Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Динамика иммунного статуса и репаративных процессов при термической травме в условиях локального применения эпидермального фактора роста (клинико-экспериментальное исследование)

На правах рукописи

сЛл.оъ'ал-^С'?

Лихачева Альфия Габдуллаевна

ДИНАМИКА ИММУННОГО СТАТУСА И РЕПАРАТИВНЫХ ПРОЦЕССОВ ПРИ ТЕРМИЧЕСКОЙ ТРАВМЕ В УСЛОВИЯХ ЛОКАЛЬНОГО ПРИМЕНЕНИЯ ЭПИДЕРМАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА (КЛИНИКО-ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.03.03 - патологическая физиология 14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

25 ДПР 2053

005057747

Челябинск - 2013

005057747

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, на кафедре патологической физиологии и на кафедре микробиологии, вирусологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики

Научные руководители:

доктор медицинских наук,

профессор ОСИКОВ Михаил Владимирович

доктор медицинских наук,

профессор ТЕЛЕШЕВА Лариса Федоровна

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор, ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов»

ФМБА России, директор СИМБИРЦЕВ Андрей Семенович

Доктор медицинских наук, профессор

заведующий кафедрой гистологии,

эмбриологии и цитологии

ГБОУ ВПО «Челябинская государственная

медицинская академия» Минздрава РФ БРЮХИН Геннадий Васильевич

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И.Пирогова» Минздрава России

Защита диссертации состоится «¿*» сьггл^^м, 2013 года в /.¿¿часов на заседании диссертационного совета Д .208.117.02 при ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия» Минздрава России (454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия» Минздрава России (454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64).

Автореферат разослан <и'в » е^ся лгъя 2013 г. Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор ТИШЕВСКАЯ Наталья Викторовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность темы

В настоящее время достаточно распространенной разновидностью травматических повреждений кожи является термическая травма (ТТ). Результаты многочисленных отечественных и международных эпидемиологических исследований свидетельствуют о неуклонном росте числа обожженных больных с определенными различиями в зависимости от расы, пола, возраста, региона проживания; в РФ в 2009 году ожоги зарегистрированы у 313,5 тыс. человек, их распространенность не имеет тенденции к уменьшению; по данным ВОЗ, термические поражения занимают 3 место среди других травм, в РФ на долю ТТ приходится 10-11%. (Социально-значимые заболевания, 2011: Allorto N.L. et al., 2009; Burd A., 2010; Burton K.R. et al., 2009; Hendrix L. et al., 2011; Iqbal T., 2011, 2012; Keck M. et al., 2009; Khan N. et al., 2006; Kai-Yang L. et al., 2008; Mock С. et al., 2009; Othman N. et al., 2010; Papp A. et al., 2008; Pham T.N. et al., 2009, Rani M. et al., 2012; Stander M. et al., 2011). Steven Wolf, редактор журнала «Burns», с 2007 г. проводит ежегодный мониторинг статей в изданиях, индексированных в англоязычных базах данных, и констатирует, что несмотря на значительное количество оригинальных публикаций, посвященных вопросам эпидемиологии, патогенеза, диагностики, лечения, реабилитации при ТТ (1000-1500 в год) и достигнутые терапевтические успехи в комбустиологии, многие вопросы до спх пор не вскрыты, а центральную позицию в их решении занимают исследования в области патофизиологии ТТ (Wolf S.E, 2008,2009, 2011; Sen S. et al., 2010).

При ТТ гиперергия и потеря физико-химической и сосудистой автономии очага повреждения приводит к манифестации синдрома системного воспалительного ответа (systemic inflammatory response syndrome, SIRS), изменению функций многих органов и систем (с развитием в финале полиорганной недостаточности - multiple organ dysfunction syndrome, MODS), в том числе, одной из ключевых регуляторных систем организма - кроветворения и иммуногенеза (Dahiya P. et al., 2009; Peng DZ. et al., 2008; Ravat F. et al., 2011). Патофизиологическими и патохимическими паттернами системных изменений при ТТ выступают оксидативный стресс, эффекты щггокннов и других аутокоидов, гиподиспротеинемия, активация плазменных про-теолитических систем, эндотелиальная дисфункция и др., а потенциирующими факторами являются стресс, массивный некроз тканей, шок, присоединение инфекции, недостаточное питание, различные лечебные процедуры (Волчегорский И.А. и др., 1991, 1992, 2000; Волчегорский И.А., 1993; Долгушин И.И. и др., 2001; Саломатин В.В., 1993; Черешнев В.А. и др., 2002; Atiyeh B.S. et al., 2008; Shupp J.W. et al., 2010; Tredget E.E., 1992; Williams F.N. et al., 2011).

Сведения об изменении иммунореакгивности при ТТ, несмотря на большой объем феноменологических данных, противоречивы, большинство исследователей отмечают активацию фагоцитов, изменение активности комплемента, концентрации в сыворотке иммуноглобулинов и др. опсоиинов, депрессию клеточного звена адаптивного иммунитета, неоднозначны сведения о цитокиновом профиле (Calum H. et al., 2009; Finnerty C.C. et al., 2009; Hunt J.P. et al., 1998; Pap G. et al., 2006; Parment K. et al., 2007; Patenaude J. et al., 2005; Peng X. et al., 2006; Robins E.V. et al., 1989; Rosenbach A.E. et al., 2011; Sparkes B.G. et al., 1993; Stoilova Y.D. et al., 2007). До сих

пор не достигнуто консенсуса в понимании ключевых механизмов изменения иммунного статуса при ожогах. Полагают, что ТТ имеет специфические, отличные от других видов травм, закономерности изменения локального и системного иммунитета, детерминирующие послеожоговые изменения и заживление раны (Schwacha M.G. et al., 20¡0). Неоднозначны сведения о связи иммунореактивности организма с морфологией очага повреждения и динамикой заживления раны при Т Г (Alexander M. et al., 2002).

В тоже время, дисфункция иммунной системы при ТТ является причиной повышенной восприимчивости к условно-патогенной микрофлоре, гнойно-септических осложнений, септического шока, расширения зоны вторичной альтерации, полиорганной недостаточности и летальности, поэтому мультитропные терапевтические направления в комбустиологии должны включать иммунокорриги-рующие подходы (Ipaktchi К. et al., 2009; Kravitz M., 1993; Stoilova Y.D. et al., 2007). Особый интерес при этом вызывают эндогенные иммуномодуляторы локального действия, в частности эпидермальный фактор роста (ЭФР, EGF). Рекомбинантный человеческий EGF (rhEGF) показал свою эффективность при экспериментальных ожогах и применяется у больных с ТТ (Berlanga-Acosta J. et al., 2009; Hu D.H. et al., 2012; Wang S.L. et al., 2002; Xing B.R. et al.,2003; Zheng J. et al., 2003, 2005; Zong S. et al., 2010). Большинство исследований посвящено изучению влияния rhEGF на скорость заживления ожоговой раны, эпителизацию и формирование рубцовой ткани, но механизмы действия EGF при ТТ до конца не ясны (Alemdaroglu С. et al., 2008; Hardwicke J. et al., 2008; Liao Y. et al., 2003).

Данные об изменении иммунореактивности при ТТ на фоне применения rhEGF немногочисленны и противоречивы. Положительные эффекты применения rhEGF при ожогах, ускоряющие заживление раны, снижающие риск гнойно-септических осложнений и повреждений отдаленных органов, его цитопротекторный эффект могут быть обусловлены влиянием rhEGF на иммунный статус организма. В литературе отсутствуют данные о системных эффектах ЭФР при локальном применении. В тоже время, известно, что взаимодействие EGF со своим рецептором приводит к активащга транскрипционного фактора ErbB, связанного с синтезом многих факторов роста и матриксных металлопротеиназ, имеющих значение в канцерогенезе (Higashiyama S. et al., 2008).

Цель работы

Изучить динамику иммунного статуса и репаративных процессов при термической травме в условиях локального применения эпидермалыюго фактора роста.

Задачи исследования

1. Исследовать иммунореактивность организма по показателям количественного состава лейкоцитов в периферической крови, функциональной способности фагоцитов, Thl- и ТЬ2-зависимого иммунного ответа при экспериментальной термической травме в условиях локального применения эпидермального фактора роста.

2. Изучить клеточный состав очага повреждения и динамику заживления ожоговой раны при экспериментальной термической травме в условиях локального применения эпидермального фактора роста.

3. Исследовать количественный состав лейкоцитов, субпопуляционный спектр и выраженность апоптоза лимфоцитов периферической крови, концентрацию иммуноглобулинов А, М, G в сыворотке у больных с термической травмой в условиях локального применения эпидермального фактора роста.

