиыиотерашш.

- в соответствии с этим были поставлены следующие вадя"Ч:

1. Получить шташ опухолевых клеток Р-388 с индуцированной устойчивостью к доксорубицину и определить характер этой устойчивости.

2. Определить ln vivo возможность преодоления ревистеитности в доксоруби'пшу с помощью трифтаэииа, галидора, ноаокаинашща и финоптина.

3. Изучить влияние финоптина на фармакологическое действие цик-лофосфана в системе in vivo.

4. Иссле-овать действие иммунных реакций на клетки с фенотипам МЛУ.

5. Сравнить лечебный эффект комбинации иьшуноиодуляторов - липо-полисахарида я мураьшдипептада иа чувствительный и резистентный к доксорубицину лейкоз Р-388.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

С использованием полученного авторы штамма Р388/ДКС, полностью соответствующего классическому типу МЛУ, проанадиаиг вала возможность использования таких известных официальных препаратов

- Б -

как трифтазин, галидор с цель» снижения резистентности к доксору-бишну in vivo. По нашим данным их применение в качестве модификаторов МЛУ in vivo не целесообразно, так как они не увеличивают лечебного действия доксорубшшна (ДКС) и не имеют реимуцеств по сравнению г -финоптином (И).

Впервые показана возможность индукции устойчивости опухолей к комбинированному применению ДКС и ФП, так как введение животным Ш для преодоления устойчивости опухоли к ДКС в течение достаточно короткого времени (б пассажей) приводило к отбору опухолевых клеток, устойчивых к комбинации ФП+ДКС. Это необходимо учитывать, назначая применение ФП для преодоления МЛУ при повторных длительных курсах химиотерапии.

Представляется важным, что применение финоптина в сочетании с цммофосфанои приводит к изменению метаболизма цитостатика и сопровождается увеличением его токсичности, что необходимо учитывать при назначении курсов полихимиотерапии в клинике.

Впервые получены экспериментальные данные о равнозффективном торможении роста клеток чувствительного и резистентного к ДКС штамма лейкоза Р388 при сочегаяном применении ДКС и иммуномодуля-торов - липополисахарида (ЛПС) и мурамилдипептида (МШ) in vivo. Основываясь на Различиях механизмов и возможности синергического действия идауномодуляторов и цитос атиков следует шире использовать иммунохимиотерапевтические подходы в клинической практике.

АПРОБАЦИЯ ДИССЕРТАЦИЯ.

Д!йсертация апробирована на совместной научной конференции лаборатории биологических модификаторов противоопухолевого иммунитета, лаборатории изучения новых противоопухолевых лекарств, ■ лаборатория меточного метаболизма, лаборатории экспериментальных моделей опухолей, лаборатории по созданию нетоксичных иммуномоду-ляторов и лаборатории противоопухолевого иммунитета ОНИ РАМН 2 шля 1993 года.

Материалы осэрташи были представлены: на заседании Проблемной катсслт "Лекарственные методы лечения злокачественных опухолей", Москва, 1990; на 11 конференции европейской ассоциации раковых исследований, Генуя, 1991.

- в -

СТРУКТУРА И ШЬЕМ ДИССЕРТАЦИИ.

Диссертация изложена на /Jó" страницах машинописного текста и состоит чз хведения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований (4 главы), обсуждения и выводов, иллюстрирована 1(> рисунками и $ таблицами. Список литературы включает«//^ работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. ИССЛЕДОВАНИЯ.

ЗКивот-ые. В работе использованы .мыши чнбредных линий, а также их гибриды, получение из питомника "СтодОовая" РАМН и из разведения ОЩ РАМН.

Опухоли. Лейкозы La и P3S8 были получены из банка опухолевых штаммов РНЦ РАМН; Р388/ДКС (с индуцированной устойчивость») к ДКС) и Р388/Ш+ДКС (с индуцированной устойчивостью к комбинации (ФП+ДКС) получены нами в результате лекарственной селекции in vivo клеток исходного штамма Р388. Исходный штамм лшфолейкоза L1210 ■ и его сублиния с фенотипом ШУ любезно представлены проф. М.Фодьмом (Немецки? Раковый Центр, Гейдедьберг, С-РГ). Опухоли поддерживались регулярными пассажами на «швах соответствуем линий.

Моноклонадьиые антитела, реактивы и лекарственные "оедства. Моноклонадьныэ антитела к дифференцировочным антигенам лимфоцитов мыши приобретены у фирм Serotec» Becton Dickinson, Cederlmo. Противоопухолевые препараты: винкристин (Гедеон Рихтер, Венгрия), доксорубицин, рубомишн, актиношщин D, циклофосфан, а также другие препараты: финоптин ("Orion" Финляндия), гадидор (Гедеон Рихтер, Веырия), трифтазвд, новокаинаад являются официальными препаратами. Хроматографу* "»ски чистый IKC был любезно пред оставлен ю.В.Дудником ( .Институт по изысканию новых антибиотиков ). Реактивы: тритон X-10Q ("Serva", ФРГ), флюоресцентный краситель ХЕХСТ-33258 ("Serva"), дипоподасахарид Е.соН (иташ 055 "Dlfco", США), ыурамилдипептид ("Sigma", ОСА). Препараты вводили в физиологическом растворе внухрибрюшшно или подкожно в догах и режимах, указанных при описании результатов.

