Автореферат и диссертация по медицине (14.00.46) на тему:Клинико-иммунологическая оценка эффективности лечения глубоких ожогов с использованием культивированных клеток кожи

На правах рукописи

Шаронова Елена Анатольевна

КЛИНИКО-ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕЧЕНИЯ ГЛУБОКИХ ОЖОГОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КУЛЬТИВИРОВАННЫХ КЛЕТОК КОЖИ

14.00.46 - Клиническая лабораторная диагностика 14.00.27 - Хирургия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Саратов - 2005

Работа выполнена в Саратовском Военно-медицинском институте и Институте хирургии им. А.В. Вишневского РАМН.

Научные руководители:

докт. мед. наук профессор Туманов Владимир Павлович; докт. мед. наук профессор Долишний Владимир Николаевич.

Официальные оппоненты:

докт. мед. наук профессор Блувштейн Григорий Авраамович; докт. мед. наук профессор Коршунов Геннадий Васильевич.

Ведущая организация: НИИ скорой медицинской помощи им. Н.В. Скли-фосовского (г. Москва).

Защита диссертации состоится "_" 200 г. в "_" час. на

заседании диссертационного совета Саратовского медицинского университета (410012, Саратов, ул. Б.Казачья, 112).

Автореферат разослан "_"_200 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Саратовского медицинского университета.

Ученый секретарь диссертационного совета докт. мед. наук профессор

Бородулин В.Б.

SLW 50L

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Техногенные катастрофы, участившиеся в последнее время и сопровождающиеся ростом термических поражений человека, позволяют считать ожоговый травматизм одной из важнейших проблем практической медицины (Смирнов С.В., 1997; Алексеев А.А.,1999; Xiao, 2000).

Всеобъемлющий хирургический подход к лечению ожоговой раны и значительные трудности при ликвидации острого воспаления при подготовке ран к пластическому замещению дефекта напрямую определяют поиск новых биотехнологических подходов к ауго дермопластике. Это связано с тем, что в современной комбусшологии остается нерешенной проблема закрытия глубоких обширных ожоговых поверхностей после хирургической некрэктомии, при которой выполнение аутодермопластики затруднено из-за дефицита донорских ресурсов кожи (Туманов В.Н.,1997; Белянский Н.В.,2000).

При этом в основу терапии ожоговой болезни (ОБ) и профилактики ее осложнений должен быть положен принцип, предусматривающий как коррекцию системных нарушений гомеостаза, так и одновременно оптимизацию процессов заживления ожоговой раны (Алексеев А.А.,1999), Последнее в большой степени зависит от функциональной активности иммунокомдетентных клеток, обеспечивающих скорость и адекватность репаративных процессов в ране, и от состояния аутоиммунитета, ответственного за трансплантационный иммунитет и, соответственно, успех кожной пластики (Linquist R.,1983).

Однако эти важнейшие аспекта патогенеза и лечения ран при ОБ освещены недостаточно (Клячкин И.М.,1996; Гринин А.М.,1997; Белянский Н.В.,2000), в то время как для решения вопроса об успешном оперативном лечении необходимо учитывать некоторые ключевые показатели гомеостаза в зависимости от особенностей иммунного статуса больного.

Следовательно, поиск новых подходов к улучшению результатов хирургического лечения глубоких ожогов, в частности, с использованием раневых пленочных покрытий с поверхностным слоем базальных кератиноцитов, а также разработка критериев прогнозирования исходов аутодермопластики по состоянию иммунокомпетентных клеток у обожженных определяют актуальность работа. Цель исследования

Оптимизировать клинико-лабораторную оценку состояния больных с глубокими ожогами для повышения эффективности хирургического лечения путем трансплантации комбинированных пленочных покрытий с клетками эпидермиса человека.

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ КИКЛИвТЕКА/

гтаз»

г* 4

Задачи исследования

1. Разработал, методики получения и технологию применения комбинированных пленочных покрытий с выращенными клетками базального слоя эпидермиса (аутокератиноцитами) и микротрансплантатами кожи для закрытия глубоких ожоговых ран.

2. Оценил, эффективность применения комбинированных пленочных покрытий с аутокератиноцитами и микротрансплантатами кожи при лечении глубоких ожогов и гранулирующих ран.

3. Исследовать динамику иммунитета и аутоиммунитета (аутоантиген-ное состояние кожи и внутренних органов) при использовании комбинированных покрытий с аутокератиноцитами и микрспрансплантатами кожи.

4. Определить прогностические критерии возможности применения покрытий с аутокератиноцитами и микрспрансплантатами кожи и аутодермо-лластик и по состоянию иммунного и аутоиммунного статуса пациента Положения, выносимые на защиту

1. Предлагаемые методики получения и применения комбинированных пленочных покрытий с выращенными клетками базального слоя эпидермиса (аутокератиноцитами) и микротрансплантатами являются эффективными для закрытая глубоких ожоговых ран в условиях дефицита донорской кожи

2. Результата проведения трансплантации покрытий и аутодермопластик обусловлены тяжестью поражения и характером иммунных и аутоиммунных реакций организма.

3. Исследование аутоиммунных реакций позволяет прогнозировать результата проведения трансплантации покрытий и аутодермопластик.

Научная новизна

1. Разработана ранее не описанная методика получения и применения комбинированных пленочных покрытий с выращенными клетками базального слоя эпидермиса (аутокератиноцитами).

2. Разработана ранее не описанная методика получения и применения комбинированных пленочных покрытий с микротрансплантатами кожи.

3. Изучена возможность прогнозирования результативности применения комбинированных покрытий с культивированными клетками и микротрансплантатами кожи по состоянию аутоиммунного статуса больных.

Практическая значимость:

1. Разработаны экономичные методики получения и технология применения комбинированных пленочных покрытий с выращенными клетками эпидермиса кожи человека для закрытия глубоких обширных ожоговых ран.

2. Комбинированные пленочные покрытия с аутокератиноцитами и микротрансплантатами кожи являются высокоэффективными средствами для закрытия глубоких ожоговых ран в условиях дефицита донорских ресурсов

кожи. Средние соотношения площади донорского участка и полученного трансплантата с аутокератиноцитами составили 1:168,8 и 1:249,4 - для микротрансплантатов при (р<0,89).

3. Изучены основные причины неудач применения как трансплантаций комбинированных покрытий, так и аутодермопластик, которыми являются тяжесть состояния пациента, нагноение ран и применение покрытий на неподготовленную поверхность.

4. Показатели степени иммунной недостаточности и глубокая разбалансиров-ка и несостоятельность клеточного звена иммунитета оказывает прямое влияние на результаты применения покрытий и аутодермопластик, сопровождалась в дальнейшем отторжением и лизисом аутокератиноцитов и микротрансплантатов, а также и расщепленных лоскутов кожи.

5. Установлено, что высокие титры аутоантител (выше соотношения 1:128) к коже, тимусу и селезенке свидетельствуют об активации аутоиммунных процессов и нецелесообразности проведения как трансплантаций комбинированных покрытий, так и аутодермопластик, в связи с очень высоким риском лизиса покрытая. Трансплантация должна быть отсрочена до проведения целенаправленной иммуномодулирующей терапии.

Апробация работы и внедрение в нраюнку

Материалы исследования доложены на международном симпозиуме «Новые методы лечения ожогов с использованием культивированных клеток кожи человека» (Саратов, 1998); Всероссийском съезде травматологов (Москва, 2000); международном медицинском форуме «Человек и травма» (Нижний Новгород, 2001); конференции молодых ученых СГМУ (Саратов, 2001); Всероссийском симпозиуме с международным участием "Теория и практика клеточных биотехнологий (Самара, 2004). Изданы методические рекомендации "Прогностические критерии проведения аутодермопластики по профилю аутоиммунного статуса коя® и внутренних органов у обожженных".