4. Определить уровень в сыворотке и продукцию мононуклеарами периферической крови отдельных цитокипов ( ИЛ-1Р, ИЛ-4, ИФН-у, ТФР-pl и ЭФР) у больных с термической травмой в условиях локального применения эпидермального фактора роста.

5. Определить наличие и характер связи между показателями иммунореактивно-сти организма, клеточным составом очага повреждения и динамикой заживления ожоговой раны при термической травме в условиях локального применения эпидермального фактора роста.

Научная новизна исследования

Впервые установлено, что при термической травме одним из механизмов ней-трофильного лейкоцитоза в периферической крови выступает повышение концентрации в сыворотке ИЛ-1р; развитие лимфоцитопении, включая дефицит CD3+, CD4+, CD8+, CD22+ лимфоцитов, связано со снижением уровня ИФН-у в сыворотке, активацией апоптоза лимфоцитов и увеличением лимфоцитарной инфильтрации в очаге повреждения. Впервые показано, что у больных после термической травмы повышение концентрации в сыворотке ИЛ-1Р, снижение — ИФН-у и ЭФР, в том числе, связано с изменением продукции указанных цитокинов мононуклеарами периферической крови. Впервые продемонстрировано, что уменьшение площади раневого дефекта и увеличение скорости его эпителизации при термической травме нарастает по мере снижения количества нейтрофилов в крови и в очаге повреждения, увеличения количества лимфоцитов в крови и в очаге повреждения, снижения функциональной способности фагоцитов, восстановления Thl-и Независимого иммунного ответа. Впервые представлены данные, уточняющие механизм протекторного действия эпидермального фактора роста при термической травме in situ. В частности, локальное применение эпидермального фактора роста при термической травме приводит к снижению количества нейтрофилов в периферической крови по мере уменьшения концентрации в сыворотке и продукции мононуклеарами ИЛ-1р; увеличению количества CD3+, CD4+, CD8+, СГ)22+пимфоцитов по мере увеличения уровня ИФН-у в сыворотке и ограничения апоптоза лимфоцитов. Впервые показано, что локальное применение эпидермального фактора роста ускоряет заживление ожоговой раны в связи с восстановлением количества нейтрофилов и лимфоцитов в крови, функциональной способности фагоцитов, Thl-зависимого иммунного ответа и клеточного состава очага повреждения.

Теоретическая и практическая значимость исследования

Проведенный комплексный анализ иммунореактивности и морфологии очага повреждения при ТТ позволил выяснить закономерности изменения количественно-

го представительства в периферической крози нейтрофилов и лимфоцитов, функциональной активности фагоцитов, клеточного и гуморального адаптивного иммунитета и цитокинового профиля крови, имеющие значение в динамике изменения площади раневого дефекта и скорости его эпителизации. Установлено, что протекторные свойства эпидермального фактора роста при ТТ, реализуемые in situ, в том числе связаны с его системными иммунотропными эффектами: восстановлением количества нейтрофилов и лимфоцитов в крови, функциональной способности фагоцитов, Thl-зависимого иммунного ответа. Полученные результаты могут быть использованы в практической работе клинических иммунологов, комбустиологов, а также в преподавании соответствующих разделов на теоретических и клинических кафедрах медицинских ВУЗов. Полученные сведения об иммуномодулирующих эффектах эпидермального фактора роста при термической травме являются предпосылкой для проведения дальнейших исследований по расширению показаний для его клинического применения.

Основные положения, выносимые на защиту

1. При термической травме развивается нейтрофильный лейкоцитоз, CD3+, CD4+, CD8+, CD22+ лимфоцитопения, активация функциональной способности фагоцитов, депрессия Thl - и Th2-зависимого иммунного ответа в связи с увеличением концентрации в сыворотке ИЛ-ф, снижением -ИФН-у и ЭФР, активацией апоптоза лимфоцитов и изменением клеточного состава очага повреждения.

2. Локальное применение эпидермального фактора роста при термической травме оказывает модулирующее влияние на количественный состав лейкоцитов и цитокиновый профиль периферической крови, состояние врожденного и адаптивного иммунного ответа и клеточный состав очага повреждения.

3. Ускорение заживления раны при термической травме в условиях локального применения эпидермального фактора роста определяется иммунореактивно-стью организма и клеточным составом очага повреждения.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 13 научных работ, из них 6 — в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Апробация работы

Основные положения диссертации представлены на VI международной Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2011); III международной (X итоговой) научно-практической конференции молодых ученых ЧелГМА (Челябинск, 2012); IV Всероссийской научной конференции с международным участием «Микроциркуляция в клинической практике» (Москва, 2012); V Архангельской международной медицинской научной конференции молодых ученых и студентов (Архангельск, 2012); 70-й открытой научно-практической конференцией молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Волгоград, 2012); международной научной конференции «Практикующий врач» (Италия, Рим, Флоренция,

2012); Всероссийской молодежной конференции «Медицинские основы жизнедея-

-----... ...................... ~ ..............................—-------- . ........ /7-Л__________11 О___ __ _

| i и ¡пи 1.1Л1 а о nupjvii-, iiaiujiui iиi ta 7kl i i и [ < i i л i i i i ^" \ку,vi^i\, 11 utupuL-

сийском научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт Петербург, 2012), VII Международной научной конференции молодых ученых медиков (Курск, 2013).

Внедрение результатов исследования

Результаты исследования внедрены в учебный процесс кафедр патофизиологии, микробиологии, вирусологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики, метод экспериментального моделирования термической травмы внедрен в научную работу кафедры патофизиологии, НИИ иммунологии «Челябинская государственная медицинская академия» Минздрава России. Результаты применения эпидермального фактора роста при термической травме внедрены в практику работы областного ожогового отделения МБУЗ ГКБ №6 г. Челябинска.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 190страницах, содержит 43таблицы и 28рисунков; состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Список литературы включает 309 источников (50 -отечественных и 259 - зарубежных авторов).

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Материалы и методы исследования

Дизайн клинического фрагмента работы представлен на схеме (рис. 1).

Проведено краткосрочное, открытое, проспективное клиническое исследование иммунореактивности и иммунотропных эффектов эпидермального фактора роста у больных с термической травмой. План исследования соответствовал положениям Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации (BMA) последнего пересмотра (Сеул, 2008) с учетом разъясняющего примечания к параграфу 29, внесенного Генеральной Ассамблеей BMA (Вашингтон, 2002) и был одобрен этическим комитетом ГБОУ ВПО« Челябинская государственная медицинская академия» Минздрава России (протокол № 2 от 14.02.2012г.). В исследовании приняли участие 66 больных с термической травмой, находящихся на лечении в областном ожоговом отделении МБУЗ ГКБ №6 г. Челябинска с января 2010 г. по июнь 2011 г. От всех больных было получено письменное информированное согласие на участие в исследовании.

Отбор больных для исследования проводили в соответствии с критериями включения и исключения. Критерий включения: больные в возрасте 18-60 лет, мужчины и женщины с ожогами II-IIIA степени площадью 4%-15%. Критерии исключения: 1)сумма площади ожогов превышает 15%поверхности кожи; 2)болезни соединительной ткани; 3)любые заболевания и состояния, связанные с риском для жизни; 4) алкогольная или наркотическая зависимость в период 12 месяцев до начала исследования; 5) наличие в анамнезе инфицирования ВИЧ, гепатитом В и/или С, туберкулезом; 6)беременность, лактация; 7)злокачественные новообразования ко-

жи в зоне термической травмы; 8) прием иммунотропных препаратов в период 3 ме-

___. ... . . л........ ................... о_______...-------------- { .............. .. . .. 1Л----

СЯдсо ди паюла т/шедивйппд. и пссл^дияаипс т\лшч^пи и чслиосл , и 1.1. IV

щин и 26мужчин (средний возраст 38,79±2,31 лет). Причиной термической травмы у большинства больных явились контакт с пламенем и горячей жидкостью.