Основные биохимические и спектральные методы.

Уровни накопления ДКС определяли спектрофяюоршетрически по методу Bachur et al. (1970) на флюоресцентном спектрофотометре Hitachi М - 850 в стандартной кювете, Спектральная ширина челей составляла Юнм. Концентрацию антибиотика определяли при ех-4?0нм

и em-БеОнм. Измерение интенсивности Флюоресценции красителя Хехст 33258 проводили при ех-347нм и егп-454нм.

Содержание метаболитов цнклофосфана (Ш>) определяли в плазме крови мышей по методам Alberts (1976) и Alarcone (1.58).

Для опр деления экспрессии Р-гп плазматические мебраны клеток лейкоза выделяли в градиенте концентраций перкола. Выделение Р-гп из плазматических мембран проводили по методу, описанному для выделения Р-гп из клеток яичника китайского хомячка (Riordan and Ling, 1979), с последующим концентрированием s-D-галактоэосодер-дащих гликопротеидных фракций удьтрафильтрацией. Анализ фракций Р-гп проводили методом ВЗЖХ (Msnabe et al., 1987) на предварительно откалиброванной белками по молекулярное весу гель-фильтрационной колонке TSK-G-3000-5W ( фирма 1KB ). Работа' выполнена совместно с сотрудниками Научного центра молекулярной диагностики Ш РФ В.А.Сухановым и В.Л.Дьяковыы.

Уровень лекарственной резистентности клеток лейкоза Р388/ДКС и Р388/ФП+ДКС к ДКС определяли по степени тормодения препаратом гпизочения эН-уридина.

Основные иммунологические методики.

Для получения in vivo цитотоксических Т лимфоцитов (ЦТЛ), спешфшшх к а- ■'игенач гистосовмгстимости, мышей однократно иммунизировали внутрибрюшинной инъекцией 2х107 меток алдогенной опухоли. Клетки смезЭнки тестировали через 10-12 дней на цито-токсическуга активность. Их цитотоксическую активность определяли стандартным методом по высвобоздеиио из убитых клеток-мишеней нзотопй 51Сг (Brunner et al., 1976) или 3Н-уридина (В.Б.Фукс и ДР.> 1SB1).

Экспрессию ыэмбранкнх марк&ров на мшдаых' лимфоцитах определяли шл!уиофапооресце!1кш методом с помощью монокяоналышх антител к Thy-1. Lyt-1 шш lyt-2 детерминанта и проточного цитометра FACSCAíl фирмы Becton Dickinson, США. Разделение клети? осуществляли на прибора MACS (Becton Dickinson, ФРГ) в магнитном поле с ломоеью специальных железосодержащих бштишшфоваиных частиц (S. Miltenyi, 1290).

Реакцию распознавания исходных опухолг чх клеток и с фенотипом ШУ лш£оцитамй нормальных мышей оценивали в смешанной лимфо-цт dpHO-опухолевой iíy—зуро (MLTC) in vitrcr по клеточной пролиферации (включению в клетф! 3Н-тш.шдина) и образован*; ЦТЛ. Стад лирущие опухолевые клетки предварительно обрабатывались митоми-

цииш С (100 мкг\ыл).

Химиоте рапе в г ическне ме тоди,

Опухолевые штаьшы прививались скнгешшм «швотиш подкогшо или в Орвдиуе полость в дозе Бх105-10б клеток. Терапкэ начинали на разиы» сроки после прививки. Действие исследуемых препаратов оценивали по следухдао) критериям: тормоши» роста опухоли, увеличена» продолжительности кизна или гибели животных, проценту их пеш-иого ивлечения. Токсичность коыбинашй оценивали по ршшей гибели йивотнш .

Статистически обработка результатов. Рассчот ошбки показателя средней, лосговериости разницы мелду значениями, коэффициента корро/дади и ошибки коэффициента корреляции проводили с кс-польво&аниеи соотетстгукхпих кешьотерния прогрша.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ШХЯЕДОРАЫЙ.

1. Характеристика типа устойчивости клеток лейкоза РЗЯ-З/ДКС к доксорубмшну.

Клетки лейкоза ЬЗйЗ. устойчивые к доксоруОишшу (РЗ&8/ДКС), били получены селекцией на »четок «сходного лойкоза Р-388, принятого швам EDF1, на фон© ид леченал ыааыми доааии антс^лотикд. Полученный ¡атака проявил перекресту» устойчивость к тшь^ препаратам нак йкгшгомицин D, шшкрнстш» рубоупшш, пришжйылзхся в терапевтических дозах - Биг/кг, £,5щ*/кг и 7ш'/кг состчетствеи-но.что свидетельствует в пользу индукцш МЛУ.