Метод внедрен в работу хирургического отделения ММУ «Больница N 7» г. Саратова, учебный процесс кафедры оперативной хирургии и топографической анатомии СГМУ, клиническую практику Российского ожогового центра МЗСР РФ (отдел термических повреждений ГУ "Нижегородский НИИТО МЗСРРФ).

По материалам диссертационного исследования опубликовано 14 печатных работ. Иммунологические исследования проведены в РосНИЛЧИ «Микроб», г. Саратов (Н.В.Емельянова, Л.В. Шанина).

Материалы и методы исследования

Исследование выполнено на базе Саратовского межрегионального ожогового центра с 1998 по 2001 гг. Всего в исследование включены 139 пациентов.

Для изучения эффективности покрытий с культивированными клетками было сформировано 4 группы. Распределение больных по группам проводили ретроспективно в зависимости от проводимого лечения. 1 группу {42 пациента) составили больные, которым трансплантировали выращенные пласш керати-ноцитов. 3 групп/ (33 пациента) составили больные, которых лечили микротрансплантатами на пленках. 2 и 4 группу (23 и 41 пациент) сравнения составили больные, которым выполняли традиционную аутодермолластику расщепленными кожными лоскутами. Выделение двух групп сравнения требовалось для того, что бы обеспечил, корректность сопоставления пациентов по площади и тяжести поражения - основного фактора, определяющего исход термической травмы. Подбор больных осуществляли слепым методом из пациентов, находившихся на лечении в тот же период времени.

Критерием включения пациента в исследование было наличие термического ожога ШБ-степени и гранулирующие раны. Критерии исключения: электротравма, химические ожога, наличие сопутствующих хронических заболеваний в стадии суб- и декомпенсации; смерть пациента в стационаре, наличие психического заболевания, требующего постоянного наблюдения, а также выраженная энцефалопатия с возбуждением больного.

Средний возраст пациентов составил 29,6+19,6 лет. Анализ не выявил существенных различий в возрасшом составе групп пациентов. Обращает на себя внимание двукратное преобладание мужчин. Диагностику глубины поражения кожи проводили традиционными методами. 6 исследование включены окончательные данные глубины поражения через 48 ч после травмы. Распределение пациентов по площади ожога представлено в таблице 1.

Таблица 1

Распределение пациентов по площади ожога в % от поверхности тела

Средняя площадь ожога

Группа N общая Поверхностные глубокие

1 42 36,2+10,5 10.5+3,8 25,8+6,7

2 23 44,3+11,8 13,5+6,4 34,1±9,2

3 33 25,3+6,4 15Д+7,2 11Д±3,2

4 41 23,9+5,3 10,2+4,7 13,8+5,8

Тяжесть поражения пострадавших рассчитывали на основании индекса тяжести поражения(ИТП) - модифицированного индекса Франка. ЙТП был предложен Н. Р. Панченковым и др. (1888). ИТП рассчитывали по формуле: ИТП=8п-ша + З'Бшв-гу Выделяли три степени тяжести термической травмы легкая - менее 30 баллов, средняя - от 30 до 59 и тяжелая - свыше 60 баллов. В дальнейшем мы изучили распределение пострадавших по тяжести поражения (табл. 2).

Таблица 2

Распределение пациентов по тяжести в зависимости от площади ожога

Группа Индекс тяжести поражения Тяжесть ожоговой травмы Всего

легкая Средняя тяжелая

а.ч. % Ал. % а.ч %

1 87, 9±56, 7 2 4,76 10 23,8 30 71,4 42

2 113,6142,7 О-2 р=0, 625) 0 0 3 13,0 20 86,9 23

3 48, 3+35,5 13 3974 9 27,2 11 33,3 33

4 51, 6+34, 8 (3,4р=0, 6931) 15 36,6 6 14,7 18 48,7 39

Примечание: верхний индекс - значение р между указанными группами

У всех здоровых и больных был проведен в динамике иммунологический мониторинг до проведения трансплантации покрытий с клетками и аутодермо-ззластшси и по мере наступления окончательных результатов, после чего больные были разделены на 5 групп в зависимости от исхода лечения. В исследование вошли 75 человек из 1-й и 3-й групп, которым была произведена трансплантация клеточных покрытий. В каждую труппу вошли больные с пластикой ран кератиноцитами и микротрансплантатами (табл. 3). Группу сравнения составили 18 человек из 2-й и 4-й групп, отобранных случайным методом, которым после некрэктомии и традиционного лечения провели аутодермопла-стику расщепленными кожными лоскутами. В исследование включены результаты обследования 7 здоровых мужчин и 5 женщин (5-я группа), сопоставимых по возрасту с группами сравнения.

Таблица 3

Распределение пострадавших в зависимости от вида проведенной пластики

Группа Вид пластического Количество Результат пластики

покрытия больных 1* 2* 3*

1 МАП + КЦ 33 33

2 МАП + КЦ 27 27

3 МАП + КЦ 15 15

4а Аутодермопластика 12 12

46 6 6

5 Здоровые 12

Всего 105 45 27 21

Примечание:!* - быстрое неосложненное приживление покрытий после 1 пла-

стики

2* - лизис покрытия после первой трансплантации и приживление после последующих;

3* - первоначальное частичное приживление с последующим лизисом

Всем пациентам после поступления проводили стандартную интенсивную терапию ожогового шока. Дальнейшее лечение пострадавших проводили комплексно. Оно включало в себя инфузионную, дезинтоксикационную терапию, коррекцию водно-электролитного баланса, антибактериальную терапию, направленную на предотвращение развития вторичного некроза. Хирургическую или ферментативную некрэктомию выполняли в сроки 10-12 суток от травмы. В зависимости от глубины поражения осуществляли различные типы операций: тангенциальную некрэктомию или тангенциальное очищение.

Технология выращивания и трансплантации культивированных керата-ноцитов человека включает в себя следующие этапы: отбор кожи у пострадавших (доноров), транспортировку биопхатов кожи в биотехнологическую лабораторию, выделение клеток базального слоя и наращивание многослойных пластов кератиноцитов (МПК), трансплантацию клеточных культур на подготовленные ожоговые раны и последующее ведение ран. Одним из необходимых условий успешного осуществления технологии является охсутсгвие микробной загрязненности. В связи с тем, что расщепленные лоскуш кожи толщиной 0,2-0,3 мм лучше пропитываются ферментом, выделение клеток происходит быстрее.

В процессе отработки метода было установлено, что кератиноциты из кожи тяжелообо жженных пролиферируют в культуре значительно хуже, чем клетки, взятые от здоровых доноров. Кроме того, биоптаты кожи лучше всего отбирать в первые часы после травмы или непосредственно после выхода пострадавшего из состояния ожогового шока. Хранение лоскутов кожи при комнатной температуре не позволяет выделить из них достаточное количество жизнеспособных клеток, пролиферация кератиноцитов в культуре происходит вяло. Лоскуты кожи хранили при пониженной температуре (0 - +4С°) и стремились к тому, чтобы до начала выделения клеток проходило не более 72 ч.

Трансплантацию на раневую поверхность и выращенных пластов кера-тиноцитов и микротрансплантатов осуществляли на микропористых матриксах "копрофан" и выполняли в операционной.

Раневую поверхность после наложения выращенных пластов кератино-цитов закрывали влажно-высыхающей повязкой с раствором антибиотика (це-фалоспорины 1-2 генерации, геигамицин) в количестве 1,0 на 100 мл 0,9%-ного раствора хлорида натрия. Раневую поверхность после наложения пленок с микроаутотансплангатами также закрывали влажно-высыхающей повязкой с раствором антибиотика.