Рис. I. Этапы клинического фрагмента работы

Исследуемые пациенты случайным образом были разделены на 2 группы: контрольная (к) -больные ТТ, не получающие локальную терапию ЭФР (п-23); опытная (о) - больные ТТ, получающие локальную терапию ЭФР (п=13). Опытной группе наряду с комплексным лечением местно проводили перевязки с препаратом «Эбер-мин», где в качестве активных веществ присутствуют эпидермальный фактор роста и сульфадиазин серебра. Контрольной группе взамен этого применяли влажновысы-хающие повязки с препаратом «Сульфаргин», мазь для наружного применения (МНН: сульфадиазин серебра, АО Таллиннский фармацевтический завод, Эстонская Республика). Относительное содержание сульфадиазина серебра в препаратах «Эбермин» и «Сульфаргин» одинаковое - 1%. Кровь для исследований у больных забирали на 1, 10 и 20сутки после получения ТТ. Группа здоровых людей (п=30) представлена клинически здоровыми добровольцами -донорами ОГУП «Челябинская областная станция переливания крови», не имеющими соматической патологии и сопоставимыми по возрасту и полу с основными группами.

Экспериментальный фрагмент работы выполнен на 188 белых нелинейных крысах-самцах массой 200-220 г., находящихся в стандартных условиях вивария на типовом рационе в соответствии с нормами, утвержденными Приказом Минздрава СССР № 1179 от 10.10.1983 г., свободном доступе к пище и воде при 12-14-часовом

BBiüüOM дне. Все манипуляции с экспериментальными живошыми выполнялись в иответствии с «Правилами проведения работ и использованием зксперименгальных кивотных» (Приказ МЗ СССР № 775 от 12.08.1977 г.) и положениями Хельеинской екларации ВОЗ (1997).

Моделирование термической травмы. Для создания модели TT использовали шоскодонный стеклянный стакан из химического стекла с диаметром дна 4 см, на-юлненный дистиллированной водой с температурой 100°С, время контакта с кожей 0 с ( TT IIIA степени). Относительная площадь ожога составила 3,97%±0Д4%. пытной группе с первых суток после термической травмы на рапу наносился эпи-ермальный фактор роста в составе препарата «Эбермин». В контроле использовал-я препарат « Сульфаргии», содержащий сульфадиазин серебра. В обеих группах репараты использовались 1 раз в сутки в течение 14дней . Интактный контроль редставлен белыми нелинейными крысами, сопоставимыми по возрасту и массе с -ивотными основных групп. Исследования проводили на 1, 3, 7, 14. 21, 28 сутки от Т.

Для экспериментов в условиях in vitro использована цельная кровь 11 клнниче-ки здоровых людей-добровольцев и 36 больных с термической травмой.

Иммунологические методы исследования. Количество лейкоцитов в перифе-ической крови и лейкоцитарную формулу определяли общепринятыми методами.

Исследование поглотительной способности фагоцитов периферической крови роводили на модели поглощения частиц монодисперсного (диаметр 1,7 мкм) поли-терольного латекса, учитывали активность фагоцитоза, интенсивность фагоцитоза í фагоцитарное число (Фрейдлин И.С., 1986). Исследование генерации активных [>орм кислорода фагоцитами периферической крови проводили, учитывая интсн-ивность восстановления нитросинего тетразолия (HCT) в его нерастворимую фор-лу -диформазан по методу А.Н. Маянского и М.Е . Виксмана (1979).Проводили "понтанный и индуцированный НСТ-тест с учетом активности (% клеток) и интен-ивности (у.е.).

Концентрацию в сыворотке и продукцию мононуклеарами периферической крови ИЛ-lß, ИЛ-4, ИФН-у, ТФР-ßl, ЭФР определяли методом иммуноферментного анализа на «Multiscan plus» («Labsystems», Финляндия) с использованием тест-систем «Вектор-Бест» (Новосибирск), «Bender Medsystems» (Австрия), «Biosource» (США). Мононуклеары периферической крови выделяли общепринятыми методами и культивировали в течение 72 часов, в условиях термостата при 5% содержания углекислого газа в воздушной среде, при температуре 37°С.

Определение популяционного и субпопуляционного спектра лимфоцитов периферической крови (CD3+, CD4+, CD8+, CD22+, CD16+, CD25+, CD71+, CD95+, HLA-DR+) проводили с помощью иммунофенотипирования методом непрямой им-мунофлюоресценции с использованием моноклональных антител (МКА) серии ICO производства НИИ «Препарат» (Нижний Новгород).

Определение уровня иммуноглобулинов Ig A, Ig М, Ig G в сыворотке проводили с помощью иммуноферментного анализа с тест-системами производства «Вектор-Бест» (Новосибирск) на фотометре «Multiscan plus» («Labsystems», Финляндия) при длине волны 450нм и выражали в г/л. Оценка концентрации циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) проводилась по методу В.Гашковой и соавт. (1978), ос-

нованном на осаждении белков сыворотки полиэтиленгаиколем ( ПЭГ-М, масса 6000).

Оценку гуморального иммунного ответа крыс проводили по количеству антите-лообразующих клеток (АОК) в селезенке крыс, иммунизированных аллогенными эритроцитами, по A. J. Cunningham (1965) (Волчегорский И.А. и др., 2000; Webster Е. L. et al., 1998). Интенсивность ГЗТ оценивали по выраженности воспалительного отека стопы, в которую вводили аллогеиные эритроциты, использовавшиеся для предварительной иммунизации (Langrade Р. Н. et al., 1980).

Морфологические методы исследования. Морфологическое определение апоптоза лимфоцитов проводили методом суправитальной окраски клеток ядерным флюоресциирующим красителем «Hoechst 33342» с последующим морфологическим учетом на микроскопе «ЛЮМАМ-АИ1» (Россия) % лимфоцитов, имеющих выраженную фрагментацию хроматина.

Для оценки динамики эпителизации измеряли площадь раневого дефекта методом контактной планиметрии. Планиметрическое исследование выполнялось на 1,3, 7, 14, 21, 28 сутки после термической травмы. Скорость эпителизации (VS) рассчитывалась по формуле : VS = S — Sn / t, где S —начальная площадь раны до лечения (в дальнейшем, площадь при предыдущем измерении); Sn —площадь при последующем измерении; t —число дней между измерениями (Васютков В.Я . и др., 1993). Площадь раны в последующих измерениях определяли в %, принимая за 100% площадь ожоговой раны до лечения, результат выражали в % за сутки.

Гистологические исследования микропрепаратов кожи проводили на микроскопе «Leika DMRXA» (Германия) с помощью компьютерной программы анализа изображений «Image Scope М» (Россия, Москва). Морфометрически оценивали высоту эпителиального слоя, количество клеток в нем, клеточный состав инфильтрата дермы.

Статистические методы. Статистический анализ проведен с использованием пакета прикладных программ «Statistica for Windows 6.0» (Реброва О.Ю., 2006). Для анализа нормальности распределения данных применяли критерий Шапнро-Уилка, проверки гипотез о равенстве генеральных дисперсий - критерий Левена. Проверку статистических гипотез проводили с использованием непараметрических критериев (Краскела-Уоллиса, U -Манна-Уитни, WW —Вальда-Вольфовитца). Для выявления связи между параметрами использовали коэффициент корреляции Спирмена (R). Отличия считали статистически значимыми при р20,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Нами установлены некоторые механизмы изменения иммунореактивности у больных после ТТ. При динамическом наблюдении наблюдаются неоднозначные изменения количественного состава лейкоцитов и популяционного спектра лимфоцитов в периферической крови (табл. 1). На 1 сутки фиксируется лейкоцитоз за счет палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофнлов, моноцитов и лимфоцитов, обусловленный перераспределением клеток и гемоконцентрацией. Лимфоцитоз включает увеличение CD4+, CD8+, CD22+, CD71+ клеток (табл. 2). На более поздних этапах, 10-20 сутки после TT, увеличение количества нейтрофилов и моноцитов сочетается с лимфоцитопенией и эозинопенией. Лимфоцитопения обусловлена де-

прессией количественного представительства эффекторов клеточного и гуморального иммунитета: CD3+, CD4+, CD8+, CD22+. Одновременно с этим на 10-20 сутки поело I I б крови повышено количество активированных Т-лимфоцитов, несущих маркер CD71+. На 20 сутки после TT зафиксирована тенденция к восстановлению количественного состава лейкоцитов и популяционного спектра лимфоцитов в крови.

Полагаем, что нейтрофильный лейкоцитоз в периферической крови у больных после TT обусловлен активацией миелопоэза в ответ на поступление стимулирующих миелопоэз факторов из очага повреждения при ТТ. Одним из механизмов лим-фоцитопении выступает усиление гибели лимфоцитов путем апоптоза, в кровотоке возрастает количество лимфоцитов, несущих маркер готовности и морфологические признаки апоптоза (табл. 3). Установлено, что общее количество лимфоцитов, CD3+, CD4+, CD8+ клеток в периферической крови снижается по мере увеличения количества лимфоцитов, несущих CD95+ (соответственно коэффициент корреляции Спирмена R==—0,78; R=-0,66; R=-0,71; R=-0,68; p<0,01) и морфологические признаки апоптоза (соответственно R=-0,78; R=-0,73; R=-0,72; R=~0,84; p<0,01).