Устойчивость опухоли к Tt»ратин оценивали по обаопршштоиу показателю, ..арактчризуюаецу увеличение продсшщталыюсти кивни леченых швей по сраьненио " нелечекши (У®). У шаей с пртаетш лейкозом РЗ&8/Дк5"Т51Гге8Ь .¡ри лечения шетиноиниинш D. вш:крш-тнноа илу рубошщшш он соогсетсгешго составлял 16GX и 16S, 110Х и 02, '¿261 и 302.

Количество Р-гп, содераааогоса в агазиатич&сгагх меибршах. выделенных иа клеток дейко&а P-3S3 и РЗ&8/ДКС, шшиаиро&авм с помощь» электрофореза, Ддя клеше Р-ЗЭД »солич&сию белка, определяемое в фракциях Р-гп, составляло 0 - 0,045 иг/10° кле-ток, а да клеток Р388/ДКС - 0,51 - 0,68 иг/109 клеток, ч.з. соде&*ачио ш-сокь...алекулярного Р-гп в резистентных клетках PGSS/ДКС Caso бале» чем на порядок выше по сравнение с чувствительными клетками 383.

Возможность ингибировання транспорта ДКС иа клеток под ьлия-нием блокагоров кальциевых каналов (финоптин) или ингибиторов

На осиовагти подученных данных модно сказать, что Ш вызывает преодоление устойчивости и в ншгой экспериментальной система lri vivo. Игюбходкио отметить, что впадение ОТ не вызывай! идмпичшя фаршкогашенгаш ДКС и преодоление устойчивости по-вндныому, обусловлено плняннен модификатора на нарушение, выведения цитоста-тса из клеток с индуцированной устойчивостью.

В связи с теа, что ОТ обладает нежелательным побочный действием (кардиотошшостыз) нас заинтересовали другие препараты, проявившие себя как иодйфшсаторы МЛУ в системе In vitro, и приме-вшзиеся в клинике icait лекарственные средства по другим показаниям. Для сьоих исследований ыы отобрали такие препараты как гали-дор (спазмолитик), повокаияшид (сердечно-сосудистое средстЕо) и грМтавин (нейролептическое средство). Нами были проведены исследования с целью подбора дозы и режима их комбинированного применения с ДКС. Приязненна галидора (ГЛ) в режиме однократного введения в доэо 150ыг/кг пэ давало эффекта. Более высокие дозы вызывали выраженную токсичность п гибель мышей. Двукратное введение ГЛ й дозе БСиг/кг Taitse не вызывало повышения противоопухолевого действия ДКС и не обладало преимущества»*» по сравнению с ОТ. Аналогичные результат были получены при применении трифтазина однократно в дозе '.5i.iT/icr и 15мг/кг. Применить двукратный редш введения этого модификатора не \ алось из-за проявления острой токсичности.

Так как Щ применяется для преодоления 1Ш у' экспериментальных животных и у Сольных в кшшке; целью нашего исследования явилось изучение возможности индукции устойчивости к комбинации ФЛ+ДКС в резистентных-к ДКС опухолевых клетках лейкоза Р388/ДКС. Был проведен сравнительный анализ влияния ФП на накопление ДКС в клетках чувствительного к антибиотику лейкоза Р-388, устойчивого к ДКС лейкоза Р388/ДКС и полученного нами птамма Р388/ФП+ДКС с индуцированной устойчивостью к комбинации Ш+ДКС.

■ Клетки лейкоза Р533/ФП+ДКС были получены из штамма Р388/ДКС •селекцией (weTc,w устойчивых к комбинации ФП.н ДКС. Для развития устойчивости клеток потребовалось 6 пассажей.

На.рис. 2 представлены данные по изучению влияния ДКС в раз-личиых концентрациях на включение эН-уридина в клетки лейкоза P-.j8.P388/ДКС и P3S 'ФП+ДКС. Отмечается увеличение среднетскси-чёской дозы при обработк. клеток в культуре (IC50) ' 0,9 мкг/ i для чувствительных клеток (кривая!) до 5,3 мкг/мл (клетки лейкоза

120

100

Рис.2. Влияние ДКС на вг-ючеиие 3Н-урядила в клетки дейлоза РЗЗЗ, Р388/ДКС И РЗЗа/ФП+ДКС. По оси абсцисс - концентрация ДКС (ига /ив); • по оси ординат - включение 3Н-урцднш в каьткн по тисеошэ п контролп з X.

1 - 2 • Р388/ДКС; 3 - Р38В/«ЬДКС.

Р388/ЛКС, кривая 2) и 1,6 икг/цд для клеток лейкоза Р38й/0ШДКС (кривая 3). Такое ивменение 1Сьо соответствует вестнкратаоау увеличению уровня резистентности клеток дейкоаа РоШДКС и дгукрат-ншу увеличению уровня резистентности клеток лейкоаа Ро£8У»П*ЛКС по сравнении с чувствительными клетками л ¿-ниша Р-Зй8.