Сроки трансплантации зависели от вида раны: на дермальную поверхность монокультуры клеток накладывали фазу после некрэкгомии, на раны, представленные подкожно-жировой клетчаткой - через 7-8 дней - после образования грануляционной ткани.

Выделение базальных кератиноцитов из кожных лоскутов проводят с помощью обработки ферментами- трипсином, коллагеназой, диспазой, а также различными сочетаниями ферментов. В нашей работе мы использовали раствор трипсина 0,25%. Под его действием происходит разрушение межклеточных связей и кератиноциты высвобождаются в среду в виде единичных клеток или агрегатов, состоящих из разного количества (от 4 до 30) эпидермоцитов. В нашей работе было выявлено, что кератиноциты, находящиеся в агрегатах, лучше сохраняют жизнеспособность, чем единичные клетей. Эффективность культивирования кератиноцитов во многом зависит от того, как была выполнена процедура выделения клеток. Избыточная обработка трипсином приводит к резкому снижению жизнеспособности кератиноцитов.

Мы выращивали кератиноциты в ростовой среде ОМЕМ и Р-12 в соотношении 1:2 с добавлением 10%-ной эмбриональной телячьей сыворотки. В среду вносили эмбриональный фактор роста, инсулин, глютамин, селенит натрия.

Культивировали в пластиковых чашках Петри на фидерном слое 0, 8-1%-ного раствора коллагена для кондиционирования ростовой среды биологически активными веществами и лучшего прикрепления клеток. Инкубацию клеток вели в инкубаторе при температуре 37 градусов и с концентрацией углекислого газа в атмосфере 5%. Через 48 часов производили смену среды. В это же время наблюдалось образование колоний кератиноцитов. Ростовую среду меняли каждые 3 дня. Клетки активно делятся и формируют крупные колонии. Через 2 недели колонии сливаются между собой и на третьей неделе роста сформировавшийся клеточный пласт трансплантировали на подготовленные раны. О зрелости пласта судили, главным образом по картине, наблюдаемой в инвертированном микроскопе.

Выращенные многослойные пласты кератиноцитов могут быть пересажены на различные виды ран. Приживление клеток происход ит только при пе-

ресадке на хорошо васкуляризированное раневое ложе. Пленочные матриксы с культивированными клетками использовали после тщательной подготовки ожоговых ран.

Извлечение матриксов с клетками из культуральных чашек проводят осторожно двумя пинцетами таким образом, чтобы пленочные покрытия не сворачивались и не слипались. Внимательно следили за плотностью прилегания матриксов к раневой поверхности. При образовании пузырей или скопления крови их удаляет из под пленки осторожными движениями браншей пинцета по направлению от центра к краю раны. Через 2 суток при перевязке фиксирующую повязку осторожно снимали, чтобы не сместить пленочный матрикс, и оценивали состояние раны под ним. Если не отмечали скопления эксудата, то рану закрывали влажно-высыхающей повязкой Последующие перевязки проводили через день, матриксы удаляли после полной эпителизации раневой поверхности. При скоплении экссудата пленку надсекали, содержимое удаляли и вновь накладывали повязку.

При глубоких ожогах Ш Б-1У степени после выведения пострадавших из шока производили иссечение некротических тканей и гемостаз. Затем раны подготавливали к трансплантации клеточных культур с помощью коллагено-вых покрытий, которые способствуют раннему началу регенерации соединительной ткани. Площадь ран к моменту трансплантации культуры клеток сокращается на 20-40%. После этого на раневую поверхность накладывают пленки с культивированными клетками, которые фиксируют к ране повязками.

При наличии признаков развития инфекции в ране (пропитывание повязок пятнами бурого или зеленоватого цвета, неприятный запах) делали перевязку в более ранние сроки. Во время первой перевязки недопустимо использовать перекись водорода. Последующие перевязки делали с интервалом в одни сутки и использовали мази на водорастворимой основе. Необходимо следить, чтобы на участки с пересаженными клетками не было давления.

В случаях иссечения струпа до поверхностной фасции или подкожно-жировой клетчатки наложение клеток кожи осуществляют после формирования грануляционной ткани.

В условиях лаборатории и клиники был отработан оптимальный режим выполнения операции микроаутодермопластшси для восстановления кожи. Микротрансплантаты (МТ) размерами 1*1 мм наносили на микропористую пленку "Копрофан", предварительно обработанную 0, 8-1%-ньш раствором коллагена дермальной поверхностью вверх. Добавлялся минимум питательной среды для прикрепления микротрансплантатов к поверхности подложи! (4-5 мл), а после прикрепления МТ - среда для роста кератиноцитов (ОМЕМ:Р-12 + 10% эмбриональной телячьей сыворотки) в количестве 10 мл на объем стандартной чашки Петри. В таком виде пленочные матриксы с микротрансплантатами можно сохранять долгое время (максимум при наших наблюдениях - 30

дней) и трансплантировать на рану по мере ее готовности. С целью упрощения технологии получения МТ применяли метод, предложенный Б. А. Парамоновым (1991). Расщепленную кожу дважды пропускали между валиками перфоратора кожных трансплантатов (1:6) фирмы СоШпб (Франция) во взаимно перпендикулярных направлениях. Микроаутодермопластику использовали при лечении 33 обожженных с глубокими ожогами на пораженной площади от 10% до 80% тела. Одномоментно этим методом восстанавливали кожный покров на площади от 0,6% до 22%. Во всех случаях микротрансплантаты накладывали на микропленке.

Методы исследования включали в себя проведение комплексного клини-ко-лабораторного обследования больных (клинический и биохимический анализ крови, мочи, коагулограмму, ежедневный контроль за кислотно-основным состоянием крови, показатели гематокрита, бактериологическое исследование ран) с оценкой клинического течения ожоговой болезни.

Оценку иммунного статуса проводили следующими методами. Лимфоциты выделяли из периферической крови с использованием гепарина (100 ЕД/мл) методом седиментации клеток на градиенте фиколлверографина (плотность 1, 077 г/мл); фенотипирование лимфоцитов методом иммунофлуорес-центного анализа с помощью панели моноклональных антител по СД-рецепторам на люминесцентном микроскопе "Люмам Р-84" (спектр возбуждения 500-700 нм), проведено выборочно в каждой группе (1, 2, 3, 4) пациентов. Степень иммунной недостаточности (СИН) оценивали по основным видам СД-рецепторов (Гринин АН, 1998): (показатель СД больного/ показатель СД здорового - 1 ) * 100%; при этом знаки "+" или "-" соответственно указывают на гипер- или гипофункцию определенного рецептора СД (показатель 1-33% -транзиторность процесса, не требующего коррекции (1 СИН); 34-66% (2 СИН) требует иммунокоррекции; превышение 60% (3 СИН) - полная разбалансиров-ка работы иммунного рецептора СД). Определение иммуноглобулинов классов А, М, в проводили методом радиальной иммунодиффузии в геле; определение циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) - методом селективной преципитации в тест-системе с полиэтиленгликолем (ПЭГ -6000) на спектрофотометре СФ-46-450 нм; определение молекул средней массы (МСМ) по НИГабриэяян с соавт. (1981) в модификации МЯ.Малаховой (1995); определение лейкоцитарного индекса интоксикации (ЛИИ) по Кальф-Калифу (1941); оценку аутоиммунного статуса - с использованием противоорганных эритро-цитарных антигенных диагностикумов '^ер-система" (к коже, печени, почкам и др.), позволяющих выявлять сывороточные гомологичные аутоантитела в сыворотке больного (Шанина Н.Ю., 2000). Аутоантитела в нативной сыворотке крови выявляли микрометодом в РНГА, титр в норме не превышает значений 1:4. Оценка показателей клеточного звена иммунитета: функциональная актив-

носп. лимфоцитов в реакции бласггрансформации (РБТЛ) с фитогемаглюти-иином (ФГА) (подсчет радиоактивности Зн тимидина с активностью 17 МеВ^шМ жидким сцинтилляционным методом (Емельянова Е.В., 1992); активность интерлейкина 1 (ИЛ-1) в присутствии митогена ФГА (ОррепЬепп С.е1 а1., 1980); активность интерлейкина 2 (ИЛ-2) (рост клеток в присутствии кон-ковалина А-кон-А (Емельянова КВ., 1992).