При оценке концентрации иммуноглобулинов в сыворотке у больных с TT на 1 сутки наблюдения обнаружено снижение содержания Ig классов М и G, что, вероятно, является отражением выхода плазмы с растворенными в ней белками в очаг повреждения; на 10 сутки значимо повышается количество IgM, что может быть связано с реакцией на наличие ауто- и микробных антигенов в очаге повреждения (табл. 4).

Основными регуляторами врожденного и адаптивного иммунитета при TT, изменяющими количественный состав и функционалыгую активность иммунокомпе-тентных клеток, гуморальных факторов в очаге воспаления, периферической крови, органах иммуногенеза и кроветворения, являются цитокины. При оценке цитокино-вого профиля крови у больных с TT обнаружены значимые изменения на 1-10 сутки, к 20 суткам концентрация цитокинов не отличалась от контрольной группы. Концентрация ИЛ-lß увеличивалась на 1 и 10 сутки наблюдения (табл. 5). Уровень ИЛ-4 уменьшался на 1 сутки, а ИФН-у и ЭФР - на 10 сутки наблюдения. Концентрация ТФР-ßl статистически значимо не изменялась во все сроки наблюдения.

Общее количество лейкоцитов, общее количество нейтрофилов, палочкоядер-ных и сегментоядерных нейтрофилов в периферической крови возрастает по мере повышения концентрации ИЛ-lß в сыворотке ( соответственно R=0,28; R-0,34; R=0,39; R=0,29; p<0,05). Наиболее сильная положительная корреляция отмечена на 10 сутки после TT, что свидетельствует об известной стимуляции миелоидного ростка костного мозга этим провоспалительным цитокином после TT (Chen Jing et al., 2000; Shehab El-Din S.A. et al., 1996). Количество в кровотоке лимфоцитов, несущих общий маркер Т- лимфоцитов (CD3+), Т-хелперов (CD4+>i Т- цитотоксических (CD8+) снижается по мере снижения концентрации ИФН-у в сыворотке (соответственно R-0,45; R=0,42; R=0,36; R=0,4ß; <0,05). Показано, что снижение уровня ИФН-у в сыворотке после TT обусловлено изменением кооперации макрофагов с С04+-лимфоцитами при участии белка В7-Н1 (PD-Ll) (Yamazaki Т. et al., 2005; Johannes Tschup et al., 2009).

Нами исследована секреторная активность мононуклсаров периферической

„ frnn, л тт / ^с-т —гг 1 fi —...---— 1 1 л ттгьи

JVpUDfl у WUJlUnDlA. 1 X ^lUUJl. U). ^ЬЛриЦПЛ IL/i'lp iHJI>r>llliaL, 1L-Л ПЯ 1 ïl 1U lAJ'l,

и ЭФР - снижается на 10 сутки после ожога. Как видно, изменения секреторной активности мононуклеаров полностью совпадают с результатами исследования уровня цитокинов в сыворотке, что подтверждают сильные корреляционные связи между показателями. Для ИЛ-1р R=0,78 (р<0,05), для ИФН-у - R=0,52 (р<0,05), для ЭФР -R=0,36 (р<0,05).

Таким образом, у больных после ТТ развивается нейтрофильный лейкоцитоз и иммуносупрессия в связи с уменьшением количества эффекторов клеточного и гуморального иммунитета (CD3+, CD4+, CD8+, CD22+), повышено количество лимфоцитов, несущих маркер поздней активации (CD71+). Механизмами изменения иммунорективности при ТТ выступают усиление апоптоза лимфоцитов, увеличение концентрации в сыворотке и продукции мононуклеарами периферической крови ИЛ-ip, снижение - ИФН-у,

Далее нами исследована иммунореактивность организма и особенности морфологии очага повреждения при экспериментальном моделировании ТТ. Для этого была отработана модель ТТ у крыс, унифицированная по глубине и площади поражения кожи, которая позволила в установленные сроки проследить динамику изменений показателей врожденного и адаптивного иммунитета в сопоставлении с формированием и эволюцией морфологии ожоговой раны. Крыса представляется приемлемым объектом для исследования иммунореактивности при ТТ (Singh H. et al., 1986).

При экспериментальной ТТ в периферической крови на 3-14 сутки наблюдения развивается нейтрофильный лейкоцитоз и лимфоцитопения. Функциональная активность фагоцитов периферической крови при экспериментальной ТТ изменяется неоднозначно (табл. 7). С одной стороны, увеличивается поглотительная способность фагоцитов с 1 по 21 сутки наблюдения, возрастает как количество активно фагоцитирующих клеток, так и способность захвата объектов фагоцитоза по показателям интенсивности фагоцитоза и фагощггарного числа. С другой стороны, спонтанный НСТ-тест возрастает на 1-14 сутки, а функциональный резерв фагоцитов, оцениваемый в индуцированном НСТ-тесте, снижается на 3-7сутки наблюдения. Функциональная активность фагоцитов полностью восстанавливается к 28 суткам после ТТ.

Следует отметить, что, по данным других исследователей, мониторинг НСТ-теста после ТТ имеет важную прогностическая роль: выживаемость крыс в эксперименте выше, если первоначально НСТ-тест повышается, а затем постепенно снижается, непрерывный рост НСТ-теста приводит к неблагоприятным исходам (Wang Y. et al., 1994). Кроме того, гиперергия нейтрофилов после ТТ лежит в основе развития эндотелиальной дисфункции и синдрома полиорганной недостаточности за счет воздействия АФК и ферментов лизосомального происхождения (Sahib A.S. et al., 2009; Sener G. et al., 2004). Изменение реактивности нейтрофилов при ТТ связано с Toll-подобными рецепторами (TLR), особенно TLR-2 и TLR-4 (Schwacha M.G. et al., 2012; Oppeltz R.F. et al., 2011 ).

При оценке адаптивного звена иммунитета при экспериментальной ТТ фиксируется иммунодепрессия. Клеточный иммунный ответ подавлен на 7-28 сутки на-

юдения, гуморальный -на 7-14суткн после 1 "Г и восстанавливается к 21 суткам абл. 8). Но данным ряда исследователей, иммунодефицит после 'il' у крыс обу-

ADni>U ГЧШМ^АПИР» Щ Т.*-« Л TTTïTTÉ^ r"TDa T-VAnnPnrtD ТЯ Т ТШТЛТЛЮТЧЛ1Д r4nrv Т» PDfTTTI лл г»ттттм»-<=»_

ем продукции ИЛ-2 и ИФН-у (Hunt J.P. et al., 1998 ; Peter F.W. et al., 1999).

Динамика клеточного представительства в очаге повреждения ТТ отражает из-стные закономерности его эволюции: на начальных этапах превалируют полипук-арные лейкоциты, которые постепенно заменяются мононуклеарами и фибробла-ами. При исследовании микропрепаратов кожи у крыс на 7 сутки после ТТ кле-чный состав представлен преимущественно полиморфно-ядерными лейкоцитами, мфоцитами и гистиоцитами, в динамике наблюдения с 7 по 28 сутки прогрессив-снижается количество нейтрофилов, с 21 суток снижается количество лимфоци-ви гистиоцитов, с 14 суток эксперимента возрастает содержание фибробластов абл. 9). Очевидно, что представительство и динамика клеточного состава очага вреждения при ТТ связаны с изменением клеточного состава лейкоцитов в пери-■рической крови. По данным корреляционного анализа, количество нейтрофилов в are повреждения нарастает по мере их увеличения в периферической крови =0,68; р<0,05), а количество лимфоцитов в кровотоке уменьшается по мере увели-ния их представительства в очаге (R=—0,64; р<0,05).

Для мониторинга заживления ожоговой раны и его сопоставления с изменением мунореактивности при ТТ нами использованы показатели площади ожоговой ра-I, уменьшение площади раневого дефекта относительно исходного размера на 1 ки наблюдения, а также скорость эпителизации очага повреждения. Заживление оговой раны сопровождалось постепенным уменьшением площади раневого де-екта: к 7 суткам наблюдения в среднем на 21%, к 14 суткам - на 49%, к 21 суткам -72%и к 28суткам -на 93%в сравнении с исходной площадью раны (табл. 10). аксимальная скорость эпителизации раневого дефекта наблюдалась между 21 и 28 тками. Полного заживления раны к 28 суткам после ТТ не происходило.