Сравнительная оценка лечебного д»йсиш ДКС а коибииадам ФП+ДКС у мысей о лейноаш Р-388. Р388/ДКС и КзШ/СШДКС лродсгаа-лена в таблице 2. Введение И1 увеличило лечебное действии ДКС у иышеь ^ лейкозом Р-388. Средняя продолдительиость яиэни дивотиш, леченных комбинацией СЛ+ДКС, была вше, ' чем у мшей леч< их только ДКС. Кроме того, в группе дивотных, получаааих ФП+ДКС, наблюдали 7ОХ иалечение. Введение ДКС не оказало лечебного дейс-

Таблица 2. Оценка лечебного действия ДКС и комбинации И1*ДКС у мывей с лейкозам Р-388 чувствительного к 1КС, с инлу _цированной устойчивостью к ДКС и к комбинации ДЦ'ДКС

I

IГруппа

IР-388 1Р-388 1Р-383 |рз8в/дкс

1Р388/ЛКС

1РЗ&8/ЛКС

1Р388/5П«-ДКС

1Р383ЛШДКС

|Р380/СТ1»ЛКС

Схема лечения"

ЛКС «I + ДКС

ЛКС

+ пкс яке

СП + ЛКС

Средняя продолжительность жизни погибших животных ( М + ш )

10,0 мл п

и, /

26,7 11,3 11.3

13.0 10,0

10.1 10.1

1 О.с ♦ 1.2 £ 2,0 ♦ 0.1 £ 0.2 £ 0.5 1 0,0 £ 0,1 + 0,1

<0,001 <0,001

<0,05

Количество вылеченных тавотных X

о о

70 О О О О О

о

- ДКС вводили в дозе 4 мг/кг; ОТ вводили за 15 мин и через 2 часа после вводешм ЛКС в дозе 30 мг/кг.

твия у югаей с ..Лкозси Р338/ДКС и 188/-1П+ЛКС. Средняя продолжительность жиг? на мысей в этих группах была такой же, как в контроле. Введение СП способствовало проявлению лечебного действия ДКС у мышей с лейкозом Р388/ДКС, достоверно увеличивая средня» продолжительность жизни животных, леченных комбинацией ФП+ДКО, по сравнений с животными, леченными только ДКС. В то же время, применение комбинации ОТ+ДКС было неэффективным у мышей с лейкозом РоСЗ/5П«ДКС. Средняя продолжительность жизни в группе животных, .леченних <Ш+ДКС была такая же, как у нелеченных мышей.

Результаты влияния ФП на накопление и выведение ДКС в клетках лейкоза Р-388, Р338/ДКС и Р388/ОТ+ДКС представлены на рис.3. ОТ в дозе ЗОмг/кг I. дили за 1Б мин и через 2 часа после введения ДКС (15 мг/кг). Введение ОТ не изменяло концентрацию ДКС в клетках лейкоза Р-388 (рис.ЗА). Концентрация ДКС в опухолевых клетках мы-пей, получавши. СП*-ДКС и только ДКС через -час после введения анти" .отика была пракг и*ски одинаковой и составила 115-118' нг/106 клеток. Зарегистрирован й уровень ДКС в обеих группах живота-' сохранялся в течение 6 часов наблюдения.

- и -

Рис.3. Вмшнио фиаоптииа на ншшоние ДКС в каетках.лэйшгй Р-388 (А), РЗВ8/4Л+ЕКС (Б) U РЗШ/ДКС (В). По оси абсцисс - вреиа после введения ДКС ( в чао) ; по оси ординат - концентрация ДКС (иг/10® клеток).

Введение <Ш вызвало достоверное увеличение концентрации антибиотика в клетках лейкоза Р388/ДКС в течение 5 часов наблюдения (рис.ЗВ). Так, черев 1 час после введения ДКС концентрация антибиотика в опухолевых клетках швей, получаыгих ФП*ДКС, составила 101 яг/106 клеток, а в группе животных, полулавших только ДКС всего 86 нг/к?А клеток. Увеличение накопления ДКС в группе животных, получавших 5П*ЛКС через 3 часа после введен», антибиотика вызвано повторном введением ОТ. Через Ь ч; . .а&тодеиия концентрация ДКО в обеих группах животных Снда практически одинаковой и составила пряшрко 26 к г/10® клеток.

ОТ не влияет на накопление и выведение ДКС в клетглх лейкоза РЗ£0/СП*ДКС (ряс.28). Та!?, через 1 час после введения ДКС, концентрация антибиотика в группах животных, получавши ОТ* ДКС и только ЛКС, била одинаковой н составила пршерио 76 нг/Юс клеток. Чореэ 0 часов найдзодения концентрация ДКС в обеда группах снизилась до 30-40 нг/Ю® меток.

Тагам образом, применение ОТ для преололения устойчивости опухалей к ДКС а течение б пассаа&й приводит к отбору га о ток. устойчивые к коыбицни 51МКС. Это, по наяему ыненши, следует учитывать при назначении повторных курсов ОТ для преодоления явления 1Ш а клинике.