Результаты исследований обработаны методом вариационной статистики, с определением средних величин (X и их ошибок ш) и сравнением средних с помощью критерия (1) Стьюдента. Для оценки результатов серологических реакций РИГА использовали метод арифметического усреднения (Веяепвоп МБ. а1., 1968), каждому разведению присваивая числовой индекс, что позволяло оценивать и отрицательные результаты; при расчетах оперировали с индексом в качестве вариант. Результаты исследования

Особый интерес к исследованиям и внедрению новых технологий закрытия ожоговых ран обусловлен дефицитом кожных покров при использовании традиционных методов пластики глубоких ожогов. Как известно, даже использование перфорированных лоскутов проблему не решает. Крайние степени расширения перфорированных лоскутов резко снижают эффективность пластики. Мы провели исследование использованных методов закрытия ран для оценки их эффективности и перспективности в лечении распространенных глубоких ожогов. Ниже мы приводим характеристику использованных методов.

Средняя площадь покрытий представлена в таблице 4. Необходимо сказать, что остальные дефекты кожных покровов у пациентов 1-й и 3-й групп закрывали при помощи аутодермопластик расщепленным кожным лоскутом.

Таблица 4

Г РУп па Средняя площадь покрытия Средняя площадь АДП

1 744,52±78,179 2352,61±154,162

2 4090,43±134,8411Д (р=0,000026)

3 179,03+14,629 1144,54+106,859

4 1656,58+105,988(3'4 р=0,043190)

Обращают на себя внимание статистически значимые различия в площади выполненных аутодермопластик в опытных группах (1 и 3) и в группах сравнения (2 и 4). Это означает, что данные методы лечения позволяют существенно снизить площадь донорских поверхностей, а значит и потенциально

увеличить вероятность сохранения жизни пострадавшим с большей площадью глубоких ожогов.

Интересно проследить соотношение донорских участков. В 1-й группе площадь донорских участков составила в среднем 6.3+0.69 см2, а в 3-й -15,5+5,79 см2. Различия между показателями статистически незначимы и составили р=0,3098.

Ввиду практически идентичности эффективности закрытия ран культивированными кератиноцитами и микроаутодермопластикой (1 и 3 группы) мы исследовали объединенные данные для повышения точности исследования и установили, что площадь покрытия обнаруживает умеренную корреляционную связь со сроками лечения пострадавших (г=0,563; р<0,05). Выявлена умеренная зависимость сроков приживления трансплантатов в 1-й и 3-й группах от их площади (1^=0,295; р<0,05). Для 2 и 4 -х групп эта связь оказалась намного слабее и не превышала г=-0,15 при р<0,05. Далее встал вопрос, в какие сроки впервые использовали культивированные покрытия в сравнении с первой ау-тодермопластикой в той же группе. В 1-й группе покрытия с культивированными кератиноцитами применяли в среднем на 21,5+9,5 сутки, а аутодермо-пласгаку выполняли на 19,6+2,7 сутки (р<0,45). В 3-й группе покрытая с МАП применяли в среднем на 27.8+9.7 сутки, а аутодермопластику выполняли на 16,7+8,1 сутки. Различия между сравниваемыми параметрами значимы (р<0,0045).

Таким образом, покрытия с культивированные аутокератиноцитами применяли в среднем на неделю раньше, чем аутодермопластику, так как различия между сроками выполнения аутодермоплаегак в 1 и 3-й группах статистически незначимы (р<0,42).

Площадь выращенных покрытий составила в 1-й труппе 744,5+78,18 см2 (от 75,0 до 3000,0) и в 3-й группе 179,0+14,63 см2 (от 40,0 до 500,0), р<0,0002. При том, что площадь донорских участков кожи, взятых для выращивания данных покрытий составила в 1 группе 6,3 ± 0,69 кв.см, и в 3-й 15,5 ± 5,79 кв.см.

Далее мы рассчитали процент закрытия глубоких ожогов культивированными покрытиями, который составил для 1-й группы 24,4+2,06% (от 3,2 до 77,5%) и 16,5+1,23% (от 0 до 40,0%) - для 3-й группы. Различия между группами составили р<0,059.

Мы оценили эффективность методов получения трансплантатов в 1 и 3-й группах, разделив площадь выращенного покрытия на площадь взятого для культивирования участка кожи. Средние значения эффективности составили 168,5 (от 59,7 до 450) для 1-й группы и 248,5 (от 62,5 до 588,2) - для 3-й группы ( рис. 1). Различия между группами незначимы (р<0,89).

Рис. 1.

Сравнительная эффективность методов - соотношение площади донорского участка для культивирования клеток к площади полученного покрытия (1 и 3-я группы)

Далее мы решили проверить, влияет ли эффективность каждого из исследуемых методов лечения на вероятность лизиса покрытия. Анализ показал, что корреляционная зависимость для 1-й группы составила а для 3-й

группы г=-0,05 при (р<0,05). Следовательно, стремление повысил эффективность покрытий не отразится на вероятности лизиса культивируемых покрытий.

В 1-й труппе был отмечен 21 случай лизиса покрытая, в 3-й группе - 11. Оценить общую картину лизисов покрытий не представляется возможным вследствие того, что за случай использования покрытия принимали трансплантацию от 1 до 9 пластов, в то время как за каждый случай лизиса - неприживление хотя бы одного из пересаженных пластов.

Основные неудачи в лечении ожоговых ран связываются с лизисом как аутодермальных лоскутов, так и раневых покрытий. В табл. 5 мы приводим анализ частоты случаев лизиса раневых покрытий в 1-4 -й группах.

Таблица 5

Основные характеристики случаев лизиса раневых покрытий

Гр. Частота лизиса покрытий Средняя площадь лизиса покрытия^) Частота лизиса аутодермальных лоскутов Средняя площадь лизиса лоскута (%)

абс.ч % абс.чи с. %

1 26 61,9 59,6+2,87 0

2 - - - 4 16,7 85,0+17,3

3 11 33,3 56,3±2,90 2 6,1 100,0±0

4 - - - 22 53,7 57,4±3,84

Р - - 1,3 0,7557 - - 0,1730

Примечание: верхний индекс - значение р между указанными группами

Анализ показывает, что при достаточно высокой частоте лизисов статистически значимых различий площади лизиса покрытий в 1 я 3-й труппах не

отмечено. Также не выявлено различий по площади лизиса аутодермалышх лоскутов между группами сравнения (2 и 4-я группы), хотя их однородность уже была доказана ранее. Средние данные для 2 и 4-й групп составили 60,9+3,74%. Сравнение их с 1-й группой выявило, что р=0,8487, а с третьей -р=0,5378. Среднее количество лизисов покрытий с культивированными ауто-кератиноцитами (1-я группа) составило 0,6+0,05, а микроаутодермальных покрытий - 0,3+0,05. Различия между группами статистически значимы (р=0,0146). Среднее количество лизисов аутодермалышх покрытий составило • во 2-й группе 1,5+0,6, в 3-й - 1,0+0,0 и в 4-й - 1,5+0,7. Статистических разли-

чий между 2 и 4-й группами нет (р=1,00). 2 случая лизиса аутодермального покрытия в 3-й группе мы не сравнивали ввиду отсутствия их в 1-й группе. Сле-1 довательно, независимо от применяемых методов пластического закрытия ран,

частота и площадь лизисов покрытий и аутодермалышх лоскутов остаются одинаковыми.

