Автореферат и диссертация по медицине (14.01.01) на тему:ДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫЕ ПОДХОДЫ В ВЕДЕНИИ БОЛЬНЫХ С ПРЕЖДЕВРЕМЕННОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТЬЮ ЯИЧНИКОВ

На правах рукописи

ЖАХУР Наталия Александровна

ДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫЕ ПОДХОДЫ В ВЕДЕНИИ БОЛЬНЫХ С ПРЕЖДЕВРЕМЕННОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТЬЮ ЯИЧНИКОВ

14.01.01 - акушерство и гинекология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

47784

2 6 МАЙ 2011

Москва - 2011

4847784

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации в отделении гинекологической эндокринологии

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Марченко Лариса Андреевна Курило Любовь Федоровна

Уварова Елена Витальевна Журков Вячеслав Серафимович

Ведущее учреждение:

Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии

Защита диссертации состоится <<// » ¿¿¿¿¿¿^— 2011 г. в 13.00 ч. на заседании диссертационного совета Д 208.125.01 при ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России Адрес: 117997, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России

Автореферат разослан «-/^ » ^ ^"¿-2011г.

Ученый секретарь

диссертационного совета доктор медицинских наук

Калинина Елена Анатольевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Преждевременная недостаточность яичников (ПНЯ) - это патологическое состояние, характеризующееся аменореей, бесплодием, симптомами гипоэстрогении и повышенным уровнем гонадотропинов (ФСГ, ЛГ) в крови у женщин в возрасте до 40 лет [Сметник, 1997]. Встречаемость данной патологии составляет 1-3% и достигает 10% в структуре аменорей [Anasti, 1998]. По современным представлениям ПНЯ развивается вследствие недостаточной закладки фолликулов во время внутриутробного развития, нарушения их созревания фолликулов или процесса ускоренной их атрезии.

Анализ причин ПНЯ показал, что численные и структурные аномалии хромосомы X встречаются в 4,2-5,6% случаев, генные нарушения - в 13,930%, аутоиммунная форма заболевания - в 10-15,2% и ятрогенная - в 2-3% [Woad, 2006; Табеева, 2009]. Однако, несмотря на современные диагностические возможности, в большинстве случаев точно выявить этиологию данного заболевания крайне сложно, в связи с чем идиопатическая форма в структуре ПНЯ продолжает составлять более 50% [van Kasteren, 1999; Goswami, 2007]. В то же время встречаемость семейных форм заболевания примерно у каждой 3-4 пациентки приводит к выводу о большей значимости генетических факторов в генезе преждевременного истощения фолликулярного пула. Известно, что патогенез как первичной, так и вторичной яичниковой недостаточности сводится к несоответствию скорости атрезии фолликулов в гонадах некой физиологической норме, в результате чего к возрасту менархе количество фолликулов оказывается меньше нормального или они полностью отсутствуют. Общность патогенеза этих двух состояний приводит к заключению о наличии аналогичных причин, запускающих этот патологический процесс.1 В последние годы появились работы, доказывающие наличие ограниченного мозаицизма 45,Х/46,ХХ в гонадах у пациенток с дисгенезией гонад и нормальным женским (46,XX) кариотипом в лимфоцитах [Ropke, 2004].

Хорошо известно, что для больных с ПНЯ наиболее сложной проблемой является, поиск лечебных подходов в преодолении бесплодия. В литературе описаны случаи спонтанных беременностей на фоне длительного периода вторичной гипергонадотропной аменореи, однако частота их наступления крайне невысока и не преодолевает 10% барьер [Тагиева, 2005; Nelson, 2009].' Таким образом, на сегодняшний день программа ЭКО с использованием донорских ооцитов рассматривается у этой категории больных как единственный высокоэффективный метод лечения бесплодия. Однако, многие пациентки с истощенным фолликулярным резервом по социальным, религиозным или личностным мотивам настаивают на достижении беременности за счет собственной яйцеклетки. С 1990 года появились работы, свидетельствующие о возможности наступления беременности у больных с ПНЯ на фоне стимуляции овуляции при применении различных препаратов и схем, включая оральные контрацептивы, глюкокортикостероиды, гонадотропины, эстрогены,

агонисты гонадотропин-рилизинг гормона (аГнРг), дегидроэпиандростерон и др. [van Kasteren, 1999; Tartagni, 2007; Mamas, 2009]. Однако особый интерес ученых всегда был направлен на два принципиальных подхода к терапии бесплодия у больных с ПНЯ. Во-первых, индукция фолликулогенеза с использованием гонадотропинов после предварительной супрессии гипофиза препаратами аГнРг, что диктуется существующей гипотезой о возможности развития резистентности яичников к экзогенным гонадотропинам при высоких уровнях эндогенного ФСГ [van Kasteren, 1999; Santoro, 2003], и, во-вторых, стимуляция овуляции на фоне дополнительной терапии эстрогенами, которые, помимо подавления повышенного уровня ФСГ, по некоторым данным, могут повышать чувствительность гранулезных клеток к действию экзогенных гонадотропинов за счет восстановления нормальной функции рецепторного аппарата [Tartagni, 2007]. В 2007 году в литературе появились обнадеживающие результаты плацебо контролируемого исследования Tartagni М. с соавт., в котором авторы провели стимуляцию овуляции гонадотропинами с предварительной терапией высокими дозами этинилэстрадиола (EEj) у больных с ПНЯ и достигли овуляции у 32% и беременности у 16% больных.

Несмотря на возможность овуляции у половины больных на сегодняшний день не определена наиболее эффективная схема стимуляции яичников и не выделены клинико-лабораторные показатели, которые могли бы прогнозировать ее успешность у данной категории больных. Цель исследования: на системном и тканевом уровнях изучить патогенетические факторы развития ПНЯ, а также оценить эффективность стимуляции фолликулогенеза и разработать критерии ее успеха при данной патологии.

Задачи исследования:

1. Оценить частоту различных этиопатогенетических форм ПНЯ, используя современные клинико-диагностические и молекулярно-генетические методы обследования;

2. Изучить половые хромосомы в интерфазных ядрах клеток из биоптатов яичниковой ткани с помощью флуоресцентной in situ гибридизации и проанализировать клинико-лабораторные особенности ПНЯ при наличии гонадного мозаицизма по половым хромосомам;

3. Оценить возможность фолликуло- и оогенеза в ответ на стимуляцию яичников и провести сравнительный анализ эффективности и безопасности терапии гонадотропинами с предварительным подавлением гонадотропной функции гипофиза препаратами агонистов ГнРг или высокими дозами этинилэстрадиола у больных с ПНЯ;

4. Разработать совокупность клинико-лабораторных и молекулярно-генетических факторов эффективности стимуляции яичников у больных с ПНЯ;

5. Оценить частоту наступления беременности в программе ЭКО с использованием донорских ооцитов у больных с преждевременной недостаточностью яичников.

Научная новизна Впервые проведен анализ половых хромосом непосредственно в яичниковой ткани у больных с вторичной гипергонадотропной аменореей. Показано, что для больных с ПНЯ и нормальным кариотипом в лимфоцитах крови с высокой значимостью характерны различные виды численных нарушений половых хромосом в гонадах, а в 3,4% случаев могут присутствовать клетки с хромосомой У, которые не обнаруживаются при исследовании лимфоцитов даже с помощью ИЗН-анализа. Полученные результаты доказывают связь ПНЯ с наличием ограниченного гонадного мозаицизма по половым хромосомам и позволяют утверждать, что одним из возможных механизмов преждевременного истощения фолликулярного пула у данной категории больных может быть ускоренный апоптоз половых клеток, сопряженный с анеуплоидией половых хромосом в яичнике.

Впервые проведен сравнительный анализ традиционной схемы стимуляции овуляции по «длинному» протоколу с предварительной десенситизацией гипофиза препаратами аГнРг и модификации инновационной схемы стимуляции яичников с применением высоких доз (0,15 мг/сут) ЕЕ2 у больных с ПНЯ. Показано, что обе схемы стимуляции имеют одинаковую эффективность в достижении овуляции, однако только использование ЕЕ2 способствует синхронизации процессов созревания фолликулов и адекватного роста эндометрия. При этом, в ответ на проводимую терапию рост фолликулов более 10 мм наблюдается у одной трети больных и у 11,1%-23,5% происходит овуляция. Впервые выделены клинико-лабораторные показатели, которые могут прогнозировать успех индукции овуляции у больных с ПНЯ.

Практическая значимость Выявленная анеуплоидия половых хромосом в гонадах у больных с ПНЯ характерна для соматических клеток яичника (строма). Таким образом, наличие на тканевом уровне данной патологии не увеличивает вероятность рождения ребенка с нарушениями кариотипа и не является противопоказанием для проведения стимуляции овуляции у данной категории больных. Обнаружение у 3,4% пациенток с ПНЯ материала хромосомы У в яичниковой ткани ставит вопрос о необходимости постоянного динамического наблюдения за данной категорией больных в связи с существующим риском развития гонадобластомы.

Разработан алгоритм лечения бесплодия у больных с ПНЯ. Показано, что пациентки с поздним дебютом и семейной формой заболевания, а также с нормальной концентрацией в крови тестостерона и наличием фолликулов в обоих яичниках по данным УЗИ имеют большую вероятность наступления индуцированной овуляции, в то время как любая сопутствующая аутоиммунная патология, а также выявление неслучайной инактивации хромосомы X и периоофорита являются неблагоприятными прогностическими факторами достижения овуляции.

Положения, выносимые на защиту

1. Для больных с ПНЯ характерны различные виды численных нарушений половых хромосом в гонадной ткани, при этом межтканевые различия по хромосомной конституции лимфоцитов и соматических клеток яичника выявляются у 72,4% больных. Среди вариантов анеуплоидии в гонадах преобладает моносомия X, крайне редко (3,4%) возможно обнаружение хромосомы У. Все выше представленное позволяет предположить, что одним из ведущих механизмов преждевременного истощения овариального пула при ПНЯ может являться ускоренный апоптоз ооцитов, идентичный таковому при типичной форме дисгенезии гонад.

2. Эффективность стимуляции яичников у больных с вторичной гипергонадотропной аменореей не зависит от используемой схемы, при этом в ответ на терапию активация фолликулогенеза наблюдается у одной трети больных, которая у 11,1-23,4% пациенток заканчивается овуляцией. Только использование этинилэстрадиола в схемах индукции овуляции у больных с ПНЯ способствует синхронизации процессов роста фолликулов и эндометрия.