3. Влияние фшюптииа на фармакологическое действие циклофссфана.

Известно, что Ллэклтсры кальциевых каналов активно ы^таболи-Шфуэтсд а печени, подвергаясь там 0- и й-деиетилированиг >-ч ци-техршэ Р-450 ключевом ферменте метаболизма мне. лх цитостатиков (Маапраа «I а]., ШЭ). Поскольку в современной онкологической практике используется поднхимиотерапка, применение блокат .оъ .¿яышевах каналов для преодоления устойчивости клеток к одним цнтостатикаа ыоаы окаг. ть влияние на метаболизм других противоо-

/хояешх препаратов. Иоленяв эффективность лечения. По этпричине ка изучали влияние ОТ на изменение токсического и терапевтического действия ОФ. часто используемого в схемах конь,тированной »чииитератш.

Ш, применявшийся в дозе 20 иг/кг га 15 мин до введения ЦФ, увеличивал токсическое дейе вие ЦФ, вы^вая гибель ЗОХ дивотных. получнваих .Э в дозе 300 мг/кг, тогда как один цитостатмк в этой дозе не вызывал гибели животных. При введении ЦФ в дозе 350 мг/кг на фоне модификатора отмечалась гибель 40Х жи- тных против юх в

контроле. Количество павян* «швотных при введении одного Дф в дозе 400 «г/кг составляло 601, а щи введении комбинации препаратов 30Z. Таким образом, LDso для одного цикаофссфана в наших экспериментах составляло 388.0 i 13.9 мг/кг. а при комбинации ПФ*«П LDgo цит'х-татика достоверно уменьвалась во 342.8 * 16,В мг/кг (п-90).

Было изучено влияние <М на лечебное действие ЦФ (таблица 3). Показано,что <И1 достоверно увеличивает среди») продолжительность киени животных, получивших цитостатик в дозах 100 ми 200 ыг/кг в комбинация с модификатором. При этом УШ животных, позучявсих в дозе 100 мг/кг, составило 196*. тогда как на фояе модификатора отмечалось возрастание этого показателя до 22ЬХ, что несколько выше УПЕ животных, получивших один ДФ в доза 200 мг/кг. СП вызывал уменьшение УПЖ и количество излеченных кивотиых при применении с Цф в догах ..д» 300 мг/кг. УПЕ уменьшалось с 2В0Х до 33% при введении Щ> на фоне модификатора соответственно в дозах '"Ю и 400 мг/кг. Это объясняется увеличением токсичности ПФ в комбинации с ФП. Изменение фармакологического действия ЦФ можно обьяс-лить влиянием ФП на метаболизм ПФ на шпгохроые P-45Q.

Таблица 3. Влияние фииоптина на лечебное действие щшсфосфана у мышей с лейкозом la.

1 Доза ЦФ Модификатор ¡Средняя продешште- УШ IКоличеству!

) мг/кг |льностъ жизни павшх к (нглечешш!

1 • 1 животных в днях, контролю i животных, 1

1 (М + П1) X 1 г___!

'Контроль I 8,3 + 0,2 1 о I

1 - ФП 1 8,Б + 0,2 г I о í

1 100 - I £4,6 + 1,1 195 i о I

1 100 ш | 27.0 + 0,9 225 1 10 |

1 200 - I 25,2 > 3,3 £04 i о |

1 too 2D I 31,Б +• 3,Ь 280 1 60 |

1 300 - | 16,7 + 2,7 101 1 ВО |

! 300 <Н1 1 13,8 4.3,1 ' es 1 30 1

1 350 - | 10,6 + 2,4 28 1 0 1

1 50 ш 1 4,4 + 0,5 -47 Г 0 {

1 400 - I 10,0 + 2,4 20 1 о i

1 400 вя'- | 5,6 ♦ 0,9 -33 1 0 {

Наш проводилась регистрация спектров связывания цитсхрома P-45Ö с «П. Проведенный анализ указывает на то, что и ПФ И «П могут являться субстратами шпохрсма Р-450.

Исследовалась 1*ариакокюшткка peaKTitBHoro метаболита Ш> (MBF) у мызей, получ»>тих один цитостатьк в дозе 200 мг/кг иди в комби-папин с ФП »-О мг/кг ва 16 иян до Цф и чер&8 IX) мин после его введения). Применение модификатора называет с виг м.1кснмуыа ган-цеитрадии НБР с 10-ft на 30-» минуту. При атом максимальная концентрация реактивных ыетаболитов а плазме крови мшей, получавиих модификатор, возрастает почти в 2 раза. Аналогично изменялась и iармдкокинытика другого метаболита ЦФ - акролеин* (возрастали^ штенгряции в плагм« крови со 180 до 240 мкЫ). NBP опосредует дечебнсиз и токсическое действие цитостатика, тогда как акролеин только токсическое.

4. Анализ взаимодействия In vitro еубпопуляций »аа*унскемпе-TcHTiiux клеток и опухала с 4»нотипом Ш!У.