Анализ случаев повторных лизисов аутодермалышх лоскутов мы проводили с объединенными данными 2 и 4-й групп ввиду отсутствия между ними других различий, кроме степени тяжести. Повторных лизисов покрытий не было, так как повторно трансплантацию клеток и покрытий с микротрансплантатами не выполняли. Изучение случаев повторных лизисов и их площади показывает, что у большинства пострадавших с тотальными лизисами они возникали повторно и в 40% случаев имели обширный характер. Кроме того, подавляющее количество случаев лизиса во всех группа превышает 50% площади пересаженного аутодермального лоскута, что также вряд ли можно объяснить только техническими причинами. Данные случаи, как доказано далее, обусловлены механизмами аутоагрессии.

В литературе имеются указания на то, что одним из основных факторов, влияющим на лизис покрытий, является тяжесть травмы. Мы решили более подробно исследовать данную проблему. Зависимость количества случаев лизиса покрытий и аугодермальных лоскутов в зависимости от тяжести пострадавших представлена на рис. 2.

Рис. 2.

Зависимость количества случаев лизиса покрытий (1, 3-й группы) и АД лоскутов (2, 4-й группы) в зависимости от тяжести повреждения (легкой, средней и тяжелой).

Различия между группами значимые (Р<0,05).

1 группа 2 группа 3 группа 4 группа

На первый взгляд, можно было бы сделать вывод, что имеет место выраженная вероятность лизиса покрытий с КЦ у тяжелых пациентов 1-й группы и отсутствие таковой в 3-й группе. Но для того, чтобы нивелировать различия между группами по степени тяжести пациентов, мы провели дальнейшие исследования. Выявлена умеренная положительная связь (рис. 2) тяжести повреждения и факта (вероятности) лизиса покрытия при трансплантации аутокера-тиноцитов в 1-й группе (г=0,445 при р<0,05). Дальнейший анализ показал, что в 3-й группе тяжесть травмы и факт лизиса покрытия также обладают умеренной положительной корреляционной связью (гН),372; р<0,05), а степень этой • зависимости практически идентична таковой в 1-й группе. При изучении зависимости тяжести травмы от вероятности лизиса пересаженных расщепленных аутодермальных лоскутов у пациентов 2 и 4-й групп, обнаружена слабая обратная связь (г=-0,16 при р<0,05). Учитывая, что И111 является производной величиной, мы проанализировали зависимость вероятности лизиса от глубины и площади поверхностных и глубоких ожогов. Распространенность поверхностных ожогов не влияла на вероятность лизиса покрытий в 1 и 3-й группах <п=-0,28 и г=-0,03), а также и лоскутов во 2 и 4-й группах (п=-0,09) при р<0,05. Распространенность глубоких ожогов обнаруживает умеренное влияние на вероятность лизиса покрытий в 1 и 3-й группах (г=0,33 и г=0,50), а во 2 и 4-й группах практически нет (г=Ч),20) при р<0,05. Следовательно, с увеличением площади глубокого ожога вероятность лизиса покрытий повышается. Таким образом, тяжесть повреждения практически не влияет на вероятность лизиса расщепленного аутодермального лоскута и умеренно влияет на вероятность лизиса покрытия с культивированными аутокератиноцитами и макроаутодер-мотрансплантатами.

В дальнейшем мы решили выявить, влияет ли тяжесть травмы на количество повторного лизиса у пациентов 2 и 4-й групп и обнаружили что ЩШ имеет обратную связь с количеством лизисов (г=-0,30; р<0,05), причем за счет глубоких ожогов (г= -0,38; р<0,05). Распределение обнаруженных причин неудачных попыток пластического закрытия ожоговых ран приведено ШЩЙрб.

Таблица 6.

Причины неудач пластического закрытия ран

Причины неудач пластического Группа

закрытия ран 1 2 3 4

Аб % Аб % Абс % Абс %

с.ч с.ч ч. ч.

Тяжесть состояния 5 33,3 ] 5,9 4 21,1 2 10

Нагноение ран 5 33,3 4 23,5 5 26,3 6 30

Наличие грибковой флоры 1 6,7 0 2 10,5 0

Вялые грануляции 1 6,7 4 23,5 1 5,3 3 15

Вторичный некроз 0 5 29,4 1 5,3 5 25

Выполнение пластики после некрэкгомии 3 20,0 2 11,8 6 31,6 3,0 15

Наличие остатков подкожной клетчатки 1 5,9 0 1 5

Всего 15 100 17 100 19 100 20 ¡100

Кроме того, во 2 и 4-й группах на площадь лизиса не влияют ни пол - г=-0,05 (г=-0,16 для 1-й группы и г=-0,14 для 3 группы), ни возраст - г=-0,01 (г=-0,1 для 1 и г=0,23 - для 3-й группы), ни время выполнения некрэкгомии (г=-0,1 ч для всех групп). Пол, возраст и время выполнения некрэкгомии также имеют

слабую связь (к-0,3 во всех группах) с вероятностью лизиса аутодермальных покрытий. Для всех случаев р<0,05. Следовательно, лизис раневых покрытий с культивированными кератиноцитами и микроаутодермотрансплантатами в большей степени зависит от тяжести повреждения, чем от традиционных аутодермальных расщепленных лоскутов. Относительно редкая частота обширных лизисов в опытных группах, вероятно, свидетельствует о невысокой аутоанти-генной нагрузке предлагаемых методов лечения.

С учетом поставленных задач иммунологический мониторинг проводился в несколько этапов: до операции (исходная реакгавность организма) и на 10-е сутки после операции (окончательный результат с учетом положительного или отрицательного эффекта операции трансплантации аутокерапшоцигов или традиционной аутодермопластики).

У 29,4% (п=33) больных (п1 группа) послеоперационный период протекал гладко и в среднем через 13,8+4,2 сут был получен положительный результат с хорошей эяителизацией ожоговых ран. У 23,0% (п=27) больных (п2 группа) пластика культивированными клетками была малоэффективной в первые 10 сут (частичный лизис трансплантата до 40-50%), что потребовало проведения активной детоксикационной терапии, после которой была произведена повторная трансплантация аутокератиноцитов и раны подверглись регенерации.

В пЗ группе - (15 пациентов) (13,2%) первоначальный эффект пластики * был положительный с достаточно выраженной регенерацией эпителия после

трансплантации выращенных клеток, однако к 12,8+2,5 сут началось частичное, а затем более значительное отторжение трансплантата до 65-70% от пересаженной площади. К этому времени отмечали и ухудшение общего состояния пациентов - повышение температуры, выраженное беспокойство, уменьшение диуреза, усиление болей в области ран.

У части больных этот процесс удалось прервать (антибиотикотерапия, иммунокоррекция). Однако у 4 пациентов пЗ группы наступил лизис трансплантата, и эти больные были выделены в группу пЗа. Стандартное определе-

ние количества лейкоцитов и лимфоцитов перед операцией выявляет значимое 2-3-кратное увеличение лейкоцитов, наиболее заметное в пЗ группе. Обращает на себя внимание лимфопения в п2 группе, а глубина снижения сильнее в остальных группах.