3. Совокупность клинико-лабораторных показателей, включающая поздний дебют и семейную форму заболевания, а также наличие в обоих яичниках фолликулов, способных к физиологической продукции тестостерона являются благоприятными факторами индуцированной овуляции. Выявление сопутствующей аутоиммунной патологии, воспалительных изменений в яичниках и наличие неслучайной инактивации хромосомы X относятся к неблагоприятным признакам. С наибольшей эффективностью преодолеть бесплодие у больных с ПНЯ на сегодняшний день удается только с помощью методов вспомогательных репродуктивных технологий с использованием донорских ооцитов.

Апробация материалов диссертации

Основные результаты работы доложены и обсуждены на VIII Европейском Конгрессе по Менопаузе (ЕМА5) (Лондон, 2009), на IV Международном Конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 2010) и в виде постерного доклада на XIV Всемирном Конгрессе по гинекологической эндокринологии (КОЕ) (Флоренция, 2010). По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ. Обсуждение диссертации состоялось на межклинической конференции в отделении гинекологической эндокринологии ФГУ «НЦ АГиП им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России (22.10.2010) и на заседании апробационной комиссии ФГУ «НЦ АГиП им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России (15.11.2010г.).

Внедрение результатов исследования в практику

Комплексное обследование и принципы лечения у пациенток с ПНЯ внедрены в клиническую практику ФГУ «НЦ АГиП им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России. Материалы диссертации используются при чтении лекций по гинекологической эндокринологии.

Структура и объём диссертации

Работа имеет 6 глав, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, глав, отражающих полученные данные, обсуждение полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, изложена на 235 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 31 таблицей и 30 рисунками. Список литературы включает 306 источника (36 на русском и 270 на иностранных языках).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы

Основная группа: 143 пациентки с ПНЯ

Группа сравнения: 3 женщины с различными формами дисгенезии гонад в возрасте от 20 до 39 лет (средний возраст - 27,0+10,4 года) для определения плоидности половых хромосом в ткани гонад.

Группы контроля: 1) 15 здоровых фертильных женщин репродуктивного возраста для оценки гормональных параметров; 2) 15 женщин со своевременной менопаузой для оценки антиовариальных антител; 3) 10 образцов яичниковой ткани женщин, погибших при чрезвычайных обстоятельствах, в возрасте до 40 лет (в среднем - 28,4±б,3 года) для определения половых хромосом в ткани яичника.

Критерии включения в основную группу: возраст от 18 до 40 лет, отсутствие самостоятельных менструаций 6 и более месяцев, уровень ФСГ > 40 МЕ/л в двух измерениях.

Критерии исключения из основной группы: первичная гипергонадотропная аменорея, ятрогенные причины ПНЯ (операции на яичниках, химиотерапия, лучевая терапия в анамнезе), тяжелые наследственные заболевания (галактоземия, блефарофимоз).

Пациенток обследовали с использованием комплекса современных и наиболее информативных методов исследования. Общеклиническое обследование проводили по стандартной схеме, используемой в ФГУ НЦ АГиП им. В.И.Кулакова Минздравсоцразвития России, предусматривающей тщательное изучение семейного анамнеза, объективное гинекологическое исследование. Уровни гормонов (ФСГ, ЛГ, ТТГ, эстрадиола (Е2), общего тестостерона (Тобщ), ТЭСГ, кортизола, дегидроэпиандростерона сульфата, 17-оксипрогестерона, Т4св) определяли методом ИФА с помощью соответствующих тест-систем на автоматическом анализаторе «Cobar Core II». Определение в плазме антимюллерова гормона (AMT) проводили методом ИФА с помощью коммерческих наборов DSL (США). Аутоантитела к антигенам яичника определяли методом непрямого иммуноферментного анализа (ELISA), к антигенам щитовидной железы - методом ИФА по стандартной методике. Трансвагинальное ультразвуковое исследование органов малого таза проводили на аппарате Aloka SSD 1200, 2000 Toshiba SSA-240 (Япония). УЗИ щитовидной выполняли на том же аппарате при

помощи мультичастотного линейного датчика (8-10 МГц). Лапароскопию с биопсией яичников проводили с использованием инструментальной техники фирмы «Karl Storz». Морфологическое исследование биоптатов тканей яичников проводили по общепринятой методике. Кариотип в лимфоцитах периферической крови исследовали с помощью стандартной цитогенетической методики (G-окраска). Длину CAG-повтора 1 экзона гена AR и неслучайную инактивацию хромосомы X (SXCI) определяли с помощью метилчувствительной количественной флуоресцентной ПЦР. Для определения полиморфизма гена FMR1 (премутация FRAXA) использовали изучение длины CGG-повтора методом метил-специфической ПЦР. Исследование половых хромосом в интерфазных ядрах клеток яичников, эндометрия и лимфоцитов осуществляли с помощью флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) с центромерными пробами на хромосомы X, Y и контрольную пробу на хромосому 18 (Abbot-Vysis, США).

После проведения полного обследования нами было отобрано 35 пациенток с ПНЯ с нормальным кариотипом в лимфоцитах периферической крови, не имеющих противопоказаний к стимуляции овуляции и желающих наступления беременности. Пациентки были разделены случайным (рандомизированным) образом на 2 группы: 1-ой группе больных (п=18) была проведена традиционная схема стимуляции яичников с помощью фоллитропина альфа (аФСГ, Гонал Ф) после предварительной десенситизации гипофиза препаратом агонистов гонадотропин-рилизинг гормона (Трипторелин) («длинный» протокол); 2-ой группе (п=17) была проведена инновационная схема стимуляции овуляции также аФСГ, но на фоне приема высоких доз этинилэстрадиола, по модифицированной схеме Tartagni М. с соавт. (2007).

Исследование было одобрено Комитетом по этике биомедицинских исследований при ФГУ НЦ АГиП им.В.И.Кулакова Минздравсоцразвития России.

Результаты исследования и их обсуждение

На первом этапе работы проведено клинико-лабораторное обследование 143 пациенток с ПНЯ (средний возраст 33,05+5,9 года). Семейная форма заболевания обнаружена у 29,4% (42/143) пациенток. Большинство женщин 121/143 (84,6%) до развития заболевания имели регулярный ритм менструаций, однако у 14,7% (21/143) пациенток нарушения менструального цикла были отмечены уже с менархе в виде олигоменореи. К моменту обращения в Центр и обследования длительность заболевания колебалась от 7 месяцев до 14 лет и в среднем составила -3,5±4,3 года. Клинически начало заболевания в 80,4% (115/143) случаев проявлялось олигоменореей, в 9,1% (13/143) внезапной аменореей и в 10,5% (15/143) отмечались маточные кровотечения. Продолжительность регулярного менструального цикла имела большой разброс (от 4 месяцев до 27 лет) и в среднем составила 12,6±8,9 лет. Нарушения менструального цикла в среднем отмечены в возрасте 27,5±8,1 года, тогда как средний возраст

наступления аменореи составил 29,8+7,4 года.

До развития заболевания беременности имели место у 51,7% женщин (74/143). Всего у наших пациенток было 198 беременностей, из которых 115 (58,1%) закончились искусственными абортами, 14 (7,1%) неразвивающимися беременностями или самопроизвольными выкидышами, 2 (1,0%) - преждевременными родами в 27-28 недель беременности (дети погибли), 1 (0,5%) - интранатальной гибелью плода, 1 (0,5%) -своевременными родами ребенком с множественными пороками развития и врожденным слабоумием. Только 65 (32,8%) беременностей закончились своевременными родами здоровым ребенком. Таким образом, репродуктивная функция до выключения функции яичников успешно была реализована (хотя бы одни роды здоровым ребенком) только у 35,7% (51/143) больных.

При гормональном обследовании у больных из основной группы было установлено повышение уровней ФСГ и ЛГ (в среднем 105,71±35,96 МЕ/л и 66,0±41,73 МЕ/л, соответственно) и снижение концентрации Е2 (79,11+54,99 пмоль/л), что подтверждало наличие у них преждевременной недостаточности яичников. Уровень АМГ в сыворотке крови был исследован у 58 пациенток с ПНЯ и оказался ниже чувствительности метода у 79,3% (46/58) больных, а у остальных в среднем составил 0,26±0,2 нг/мл, что было значимо ниже, чем в контрольной группе фертильных женщин (2,72+0,67 нг/мл) (р<0,05). Выявление антиовариальных антител было проведено 66 больным. В группе с ПНЯ у 21,2% (14/66) женщин сыворотка крови была положительной на наличие антиовариальных антител, в то время как все контрольные образцы были негативны (р<0,005).

Средние объемы яичников по данным УЗИ составили: правый -2,4±1,6см3, левый - 2,4±1,8 см3, при этом у 48,3% (69/143) пациенток объем правого, а у 58,0% (83/143) женщин объем левого яичника не превышал 2 см3. В правом яичнике фолликулы выявлялись в 53,1% (76/143) случаев и в левом яичнике - в 49,7% (71/143) случаев. При этом только в одном яичнике фолликулы визуализировались у 25,2% (36/143) пациенток, в двух яичниках - у 39,1% (56/143), афолликулярный тип яичников выявлен у 35,7% (51/143).

Лапароскопия была произведена 49,7% (71/143) пациенткам с ПНЯ. Согласно последующему гистологическому исследованию биоптатов яичников, несмотря на стойкую гипергонадотропную аменорею, примордиальные фолликулы были сохранены у 36,6% (26/71) больных.

В результате исследования кариотипа в лимфоцитах периферической крови с помощью стандартной О-окраски его аномалии у больных с ПНЯ были выявлены в 7,7% (11/143) случаев. У 3 больных (2,1%) обнаружены численные нарушения половых хромосом - в виде моносомии хромосомы X у 2-х больных (1,4%) и кариотипа 47,ХХУ у одной пациентки (0,7%). У 1,4% (2/143) пациенток были выявлены структурные аномалии хромосом - у одной в виде инверсии, затрагивающей хромосому 7 46,ХХ,ту(7)(р12^11) и у второй в виде образования производной хромосомы X - 46,Х,<1ег(Х). Еще у 6-ти пациенток (4,2%) имел место хромосомный мозаицизм. У одной из них

83,3% клеток содержали одну и 16,7% клеток - две хромосомы X, одна из которых, однако была изодицентрической [45,X/46,X,idic(X)(p22.1)]. У трех других пациенток имел место низкий уровень мозаицизма с наличием X моносомной клеточной линии в 10-55% клеток (45,Х/46,ХХХ) и у двух пациенток кариотип характеризовался наличием трех клеточных линий -нормальной, X моносомной и X трисомной (45,Х/47,ХХХ/46,ХХ).