Известно, что боилшиютву опухолей свойственна супроссороген-нал и кымуносупрессоркая активность. Сказывает ли влияние на эти свойства опухолевых клеток гиперокспр«зссия р-гликопротеина и другие изменения. связанные с этим процессом, не известно. Дил поис-jía ответов на иоставленные попро... были использованы следующие и$толнческя0 подходы: оценка прс\лйч.*ративной активности и способности лимфоцитов к дифКренцировке в Т-киллеры (ПШ в сингекной а ахгогбниой сказанной к. ьтуре (MLTC) в ответ на чувствите—жый з резистентный л ДКС опухолевый птамы, а также сравнение чувствительности этих клеток к цитотоксическоау действии ЦТЛ.

Сннгохше jmrjciurm селезенки китакткых животных отвечают \zb iu-болызой пролиферативной реакцией в первые 24-48 часов посла контакта с предоброе. = .иными митоывдииом С опухолевыми ¡слетка-ь... исходного нтаыма Ро8в. что вполне соответствует литера, /рным данкнм, 0ацсывас"ц!м динамику пролиферативной активнее i лимфоцитов в 1.1ТС. В тех se условиях клетка езташа Р388/ДКС. иыеоднх фв-V. m ИДУ, шзшцш! в 3,9 роз более высокую реакцию, чем исходный агама. Другой, независимо подученный втй- • Р338/ДКС (любезно предоставлен i 4.8. Ы.Ы.Вядро,. облапеюадай более высокой резистентностью к ДК1, in vivo, сти лировал пролиферацию лимфоцитов еще в 1,6 раз больве. На более поздних сроках культивирования клеток (72-96 часов) пролиферация лимфоцитов на опухолевые штаммм сняла-

лась до контрольных значен» в монокультуре лимфоцитов. Именно в этот период отмечался лик проялферативной активности Л1шфоютов ö ответ на алдогеикые тралсплантааионныв антш'еиы, веди в качество стимуляторов были использованы обработанные ынтсыицином С клешз селевенкн мышей, отличашихся по антигенам кшплекса Н-2. Пролиферация на адлоантигекы в ULTC была существенно снижена. если в качестве стимуляторов были использованы клетки любого из штвгеюв лейкоза Р388. Как известно, исходный штеш опухеш! Р383 представляет собой миелиюнсцитарныЛ лейкоз. Чтобы искяочить вероятность влияния на полученные ревультаты индивидуальных особенностей выбранного штамма были проведены аналогичные эксперименты с использованием исходного и экспрессирукщегэ Р-гликопротеин етш&а В-лиыфэцитарного лейкоза L-ШО. Штама L-1210/ДКС гакаа вызывал повыаенну» пролив рацию лимфоцитов в IÍLTC на ранних сроках культивирования. Лимфоциты. активно продиферирушне в сишенио». (LTC при реакции на клетки с фенотипом ШУ, либо несут на своей шиб-ране Lyt маркеры, либо для проявления пролиферативной шш©-ности требуют обязательного присутствия в культуре клеток с rem Фенотипом. Об этом сведете, ствует тот факт, что прэдварэтельноэ удаление из суспензии лимфоцитов клеток с одновременной экспрессией этих маркеров приводило к отмене пролиферативной реакция оставшихся лимфоцитов в ответ на ДКС-резистентный сташ.

Нам не удалось обнаружить спухольспешфических ЦТЛ в синтея-ной MLTC в ответ на любой иэ исследованных штаммов лейкоза P3SQ в ех случаях, -когда опухолевые кяатки-шшеня в цитотокснчесноа тесте метили изотопом 51Сг. Применение для оценки цнтотоксической . мембранотокстеской рея-ши более чувствительной методики о предварительной меткой клеток-ышшией ^Н-уршшном выявило бшео у, 5кое образование вторичных Т-киллеров в сдучаа, когда в качеот-стимудируадга клеток в KCLTC испояьвовааи штамм Р388/ДКС,

Низкая пролиферативная активное? и неспособное, образовывать высокоактивные Т-кидлеры антщ'енспецифическиыи Т-клетками памяти може^ свидетельствовать о высокой супрессорогенаой и/иди . иммуногупрессивной активности как исходного (чувствительного) штамма P3SS, так и лпрессиру} вгоР-гликопротенн РЗВ8/ДКС.

В научно, литературе последних а»гт представлены данные об одинаковой чувствительности к цитотоксическому действия натуральных и лиуфокинактивированных киллеров у некоторых исходных опухолевых штаммов и клеток <■ индуцированной ЫЛУ. Нам представлялось

особенно важным выяснить чувствительность исслел< аиных в наяей работе штаммов к датотоксическоыу действию антигенспецифнческих Т-киллеров, поскольку в последнее время именно с этими клетками свяэывевтся наибольшие надежды при разработке новых методов клеточной адоптивной иммунотерапии опухолей. Для ответа на этот вопрос были псшуч "ы алдогенные Т-киллеры m vivo на 10 день после иммунизации ышей линии СВА 107 живыми клетками лейкоза Р388 несущего антигены гистосовместимости, отличали'- гя по всему комплексу Н-2 В качестве клеток-мишеней в 4 часовом цитотоксическом тесте использовали меченые изотопом 51Сг клетки Р388 или Р383/ДКС. Оба штамма оказались чувствительными к цитотоксическому действия Т-киллеров ( цитотоксические индексы при соотношении зф-фектор-мишень 100:1 для указанных выше штаммов соответственно 44*6,БХ И 39+4,7%).