С использованием корреляционного анализа при экспериментальной ТТ уставлена тесная связь скорости заживления раневого дефекта кожи, иммунореактив-сти организма по показателям врожденного и адаптивного иммунитета, а также орфологии очага повреждения, в частности представительства в нем нейтрофилов, гмфощгтов и фибробластов. Результаты корреляционного анализа схематически едставлены на рис. 2.

Как видно, снижение площади и увеличение скорости эпителизации раневого "фекта нарастают по мере снижения количества лейкоцитов, нейтрофилов, увели-■ния количества лимфоцитов в периферической крови, снижения функциональной особности фагоцитов, восстановления реакции ГЗТ и количества АОК в селезенке осле повторной иммунизации. Кроме того, на 7 и 14 сутки экспериментальной ТТ ощадь раневого дефекта уменьшается, а скорость его эпителизации растет по мее снижения представительства в очаге нейтрофилов ( соответственно R—-0,42; =-0,50; р<0,05) и увеличения - лимфоцитов ( соответственно R=0,29; R=0,69; 0,05) и фибробластов (соответственно R=0,41; R=0,81: р<0,05).

На следующем этапе работы нами исследовано влияние локального применения ФР на иммунореактивность организма и ее связь с репаративными процессами по-е повреждения при ТТ. Локальное применение ЭФР у больных с ТТ приводит на

10 сутки к снижению содержания нейтрофилов за счет палокоядерных н сегментоя-дсркых форм, лоБышснпю количества лимфоцитов в периферическом крови без достижения уровня здоровых людей (табл. 1).

Площадь ожоговой раны

Снижение площади ожоговой раны

Скорость эпителизации ожоговой рапы

Площадь ожоговой раны

Снижение площади ожоговой раны

Скорость эпителизации ожоговой раны

б)

Рис. 2. Статистически значимые (р<0,05) связи между показателями иммуно-реактивности и заживления раны на 7 (а) и 14 сутки (б) после ТТ.

Сплошные линии обозначают положительные связи, штриховые -отрица -тельные

Кроме того, увеличивается представительство СОЗ+, СБ4+, С08+, С022+ лимфоцитов и лимфоцитов, несущих маркеры поздней активации (СВ71+, НЬА-1Ж) (табл. 2). На 20сутки после ТТ количество лейкоцитов, лейкоцитарная формула, а также представительство популяций лимфоцитов не отличались от соответствующих показателей группы здоровых людей. Одним из механизмов увеличения общего количества лимфоцитов и их субпопуляций в периферической крови у больных на 10 сутки после ТТ является снижение интенсивности апоптоза. Уменьшалось содержание лимфоцитов, экспрессирующих маркер готовности к запрограммированной гибели (С095+),а также имеющих морфологические признаки апоптоза (табл.

Лейкоциты. • 10ч/л ~ ——___

Нейтрофилы. «10 /л

Лимфоциты, • 109/л

Активность НСТ-теста \\ ^^

Интенсивность НСТ-теста

Активность фагоцитоза

Интенсивность фагоцитоза

ГЗТ

/ г

АОК в селезенке, • 104 ед.

й-

Лейкоциты,' 10 /л

Нейтрофилы.» 10 /л

Лимфоциты, • 10 /л

Активность НСТ-теста

Интенсивность НСТ-теста

Активность фагоцитоза

Интенсивность фагоцитоза

ГЗТ

АОК в селезенке, • 10 ед.

3). Полагаем, что одним из механизмов снижения апоптоза лимфоцитов в условиях

ттпт>п П1 1ТЛТ-Л ТТ111111/11ТГ1Т11111 ("Т^ П 1 I/.-1-Г1-Г 1 1Т' I 1II '1Л11111111 'Ч 111 (1 ЧЧ'^ЧПЧИТКИ! 11 "11 Т11" ГЦ ТТIЧ 11 ' Ч 1 '1

ЛОкаЛЫЮГО ПрИМеИеПЯл пшш^ 1 иини иАршипк/ип^ ылт^ицгш и

ге повреждения, снижение продукции и/или выброса аутокоидов, в том числе с про-апоптогенным действием. Общее содержание лимфоцитов, СБЗ^, СБ4+, СБ8+ лимфоцитов в крови увеличивается по мере снижения количества лимфоцитов, несущих признаки готовности к апоптозу (соответственно Я=-0,37; 11=-0,78; 11=—0,75; Я=-0,78; р<0,05) и его морфологические признаки ( соответственно 11=-0,43; Л=-0,66; Я=-0,69; Ы=-0,63; р<0,05).

Таблица 1

Влияние локального применения эпидермального фактора роста на количественный состав лей_КОЩ1ТОВ периферической крови у больных с термической травмой (М+т)_

Группы / Показатели, • 109/л Группа 1 Здоровые п=30 Группа 2к ТТ 1 сутки п=23 Группа Зк ТТ 10 сутки п=23 Группа Зо ТТ+ЭФР 10 сутки 11=13 Группа 4к ТТ 20 сутки 11=23 Группа 4о ТТ+ЭФР 20 сутки п=13

Лейкоциты 5,33+0,29 9,14±0,бб * 8.35+0,47 * 9,05±1,05 * 6,80±0,53 * 6,60+0,63

Эозинофилы 0,07±0,01 0,04±0,02 * 0,04±0,01 0,12±0,03 0,05±0,02 0,05+0,01

Нейтрофилы п/ядерные 0,13+0,01 0,69+0,05 * 0,95+0,07 * 0,78±0,13 * # 0,45±0,04 # 0,43±0,07 *

Нейтрофилы с/ядерные 3,13±0, 8 5,92±0,51 * 5,43±0,34 * 5,12+0,63 * # 4,12+0,35 * 3,88+0,33

Нейтрофилы 3,26+0,19 6,60+0,54 * 6,38+0,39 * 5,90+0,74 4,5б±0,38 * 4,31+0.38 # '

Лимфоциты 1,69±0,09 2,49±0,14 * 1,53±0.09 * 2,50±0,25 1,9б±0,14 1,97+0,21

Моноциты 0,27±0,03 0,39±0,04 * 0,40±0,04 * 0,52±0,08 * 0,28±0,04 0,27+0,07

Примечание. Здесь и далее * -статистически значимые (р<0,05)различия при сравнении с группой I, # - при сравнении контрольной (к) и опытной (о) групп (р>»-рз..; р^-р«»).

Локальное применение ЭФР у больных с ТТ не приводит к статистически значимым изменениям содержания иммуноглобулинов классов А, М, О в сыворотке по сравнении с группой контроля на 10 и 20 сутки наблюдения (табл. 4). Обнаружено, что в условиях локального применения ЭФР у больных с ТТ в сыворотке снижается концентрация ИЛ-1 р и повышается концентрация ИФН-у, хотя их уровень не достигает значений в группе здоровых людей (табл. 5). Полагаем, что ЭФР, содержащийся в препарате «Эбермин» и применяемый локально у больных с ТТ, не поступает в системный кровотоки не оказывает системного действия, т.к. нами не обнаружено достоверных изменений концентрации ЭФР в сыворотке по сравнению с контрольной группой. Локальное применение ЭФР у больных с ТТ приводит к достоверному снижению продукции ИЛ-10 мононуклеарами периферической крови и на правах тенденции к повышению продукции ИФН-у (табл. 6). Уровень в сыворотке ИЛ-1Р снижается по мере уменьшения его продукции мононуклеарами (11=0,67; р<0,05).