Исследование полиморфизма FMR1 гена было проведено 69,2% (99/143) больным. Гетерозиготное носительство премутации гена FMR1 обнаружено в 2 случаях, что составило 2,0%. Одна из этих больных с аллельным вариантом гена FMR1 45/56 CGG-повторов страдала семейной формой ПНЯ, а другая больная имела 34/60 CGG-повторов в гене FMR1 и страдала спорадической формой ПНЯ. Увеличение числа CGG-повторов в пределах «серой зоны» (от 41 до 50) нами выявлено примерно у каждой десятой больной (11,1%, 11/99). Исследование полиморфизма гена AR и SXCI было проведено на 114 образцах крови больных с ПНЯ (79,7%), из которых информативным (гетерозиготы по гену AR) оказался 101 образец. Неслучайная инактивация хромосомы X, косвенно указывающая на возможные нарушения в хромосоме X, при пороговом уровне >80% была выявлена у 21% (21/101) больных с ПНЯ. Средние значения длин аллелей в гене AR у наших больных с ПНЯ составили 21,26+1,92 С AG-повторов в аллели 1 и 24,19±2,58 CAG-повторов в аллели 2. Показатель SBM (simple biallelic mean - средняя длина аллелей) составил 23,05±1,85 CAG, a XWBM (X weighted biallelic mean - средняя длина аллелей, связанная с XCI), характеризующий как длину CAG-повтора, так и инактивацию несущей его аллели - 23,06±1,90 CAG.

Особый интерес представляет исследование половых хромосом в интерфазных ядрах гонадных клеток с помощью FISH, которое было проведено на 31 (21,7%, 31/143) образце яичниковой ткани больных с ПНЯ, среди которых 29 имели нормальный кариотип в лимфоцитах периферической крови (46,XX), 1 больная имела кариотип 47,XXY и у 1 больной выявлен мозаицизм 45,Х[30]/46,ХХ[6]. Дополнительно мы исследовали половые хромосомы у 3-х пациенток с первичной гипергонадотропной аменореей, среди которых 2 имели нормальный кариотип (46,XX) в лимфоцитах и одна - регулярную форму моносомии X. В качестве контроля было исследовано 10 аутопсийных образцов яичниковой ткани, полученных от молодых женщин в возрасте 21-35 лет (средний возраст 29,1±5,6 года), погибших при чрезвычайных обстоятельствах. Выделенная группа больных с ПНЯ для исследования гонадного мозаицизма по половым хромосомам значимо не отличалась от всех обследованных больных с ПНЯ и, следовательно, изучаемые группы были репрезентативны.

В результате исследования половых хромосом в ткани яичников у 29 больных с ПНЯ и нормальным кариотипом в лимфоцитах у 72,4% пациенток (21/29) обнаружены различные виды гонадного мозаицизма. Из них у 51,7% (15/29) больных имела место одна анеуплоидная клеточная линия,

представленная в 31% (9/29) случаев моносомией X и в 20,7% (6/29) случаев трисомией хромосомы X, при этом анеуплоидия была обнаружена в 2-10% и 1-10% проанализированных клеток, соответственно. У 20,7% (6/29) оставшихся пациенток был обнаружен мозаицизм с наличием нескольких различных клеточных линий с аномальным хромосомным набором (сложный мозаицизм). У 10,3% (3/29) пациенток было выявлено наличие двух аномальных клеточных линий - в двух случаях сочетание моносомии с трисомией X в 13% клеток и в одном случае сочетание трисомии с тстрасомией хромосомы X в 11% клеток яичника. У 10,3% (3/29) других пациенток нами были обнаружены три клона клеток с анеуплоидиен половых хромосом. Две из них имели сочетание moho-, три- и тетрасомии X, встречающихся в 16-26% клеток, У третьей пациентки выявлено сочетание моносомии X в 38% клеток, трисомии X в 3% клеток и наличие в 30% клеток яичников хромосомы Y (Рис.1). У пациентки с ПНЯ и кэриотипом 47,XXY в лимфоцитах в гонадах мозаицизма обнаружено не было - все проанализированные гонадные клетки содержали две X и одну Y хромосому (Рис.2), У другой пациентки с ПНЯ и мозаичным карнотитом 45,Х/46,ХХ в лимфоцитах в клетках гонад также был обнаружен мозаицизм, однако доля распределения и состав клеточных клонов значительно различались.

У трех из 8 (27,6%) пациенток с ПНЯ, нормальным кариотипом в лимфоцитах и высоким уровнем гонадного мозаицизма по половым хромосомам (от 10% клеток и выше), мы дополнительно исследовали половые хромосомы в ткани эндометрия, полученной при ЦУГе эндометрия. В результате исследования у всех трех больных было выявлено не более 2% эндометриальных клеток с моносомией X, остальные исследованные клетки содержали две хромосомы X. У пациентки с ПНЯ и наличием хромосомы Y в 30% клеток яичника, в эндометрии ни одной клетки с хромосомой Y обнаружено не было.

У всех 3-х пациенток (100%) с первичной аменореей (группа сравнения) в яичниковой ткани были выявлены клеточные линии с различным набором половых хромосом. У двух пациенток с нормальным кариотипом в лимфоцитах крови в гонадах имел место мозаицизм - в одном случае простой, с наличием X моносомного клона, а в другом случае сложный, с наличием клеток с моно- и трисомией X, а также в 2% клеток была обнаружена хромосома Y. У пациентки с регулярной формой моносомии X в лимфоцитах периферической крови в гонадах выявлено 28% клеток с двумя хромосомами X, 2% клеток с тремя хромосомами X и 50% клеток в комплексе половых хромосом имели хромосому Y.

Таким образом, у одной пациентки с ПНЯ (3,4%) у 2-х больных с дисгенезией гонад в ткани гонад FISH методом были обнаружены клетки с хромосомой Y. Исходя из этого, у двух пациенток с высокой долей клеток с хромосомой Y (30 и 50%) в яичниковой ткани мы провели дополнительное исследование половых хромосом в лимфоцитах крови также FISH методом. Результаты исследования показали, что в лимфоцитах у этих больных имеет

место лишь низкий уровень мозаицизма по анеуплоидии хромосомы X (от 2 до 2,8%) и отсутствует хромосома У.

Рисунок 1. Варианты гонадного мозаицизма у больных с ГОШ.

FISH-анализ с центромерными пробами на X (СЕР X, Abbot-Vysis, Spectrum Green),Y (CEP Y, Abbot-Vysis, Spectrum Orange) и 18 пару аутосом (СВР X, Abbot-Vysis, Spectrum Blue), ув. x 1000.

А: простой мозаицизм с наличием моносомии хромосомы X. Б: простой мозаицизм с наличием трисомии хромосомы X. В: сложный мозаицизм с наличием моносомии и трисомии хромосомы X. Г: сложный мозаицизм с наличием трисомии и тетрасомии хромосомы X. Д: сложный мозаицизм с наличием моносомии, трисомии и тетрасомии хромосомы X. Е: сложный мозаицизм с наличием ядер с двумя хромосомами X, с моносомией X и ядер, с одной хромосомой X и одной хромосомой Y.

Рисунок 2. Выделенные ядра гонадных клеток у больной с ПНЯ и 47,XXY кариотипом в лимфоцитах. FISH-анализ с центромерными пробами на хромосому X (СЕР Xt Abbot-Vysis, Spectrum Green),Y-хромосому (CEP Y, Abbot-Vysis, Spectrum Orange) и 18 хромосому (СЕР X, Abbot-Vysis, Spectrum Aqua), ув. x lOOOl

Проведение Р18Н-анализа половых хромосом в ткани яичников контрольной группы показало, что в 80% случаях (8/10) все клетки содержали две хромосомы X. В двух случаях (20%) обнаружен тканевой мозаицизм: в одном случае присутствовала клеточная линия с моносомией хромосомы X (в 39% клеток атрезирующегося фолликула) и в другом случае - с трисомией хромосомы X в 9% клеток яичника. Анализ частоты выявления мозаицизма в ткани яичников у больных с ПНЯ и нормальным кариотипом в лимфоцитах периферической крови (72,4%, 21/29) и у больных с дисгенезией гонад (100%, 3/3) относительно контрольной группы (20%, 2/10) с высокой степенью статистической значимости (/><0,003) подтвердил, что у женщин с преждевременным истощением фолликулярного пула значительно чаще наблюдаются численные нарушения половых хромосом в соматических гонадных клетках

Сравнительный анализ клинико-лабораторных характеристик больных с ПНЯ с наличием или отсутствием мозаицизма половых хромосом в яичниковой ткани показал, что ни один показатель, характеризующий анамнез и клинический статус наших пациенток, у больных с найденным мозаицизмом половых хромосом в яичниках не отличаются от аналогичных показателей пациенток без такового.

Вторым этапом исследования стало проведение стимуляции овуляции гонадотропинами по двум схемам у 35 пациенток с ПНЯ. У 18 пациенток была использована схема стимуляции гонадотропинами в максимальной дозе 450 МЕ/сут с предварительной десенситизацией гипофиза аГнРг (1 группа). У 17 пациенток была применена модифицированная схема ТаПа^^и М. с соавт. (2007) с помощью средних доз гонадотропинов (225-300 МЕ/сут) на фоне предварительной терапии этинилэстрадиолом (ЕЕ2) 0,15 мг/сут, продолжающейся весь период введения гонадотропинов (2 группа) (Рис.3).

Начало ХГЧ

стимуляции , 5-7 000 Ед

овуляции Фолликул 18 мм Фоллитрошш О-

Начало протокола

Трипюрел им (Ммг/су*

лоо альфа

мг'счт 450мг/сут Трипифс.шн 0.05м1/с\т

А.

I 21 :: 24 25 2»; 27 . Дин цикла на ЗП

7 Н ^ 11 12 13 14 I

Начало протокола

Начало стимуляции овуляции

Фоллитрошш альфа

хгч

5-7 000 Ед Фолликул 18 мм

О

225мг/сут 300м г/су г

Э т п н и л з <1 г о а д и о л 0,15 мг/сут

I : 3 4 5 к 7 8 Дни протокола

: I'' 17 1к IV 2и 2

Б.

Рис. 3. Схемы стимуляции овуляции в 1 группе (А) и во 2 группе (Б).

Пациентки были случайным (рандомизированным) образом распределены в ту или иную группу и, как показал последующий анализ, не отличались между собой по возрасту (32,6+5,5 и 32,8+4,7 лет, р>0,05) и длительности аменореи (3,9+3,4 и 5,3±4,8 лет, р>0,05).

Несмотря на использование различных по механизму действия препаратов для подавления гонадотропной функции гипофиза концентрация сывороточного ФСГ достоверно снизилась в обеих группах (с 75,9±26,2 до 14,7±8,3 МЕ/л в 1 гр„ /><0,001; и с 121,7±39,2 до 14,0±8,8 МЕ/л во 2 гр., /х0,001)(Табл.1).