5. Исследование чувствительности опухолевого штшиа Р388/ДКС с фенотипом )Ш к комбинированной иммунохимиотерапии ln vivo.

На основании данных о ярко выраженном противоопухолевом и им-цуностимулирущеы действии (усиление тушрицвдности макрофагов, аатуральнш и Г-киллеров) липополисахарида (ЛПС), ыурамилдипепти-да (ВДП) и ДКС нам представлялось целесообразна исследовать терапевтический эффект их совместного применения при воздействии на опухолевые клетки с ИЛУ в системе 1». ¿lvo.

В наших химиотерапевтических экспериментах мы использовали iosseft BDFi с лейкозами Р-388 и Р388/ДКС, перевитыми подкожно по 1x10е клеток. Разовые ;озы препаратов были еле-.тощими: —1С -0,35ыг/кг; Щц - 1ЫГ/КГ: ДКС - Быт/кг. Их вводили многократно виутрибршиино. Противоопухолевый аффект оценивали по торможению поста опухолевого узла (ТРО) и увеличению продолжительности жиояи . .лвотных. Торможение роста опухолей было Наиболее выражено в группах с комбинацией ЯР -'»адп+ДКС (ТРО - 90Х) (рис. 4а и 46). При-kjpno тагам же было значение этого показателя и в группах, ..¿чен-гш этими модификаторами без цитостатика. При приыене'-чи только ДКС а случае чувствительного лейкоза Р-388 ТРО составило больше Г х, т.е. эффект от такого лечения был ниже, чем от применения комбинации гошуномодуляторов (рис.4а) Эффективность лечения атамма Р388'ДКС одним ДКС б^.ее чем в 2 раза ниже в сравнении с лечением эх'иы цитостатик~ч чувствительного лейкоза Р:388, что обьясняется наличием МЛУ у клеток штамма Р388/ДКС (рис.46).

• ш -

SS-i ВЕЗ-а ЕЗ-з 123-4

Рис.4. Влияние терапии доксорубиц..нсм в кшбииацт» с мурамил-дипептидоы и дипополисахаридом на рост ín vivo лейкозов ?-Ш (а) и Р388/ДКС (б) П- оси ординат - дни после прививки опухоли; по оси абсцисс '' объём опухолевого увда в мм3.

1 - ДКС+МЩ1+ЛПС; 2 - ЩП+ЛПС; 3 - ДКС; 4 - нелеченные. '

Оценка протнзоспухолевой активности пр;:меняо1а« препаратов по удлинению продолжительности жизни животных с лейкозом Р-ЗР-О и РЭЗЗ/ЛКС такгл показала паибашаую зЭД^ктиаиссть от пр]шеиекия 1ХУбШ1СЦ!5и Л1С» ЦДЛ'ДКС (?;йл.4). В то до время. включение 2КС » комбинаций ш»'-чоиодуляторо» для лечения резистентного таима не давало никаких про югу ¡пест в по сравнена с лемшем только ЛПС+'.'ДП. У1Ш при лечонго.: ЛПО^Ш*ДКС чувствительною лейкоза составляет 52,БХ. а при лечении устойчивого л«йкоза - 44,62, что в представленной работе является лучяиы показателей среди кеподьво-Еашшх для лечения препаратов и их комбинаций и представляется ^аааоэФФективиш для воздействия как на чувствительные, так и на устойчивые опухолевые клотки.

Таблица 4. Продолжительность ®ши животных после иммуно-

хшюгералии шзей В0Р1 с лейкозом Р-388 и Р38В/ДХС.

1 Тип | Средняя 1 Удлинение |

| опухолевого зтаччгл | продолжитесь кость I продолжительности (

I и вид лечения 1 1 1 жизни (Б ДНЯХ) I жигни в % | 1 |

1 1 I Р-3&3 I 1 1 1 1

| нелечены» | 21,7 ♦ г,. 1 - 1

| ЛИС»МЛН 1 зо.з + ел* I 39,6 |

1 ДКС | 27,4 + 5,6* 1 26,2 |

1 лпешдгмге | » . .. i 33,1 1 6,8* I 52,5 1 1 |

1---------------------------..............1 1 рзав/дке | 1 1

' нелеченые | 21,3 ± 2,6

ДКС | 23,0 1 3,1 1 8,0 I

I ЛПС+МЗП 1 < Й),4 + 5,5** 1 42,7 |

, ЛПС»Ш*ДКС I зо.з + ел** 1 44,6 1

достоьераап значимость различий между полеченным контролем (р-388) и леченной группой; достоверна1! значимость различий иг ту группой леченной только ЛУ" и комбинацией ..репаратов.