Таблица 2

Влияние локального применения эпидермального фактора роста на субпопуланионный спектр _лимфоцитов у больных с термической травмой__

Т-._______ / 1руииы / Показатели, • 10% Группа 1 Здоровые п=30 Группа 2к тт 1 сутки п=23 г-_______ 1 рушш -1 к тт 10 сутки п=23 Группа Зо ТТ+ЭФР 10 сутки п=13 т->.______ А.. 1 рушш -п; тт 20 сутки п=23 т->........л. 1 руина -н| ТТ+ЭФР 20 сутки п=13

СОЗ+ 1,24±0,09 1,53±0,08 0,93±0,06 * 1,57±0,16 *# 1,19±0,10 * 1,05±0,09 *

С04+ 0,65±0,0б 0,89±0,05 * 0,54±0,04 * 0,93±0,09 * # 0,69±0,06 0,61 ±0,05

СЭ8+ 0,47±0,03 0,59±0,03 * 0,36±0,02 * 0,62±0,07 # 0,49±0,05 0,43±0,03

СЭ4/С08 1,48±0,02 1,49±0,03 1,50±0,04 1.51±0,01 1,46+0,03 1,42±0,03

С022+ 0,35+0,03 0,51±0,04 * 0,31±0,02 # 0,48±0,05 # 0,35±0,03 0,33±0,03

СО 16+ 0,3 (±0,03 0,38±0,02 0,30±0,02 0,35±0,05 0,37±0,03 0,28±0,02

С025+ 0,28= =0,05 0,35±0,03 0,21 ±0,02 0,28±0,03 0,21+0,02 0,22±0,01

С071 + 0,16±0,02 0,41 ±0.04 * 0,27±0,02 * 0,37±0,05 * # 0,27±0,03 * 0,22±0,02 *

НЬА-1Ж-г 0,37+0,04 0,41 ±0,04 0,29±0,02 0,58±0,07 *# 0,39±0,03 0,36±0,02

Таблица 3

Влияние локального применения эпидермального фактора роста на показатели апоптоза лим-__фоцитов у больных с термической травмой (М±т)__

Группы / показатели Группа 1 Здоровые п=30 Группа 2 к ТТ 1 сутки п=23 Группа Зк ТТ 10 сутки п=23 Группа Зо ТТ+ЭФР 10 сутки п=13 Группа 4к ТТ 20 сутки п=23 Группа 4о ТТ+ЭФР 20 сутки п=13

С095+, % 10,45+0,92 11,62±0,29 15,40+0,79 * 9,64±0,39 # 14,13±0,51 * 8,75+0,60 #

С095+, • Ю'/л 0,20±0,03 0,25±0,01 * 0,24±0,02 * 0,24+0,03 0,27±0,02 * 0,17±0,02 #

признаки апоптоза, % 7,50+0,66 7,77±0,44 11,20+0,61 * 6,27±0,42 8,63+0,62 5,75+0,48 #

признаки апо-птоза. •ю7л 0,13±0,01 0,17±0,02 0,17±0,01 * 0,15±0,02 # 0,17±0,02 0,11±0,02 #

Установлено, что количество нейтрофилов в крови снижается по мере уменьшения концентрации ИЛ-1(5 (11=0,62; р<0,05), а количество лимфоцитов, в том числе СШ • , СВ41, СЭ8+, СВ71+, НЬА-ВК+. увеличивается по мере увеличения уровня ИФН-у (соответственно 11=0,57; 11=0,54; 11=0,62; К—0.52; 11=0,42; 11=0,32; р<0,05).

Полагаем, что обнаруженные изменения иммунореакгивности имеют связь с локальными эффектами ЭФР в очаге повреждения при ТТ. Для проверки предположения применяли ЭФР при экспериментальной ТТ. Установлено, что на 3-14 сутки

меныпается выраженность в периферической крови нейтрофильного лейкоцитоза и имфоцитопении, количество лимфоцитов восстанавливается до уровня интактных "йботных. Снижается функциональная активность фагоцитов на 3-14сутки (таил. ). Функциональный резерв фагоцитов, оцениваемый в индуцируемом НСТ-тесте, ю изменяется и снижен при сравнении с группой интактных животных. Локальное рименение ЭФР приводит к восстановлению клеточного адаптивного иммунитета крыс на 7-28 сутки и не оказывает значимого влияния на выраженность гумораль-ого иммунного ответа крыс (табл. 8).

Таблица 4

Влияние локального применения эпидермалыюго фактора роста на показатели гуморального иммунитета у больных с термической травмой (М±т)

Группы / показатели

Группа 1 Здоровые 11=30

Группа 2 к ТТ 1 сутки п=23

Группа Зк

ТТ 10 сутки п=23

Группа Зо ТТ+ЭФР 10 сутки п=13

Группа 4

ТТ 20 сутки п=23

Группа 4о ТТ+ЭФР 20 сутки п=13

мг/мл

1,96±0,05

1,82±0,17

1,60±0,31

1,89+0,16

2,39+0,25

2,10±0,32

мг/мл

1,47±0,12

0,96+0,08

2,08+0,20

2,06+0,22

1,84+0,30

2,08+0,26

I? О, мг/мл

11,38±0,42

9,63±0,35

11,89±0,67

11,82±0,38

13,80±0,98

12,00±0,29

ЦИК, у.е.

36,60+6,27

35,00+2,57

45.67+6,56

54,78+6,28

40,00±4,98

39,00+5,73

Таблица 5

Концентрация цитокинов в сыворотке у больных с термической травмой в условиях локального _применения эпидермального фактора роста (М+т)___

Группы / показатели, пг/мл Группа 1 Здоровые п=30 Группа 2к ТТ 1 сутки 11=23 Группа Зк ТТ 10 сутки п=23 Группа Зо ТТ+ЭФР 10 сутки п=13 Группа 4к ТТ 20 сутки п=23 Группа 4о ТТ+ЭФР 20 сутки п=13

ИЛ-1(5 78,76±5,11 105,64±3,25 * 138,68±11,85 * 103,82±7,13 *# 87,28+4,76 82,28+4,11

ИЛ-4 1,75±0,14 1,28±0,09 * 1,78±0,12 1,37±0,22 2,15±0,17 1,99±0,11

ИФН-у 14,05±2,84 - 16,69±1,15 4,42+0,62 * 8,86±0,77 *# 11,18±1,19 12,77±1,00

ТФР-Р1 343,59+35,58 438,62±63,67 417,93+47,42 415,75±97,31 276,12+45,56 289,68+56,47

ЭФР 134,08+10,76 145,27±6,61 85,71+8,53 * 95,32±1б,92 * 128,49+10,09 111,92+13,37

При экспериментальной ТТ в условиях локального применения ЭФР отмечены изменения морфологии ожоговой раны (табл. 9). На 7-14 сутки наблюдения уменьшается представительство нейгрофилов, лимфоцитов и гистиоцитов, увеличивается количество фибробластов. К 28 суткам в очаге уменьшается количество фибробла-стов. Все это создает предпосылки для завершения альтеративных и сосудисто-экссудативных реакций и более ранней активации процессов восстановления поврежденных тканей.

Таблица 6

I ........ . . ___________________________. ..................................._ „

111'VJUV n LUI 'I j к/|\и т/и .vn'iit/n_vj\. v t и j л i>i и J it,) ч I 11L ^ mil 1 iv^i wot i "v иил!чш|л С ТСрМИЧССКОП ТрйБ-

Группы / показатели Группа 1 Здоровые п=22 Группа 2к ТТ 1 сутки п-14 Группа Зк ТТ 10 сутки п-14 Группа Зо ТТ+ЭФР 10 сутки п-14

ИЛ-1(3, пг/мл 13,30±1,30 17,36±0,50 * 27,62±1,33 * 20,31±2,92 *#

ИЛ-4, пг/мл 1,66±0,14 1,59±0,12 1,42±0,10 1,29±0.14

ИФН-у, пг/мл 5,03±0,51 4,07±0,27 1,9б±0,32 * 3,54±1,15 *

ТФР-pl, пг/мл 517,09±74,88 591,25±53,73 443,37±39,05 525,69±26.85

ЭФР, пт/мл 74,84±4,28 71,96±4,39 36,71 ±5,97 * 49,3 8± 12,62 *

Локальное применение ЭФР приводит к сокращению площади и ускорению скорости эпителизации раневого дефекта при сравнении с контрольной группой крыс в интервале с 3 по 21 сутки (табл. 10). Полного заживления раны к 28 суткам не происходило.

Установлено, что протекторные эффекты ЭФР в очаге повреждения имеют значимую связь с изменением иммунореактивности при ТТ: количеством в крови ней-трофилов и лимфоцитов, функциональной активностью фагоцитов, выраженностью клеточного адаптивного иммунитета, а также представительством в очаге повреждения нейтрофилов, лимфоцитов, гистиоцитов, фибробластов.

Полагаем, что локальное применение ЭФР при ТТ приводит к ограничению вторичной альтерации в очаге повреждения и как следствие нейтрофильной инфильтрации. В свою очередь, снижение масштабов повреждения в очаге повреждения препятствует гиперергическому характеру развития воспалительного процесса: эскалации сосудисто-экссудативных реакций, потере автономности очага и избыточному поступлению аутокоидов в системный кровоток, о чем свидетельствуют изменения иммунореактивности. В частности, снижение нейтрофильного лейкоцитоза в крови, функциональной способности фагоцитов, секреторной активности мо-нонуклеаров, ограничение апоптоза лимфоцитов и сдерживание иммунодепрессии. В свою очередь, благоприятный фон иммунореактивности организма способствует реализации пролиферативных и репаративных реакций в очаге повреждения, что подтверждается более ранним представительством фибробластов.