Таблица 1. Сравнительный анализ двух протоколов стимуляции

яичников

Показатель Группа 1 (п=18) Группа 2 (п=17) Р*

ФСГ после аГнРг или ЕЕ2 (МЕ/л) 14,7±8,3 14,0+8,8 >0,05

ЛГ после аГнРг или ЕЕ2 (МЕ/л) 14,1±6,5 25,5+2,2 0,009

Е2 на фоне овуляции (пмоль/л) 724,5±108,2 1160,8±134,9 0,016

Толщина эндометрия на фоне стимуляции овуляции (макс.) (см) 0,9+0,26 1,1±0,23 0,030

Число растущих фолликулов 1,0+0 1,25±0,4 >0,05

Среднесуточная доза аФСГ (МЕ/сут) 328,5±79,5 264,0±21,1 0,003

Продолжительность стимуляции (дни) 11,2 ±2,3 13,8±3,9 0,020

Суммарная доза аФСГ (МЕ) 3613,9+233,0 3889,7±281,5 >0,05

Побочные реакции 5,6% (1/18) 76,5% (13/17) <0,001

р* - критерий х", критерий Стьюдента.

При сравнительном анализе эффективности двух протоколов стимуляции овуляции оказалось, что, несмотря на то, что в группе с использованием ЕЕ2 овуляция наступила у 23,5% (4/17) больных, а в группе с применением аГнРг только у 11,1% (2/18), статистически значимой разницы в преимуществе протокола с ЕЕ2 выявлено не было (р>0,05). Ни одной беременности не наступило. Число женщин без активации фолликулогенеза в обеих группах не отличалось (66,7%, 12/18 в гр.1 и 64,7%, 11/17 в гр.2, р>0,05), однако у оставшейся одной трети больных наблюдался рост фолликулов (Рис.4).

Рис 4.

Результаты стимуляции овуляции у больных с ПНЯ

Беч ошеченшчо Рос! фолдшллиис индия

роста фолликулов последующей атре'нгей

Группа 1 " Группа 2

При сравнительной оценке динамики роста концентрации Ег в двух группах были выявлены статистически значимо более низкие средние значения Е2 у пациенток в 1 гр. (Рис. 5), несмотря на дополнительную терапию натуральными эстрогенами у 77,8% (14/18) больных. При этом, известно, что на фоне приема натуральных эстрогенов, в отличие от ЕЕ2, их концентрация определяется при лабораторном исследовании, тем самым повышая реальный уровень эндогенного Ег [Taylor, 1996]. У пациенток с зафиксированной овуляцией максимальная концентрация Ег оказалась в среднем в 1,5 раза выше у пациенток из 2 гр., чем из 1 гр. (1160,8+134,9 и 724,5±108,2 пмоль/л, соответственно,/1=0,016).

мил

*

?00 , 400 ] ; 300

200

Группа 1

Группа 2

* р< 0,05; t-критерий Стьюдента

до после аГнРг -1-5д.ст 9-Юд.ст 14-1? д.ст 19-21дст протокола ппп ЕЕ

Рис 5. Динамика концентрации эстрадиола у пациенток с ПНЯ в процессе проведения стимуляции овуляции.

Корреляционый анализ показал «сильную» зависимость между диаметром максимального фолликула и максимальной концентрацией Е2 в крови (Л=0,61), что подтверждает эндогенный генез высоких уровней Е2 и свидетельствует о нормальной функции преовуляторных фолликулов.

Несмотря на то, что до начала протоколов толщина эндометрия в двух группах больных не отличалась (0,34±0,14 и 0,30±0,09 см,/»0,05), учитывая двухнедельный прием высоких доз ЕЕг, продолжающийся в процессе стимуляции яичников, толщина М-эхо по данным УЗИ стала значимо больше у пациенток во 2 гр., чем в 1 гр., уже после подавления гонадотропной функции гипофиза (Рис. 6).

Рис 6.

Динамика толщины эндометрия по данным УЗИ

до после 4-5 д ет 9-10дст 14-15дст 19-21дст

протокола аГнРг или ЕЕ

■ ■ * р< 0,05; t-критерий Стьюдента

Группа 1 Группа 2

Используемая в 1 гр. среднесуточная доза а-ФСГ была в 1,5 раза выше, чем во 2 тр. (328,5+79,5 и 264,0±21,1 МЕ/сут, соответственно, р=0,003), однако в среднем меньшее число дней стимуляции в 1 гр. (11,2±2,3 и 13,8±3,9 дней, /?=0,020) привело в итоге к одинаковой курсовой дозе препарата (3613,9+988,7 и 3889,7±1160,8 МЕ, р>0,05) на цикл стимуляции. При сравнении длительности стимуляции и суммарной дозы аФСГ у пациенток с овуляцией и без таковой достоверных различий выявлено не было.

Применение протокола стимуляции яичников на фоне ЕЕ2 с высокой степенью статистической значимости приводило к ббльшему числу побочных реакций, чем использование традиционного «длинного» протокола. В 1 гр. побочные реакции были зафиксированы лишь у одной пациентки (5,6%) (в виде подъемов артериального давления), а во 2 гр. - у 13 (76,5%) больных (в виде повышения аппетита в 5,6%, тошноты в 17,7%, увеличения уровня печеночных ферментов в крови в 23,5% и гиперкоагуляции в 70,6% случаев). Для профилактики тромбоэмболических осложнений это потребовало дополнительного назначения пациенткам антиагрегантов - ацетилсалициловой кислоты (Тромбо-АСС, Lannacher Heilmittel, Австрия) и/или антикоагулянтов - надропарина кальция (Фраксипарин, GlaxoSmithKline, Франция). Однако, ни одного осложнения, в том числе со стороны сосудистой системы, выявлено не было.

Проведенные протоколы стимуляции овуляции у больных с ПНЯ показали, что, несмотря на небольшое число успешных циклов стимуляции (11,1%, 2/18 при применении аГнРг и 23,5%, 4/17 при использовании ЕЕ2), данный контингент больных способен к восстановлению яичниковой функции в ответ на экзогенную стимуляцию фолликулогенеза. Несмотря на высокую частоту побочных реакций, в протоколе с ЕЕ2 мы наблюдали более адекватное, согласно уровням эстрадиола, развитие фолликулов и положительный эффект у ббльшего числа пациенток, что, однако, учитывая небольшую выборку, не подтвердилось статистически. Все выше представленное свидетельствует о необходимости проведения ббльшего числа циклов стимуляции у каждой пациентки, более тщательному отбору больных для уменьшения частоты побочных реакций и разработки прогностических критериев успешной индукции овуляции у больных с ПНЯ для улучшения эффективности проводимых схем стимуляции и увеличения вероятности наступления беременности. Исходя из этого, после завершения протоколов, независимо от используемой схемы стимуляции, пациентки были разделены соответственно ответу на проведенное лечение на 3 группы: группа А - пациентки без активации фолликулогенеза (23/35), группа Б -пациентки с ростом фолликулов более 10 мм, но последующей их атрезией (6/35) и группа В - больные с зафиксированной овуляцией (6/35) для проведения сравнительного анализа их клинико-лабораторных показателей.

Проведенный анализ показал, что несмотря на имеющую место тенденцию к меньшей средней длительности аменореи у больных с овуляцией относительно пациенток с неэффективной стимуляцией (2,83±1,2

лет в гр. В против 5,41±1,0 лет в гр. А), статистически значимой разницы между выделенными группами обнаружено не было. Однако у женщин с овуляцией возраст наступления аменореи был значимо старше, чем у больных без активации фолликулогенеза (26,8±6,2 и 32,0±3,35 года, р=0,036), а степень улучшения ответа яичников на их стимуляцию находилась в прямой зависимости от длительности функционирования яичников и в обратной зависимости от длительности аменореи (Рис. 7).

Семейная форма заболевания статистически значимо чаще была выявлена в группе пациенток с произошедшей овуляцией (33,3%, 2/6 против 3,4%, 1/29, р=0,017). Сопутствующая аутоиммунная патология оказалась распределена лишь у больных с неэффективной стимуляцией яичников (48,3%, 12/29 против 0) и разница также была статистически значимой (р=0,008). Однако частота обнаружения аутоантител к яичникам не различалась (15,0%, 3/20 против 16,7, 1/6,р>0,05).

Продолжительность аменореи

Возраст наступления аменореи

Продолжительность функционирования япчнпксв

5,4±1,0

за±о,8 1 2,8*1,2

26,8±6,2

йЫЬйтйЯ

29,5*6,7

13,4±б,1 16,&Ь7,

5

18,3±4,0

О 10 20 30 40

Беч роста фолликулов (группа А) ГОДЫ

Рост фолликулов с атречпей (группа®) ■ Овуляция (группа В)

Рис.7. Зависимость эффективности стимуляции овуляции от продолжительности и возраста наступления вторичной аменореи.

Средние значения То6щ в сыворотке крови были статистически значимо выше у пациенток с зафиксированной овуляцией по сравнению с больными без отмеченного роста фолликулов (1,07±0,5 и 0,69±0,1,р=0,03) и находились в прямой зависимости от эффективности проведенной терапии (Рис. 8). У больных с последующим ответом яичников на терапию фолликулы в двух яичниках визуализировались в 2 раза чаще, чем у пациенток с неэффективной терапией (58,3%, 7/12 в гр. Б и В против 30,4%, 7/23 в гр. А, /?>0,05). Также была выявлена значимая разница между частотой выявления периоофорита у больных без отмеченного роста фолликулов и больных с овуляцией (135,3%, 6/17 и 0, соответственно,¿>=0,037)

1.07±0,5

■ Овуляция trpv-nra В)

О

■ Без роста фолликулов irpvimftA)

Рост фоштакупов с ггтрезнзй (группа Б)

Нижняя граница нормы уровш Тобщ в

крови у женщин репродуктивного возраста

Рисунок 8. Зависимость эффективности стимуляции овуляции от уровня тестостерона у пациенток с ПНЯ.