»

- £2 -t Ы В О Д Ы

1. Механизм лекарственной устойчивости к доксорубицину (ДКС) в клетках линии Р388/ДКС соответствует "классическому" типу множественной лекарственной устойчивости 0Ш), что подтверждается совокупностью следующих фактов: а) гиперэкспрессией белка с молекулярной массой 196 «Da в плазматических мембранах клеток;

б) уменьшением уровня накопления ДКС;

в) наличием перекрестной резистентности к актиномицину D, винк-ристину, рубомищш";

г) нарушением выведения ДКС из этих резистентных клеток при введении финоптина (531).

2. Применен« галидора и трифтазина в качестве модификаторов МЛУ in vivo нецелесообразно, так как они не имеют преимуществ по сравнению с ФП в увеличении лечебного действия ДКС.

3. Использование 50 для лечения опухолей о фенотипом МЛУ вызывает селекцию резистентных клеток к комбинации ДКС и Cíl in vivo. Лейкоз Р388/ФШ-ДКС, у^ойчивый к комбинации ШЩС, был индуцирован у мышей малыми дозами этого модификатора в течение 6 пассажей клеток лейкоза Р388/ДКС.

4. Использование ® в сочетании о шшофосфаном приводит к изменению метаболизма цитостатика и сопровождается увеличением ^го токсичности, что следует учитывать при применении этой комбинации в клинике.

5. Не выявлено различий в чувствительности к цнтотоксическому ; йствгао Г-киллеров между исходишь (чувствительным) и устойчивым i ДКС штампами лейкоза Р-388. ,

6. Выявлена повышенная пролиферативная активность Т-лимфоцитов в раните'сроки их совместного культивирования in vitro о обработавши митошшином С опухолевыми клетками o фенотипом 1Ш.

{ ■ , • v

7. Приме. жт комбинации иммуношдудяторов - липополисахарида и мурамилдавптида приводит к. выраженному : и раввозффективиому 'тормохек то росга клеток чувствительного и устойчивого к ДКС штаммов лейкоза Р338 ln vlv .

- 23 -

' СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕР НИИ:

1. Влияние финоптина на накопление доксорубицина в клетках лейкоза Р388 о индуцированиой устойчивостью к антибиотику,- Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1089, Н ,12. C.714-71S (соавт.; JJopos Л.В., Донешсо Ф.В., Ситдикова С.Ы.).

2. Влияние финоптина на накопление доксорубицина в клетках лейкоза Р388 с шдуцировашой устойчивостью к комбинации фшюпти-иа о доксорубишшоы.- Бюллетень экспериментальной с.галогии и медицины, 1990, МЗ, с. 290- 292 ( соавт.: Mop i .В., Доиеико Ф.В., Ситдикова С.М., Кабиева А,0.).

3. Исследование сравнительного накопления флуоресцентного зонда Хехст 33258 в клетках лейкоза Р388, чувствительных и устойчивых к доксорубицину.- Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1990, N9, с. 310-312 ( соавт.: Донешсо Ф.В., Егудина С.А., Кабиева А.О и др.).

4. Модификация фармакологического действия циклофосфана бло-катором Са2+ каналов, фнноптином.- Тезисы докладов, сборник "Мо-дификавия лекарственной терапии опухолей", 1991, о. 52-56 ( соавт. ¡Мороз Л.В., Доиенко Ф.В., Кабиева А.О.).

6. Экспрессия Р- гликопротеияа в ¡метках лейкоза P3S8 о индуцированной устойчивостью к диксорубшшу.- Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1991, 113, с. 290-291 ( соавт.: Суханов В. А., Дьяков В. Л., Дояени» Ф.В., Мороз Л.В. и др.).

В. Влияние финоптина на метаболизм и фармакологическое действие цикяофосфана In vivo и In vitro.- Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1991, N3, с.ЭСЮ-Э02 (соавт.: Доненко Ф.В., Чиквапяши Б.Ш. и др.).

7. Verapamil effect on accumulation of doxorubicin 1. the leukemia Р-ЗЬи cells with induced antibiotic resistance. -Arch. Geschwul stforsch, 1SS0, v 60, К 2, p 129-132 ( L.V. Mores, F.V. Donenco, S.M. Sitdlkova ).

8. Influence of verapamil on the doxorubicin accumulation In leukemia P388 cells with induced reslstence to Verapamil + noxorubicin combination Arch. Geschwul stforsch., 1991, v6i, N2, p 105-109 ( L.V. !,tor02, F.V. Donenco, A.0. Kableva ).

9. Anallsis of mechanisms of immunity to native ' umor cells and with the phenotype of multidrug resistance before and after ' логару.- European journal of cancer, 1991, v 27, suppl.3, p 20 (A.A. Pimenov, V,V. Deev ).