Анализ изменения ЛИИ, ЦИК и МСМ также выявляет значительное увеличение показателей этих маркеров эндотоксикоза, причем опять обращает на себя внимание п2 группа, в которой зафиксированы практически двукратный рост ДИК и четырехкратный - МСМ, значимо выделяющийся из остальных опытных групп.

Обращают на себя внимание значительное повышение уровня IgA и 1дМ и снижение - ^У во всех группах по отношению к здоровым пациентам (р<0,05). Практически отсутствуют значимые различия между группами пЗ и п4. Отмечаются более выраженное снижение и повышение IgM в группе п2 относительно групп пЗ и п4.

На фоне лимфопении в группах п1, п2, пЗ, п4(а,б) по сравнению со здоровыми отмечался и дисбаланс субпопуляций Т-клеток со снижением общей фракции (СДЗ), хелперной (СД4) и с возрастанием количества супрессоров (СД8), которые свидетельствовали об имеющей место иммуносупрессии и развитии вторичного иммунодефицита. На это указывало и достоверное снижение иммунорегуляторного индекса СД4/СД8, где его показатели по сравнению со здоровыми последовательно снижались (2,5 - здоровые; 1,86-1,47 - больные). Особенно важен факт наибольшего снижения индекса СД4/СД8 у больных п2 группы, который указывал на глубину разбалансировкн в работе клеточного звена иммунитета, что и проявлялось сразу после операции. Селективная активация Т-супрессоров у всех обследованных являлась защитной реакцией организма дня предотвращения выраженной аутоиммунной реакции против термически измененных аутоавтигенов кожи, что было подтверждено в дальнейшем.

Полученные результаты, свидетельствующие о глубоких нарушениях в системе иммунного функционирования в группах пациентов п2, пЗ и п4б, были дополнены данными о степени иммунной недостаточности (СИН) по сравнению с больными в группах п1 и п4а и здоровыми 5-й группы ^рш^

л1 п2

п4а п4б

СИН

■до лечения

И после лечения

СИН

СД4

111111

п1 п2

I до печения

И после печения

СИН

■да печения

пЗ пЗа п4а п4б В после лечения "1

СИН

сдз

СД8

Рис.3. Динамика показателей степени иммунной недостаточности по субпопуляциям клеточного иммунитета до трансплантации клеточных покрытий и в конце лечения в группах п1, п2, пЗ, п4 аД Больные пЗа группы (СИН СД8, 4 пациента) с отрицательным результатом трансплантации.

В п1 группе степень иммунной недостаточности (СИН) по всем субпопуляциям лимфоцитов перед операцией носила транзиторный характер, подтверждая выраженную активность клеточного звена иммунитета, что позволило всему послеоперационному периоду пройти без осложнений и получить положительный исход операции пересадки покрытий с клетками. Наибольшее угнетение фракции хелперов и возрастание активности супрессоров отмечено во п2 труппе пациентов и несколько менее в пЗ и п4б группах, у которых СИН превысила (п2 группа) или вплотную подошла (пЗ и п4б группы) к показателям второй степени иммунной недостаточности (34-66%).

Правильность полученных результатов доказательно была подтверждена в динамике наблюдения за послеоперационным периодом. Как оказалось, глубокая разбалансировка и несостоятельность клеточного звена иммунитета в группах п2, пЗ и п4б сопровождались в дальнейшем отторжением и лизисом аутокератиноцитов и микрогрансплантатов, а также расщепленных лоскутов

кожи в первой половине послеоперационного периода (группа п2) или во второй его половине (группы пЗ и п4б).

На фоне проводимых симптоматической, антибактериальной (группа п!) и дополнительно иммунокорригирукяцей терапии (в группах п2, пЗ, пЗа, п4а и п4б) отмечали положительную динамику СИН у больных всех групп (кроме пЗа), но с различием в спектрах исследованных субпопуляций и их уровнями.

О состоянии аутоиммунных реакций у пациентов судили по уровням ор~ ганоспецифических антител в сыворотках до пересадки покрытий с культивированными клетками и в конце лечения. Лабораторный контроль в системе РНГА позволил выявить достоверно высокие исходные уровни аугоантител у всех пациентов, различающимся, однако, по титрам и спектру, в зависимости от дальнейшего течения послеоперационного периода. Так, в группе п1 и п4а с первоначальным положительным результатом аутопластики (соответственно аутокератиноцитами и расщепленными кожными лоскутами) исходные показатели были достоверно наименьшими по сравнению с аналогичными в группах п2, пЗ, п4б с осложненным, но в итоге положительным исходом операции. Они были в 2 раза ниже, чем в группе больных пЗа группы с отрицательным результатом пластики, где среднестатистические уровни аутоаитител равнялись 59,8-39,8, а в абсолютных показателях в РНГА они составляли у отдельных пациентов 1:128. Следовательно, имеющая место интоксикация перед пересадкой (высокие уровни МСМ, ЛИИ, ЦИК) сопровождалась изменением антигенной структуры клеток внутренних органов с выраженным всплеском гомологичных аутоантител к ним, углубляющих состояние эндотоксикоза.

Однако несмотря на достоверное повышение перед операцией уровня аутоантител к коже, почкам, легким и печени у пациентов п1 и п4а групп у них отмечены самые низкие показатели аутоантител к органам иммуногенеза - тимусу и селезенке, свидетельствуя об их достаточно сохраненной функции. Это совпадает с результатами изучения у них активности пролиферативных процессов, которые были самыми высокими из всех исследуемых групп и позволили получить первоначально положительный результат трансплантации в группах п1 и п4а. Наибольшее повышение уровня аутоантител к коже отмечено в группе пЗа с неблагоприятным исходом пластики (см. рис. 4). Следовательно, уровень аутоантител к коже может служить точным индикатором возможности выполнения эффективной пластики.

70,0 80,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0

Рис. 4.

Динамика татра аугоантател к коже в различных группах до и после пластического закрытия ран

р 1 р 2 р 3 р За р4а р4б

Таким образом, детальное изучение состояния иммунной системы у 93 пациентов с ожоговой болезнью (75 больных с использованием аутокерагино-цитов и микротрансплантатов и 18 больных группы сравнения) выявило разнообразные комбинированные виды нарушений иммунитета в 100% случаев.

Установлено, что у 45 больных (48,38%) заболевание сопровождалось сочетанным мозаичным поражением клеточного и гуморального звеньев иммунитета, но с адаптивным характером СИН и с достаточно сохраненной функциональной активностью пролиферативных клеточных процессов, позволивши* реализовать положительное течение послеоперационного периода с первоначальным успешным результатом пластики. У 44 пациентов (47,3%) нарушения популяционного спектра Т- и В-лимфоцитов были более глубокие и степень иммунной недостаточности уже требовала иммунокоррекции (в част* ности, иммунофаном).

Пролифератавная активность клеточных процессов и цитокинового звена иммунитета также была более низкой, по сравнению с предыдущей группой, что привело к осложненному и отсроченному, но, в конечном счете, к позитивному результату операции только после проведения соответствующей патогенетической терапии. Несмотря на проводимое лечение у 4 пациентов (4,3%) пластика оказалась несостоятельной. В этой группе наблюдалась полная раз-балансировка показателей Т- и В-иммунитета (СИН - 3 степени угнетения), самые низкие показатели функциональной активности пролиферативных клеточных процессов и цитокинов, продолжающие снижаться к концу лечения.