Нами обнаружено, что SXCI при пороговом значении 80% была выявлена только у пациенток с неэффективной индукцией овуляции. При этом, имела место обратная зависимость между частотой обнаружения SXCI и степенью улучшения ответа яичников на их стимуляцию (33,3%, 7/21 в гр.А > 16,7%, 1/6 в гр. Б > 0 в гр. В). Что касается полиморфизма гена FMR1, то была обнаружена тенденция к увеличению длин CGG-повторов как в первой, так и во второй аллели у пациенток с зафиксированной овуляцией

Для подтверждения или опровержения выявленной зависимости эффективности индукции овуляции у больных с ПНЯ от данных показателей мы применили метод корреляционного анализа с вычислением коэффициента ранговой корреляции Спирмена (Табл. 2). I

Проведенный анализ выявил «умеренную» положительную связь эффективности стимуляции яичников у больных с ПНЯ с возрастом выключения (Л=0,3б) и с продолжительностью функционирования яичников (#=0,35), а также с семейной формой заболевания (Я=0,45), концентрацией | "Гобщ в крови (7?=0,37) и обнаружением фолликулов по УЗИ в обоих яичниках до начала терапии (Я=0.34). Отрицательная «умеренная» связь была выявлена между эффективностью стимуляции овуляции и наличием любой сопутствующей аутоиммунной патологии (/¿=-0,38) или ЭХСЛ при 80% пороге инактивации (Л=-0,36), Следует отметить, что при исследовании нам не у далось обнаружить связи эффективности стимуляции у больных с ПНЯ с длительностью аменореи, концентрацией АМГ, наличием или отсутствием I антиовариальных антител в крови и фолликулов при гистологическом исследовании биоптатов яичниковой ткани, которые наиболее часто обсуждаются в литературе как возможные прогностические критерии эффективности стимуляции овуляции или спонтанного восстановления функции яичников у больных с ПНЯ.

(Р=0,07),

Таблица 2. Взаимосвязь эффективности стимуляции овуляции у

Показатели Коэффициент ранговой корреляции Р

Эффективность СО/ длительность аменореи -0,27 0,12

Эффективность СО/ возраст наступления аменореи 0,36 0,034

Эффективность СО/ продолжительностьть функционирования яичников 0,35 0,041

Эффективность СО/ семейная форма ПНЯ 0,45 0,007

Эффективность СО/ сопутствующая аутоиммунная патология -0,38 0,025

Эффективность СО/ концентрация То6щ 0,37 0,028

Эффективность СО/ концентрация АМГ 0,08 0,69

Эффективность СО/ наличие антител к яичнику 0,07 0,74

Эффективность СО/ фолликулы при УЗИ - как минимум в одном из яичников - в обоих яичниках 0,10 0,34 0,55 0,045

Эффективность СО/ 8ХС1 (80% порог) -0,36 0,041

Эффективность СО/ экспансия гена /'"МЛ/ аллель 1 аллель 2 0,25 0,31 0,17 0,09

Эффективность СО/ фолликулы по данным гистологического исследования 0,17 0,39

Эффективность СО/ периоофорит -0,33 0,09

* СО - стимуляция овуляции

Для расчета относительного риска (ОР) неэффективной индукции овуляции мы сравнили пациенток без активации фолликулогенеза (гр. А) с пациентками с положительным ответом на стимуляцию (грю В) в попытке исключить влияние больных, у которых был отмечен рост фолликулов, но не произошло овуляции, так как не ясно, произошло ли это вследствие независимых эндогенных причин или оказала влияние схема стимуляции (Табл. 3). Учитывая отсутствие больных с данными параметрами в группе больных с овуляцией (0%) рассчитать 95% доверительные интервалы для данных рисков не представлялось возможным.

Проведенный анализ показал, что при наличии любой сопутствующей аутоиммунной патологии относительный риск плохого ответа яичника на их стимуляцию у больных с ПНЯ в 7 раз выше, чем у пациенток без таковых (ОР = 6,91). При наличии 5ХС1 данный показатель составил ОР = 4,15, а при обнаружении периоофорита по гистологии ОР = 3,60

Таблица 3. Значемые относительные риски неэффективной стимуляции _ овуляции у больных с ПНЯ __

Пациентки с Пациентки с Относительный риск (ОР)

Показатель овуляцией (п=6) отсутствием роста фолликулов (п=23) Р

N % п %

Сопутствующая аутоиммуная 0 0 12 52,2% 0,02 6,91

патология

эха 0 0 7 30,4% 0,56 4,15

Периоофорит по гистологии 0 0 6 26,1% 0,037 3,60

Учитывая, что на сегодняшний день основным способом преодоления бесплодия у больных с ПНЯ остается программа ЭКО с использованием донорских ооцитов (ЭКО-ДО), мы оценили частоту наступления беременности и ее исходы при реализации данной программы у наших больных. В данном исследовании 18 больным с ПНЯ в возрасте от 22 до 40 лет (средний возраст 32,4±5,6 года) с продолжительностью аменореи от 7 месяцев до 19 лет (в среднем 6,5±5,5 года) было проведено от 1 до 11 попыток ЭКО-ДО, всего 32 попытки. У 13 пациенток был проведен один цикл донации ооцитов, у 4-х больных - два цикла и у одной пациентки - 11 циклов. Беременность наступила в 10 циклах донации, в 9 случаях была зафиксирована одноплодная беременность и у одной пациентки - двойня. Таким образом, частота наступления беременности на цикл донации ооцитов составила 31,3% (10/32). У половины больных (50%, 9/18) беременность наступила с первой попытки ЭКО-ДО. Девять беременностей закончились рождением здоровых детей, в том числе и беременность двойней. У одной больной в сроке 8 недель была диагностирована замершая беременность (Рис.10).

69%

Рождение 28% живого ребенка

Замершая -''/0 беременность

Рисунок 10. Результаты 32-х циклов ЭКО с донорскими ооцитами у больных с ПНЯ.

ЭКО-ДО без эффекта

Беременность

Исходя из полученных нами результатов и представленных данных литературы можно заключить, что у 72,4% больных с ПНЯ причиной преждевременного истощения фолликулярного пула может быть скрытый гонадный мозаицизм по половым хромосомам, который, характерен для соматических клеток яичника, и, следовательно, не является противопоказанием к стимуляции овуляции у его носительниц. При отсутствии тяжелой соматической патологии и противопоказаний для вынашивания беременности пациенткам с ПНЯ, настаивающим на реализации репродуктивной функции за счет собственных яйцеклеток, можно рекомендовать проведение нескольких циклов стимуляции овуляции, особенно пациенткам с наличием благоприятных прогностических факторов овуляции. При неэффективности проведенных циклов индукции овуляции и у пациенток, не настаивающих на генетически родственном ребенке, целесообразно проводить программу ЭКО с использованием донорских ооцитов.

выводы

1. Комплекс клинико-лабораторных признаков позволяет судить о структуре причин, приводящих к ПНЯ. Молекулярно-генетические нарушения выявлены в 30,7% случаев, аутоиммунное поражение яичников -в 21%, а идиопатическая форма заболевания - у 48,3% больных.

2. У больных с ПНЯ и нормальным кариотипом в лимфоцитах периферической крови в яичниковой ткани с помощью интерфазного РКН-анализа в 72,4% случаев обнаружен гонадный мозаицизм по половым хромосомам, в то время как в тканях яичника здоровых женщин частота его представленности не превышает 20% (р=0,003). Выявляемость клеток с анеуплоидией хромосомы X составляет от 1 до 71%.

3. При гонадном мозаицизме в 51,7% случаев диагностирован простой его вариант по типу сочетания нормальной (эуплоидной) и одной анеуплоидной клеточной линии (с моносомией хромосомы X (Х/ХХ) в 31% или трисомией хромосомы X (ХХХ/ХХ) в 20,7% случаев. Сложный мозаицизм выявлен в 20,7% случаев, при этом с равной частотой (10,3%) обнаружены две (Х/ХХХ/ХХ или ХХХ/ХХХХ/ХХ) или три анеуплоидные клеточные линии (Х/ХХХ/ХХХХ/ХХ или (Х/ХХХ/ХУ/ХХ). В тканях яичника здоровых женщин определен только простой мозаицизм (20%), представленный в равной степени моно- или трисомией хромосомы X.

4. В 3,4% случаев при ПНЯ и в 66,7% случаев при дисгенезии гонад с помощью РИН-анализа в гонадах, в отличие от в-окраски и РКП-анализа лимфоцитов периферической крови, выявлены клетки с одной хромосомой У. Доля клеточных клонов, содержащих хромосому У, составила от 2 до 50% исследованных клеток.

5. Больные с ПНЯ и выявленным гонадным мозаицизмом по половым хромосомам и без такового статистически не различаются по клинико-лабораторным данным, включая их репродуктивный анамнез до дебюта заболевания. Следовательно, наличие гонадного мозаицизма не является противопоказанием к стимуляции овуляции у данной категории больных.

6. Овуляция у больных с ПНЯ, подтвержденная УЗИ и уровнем прогестерона в сыворотке крови (32,4±4,1 нмоль/л), в ответ на стимуляцию яичников гонадотропинами на фоне блокады гонадотропной функции гипофиза аГнРг или высокими дозами (0,15 мг/сут) синтетических эстрогенов наступает с одинаковой частотой - в 11,1 и 23,5% случаев, соответственно (р>0,05). Активация фолликулогенеза при использовании данных протоколов наблюдается у одной трети больных.

7. Комбинация этинилэстрадиола и гонадотропинов для достижения овуляции по сравнению со стимуляцией яичников гонадотропинами на фоне десенситизации гипофиза аГнРг у больных с ПНЯ приводит к значимому повышению уровня эндогенного эстрадиола (1160,8±134,9 против 724,5±108,2 пмоль/л, р = 0,016) за счет адекватного роста и созревания фолликулов, а также способствует физиологической зрелости эндометрия (1,1 ±0,2 против 0,9±0,3 см, /7=0,03).

8. Независимо от схемы используемого протокола стимуляции к благоприятным прогностическим критериям успешной индукции овуляции у больных с ПНЯ следует относить более поздний дебют заболевания по отношению к возрасту менархе (Л=0,36), семейную форму ПНЯ (Л=0,45), уровень общего тестостерона в сыворотке крови > 1нмоль/л (Я=0,37) и наличие до начала терапии по данным УЗИ фолликулов в обоих яичниках (Л=0,34). К неблагоприятным факторам относится любая сопутствующая аутоиммунная патология как эндокринного, так и неэндокринного генеза (Я=-0,38, ОР=6,91), а также выявление неслучайной инактивации хромосомы X (7?=-0,Зб, ОР=4,15) и наличие периоофорита в биоптатах яичниковой ткани (11=-0,33, ОР=3,60).

9. Длительный прием высоких доз этинилэстрадиола в протоколах индукции овуляции, в отличие от использования аГнРг, способствует развитию гемостазиологических нарушений, купируемых прямыми антикоагулянтами только через месяц после его отмены.

10. Использование донорских ооцитов в программе ЭКО является наиболее эффективным методом преодоления бесплодия у больных с ПНЯ. Частота наступления беременности составляет 31,3% на цикл, при этом у половины больных беременность наступает с первой попытки

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При обследовании пациенток с ПНЯ помимо определения кариотипа с помощью стандартного цитогенетического метода целесообразно проведение ЖН-анализа половых хромосом в лимфоцитах для исключения «скрытого» мозаицизма по анеуплоидии хромосомы X и, возможно, обнаружения материала хромосомы У.