Нельзя исключить и прямое стимулирующее влияние ЭФР на репарацию. Известно, что ЭФР через специфические мембранные рецепторы стимулирует таксис противовоспалительных клеток, модулирует пролиферацию и дифференциацию восстанавливающихся после повреждения клеток, особенно эпидермоцитов, активирует пролиферацию фибробластов и влияет на продукцию ими простагландинов, протеогликанов, коллагена, ростовых факторов и ряда цитокинов (Fchg J. et al., 2005; Radulescu A. et al., 2010; Zhang L. et al., 2006; Yang J., 2007). Взаимосвязь иммунореактивности, клеточного состава очага повреждения и скорости заживления ожоговой раны при ТТ в условиях локального применения ЭФР представлена на интегральной схеме (рис. 3).

Таблица 7

Влияние локального применения эпидермалыюго фактора роста на функциональную активность фагоцитов периферической 1:рови ____ при экспериментальной термической травме (М±ш)__________

Группы живот- Группа 1 Группа 2к Группа 2о Группа Зк Группа Зо Группа 4к Группа 4о Группа 5к Группа 5о Группа 6к Группа 6о Группа 7к Группа 7о

ных / Показа- Интакт-ные 1 сутки ТТ 1 сутки ТТ+ЭФР 3 сутки ТТ 3 сутки ТТ+ЭФР 7 сугки ТТ 7 сутки ТТ+ЭФР 14 сутки ТТ 14 сутки ТТ+ЭФР 21 сутки ТТ 21 сутки ТТ+ЭФР 28 сутки ТТ 2^5 сутки ТТ-ЭФР

тели п=18 п=8 п=8 п=8 п-8 п=8 п=7 п=8 п=8 п=8 п=8 п=8 п=8

НСТ- 18,0±2,5 29,9±4,2 25Д±2,4 26,8±2,6 18,8±2,9 25,8±2,7 18,8±2,9 26,3±3,8 19,0±2,5 25,0±4,9 21,4±2,9 22,9±1.7 21,9±3,3

тест * * # * # * #

спонт.,

акт-гь, %

НСТ-тест 0,3±0,1 0,4±01 0,3±0,1 0,4±0Д 0,4±0,1 0,4±0,1 0,2±0,1 0,4±0,1 0,3±0Д 0,3±0,1 0,3±0,1 0,3±0Д о,з±од

спонт., *

инт-ть,

у.с.

НСТ-тест 28,9±4,2 25,4±2.5 29,8±3,1 20,3±2,9 22,4±1,3 18,8±2,5 19,5±1,7 31,3±3,4 26,6±2,9 30,4±1,0 28,8±2,0 25,7±1.9 32,9±3,7

индуцир., * * *

акт-ть, %

НСТ-тест 0,4±0Д 0,3±0,1 0,4±0,1 о,з±од 0,3±0,1 0,3±0,1 0,3±0,1 0,4±0,1 0,4±0Д 0,4±0,1 0,5±0,1 0,4±0,1 (1,5±0Д

индуцир., *

ипт-ть,

у.е.

Акт-ть 31,2±2,8 59,3±3,9 54,1±3,1 74,3±2,9 59,0±3,3 78,0±3,2 61,4±4,6 53,7±5,9 38,5±2,3 41,4±5,9 31,7±3,1 45,4±7,2 36,4±4,3

фагоци- * * * » * *# * #

тоза, %

Инт-ть 0,7±0,1 1,9±0,4 1,3±0,3 3,5±0,6 2,0±0,3 2,7±0,2 2,0±0,4 1,8±0,8 0,9±0,2 1,5±0,4 0,9±Я,2 1,1 ±0,4 ] ,0±0,3

фагоци- * * * # * *# * # * #

тоза, у.е.

Фагоцит. 2,2±0Д 2,9±0,5 2,2±0,3 4,6±0,6 3,3±0,3 3,5±0,2 3,1 ±0,4 2,9±0,8 2,4±0,3 2,7±0,3 2,4±0,3 2,6±0,5 ::,4±о,2

число, * * * # * *

у.е.

Примечание. Здесь и далее * - статистически значимые (р<0,05) различия при сравнении с группой 1, #-при сравнении контрольной (к) И ОПЫТНОЙ (о) групп (Р2К-Р2С,; РЗк'РЗо; Р4к"Р4<>; РйтРго! Рбк"Рбс>; Р7к"Р7о).

Таблица 8

Влияние локального применения эпидермального фактора роста на показатели адаптивного

Группы Группа Группа Группа Группа Группа Группа Группа Группа Группа

/ Пока- 1 4к 4о 5к 5о 6к 6о 7к 7о

затели Ин- 7 сут. 7 сут. 14 сут. 14 сут. 21 сут. 21 сут. 28 сут. 28 сут.

такт- TT ТТ+ЭФР TT ТТ+ЭФР TT ТТ+ЭФР TT ТТ+ЭФР

ные п=8 п=8 п=8 п-8 п=8 п=8 п=8 п=8

п=18

ГЗТ. мл 0,36 0,20 0,36 0.22 0,40 0,20 0,34 0,15 0,37

±0.03 ±0,05 ±0,05 ±0.02 ±0,06 ±0,02 ±0,06 ±0,05 ±0,06

* # * # * # * #

АОК се- 192,2 74,5 82,9 48,1 67,9 164,5 178,0 168,6 184,26

лезенки, ±24,7 ±15,4 ±16,6 ±13,5 ±17,3 ±17,5 ±12,4 ±15,4 ±13,39

■ 104ед. * * * *

АОК се- 125,3 46.6 106,8 24,8 29,9 96,6 102,07 102,16 116,46

лезенки, ±33,5 ±8,4 ±32,9 ±3,9 ±9,3 ±18,2 ±9,35 ±7,84 ±11,81

• 106 * * *

яск

Таблица У

Влияние локального применения эпидермального фактора роста на количественный состав клеток ожоговой раны при экспериментальной термической травме (М±т)_

Группы / Группа Группа Группа Группа Группа Группа Группа Группа

Показа- 4к 4о 5к 5о 6к 6о 7к 7о

тели 7 cvt. 7 сут. 14 сут. 14 сут. 21 сут. 21 сут. 28 сут. 28 сут.

TT ТТ+ЭФР TT ТТ+ЭФР TT ТТ+ЭФР TT ТТ+ЭФР

п=10 п=7 п=10 п=7 п=10 п=7 п=10 п=7

НФ, 70,5±7,9 5,8±1,2 27,9±1.6 6,8±1,2 4,9±1,7 5,3±1,2 0,1±0.1 0,1±0,1

ед./п.зр. # #

ЛЦ, 12,9±0,1 6,3±0,3 15,7±1,7 5,6±0,1 7,0±0,4 8,9±0,8 7,0±0,8 7,1±0,4

ед./п. зр. # #

ГЦ, 18,1 ±0,2 10,7±0,3 14,7±0,6 14,9±0,5 13,3±1,8 0,9±0,6 11,3±0,3 13,6±0,7

ед./п. зр. #

ФБ, 2,7±0,5 11,3±1.8 11,9±1,2 9,3±0,7 17,1 ±3,6 13,5+1,7 16,3±0,5 11,0±0,6

ед./п. зр. # #

Примечание. НФ - нейтрофилы, ЯЦ - лимфоциты, ГЦ - гистиоциты, ФБ - фиЬробласты

Таблица 10

Влияние локального применения эпидермального фактора роста на показатели заживления ожоговой раны при экспериментальной термической травме (М±т)

Показатели / Группы животных Площадь ожоговой раны, см* Снижение площади ожоговой раны, % Скорость эшггелизацин ожоговой раны, %

Группа 2к 1 сутки ТТ (п=10) 13,21±0,45 0 0

Группа 2о 1 сутки ТТ+ЭФР (п=7) 13,21 ±0,45 0 0

Группа Зк 3 сутки ТТ (п=10) 13,21±0,45 0 0

Группа Зо 3 сутки ТТ+ЭФР (п=7) 6,62±0,32 # 49,58+3,11 # 99,16+6.21 #

Группа 4к 7 сутки ТТ (п=10) 10,39+0,55 21.07+4,42 82,21+23,31

Группа 4о 7 сутки ТТ+ЭФР (п=7) 2,13±0,25 # 83,87±1,93 # 268,28±18,92 #

Группа 5к 14 сутки ТТ (п=10) 6,63+0,39 49,59+3,36 251.23+24,31

Группа 5о 14 сутки ТТ+ЭФР(п=7) 1,70±0,28 # 87,14±2,13 # 252,87+27,47

Группа 6к 21 сутки ТТ (п=Т0) 3,71±0,28 71,5±2,58 296,95+47,48

Группа 6о 21 сутки ТТ+ЭФР (п=7) 1,08+0,11 # 91,87+0,65 # 227,18+42,76

Группа 7к 28 сутки ТТ (п=10) 0,8±0,16 93,3+1,25 536,1±26,35

Группа 7о 28 сутки ТТ+ЭФР (п=7) 0,48+0,08 96,33±0,64 354,37+84,59

Термическая травма кожи

Изменение иммуиореактивности организма Очаг повреждения

Рис. 3. Взаимосвязь иммуиореактивности, клеточного состава очага повреждения и скорости заживления ожоговой раны при термической травме в условиях локального применения эпидермального фактора роста.

