Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Дифференциальная диагностика некоторых ненаркотических анальгетиков при химико-токсикологическом исследовании мочи

005013511

ЧУ 1

САРКИСЯН МАРГАРИТА СЕРГЕЕВНА

ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА НЕКОТОРЫХ НЕНАРКОТИЧЕСКИХ АНАЛЬГЕТИКОВ ПРИ ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОМ ИССЛЕДОВАНИИ МОЧИ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

1 5 УД? М

Пятигорск - 2012

005013511

Работа выполнена в Государственном бюджетном образователы учреждении высшего профессионального образования «Пятигорс государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохраненн социального развития Российской Федерации

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, профессор

Лазарян Джон Седракович

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор

Раменская Галина Владиславовна, ГБОУ ВПО Первый МГМУ имени И.М. Сечер Минздравсоцразвития России, директор НИИ фармации, заведующая кафедрой фармацевтической и токсикологической химии

доктор фармацевтических наук, профессор Карташов Владимир Антонович, ГБОУ ВПО Майкопский ГТУ, декан фармацевтического факультета

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Курский ГМУ Минздравсоцразвития России» (305041, г. Курск, ул. К. Маркса, д.З)

Защита состоится «27» марта 2012 г. в 900 часов на заседании диссертациош совета Д.208.069.01 при ГБОУ ВПО Пятигорская ГФА Минздравсоцразвития Росс (357532, Ставропольский край, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Пятигор ГФА Минздравсоцразвития России (357532, Ставропольский край, г.Пятигорск. Калинина, 11).

Автореферат разослан «25» февраля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Е.В. Компанцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время доля ненаркотических анальгетиков в труктуре применяемых в медицинской практике лекарственных препаратов начительна. Из этой группы лекарственных препаратов наиболее широко рименяются как в медицинской практике по назначению врача, так и самостоятельно: тбупрофен, кеторолак, метамизол натрия, нефопам, парацетамол и трамадол. Данные екарственные препараты применяются как индивидуально, так и в сочетании друг с ругом или другими наркотическими анальгетиками с целью усиления лечебного ффекта, уменьшения дозировки наркотического анальгетика, или же для усиления остояния наркотического опьянения и облегчения проявления абстинентного индрома. При определённых условиях (передозировка, многочисленные торговые азвания препаратов, взаимное потенцирование действия) приём изучаемых нальгетиков приводит к острым отравлениям, в том числе со смертельным исходом, то определяет их важное токсикологическое значение. По данным литературы азработаны ряд методик анализа отдельных вышеуказанных анальгетиков в азличных биологических объектах. Однако по настоящее время отсутствуют етодики их химико-токсикологического анализа при комбинированных отравлениях.

В связи с этим разработка методик дифференциальной диагностики указанных енаркотических анальгетиков при химико-токсикологическом исследовании мочи вляется актуальной проблемой.

Цель исследования: разработка схемы химико-токсикологического анализа бупрофена, кеторолака, метамизола натрия, нефопама, парацетамола и трамадола в оче. Задачи исследования:

1. Разработать методики идентификации ибупрофена, кеторолака, етамизола, нефопама, парацетамола, трамадола в моче с помощью химических и

, изико-химических методов.

2. Разработать методики количественного определения изучаемых нальгетиков в моче.

3. Разработать методики изолирования изучаемых лекарственных веществ из мочи индивидуально и в различных сочетаниях.

4. Предложить схему химико-токсикологического анализа пр дифференциальной диагностике отравлений изучаемыми анальгетиками.

5. Внедрить схему химико-токсикологического анализа изучаемы анальгетиков в виде Информационного письма в практику работы химико токсикологических и судебно - химических лабораторий России.

Научная новнзна работы. Предложен методологический подход к разделени и идентификации изучаемых анальгетиков (ибупрофен, кеторолак, метамизол натри нефопам, парацетамол, трамадол) при направленном химико-токсикологическо анализе с использованием комплекса химических и физико-химических методов.

В предварительном исследовании предлагается использовать в скринингово варианте метод ТСХ, а в основном исследовании - химические (хромогенные микрокристаллоскопические реакции) и физико-химические методь высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) и хромато-мас спектрометрию (ГХ/МС).

Разработана методика количественного определения ибупрофена, кеторолак метамизола, нефопама, парацетамола и трамадола методом ВЭЖХ в извлечениях и мочи как индивидуально, так и в различных сочетаниях. Дана валидационная оценк данной методики по основным критериям (линейность, специфичность, преде обнаружения, прецизионность, правильность, предел количественного определения).

Теоретически обоснованы и экспериментально подтверждены услови изолирования изучаемых анальгетиков из водных растворов с последующе разработкой способов их выделения из мочи. Установлена оптимальная кратност экстракции, изучено влияние условий гидролиза на стабильность указанны, лекарственных веществ, что позволило разработать методики их изолирования и мочи как индивидуально, так и при различных сочетаниях.