2. При наличии благоприятных прогностических критериев овуляции, к которым относятся поздний дебют и семейная форма заболевания, наличие фолликулов в обоих яичниках и нормальная концентрация тестостерона в крови, и при отсутствии неблагоприятных прогностических критериев, таких как сопутствующая аутоиммунная патология, периоофорит при гистологическом исследовании биоптатов яичников и выявление неслучайной инактивации хромосомы X, у больных с ПНЯ, настаивающих на достижении беременности за счет собственной яицеклетки, целесообразно проведение нескольких циклов стимуляции овуляции как можно раньше от начала заболевания.

3. При назначении стимуляции овуляции больным с ПНЯ необходимо отдавать предпочтение схемам с использованием сочетания гонадотропинов с этинилэстрадиолом в дозе 0,05-0,075 мг/сут.

4. В связи с высокой частотой развития гиперкоагуляции на фоне терапии высокими дозами этинилэстрадиола следует строго контролировать параметры системы гемостаза для избежания тромбофилических осложнений. При наличии отягощенного анамнеза по тромбофилии следует проводить индукцию овуляции по традиционному «длинному» протоколу.

5. При отсутствии эффекта от 3-4 циклов индукции овуляции у больных с ПНЯ целесообразно рекомендовать им программу ЭКО с донорским ооцитом

Алгоритм лечения бесплодия у больных с ПНЯ

1. Сбор анамнеза: возраст наступления аменореи, ПНЯ или ранняя менопауза в семье, сопутствующие заболевания.

2. Лабораторное обследование: уровень тестостерона, УЗИ малого таза, исследование неслучайной инактивации хромосомы X.

- Поздний дебют заболевания

- Семейная форма ПНЯ

- Отсутствие сопутствующей аутоиммунной патологии

- Нормальный уровень тестостерона в крови

- Наличие фолликулов в обоих яичниках по УЗИ

- Отсутствие периоофорита (если имеются данные гистологического исследования)

- Отсутствие неслучайной инактивации хромосомы X

- Ранний дебют заболевания

- Спорадическая форма ПНЯ

- Наличие сопутствующей аутоиммунной патологии

- Низкий уровень тестостерона в крови

- Отсутствие фолликулов или их наличие только в одном яичникае по УЗИ

- Наличие периоофорита (если имеются данные гистологического исследования)

- Наличие неслучайной инактивации хромосомы X

Отсутствие наследственных форм

тромбофилии, нормальные показатели гемостаза

3-4 цикла стимуляции овуляции фоллитропином альфа на фоне подавления

гипофиза этинилэстрадиолом в дозе 0,05-0,075 мг/сут

Наличие наследственных форм тромбофилии, хроническая гиперкоагуляция 4 4- -

3-4 цикла стимуляции овуляции фоллитропином альфа на фоне подавления гонадотропной функции гипофиза препаратами аГнРг

-I

Отсутствие наступления беременности

Программа ЭКО с донорскими ооцитами

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Клинико-лабораторные варианты течения преждевременной недостаточности яичников / JI.A. Марченко, З.Г. Габибуллаева, Г.И. Табеева, Л.Б. Бутарева, Н.А. Чернышева Н Репродуктивное здоровье: материалы II международного конгресса по репродуктивной медицине. М. 2008. С.211-213.

2. Sex chromosomal mosaicism in ovarian tissue in women with premature ovarian insufficiency /, V.P. Smetnik, L.A. Marchenko A.I.Karseladze, L.B. Butareva, N.A. Chernyshova, G.I. Tabeeva // Материалы 80Г° Европейского конгресса по Менопаузе (EMAS). Лондон. 2009. C.122.

3. Clinical and genetic characteristics of women with premature ovarian insufficiency / V.P. Smetnik, L.A. Marchenko, L.B. Butareva, N.A. Chernyshova,

G.I. Tabeeva, M.V. Nemtsova // Материалы 8°ro Европейского конгресса по Менопаузе (EMAS). Лондон. 2009. С. 121.

4. Клинико-генетическая характеристика больных с преждевременной недостаточностью яичников / Л.А.Марченко, ЛБ. Бутарева, А.И. Карселадзе,

H.А. Чернышева, Г.И. Табеева, М.В. Немцова // Материалы HI Международного Конгресса по репродуктивной медицине. М. 2009. С. 199.

5. Параовариальные кисты у больных с ПНЯ: случайность или закономерность? / Л. А. Марченко, Л.Б. Бутарева, А.И. Гус, Н.А.Чернышова, Г.И. Табеева // Материалы III Международного Конгресса по репродуктивной медицине. М. 2009. С. 169.

6. Ограниченный тканевой мозаицизм по половым хромосомам у больных с преждевременной недостаточностью яичников / Г.Т. Сухих, Л.А. Марченко, Н.А. Чернышева, А.И. Карселадзе, Л.Б. Бутарева, А.М. Строганова, Г.И. Табеева, В.П. Сметник // Проблемы репродукции. 2009. №3. С.87-92.

7. Ограниченный гонадальный мозаицизм по половым хромосомам у больных с преждевременной недостаточностью яичников / Н.А. Жахур, Л А. Марченко, Л.Б. Бутарева, А.И. Карселадзе, А.М.Строганова // Материалы IV Международного Конгресса по репродуктивной медицине. М. 2010. С. 184.

8. Возможности восстановления фертильности у пациенток с преждевременной недостаточностью яичников (обзор литературы) / Н.А. Жахур, Л.А. Марченко, Л.Б. Бутарева, М.А. Шахова // Проблемы репродукции. 2010. №1. С.40-48

9. Sex chromosomal mosaicism in ovarian tissue in women with premature ovarian insufficiency and polycystic ovary syndrome / G.E. Chernukha, L.A. Marchenko, N.A. Jahour, L.B. Butareva, A.I. Karseladze // Материалы 14on> Всемирного конгресса по гинекологической эндокринологии (ISGE).-Флоренция, Италия. 2010. С.707.

10. Гонадный мозаицизм по половым хромосомам при преждевременной недостаточности яичников и синдроме поликистозных яичников / Н.А. Жахур, Г.Е. Чернуха, ЛА. Марченко, А.И. Карселадзе, ЛБ. Бутарева, В.М.

Строганова // Материалы XI Всероссийского научного форума «Мать и дитя». М. 2010. С.370.

11. Преждевременная недостаточность функции яичников как результат анеуплоидии половых хромосом (обзор литературы) / Н.А. Жахур, Л.А. Марченко, Л.Б. Бутарева. // Проблемы репродукции. 2010. № 6. С.30-38

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

аГнРг агонист гонадотропин-рилизинг гормона

АМГ антимюллеров гормон

ИФА иммуноферментный анализ

ЛГ лютеинизирующий гормон

ОР относительный риск

ПНЯ преждевременная недостаточность яичников

ПЦР полимеразная цепная реакция

Т4св тироксин свободная фракция

Тобт тестостерон общий

ттг тиреотропный гормон

тэсг тестостерон-эстрадиол связывающий глобулин

ФСГ фолликулостимулирующий гормон

хгч хорионический гонадотропин человека

ЦУГ штриховой соскоб эндометрия

эко экстракорпоральное оплодотворение

эко-до экстракорпоральное оплодотворение с использованием ооцитов донора

аФСГ фоллитропин альфа

AR ген андрогенового рецептора

СЕР центромерная проба

Ег эстрадиол

EEi этинилэстрадиол

FISH флуоресцентная in situ гибридизация

FMR1 Fragile Mental Retardation-1 ген

R коэффициент ранговой корреляции Спирмена

SBM средняя длина аллелей

SXCI неслучайная (избирательная) инактивация хромосомы X

XCI инактивация хромосомы X

XWBM средняя длина аллелей, связанная с инактивацией хромосомы X

11одписано в печать: 16.04.11

Объем: 1,5 усл.п.л. Тираж. 100 экз Заказ N« 785 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского,39 (495) 363-78-90; www.rcglet.ru

Преждевременная недостаточность яичников (ПНЯ) - это патологическое состояние, характеризующееся аменореей, бесплодием, симптомами гипоэстрогении и повышенным уровнем гонадотропинов (ФСГ, ЛГ) у женщин в возрасте до 40 лет [31, 168]. Частота встречаемости данной патологии в женской популяции составляет 1-3% и достигает 10% в структуре аменорей [42]. По современным представлениям ПНЯ развивается вследствие резкого снижения фолликулярного пула за счет ускоренной атрезии фолликулов, недостаточной их закладки во время внутриутробробного развития или при нарушениях созревания фолликулов.

Преждевременному истощению овариального резерва могут способствовать генетические, инфекционно-токсические, аутоиммунные и ятрогенные причины [129, 298]. Однако, несмотря на современные диагностические возможности, в большинстве случаев точно выявить этиологию данного заболевания крайне сложно, в связи с чем идиопатическая форма в структуре ПНЯ продолжает составлять более 50% [129, 292]. Анализ причин ПНЯ, представленный в обзорной статье Woad K.J. с соавт. (2006), показал, что численные и структурные аномалии хромосомы X встречаются в 5% случаев, генные нарушения - в 30%, аутоиммунная форма заболевания - в 10% и ятрогенная - в 2-3% случаев [305]. Согласно проведенным в России исследованиям Габибуллаевой З.Г. (2008) и Табеевой Г.И. (2009) по выявлению различных форм ПНЯ, в 4,2-5,6% случаев наблюдаются численные аномалии половых хромосом, включая и мозаичные их варианты, в 13,9-26,4% обнаруживаются генные нарушения (неслучайная инактивация хромосомы X или премутация гена FMR1), в 14,9-15,2% выявляется аутоиммунная этиология, а на долю идиопатической формы ПНЯ приходится 52,8-67,0% случаев [9, 33]. Несмотря на это, встречаемость семейных форм заболевания примерно у каждой 3-4 пациентки приводит к выводу о большей значимости генетических факторов в генезе преждевременного истощения фолликулярного пула.