Двусторонние стрелки обозначают установленные статистически значимые (р<0,05) связи между показателями

выводы

1. Изменения иммунореактивноети при термической травме включают снижение представительства в периферической крови СВЗ+, С04+, СВ8+, СВ22+ лимфоцитов, увеличение количества Т-клеток, несущих мапкеп поздней активации СБ71+, повышение функциональной активности и снижение функционального резерва фагоцитов, угнетение ТЫ-и ТЬ2-зависимого иммунного ответа.

2. Изменение цитокинового профиля крови у больных с термической травмой включает повышение концентрации ИЛ-1Р на 1 и 10 сутки наблюдения, снижение -ИЛ-4 на 1 сутки , а ИФН-у и ЭФР -на 10сутки наблюдения, в том числе, в связи с одновременным изменением их продукции мононуклеарами периферической крови.

3. При термической травме одним из механизмов нейтрофильного лейкоцитоза в периферической крови выступает повышение концентрации ИЛ-1 р в сыворотке, а механизмами лимфоцитопении -снижение уровня ИФН-у в сыворотке, активация апоптоза лимфоцитов и увеличение лимфоцитарной инфильтрации в очаге повреждения.

4. Уменьшение площади раневого дефекта и увеличение скорости его эпители-зации при термической травме происходит по мере снижения количества нейтрофилов в крови и в очаге повреждения, увеличения количества лимфоцитов в крови и в очаге повреждения, снижения функциональной активности фагоцитов, восстановления ТЫ - и ТЬ2-зависимого иммунного ответа.

5. В условиях локального применения эпидермального фактора роста при термической травме количество нейтрофилов в периферической крови снижается по мере уменьшения концентрации в сыворотке и продукции мононуклеарами ИЛ-1|3, количество СБЗ+, С04 +-, СП8-, СБ22+лимфоцитов увеличивается по мере увеличения уровня ИФН-у в сыворотке и ограничения апоптоза лимфоцитов.

6. Локальное применение эпидермального фактора роста при термической травме приводит к снижению функциональной активности фагоцитов, восстановлению ТЫ зависимого иммунного ответа, снижению представительства в очаге повреждения фагоцитов и лимфоцитов, увеличению - фибробла-стов.

7. Ускорение заживления ожоговой раны в условиях локального применения эпидермального фактора роста определяется снижением количества нейтрофилов и функциональной активности фагоцитов в крови, увеличением количества лимфоцитов в крови, усилением ТЫ зависимого иммунного ответа, изменением клеточного состава очага повреждения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Осиков, М. В. Влияние эпидермального фактора роста на репара-

тивные процессы и показатели фагоцитарной активности при экспериментальной термической травме / М. В. Осиков, Д, Н. Барсукова, Д. В. Алексеев, А.

Г. Лихачева // Вестник РГМУ. - 2011. - № 1. - С. 300-301. - (Спецвыпуск).

2. Лихачева, А. Г. Влияние локального применения эпидермальпого фак-

п г* «ЧГЧГ^Т-О НО ГЦ» ППЛМ^ПвП 1 1ЛГЛ lltIKI ГНИТвТО ПП11 'Ч^лпвли» 4ЛНТОП1 » 1Г»М Tâm «II-

jy U риЧ> 1 U I1U 11 UiVUJU 1 upu/iv^viliivi W Г! l»li»l j 11/1JVJU ll^li ^IW11 VfpIilVlVli * Uvillilt/tl 1 ^pnui

с кой травме / А. Г. Лихачева, М. В. Осиков, Л. Ф. Телешева //Современные нау-ёмкие технологии. - 2012. - № 9. — С. 48-50.

3. Лихачева, А. Г. Исследование популяциоиного спектра лимфоцитов у льных с термической травмой II-IIIA степени / А. Г. Лихачева, Д. Н. Барсукова //

гуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины :материалы ^идейной 70-й открытой науч.-практ. конф. молодых ученых и студентов с между-р. участием. - Волгоград : изд-во ВолГМУ, 2012. - С. 290-291.

4. Лихачева, А. Г. Репаративные процессы при экспериментальной терми-ской травме в условиях локального применения эпидермального фактора роста / . Г. Лихачева, М. В. Осиков, Л. Ф. Телешева //Медицинские основы жизнедея-льности организма в норме, патологии и эксперименте : сб. тез. Всерос. молодеж-й конф. - Омск, 2012. - С. 67-68.

5. Осиков, М. В. Динамика цитокинового профиля у больных с терми-ской травмой в условиях местного применении эпидермального фактора ста / М. В. Осиков, А. Г. Лихачева, А. А. Федосов // Ангиология и сосудистая фургня. - 2012. - Т. 18, № 1. - С. 96-97. - (Приложение).

6. Осиков, М. В. К механизму иммунотропных эффектов эпидермаль-го фактора роста у больных с термической травмой / М. В. Осиков, А. Г. Ли-чева // Вести. Уральск, мед. акад. науки. - 2012. - № 4 (41). - С. 211.

7. Осиков, М. В. Популяционный спектр лимфоцитов у больных с термичкой травмой / М. В. Осиков, А. Г. Лихачева, Д. Н. Барсукова //Бюллетень Сев-

ГУ. - 2012.-Вып. XXVIII, № 1.-С. 147-148.

8. Осиков, М. В. Показатели врожденного иммунитета и морфология ara повреждения при экспериментальной термической травме /М. В. Оси-в, А. Г. Лихачева, Л. Ф. Телешева // Фундаментальные исследования. - 2012. №8(4. 2).-С. 381-386.

9. Лихачева, А. Г. Процессы апоптоза и количественный состав лейкоцитов больных с термической травмой при топическом применении эпидермального

актора роста/А. Г. Лихачева, М. В. Осиков //Материалы Шмеждунар. (Х-ой ито-вой) науч.-практ. конф. молодых ученых ЧелГМА. - Челябинск : изд-во ЧелГМА, 12. - С. 177-181.

10. Осиков, М. В. Секреторная активность мононуклеаров перифериче-ой крови у больных с термической травмой в условиях местного применения идермалыюго фактора роста /М. В. Осиков, А. Г. Лихачева, А. А. Федосов // нгиология и сосудистая хирургия. - 2012. - Т. 18, №1. - С. 75. - (Приложение).

11. Осиков, М. В. Цптокпновып профиль и секреторная активность ононуклеаров у больных с термической травмой при локальном применении

идермалыюго фактора роста /М. В. Осиков, А. Г. Лихачева, Л. Ф. Телешева Российский иммунологический журнал. - 2012. - Т. 6 (14), № 3 (1). -С . 11415.

12. Осиков, М. В. Патоморфологические аспекты локального применения идермального фактора роста при термической травме /М. В. Осиков, А. Г. Лиха-

чева, О. И. Огнева // Медицинский академический журнал. - 2012. — Т. 12, № 3. — С. 43-45.

13. Лихачева, А. Г. Влияние эпидермального фактора роста на показатели адаптивного иммунитета при экспериментальной термической травме / А. Г. Лихачева, М. В. Осиков, С. Е. Радаев, М. О. Матвеев //Материалы VI! Междунар. науч. конф. молодых ученых медиков. - Курск, 2013. - Т. II. - С. 179-181.

1 типографский лист ЮОэкз Общество с ограниченной ответственностью «ГРАФИКА 74» (ООО «ГРАФИКА 74»)

Адрес: 454091, г. Челябинск, ул. Красная 63, офис 19.

Отпечатано в типографии «ГРАФИКА 74» (ООО «ГРАФИКА 74») 454091, г. Челябинск, ул. Красная, 63 Обье 1 усл. п.л. Тираж 100 экз.