Разнохарактерный показатель аутоиммунных процессов в исследуемых группах свидетельствует о наличии неоднозначного уровня аутоагрессии в зависимости от конечного результата пластики. В группах с положительной динамикой этот показатель к концу наблюдения достоверно снижался в противовес возрастающим титрам аутоантител в группе с лизисом аутотрансплантатов. В группах с осложненным течением послеоперационного периода титры аутоантител снижались медленнее, оставаясь на более высоких цифрах, чем в группах с первоначально положительным результатом.

Таким образом, воспалительная реакция в различных группах ожоговых больных протекала по-разному, являясь индикатором иммунного состояния

гомеостаза и главным инструментом оценки реактивности организма. Следовательно, воспаление и последующие репаративные процессы в ожоговой ране должны были протекать в зависимости от исходной иммунной реактивности больного, что и было подтверждено нашими исследованиями. Выводы

1. Разработаны методики получения и применения комбинированных пленочных покрытий с выращенными клетками базалыюго слоя эпидермиса (аутокератиноцитами) и микротрансплантатами кожи для закрытия глубоких ожоговых ран в условиях дефицита донорской кожи.

2. Комбинированные пленочные покрытия с аутокератиноцитами и микротрансплантатами кожи являются высокоэффективными средствами для закрытия глубоких ожоговых ран. Средние соотношения площади донорского участка и полученного трансплантата для покрытий с аутокератиноцитами составили 1:168 и 1:249 - для микротрансплантатов при (р<0,89).

3. Исследование иммунного и аутоиммунного статусов указывает на разнонаправленные сдвиги, формирующие различные типы реакций и, вследствие этого, обусловливающие различный исход применения покрытий и ауто-дермопластик.

4. Высокие титры аутоантител (выше соотношения 1:128) к коже, тимусу и селезенке свидетельствуют об активации аутоиммунных процессов и нецелесообразности проведения как трансплантаций комбинированных покрытий, так и аутодермопластик, в связи с очень высоким риском лизиса покрытия.

5. Оптимальные сроки для трансплантации покрытий с культивированными клетками и микротрансплантатами определяются уровнем аутоантителоге-неза и исходной иммунной реактивностью больного. Трансплантация должна быть отсрочена до проведения целенаправленной иммуномодули-рующей терапии.

Практические рекомендации

1 Рекомендуется использование культивированных аутокератиноцитов и микротрансплантатов при лечении глубоких ожогов свыше 15% поверхности тела (при наличии дефицита донорской кожи). Для этого в максимально ранние сроки после травмы следует забирать расщепленные лоскуты кожи >

для их последующего культивирования по одному из двух вариантов - мик-роаутодермопластика или аутологичные кератиноциты человека.

2. Выбор метода культивирования зависит от донорских ресурсов и предполагаемого времени закрытия ран.

3. Применение культивированных аутокератиноцитов и микротрансплантатов показано при лечении длительно незаживающих гранулирующих ран после предварительной подготовки раневой поверхности.

4. Для проведения трансплантаций клеточных культур у тяжелообожженных оптимальным прогностическим параметром аутоиммунного состояния кожи

и внутренних органов является титр аутоантител в пределах 1.16. При татре аутоантител 1:32- 1:64 проведение трансплантаций связано с высоким риском лизиса трансплантата и требует предварительного проведения иммуно-корригирующей, инфузионной и десенсибилизирующей терапии. При титре 1:64 - 1:128 проведение пересадок не показано вследствие абсолютного лизиса трансплантируемых покрытий.

Список печатных работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Применение культивированных клеток для закрытия дефектов кожи/ Кузнецов Н.М., Мазка О.Н, Шаронова Е.А и др.// Новые метода лечения ожогов с использованием культивированных клеток кожи: Материалы науч. конф. - Саратов, 1998 . -С.20-23.

2. Коррекция ожогового эндотоксикоза новым энтеросорбентом и имму-нофаном/ Н.В. Белянский, Н.Ю. Шанина, Е.А. Шаронова и др.// Материалы конгреса ассоциации хирургов им.11ирогова.-М., 1998.-С.259-260.

3. Опыт применения перфузионных плеток с нативным коллагеном для лечения обожженных/ В.Н Долишний, Р.Д. Бодун, Е.А. Шаронова и дрУ/Актуальные проблемы травматологии и ортопедии:Материалы науч.конф-Н-Новгород, 2001. - С. 164.

4. Поэтапное лечение глубоких ожоговых ран коллагеновыми покрытиями на основе пленки «Копрофан»/Н.М. Кузнецов, В.Н Долишний, Е. А Шаронова и др.//Актуальные вопросы травматологии и ортопедии: Материалы науч. конф. -Н-Новгород, 2001 .-С. 169-171.

5. Шаронова Е.А Эффективность применения раствора «Ферракрил» в комплексном лечении обожженных/Е. А. Шаронова, Р.Д. Бодун, Г. С. Якунин// Саратовский медико-фармацевтический вестник.-2001 .-№ 11,-С.14-15.

6. Поэтапное лечение глубоких ожоговых ран коллагеновыми покрытиями на основе пленки «Копрофан»/Р,Д. Бодун, Е.А Шаронова, В.Н. Долишний и др7/ Актуальные вопросы военной медицины и военно-медицинского образования: Сб. науч. тр.-Саратов, 2001.- С.76-77.

7. Е. А. Шаронова. Эффективность применения биологически-активного комплекса «Хитозан» в лечении обожженных/Е.А. Шаронова, Г.С. Якунин, Р.Д. Бодун// Саратовский медико-фармацевтический вестник.-2001.-№12-С.43-44. "

8. Раневые покрытая с нативным коллагеном на пористых пленках в лечении обожженных/ Р.Д. Бодун, Е.А Шаронова, А.Н Шанава и др// Мир без ожогов: Материалы науч. конф.-Спб., 2001 .-С.78-79.

9. Микробиологическая характеристика ожоговых ран при лечении биопокрытиями на основе коллагена/Е.А. Шаронова, Р.Д. Бодун, АН. Шанава// Материалы науч.-практ. конф. молодых ученых СГМУ. - Саратов, 2001 .-С.24.

ч

i

(

I

%

I

i

ï

\ i

ИЗ 60S

РНБ Русский фонд

2006-4 9735

Актуальность проблемы. Увеличивающиеся в последнее время техногенные катастрофы, сопровождающиеся ростом термических поражений человека позволяют считать ожоговый травматизм одной из важнейших проблем практической медицины (Смирнов С.В., 1997; Алексеев А.А., 1999; Xiao, 2000).

Всеобъемлющий хирургический подход к лечению ожоговой раны и значительные трудности при ликвидации острого воспаления при подготовке ран к пластическому замещению дефекта напрямую определяют поиск новых биотехнологических подходов к аутодермопластике. Это связано с тем, что в современной комбустиологии остается нерешенной проблема закрытия глубоких обширных ожоговых поверхностей после хирургической некрэктомии, при которой выполенение аутодермопластики затруднено из-за дефицита донорских ресурсов кожи (Туманов В.Н., 1997; Белянский Н.В., 2000).

При этом в основу терапии ожоговой болезни и профилактике ее осложнений должен быть положен принцип, предусматривающий как коррекцию системных нарушений гомеостаза, так и одновременно оптимизацию процессов заживления ожоговой раны (Алексеев А.А., 1999). Последнее в большой степени зависит от функциональной активности иммунокомпетентных клеток, обеспечивающих скорость и адекватность репаративных процессов в ране и от состояния аутоиммунитета, ответственного за трансплантационный иммунитет и, соответственно, успех кожной пластики (Linquist R., 1983).