В последние годы при рассмотрении вопросов этиопатогенеза ПНЯ особое внимание уделяется роли хромосомных и генных нарушений, при этом наиболее часто аномалии выявляются на хромосоме X в виде численных (моносомия хромосомы X) или структурных (делеции, транслокации) нарушений. Еще в 1989 году в работе Кирилловой Е.А. было показано, что у больных с гипергонадотропной аменореей наиболее частой аномалией кариотипа является мозаицизм по половым хромосомам 45,Х/46,ХХ [15]. Однако, как показывают результаты стандартного цитогенетического анализа при исследовании лимфоцитов периферической крови, весь спектр аномалий кариотипа у больных с вторичной формой ПНЯ не превышает 8,3% [173]. В то же время у больных с первичной гипергонадотропной аменореей численные нарушения половых хромосом в структуре этиологических факторов достигают 50% [268]. Известно, что патогенез как первичной, так и вторичной яичниковой недостаточности сводится к несоответствию скорости атрезии фолликулов в гонадах некой физиологической норме, в результате чего к возрасту менархе количество фолликулов оказывается меньше нормального или они полностью отсутствуют. Общность патогенеза этих двух состояний приводит к заключению о наличии аналогичных причин, запускающих этот патологический процесс. В контексте приведенных данных следует подчеркнуть, что мозаичный кариотип, как правило, представлен во всех тканях организма (генерализованный, истинный мозаицизм), однако в редких случаях он может быть ограничен только какой-либо одной тканью (ограниченный тканевой мозаицизм). В последние годы появились работы, доказывающие наличие ограниченного мозаицизма 45,Х/46,ХХ в гонадах у пациентов с дисгенезией гонад и нормальным женским (46,XX) или мужским (46,ХУ) кариотипом в лимфоцитах [255]. С другой стороны, существуют данные о нормальной функции яичников и сохраненной фертильности у женщин с регулярной формой моносомии хромосомы X в лимфоцитах [193].

Проблема диагностики «скрытого» тканевого мозаицизма приобретает особое значение для больных с ограниченным фолликулярным пулом. Возможно, несмотря на нормальный кариотип в лимфоцитах периферической крови, у них имеет место нераспознанный ограниченный гонадами мозаицизм, что и объясняет преждевременное истощение овариального резерва. Исходя из всего выше представленного, а также учитывая доступность в последнее время новых молекулярно-цитогенетических методик, позволяющих провести анализ хромосом в различных тканях организма, для раскрытия возможных механизмов развития ПНЯ кажется целесообразным изучить представленность половых хромосом непосредственно в клетках гонад у данной категории больных.

Хорошо известно, что у больных с ПНЯ, помимо нарушений в сердечнососудистой, костной и моче-половой системах за счет выраженного эстроген-дефицитного состояния, которые можно компенсировать регулярным приемом заместительной гормонотерапии (ЗГТ) до возраста естественной менопаузы, наиболее сложной проблемой является поиск лечебных подходов в преодолении бесплодия. В литературе описаны редкие случаи спонтанных беременностей на фоне длительного периода вторичной гипергонадотропной аменореи. Однако частота наступления самостоятельной беременности крайне невысока и не преодолевает 6% барьер. По данным российских авторов, на фоне ЗГТ беременность у больных с ПНЯ наступает в 3,7-5,1% случаев [33, 34]. Таким образом, на сегодняшний день программа ЭКО с использованием донорских ооцитов рассматривается у этой категории больных как единственный высокоэффективный метод лечения бесплодия. Однако, многие пациентки с истощенным фолликулярным резервом по социальным, религиозным или личностным мотивам настаивают на достижении беременности за счет собственной яйцеклетки.

С 1990 года появились работы, свидетельствующие о возможности наступления беременности у больных с ПНЯ на фоне стимуляции овуляции [82], и к настоящему времени в мировой литературе описано рождение 77 детей у 1160 (6,6%) пациенток на фоне различных модифицированных схем индукции овуляции. При этом авторы представляют результаты стимуляции овуляции с примением различных препаратов и схем, включая комбинированные оральные контрацептивы (КОК), глюкокортикостероиды (ГКС), гонадотропины, эстрогены, агонисты гонадотропин-рилизинг гормона (аГнРг), дегидроэпиандростерон (ДГА) и др. [292]. Однако особый интерес ученых всегда был направлен на два принципиальных подхода к терапии бесплодия у больных с ПНЯ. Во-первых, индукция фолликулогенеза с использованием гонадотропинов после предварительной супрессии гипофиза препаратами аГнРг, что диктуется существующей гипотезой о возможности развития резистентности яичников к экзогенным гонадотропинам при высоких уровнях эндогенного ФСГ [259, 292], и, во-вторых, стимуляция овуляции на фоне дополнительной терапии эстрогенами, которые, помимо подавления повышенного уровня ФСГ, по некоторым данным, могут повышать чувствительность гранулезных клеток к действию экзогенных гонадотропинов, восстанавливая нормальную функцию рецепторного аппарата [41, 283]. В 2007 году в литературе появились обнадеживающие результаты плацебо контролируемого исследования ТаА^ш М. с соавт., в котором авторы провели стимуляцию овуляции гонадотропинами с предварительной терапией высокими дозами этинилэстрадиола (ЕЕг) у больных с ПНЯ и достигли овуляции в 32% случаев и беременности в 16% случаев [283]. Однако, частота наступления беременности в других ранее проведенных контролируемых исследованиях была гораздо ниже и в среднем составила 1,5% [292]. При этом, несмотря на возможность овуляции у половины больных с ПНЯ, предугадать вероятность перманентного или стойкого восстановления функции яичников при ПНЯ крайне сложно. Таким образом, на сегодняшний день не определена наиболее эффективная схема стимуляции яичников у больных с ПНЯ и не выделены определенные клинико-лабораторные показатели, которые могли бы прогнозировать ее успешность при данной патологии.

Цель исследования - на системном и тканевом уровнях изучить патогенетические факторы развития ПНЯ, а также оценить эффективность стимуляции фолликулогенеза и разработать критерии ее успеха при данной патологии.

Задачи исследования:

1. Оценить частоту различных этиопатогенетических форм ПНЯ, используя современные клинико-диагностические и молекулярно-генетические методы обследования;

2. Изучить половые хромосомы в интерфазных ядрах клеток из биоптатов яичниковой ткани с помощью флуоресцентной in situ гибридизации и проанализировать клинико-лабораторные особенности ПНЯ при наличии гонадного мозаицизма по половым хромосомам;

3. Оценить возможность фолликуло- и оогенеза в ответ на стимуляцию яичников и провести сравнительный анализ эффективности и безопасности терапии гонадотропинами с предварительным подавлением гонадотропной функции гипофиза препаратами агонистов ГнРг или высокими дозами этинилэстрадиола у больных с ПНЯ;

4. Разработать совокупность клинико-лабораторных и молекулярно-генетических факторов эффективности стимуляции яичников у больных с ПНЯ;

5. Оценить частоту наступления беременности в программе ЭКО с использованием донорских ооцитов у больных с преждевременной недостаточностью яичников.

Научная новизна

На основании использования современного молекулярно-цитогенетического метода расширены и дополнены представления о причинах и механизмах истощения фолликулярного пула у больных с ПНЯ. Впервые проведен анализ численных нарушений половых хромосом непосредственно в яичниковой ткани у больных с вторичной гипергонадотропной аменореей. БКИ-анализ половых хромосом в интерфазных ядрах клеток гонад показал, что у 72,4% больных с ПНЯ на фоне нормального кариотипа в лимфоцитах в гонадах наблюдается анеуплоидия хромосомы X, при этом наиболее часто (48,3%) выявляется клеточная линия с одной хромосомой X. Выявлено, что у пациенток с ПНЯ при нормальном кариотипе в лимфоцитах периферической крови в 51,7% случаев в гонадах диагностируется простой мозаицизм, представленный наряду с нормальной одной анеуплоидной линией клеток - с моносомией хромосомы X или трисомией хромосомы X, и в 20,7% случаев обнаруживается сложный мозаицизм с наличием двух и более анеуплоидных клеточных линий с нарушением плоидности хромосомы X. Показано также, что у 3,4% больных с ПНЯ в гонадной ткани могут присутствовать клетки с хромосомой У, которые не обнаруживаются при исследовании лимфоцитов периферической крови даже с помощью Р18Н-анализа. При этом для женщин с нормально функционирующими яичниками лишь в 20% случаев характерно ниличие мозаицизма половых хромосом в гонадах, представленного лишь одной дополнительной клеточной линией с моносомией или трисомией хромосомы X.

Полученные результаты доказывают связь ПНЯ с наличием ограниченного гонадного мозаицизма по половым хромосомам и имеют большую теоретическую значимость, так как позволяют утверждать, что одним из возможных механизмов преждевременного истощения фолликулярного пула у данной категории больных может быть ускоренный апоптоз половых клеток, сопряженный с анеуплоидией половых хромосом в яичнике. Наравне с этим, при сравнительном анализе репродуктивной функции больных ПНЯ с наличием и отсутствием гонадного мозаицизма было выявлено, что нарушение плоидности половых хромосом в гонадах не отражается на фертильности у этих больных до развития заболевания, а также не влияет на клиническую картину заболевания. Выявленные нарушения, таким образом, отражают лишь механизм развития данной патологии.

Проведен сравнительный анализ использования традиционной схемы стимуляции овуляции по «длинному» протоколу с предварительной десенситизацией гипофиза препаратами аГнРг и модификации инновационной схемы стимуляции яичников с применением высоких доз (0,15 мг/сут) ЕЕ2 у больных с ПНЯ. Показано, что обе схемы стимуляции имеют одинаковую эффективность в достижении овуляции, однако только использование ЕЕ2 способствует синхронизации процессов созревания фолликулов и адекватного роста эндометрия. Несмотря на почти абсолютное истощение фолликулярного пула, в ответ на проводимую терапию рост фолликулов более 10 мм наблюдается у одной трети больных, при этом у 11,1%-23,5% происходит овуляция, а у остальных больных фолликулы претерпевают атрезию.

Впервые выделены клинико-лабораторные показатели, которые могут прогнозировать успех индукции овуляции у больных с ПНЯ. Сравнительный анализ клинико-лабораторных характеристик женщин с ПНЯ относительно их ответа на индукцию овуляции показал, что благоприятными факторами успешной индукции овуляции у данной категории больных являются: более длительный период функционирования яичников (Я=0,35, /7=0,041), независимо от длительности аменореи, семейная форма заболевания (Я=0,45, />=0,007), более высокая концентрация в крови общего тестостерона (>1,0 нмоль/л, 13=0,37, />=0,028), косвенно свидетельствующая о неполном выключении функции яичников, и обнаружение фолликулов в обоих яичниках по данным УЗИ (11=0,34, /7=0,045). К неблагоприятным факторам, почти в 7 раз уменьшающим вероятность положительного ответа на стимуляцию яичников, относится любая сопутствующая аутоиммунная патология как эндокринного, так и неэндокринного генеза (11=-0,38, />=0,025; ОР=6,91), а также в 3,5-4 раза - выявление неслучайной инактивации хромосомы X при 80% пороге инактивации (К=-0,36, р=0,041; ОР=4,15) и периоофорита (Я=-0,33, /7=0,09; ОР=3,6) при гистологическом исследовании биоптатов яичниковой ткани.

Оценена частота наступления беременности у больных с ПНЯ при использовании программы ВРТ с донорскими ооцитами, которая составила 31,3% на цикл.

Практическая значимость

На основании проведенного Н8Н-анализа половых хромосом в интерфазных клетках яичниковой ткани было показано, что анеуплоидия половых хромосом в гонадах у больных с ПНЯ характерна для соматических клеток яичника (строма). Таким образом, наличие на тканевом уровне данной патологии не увеличивает вероятность рождения ребенка с нарушениями кариотипа. Следовательно, выявление гонадного мозаицизма не является противопоказанием для проведения стимуляции овуляции у данной категории больных. Обнаружение у 3,4% пациенток с ПНЯ материала хромосомы У в яичниковой ткани, не выявляемого при исследовании лимфоцитов периферической крови, ставит вопрос о необходимости постоянного динамического наблюдения за данной категорией больных в связи с существующим риском развития гонадобластомы.

На основе проведенного сравнительного и корреляционного анализа основных клинико-лабораторных показателей пациенток с эффективной и неэффективной стимуляцией овуляции впервые были выделены благоприятные и неблагоприятные факторы успешной терапии бесплодия у больных с ПНЯ. Разработан алгоритм лечения бесплодия у больных с вторичной гипергонадотропной аменореей. Показано, что пациентки с поздним дебютом и семейной формой заболевания, а также с нормальной концентрацией в крови тестостерона имеют большую вероятность наступления индуцированной овуляции, в то время как любая сопутствующая аутоиммунная патология, а также выявление неслучайной инактивации хромосомы X и периоофорита в яичниковой ткани являются неблагоприятными прогностическими факторами достижения овуляции.

Положения, выносимые на защиту

1. Для больных с ПНЯ характерны различные виды численных нарушений половых хромосом в гонадной ткани, при этом межтканевые различия по хромосомной конституции лимфоцитов и соматических клеток яичника выявляются у 72,4% больных. Среди вариантов анеуплоидии в гонадах преобладает моносомия X, крайне редко (3,4%) возможно обнаружение хромосомы Y. Все выше представленное позволяет предположить, что одним из ведущих механизмов преждевременного истощения овариального пула при ПНЯ может являться ускореный апоптоз ооцитов, идентичный таковому при типичной форме дисгенезии гонад.

2. Эффективность стимуляции яичников у больных с вторичной гипергонадотропной аменореей не зависит от используемой схемы, при этом в ответ на терапию активация фолликулогенеза наблюдается у одной трети больных, которая у 11,1-23,4% пациенток заканчивается овуляцией. Только использование этинилэстрадиола в схемах индукции овуляции у больных с ПНЯ способствует синхронизации процессов роста фолликулов и эндометрия.

3. Совокупность клинико-лабораторных показателей, включающая поздний дебют и семейную форму заболевания, а также наличие в обоих яичниках фолликулов, способных к физиологической продукции тестостерона являются благоприятными факторами индуцированной овуляции. Выявление сопутствующей аутоиммунной патологии, воспалительных изменений в яичниках и наличие неслучайной инактивации хромосомы X относятся к неблагоприятным признакам. С наибольшей эффективностью преодолеть бесплодие у больных с ПНЯ на сегодняшний день удается только с помощью методов вспомогательных репродуктивных технологий с использованием донорских ооцитов.

Апробация работы

Основные результаты работы доложены и обсуждены на VIII Европейском Конгрессе по Менопаузе (EMAS) (Лондон, 2009), на IV Международном Конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 2010) и в виде постерного доклада на XIV Всемирном Конгрессе по гинекологической эндокринологии (ISGE) (Флоренция, 2010).

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ. Обсуждение диссертации состоялось на межклинической конференции в отделении гинекологической эндокринологии ФГУ «НЦ АГиП им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России (22.10.2010) и на заседании апробационной комиссии ФГУ «НЦ АГиП им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России (15.11.2010г.).

Внедрение результатов исследования в практику Комплексное обследование и принципы лечения у пациенток с ПНЯ внедрены в клиническую практику ФГУ «НЦ АГиП им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России. Материалы диссертации используются при чтении лекций по гинекологической эндокринологии.

Структура и объём диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, характеристики материалов и методов исследования, глав, отражающих результаты собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы, изложена на 235 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 31 таблицей и 30 рисунками. Список литературы включает 306 источников (36 на русском и 270 на иностранных языках).

выводы

1. Комплекс клинико-лабораторных признаков позволяет судить о структуре причин, приводящих к ПНЯ. Молекулярно-генетические нарушения выявлены в 30,7% случаев, аутоиммунное поражение яичников -в 21%, а идиопатическая форма заболевания - у 48,3% больных.

2. У больных с ПНЯ и нормальным кариотипом в лимфоцитах периферической крови в яичниковой ткани с помощью интерфазного FISH-анализа в 72,4% случаев обнаружен гонадный мозаицизм по половым хромосомам, в то время как в тканях яичника здоровых женщин частота его представленности не превышает 20% (/>=0,003). Выявляемость клеток с анеуплоидией хромосомы X составляет от 1 до 71%.

3. При гонадном мозаицизме в 51,7% случаев диагностирован простой его вариант по типу сочетания нормальной (эуплоидной) и одной анеуплоидной клеточной линии (с моносомией хромосомы X (Х/ХХ) в 31% или трисомией хромосомы X (ХХХ/ХХ) в 20,7% случаев. Сложный мозаицизм выявлен в 20,7% случаев, при этом с равной частотой (10,3%) обнаружены две (Х/ХХХ/ХХ или ХХХ/ХХХХ/ХХ) или три анеуплоидные клеточные линии (Х/ХХХ/ХХХХ/ХХ или (Х/ХХХ/Х Y/XX). В тканях яичника здоровых женщин определен только простой мозаицизм (20%), представленный в равной степени моно- или трисомией хромосомы X.

4. В 3,4% случаев при ПНЯ и в 66,7% случаев при дисгенезии гонад с помощью FISH-анализа в гонадах, в отличие от G-окраски и FISH-анализа лимфоцитов периферической крови, выявлены клетки с одной хромосомой Y. Доля клеточных клонов, содержащих хромосому Y, составила от 2 до 50% исследованных клеток.

5. Больные с ПНЯ и выявленным гонадным мозаицизмом по половым хромосомам и без такового статистически не различаются по клинико-лабораторным данным, включая их репродуктивный анамнез до дебюта заболевания. Следовательно, наличие гонадного мозаицизма не является противопоказанием к стимуляции овуляции у данной категории больных.

6. Овуляция у больных с ПНЯ, подтвержденная УЗИ и уровнем прогестерона в сыворотке крови (32,4±4,1 нмоль/л), в ответ на стимуляцию яичников гонадотропинами на фоне блокады гонадотропной функции гипофиза аГнРг или высокими дозами (0,15 мг/сут) синтетических эстрогенов наступает с одинаковой частотой - в 11,1 и 23,5% случаев, соответственно (/?>0,05). Активация фолликулогенеза при использовании данных протоколов наблюдается у одной трети больных.

7. Комбинация этинилэстрадиола и гонадотропинов для достижения овуляции по сравнению со стимуляцией яичников гонадотропинами на фоне десенситизации гипофиза аГнРг у больных с ПНЯ приводит к значимому повышению уровня эндогенного эстрадиола (1160,8±134,9 против 724,5±108,2 пмоль/л, р = 0,016) за счет адекватного роста и созревания фолликулов, а также способствует физиологической зрелости эндометрия (1,1 ±0,2 против 0,9±0,3 см,/?=0,03).

8. Не зависимо от схемы используемого протокола стимуляции, к благоприятным прогностическим критериям успешной индукции овуляции у больных с ПНЯ, следует относить более поздний дебют заболевания по отношению к возрасту менархе (/?=0,36), семейную форму ПНЯ (/?=0,45), уровень общего тестостерона в сыворотке крови > 1 нмоль/л (Я=0,37) и наличие до начала терапии по данным УЗИ фолликулов в обоих яичниках (Я=0,34). К неблагоприятным факторам относится любая сопутствующая аутоиммунная патология как эндокринного, так и неэндокринного генеза (7?=-0,38, ОР=6,91), а также выявление неслучайной инактивации хромосомы X (/?=-0,36, ОР=4,15) и наличие периоофорита в биоптатах яичниковой ткани (Р=-0,33, 0р=3,60).

9. Длительный прием высоких доз этинилэстрадиола в протоколах индукции овуляции, в отличие от использования аГнРг, способствует развитию гемостазиологических нарушений, купируемых прямыми антикоагулянтами только через месяц после его отмены.

10. Использование донорских ооцитов в программе ЭКО является наиболее эффективным методом преодоления бесплодия у больных с ПИЯ. Частота наступления беременности составляет 31,3% на цикл, при этом у половины больных беременность наступает с первой попытки.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При обследовании пациенток с ПНЯ помимо определения кариотипа с помощью стандартного цитогенетического метода целесообразно проведение ИБН-анализа половых хромосом в лимфоцитах для исключения «скрытого» мозаицизма по анеуплоидии хромосомы X и, возможно, обнаружения материала хромосомы У.

2. При наличии благоприятных прогностических критериев овуляции, к которым относятся поздний дебют и семейная форма заболевания, наличие фолликулов в обоих яичниках и нормальная концентрация тестостерона в крови, и при отсутствии неблагоприятных прогностических критериев, таких как сопутствующая аутоиммунная патология, периоофорит при гистологическом исследовании биоптатов яичников и выявление неслучайной инактивации хромосомы X, у больных с ПНЯ, настаивающих на достижении беременности за счет собственной яицеклетки, целесообразно проведение нескольких циклов стимуляции овуляции как можно раньше от начала заболевания.

3. При назначении стимуляции овуляции больным с ПНЯ необходимо отдавать предпочтение схемам с использованием сочетания гонадотропинов с этинилэстрадиолом в дозе 0,05-0,075 мг/сут.

4. В связи с высокой частотой развития гиперкоагуляции на фоне терапии высокими дозами этинилэстрадиола следует строго контролировать параметры системы гемостаза для избежания тромбофилических осложнений. При наличии отягощенного анамнеза по тромбофилии следует проводить индукцию овуляции по традиционному «длинному» протоколу.

5. При отсутствии эффекта от 3-4 циклов индукции овуляции у больных с ПНЯ целесообразно рекомендовать им программу ЭКО с донорскими ооцитами.

Алгоритм лечения бесплодия у больных с ПНЯ