Однако эти важнейшие аспекты патогенеза и лечения ран при ожоговой болезни освещены недостаточно (Клячкин Л.М., 1996; Гринин A.M., 1997; Белянский Н.В., 2000), в то время как для решения вопроса об успешном оперативном лечении необходимо учитывать некоторые ключевые показатели гомеостаза в зависимости от особенностей иммунного статуса больного.

Следовательно, поиск новых подходов к улучшению результатов хирургического лечения глубоких ожогов, в частности, с использованием раневых пленочных покрытий с поверхностным слоем базальных кератиноцитов, а также разработка критериев прогнозирования исходов аутодермопластики по состоянию иммунокомпетентных клеток у обожженных определяет актуальность работы.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Оптимизация клинико-лабораторной оценки состояния больных с глубокими ожогами для повышения эффективности трансплантаций комбинированных пленочных покрытий с аутокератиноцитами и микротрансплантатами кожи.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Разработать методики получения и применения комбинированных пленочных покрытий с выращенными клетками базального слоя эпидермиса (аутокератиноцитами) и микротрансплантатами кожи для закрытия глубоких ожоговых ран.

2. Оценить эффективность применения комбинированных пленочных покрытий с аутокератиноцитами и микротрансплантатами кожи при лечении ожогов 1ПВ степени и гранулирующих ран.

3. Исследовать динамику иммунитета и аутоиммунитета (аутоантигенного состояния кожи и внутренних органов) при использовании комбинированных покрытий с аутокератиноцитами и микротрансплантатами кожи.

4. Определить прогностические критерии возможности применения покрытий с аутокератиноцитами,и микротрансплантатами кожи и аутодермопластик и по состоянию иммунного и аутоиммунного статуса пациента

ПОЛОЖЕНИЯ ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Предлагаемые методики получения и применения комбинированных пленочных покрытий с выращенными клетками базального слоя эпидермиса (аутокератиноцитами) и микротрансплантатами являются эффективными для закрытия глубоких ожоговых ран в условиях дефицита донорской кожи.

2. Исходы проведенных трансплантаций культивированных раневых покрытий и аутодермопластик обусловлены тяжестью поражения и характером иммунных и аутоиммунных реакций организма.

3. Исследование аутоиммунных реакций позволяет прогнозировать результаты проведения трансплантации покрытий и аутодермопластик.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

1. Разработана ранее не описанная методика получения и применения комбинированных пленочных покрытий с выращенными клетками базального слоя эпидермиса (аутокератиноцитами).

2. Разработана методика получения и применения комбинированных пленочных покрытий с микротрансплантатами кожи.

3. Изучена возможность прогнозирования результатов применения комбинированных покрытий с культивированными клетками и микротрансплантатами кожи.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ:

1. Разработаны методики получения и применения комбинированных пленочных покрытий с выращенными клетками базального слоя эпидермиса (аутокератиноцитами) и микротрансплантатами кожи для закрытия глубоких ожоговых ран в условиях дефицита донорской кожи.

2. Комбинированные пленочные покрытия с аутокератиноцитами и микротрансплантатами кожи являются высокоэффективными средствами для закрытия глубоких ожоговых ран. Средние соотношения площади донорского участка и полученного трансплантата для покрытий с аутокератиноцитами составили 1см : 164 см и 1см :249 см - для микротрансплантатов (р<0,89).

3. Изучены основные причины неудач применения как трансплантаций комбинированных покрытий, так и аутодермопластик, которыми являются тяжесть состояния пациента, нагноение ран и применение покрытий на неподготовленную поверхность.

4. Степень иммунной недостаточности и глубокая разбалансировка и несостоятельность клеточного звена иммунитета оказывала прямое влияние на результаты применения покрытий и аутодермопластик и сопровождалась в дальнейшем отторжением и лизисом аутокератиноцитов и микротрансплантатов, а также и расщепленных лоскутов кожи

5. Установлено, что высокие титры аутоантител (выше соотношения 1:128) к коже, тимусу и селезенке свидетельствуют об активации аутоиммунных процессов и нецелесообразности проведения как трансплантаций комбинированных покрытий, так и аутодермопластик, в связи с очень высоким риском лизиса покрытия. Трансплантация должна быть отсрочена до проведения целенаправленной иммуномодулирующей терапии.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ

Материалы диссертационного исследования доложены и обсуждены на международном симпозиуме "Новые методы лечения ожогов с использованием культивированных клеток кожи человека (Саратов, 1998 г.); всероссийском съезде травматологов (Москва, 2000);международном медицинском форуме "Человек и травма" (Нижний Новгород, 2001 г.); конференции молодых ученых (Саратов, 2001 г.)

Для определения сроков пластического закрытия ожоговых ран культивированными клетками кожи разработаны методические рекомендации «Определение титра аутоантител к коже и внутренним органам у обожженных».

По материалам диссертационного исследования опубликовано 12 работ. Метод хирургического лечения ожоговых больных с применением культивированных клеток кожи человека внедрен в ожоговом центре г. Саратова (ММУ «Городская больница №7»). Иммунологические исследования проведены в РосНИПЧИ "Микроб" г. Саратов (Н.В.Емельянова, Л.В.Шанина).

Выводы

1. Разработаны методы получения и применения комбинированных пленочных покрытий с выращенными клетками базального слоя эпидермиса (аутокератиноцитами) и микротрансплантатами кожи для закрытия глубоких ожоговых ран в условиях дефицита донорской кожи.

2. Комбинированные пленочные покрытия с аутокератиноцитами и микротрансплантатами кожи являются высокоэффективными средствами для закрытия глубоких ожоговых ран. Средние соотношения площади донорского участка и полученного трансплантата для покрытий с аутокератиноцитами составили 1:164 и 1:249- для микротрансплантатов.

3. Исследование иммунного и аутоиммунного статуса указывает на разнонаправленные сдвиги, формирующие различные типы реакций и, вследствие этого, обусловливающие различный исход применения покрытий и аутодермопластик.

4. Ретроспективно установлено, что высокие титры аутоантител (выше соотношения 1:128) к коже, тимусу и селезенке свидетельствуют об активации аутоиммунных процессов и нецелесообразности проведения как трансплантаций комбинированных покрытий, так и аутодермопластик, в связи с очень высоким риском лизиса покрытия.

5.Оптимальные сроки для трансплантации покрытий с культивированными клетками и микротрансплантатами определяются уровнем аутоантителогенеза и исходной иммунной реактивностью больного. Трансплантация должна быть отсрочена до проведения целенаправленной иммуномодулирующей терапии.

Практические рекомендации

1. Рекомендуется использование культивированных аутокератиноцитов и микротрансплантатов при лечении глубоких ожогов свыше 15% поверхности тела (при наличии дефицита донорской кожи). Для этого в максимально ранние сроки после травмы следует забирать расщепленные лоскуты кожи толщиной 0,2-0,3 мм для их последующего культивирования по одному из двух вариантов — микроаутодермопластика или пласты аутокератиноцитов.

2. Выбор метода культивирования зависит от донорских ресурсов и предполагаемого времени закрытия ран.

3. Применение культивированных аутокератиноцитов и микротрансплантатов показано при лечении длительно незаживающих гранулирующих ран после предварительной подготовки раневой поверхности.

4. Для проведения трансплантаций клеточных культур у тяжелообожженных оптимальным прогностическим параметром аутоиммунного состояния кожи и внутренних органов является титр аутоантител в пределах 1:16. При титре аутоантител 1:32 - 1:64 проведение трансплантаций связано с высоким риском лизиса трансплантата и требует предварительного проведения иммунокорригирующей, инфузионной и десенсибилизирующей терапии. При титре 1:64 - 1:128 проведение пересадок не показано вследствие абсолютного лизиса трансплантируемых покрытий.