Возможность использования разработанной схемы химико-токсикологическог анализа изучаемых анальгетиков была подтверждена на лабораторных животны (крысах).

Практическая значимость работы и внедрение результатов исследования.

Разработанная схема химико-токсикологического анализа (ХТА) ибупрофена кеторолака, метамизола, нефопама, парацетамола и трамадола позволяет достоверн диагностировать факт отравления и оценить его степень.

По материалам исследования подготовлено и утверждено Ученым советом ФГУ Российский Центр судебно-медицинской экспертизы» Минздравсоцразвития России ротокол №3 от 09.06.2011 года) Информационное письмо «Дифференциальная иагностика некоторых ненаркотических анальгетиков при химико-оксикологическом исследовании мочи», которое рекомендовано к использованию в имико-токсикологических лабораториях и Бюро СМЭ Российской Федерации.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены а 62- 67-ой региональных конференциях «Разработка, исследование и маркетинг овой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2007-2012 гг.); на Российской аучно-практической конференции (с международным участием) «Актуальные опросы судебно-химических, химико-токсикологических исследований и армацевтического анализа» (Пермь, 2009 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе ве в журналах, рекомендованных ВАК РФ. Положения, выносимые на защиту:

♦ результаты разработки методик идентификации и количественного определения ибупрофена, кеторолака, метамизола, нефопама, парацетамола и трамадола в моче;

♦ результаты поиска оптимальных условий изолирования исследуемых анальгетиков из мочи;

♦ результаты апробации методик химико-токсикологического анализа исследуемых анальгетиков на лабораторных животных;

♦ схему химико-токсикологического анализа мочи при отравлениях изучаемыми анальгетиками как индивидуально, так и при различных сочетаниях. Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 170 страницах и

остоит из введения, обзора литературы, четырёх глав экспериментальной части, бщих выводов, списка литературы и приложения. В тексте содержится 31 таблица и 8 рисунков. Список цитируемой литературы включает 206 источников, из них 53 на ностранных языках.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1 Разработка методик идентификации изучаемых анальгетиков Предварительное исследование по разделению и обнаружению изучаемы анальгетиков

В химико-токсикологическом анализе для идентификации лекарственны веществ прииято проводить исследование в два этапа: предварительное и основное.

В качестве предварительного способа исследования нами использован мето ТСХ на пластинах «Сорбфил», в подобранных четырех системах растворителе) использование которых в определённых комбинациях позволяют надёжно разделить обнаружить изучаемые анальгетики, а также некоторые лекарственные веществ применяемые с ними. Хроматографирование необходимо проводить при комнатно температуре (20±2°С), в камерах с насыщением парами растворителей в течение 3 минут, при длине пробега системы растворителей - 10 см.

Оптимальными проявителями для детекции зон адсорбции изучаемы анальгетиков являются УФ свет (254нм) с последующей обработкой пласти реактивом Драгендорфа. При этом предел обнаружения составил от 0,2 до 1,5 мкг пробе. Полученные результаты представлены в таблице 1. Таблица 1 - Хроматографическая подвижность изучаемых анальгетиков

Подвижная фаза

Соотношение растворителей

Значение ИГ *100 изучаемых анальгетиков

Ї?

Толуол - этанол -уксусная кислота -25% аммиак

64:30:4:2

75±3,0

25±2,0

28±3,0

61±2,5

81±2,7

17±1,1

10±1,0

15±1,2

15±1,2

62±2,

Толуол - диоксан -25% аммиак

1:15:5

30*2,1

53±2,!

1,0

55±2,0

10±1,2

12±1,(

Этанол -хлороформ -25% аммиак (5,)

50:46:4

55±3,1

91±3,4

91±3,2

82±2,7

52±3,0

45±2,5

80±3,0

90±2,4

90±1,9

95±2,

Толуол - этанол -уксусная кислота

(вЛ

75:20:5

75±2,3

14±1,:

90±2,2

16±1,2

59±2,3

11±0,9

7,0±1,7

10±1Л

8,0±1,2

57±1.(

Полученные результаты могут быть использованы при хроматографическом «следовании для выбора систем растворителей как при направленном, так и при енаправленном анализе.

В случае направленного анализа (исследуемые анальгетики), нами предлагается ариант методики хроматографического исследования в 2-3-х системах растворителей, использованием «свидетелей» в виде растворов стандартных образцов ибупрофена, еторолака, метамизола натрия, нефопама, парацетамола и трамадола.

В случае ненаправленного (группа анальгетиков) анализа на исследуемые екарственные вещества использован модифицированный вариант метода ТСХ -крининга, предложенного проф. В.А. Карташовым. В результате предварительного сследования хроматографической подвижности исследуемых анальгетиков в 4-х системах астворителей определяли коэффициент подвижности ЫМ- (1Ш100) искомых екарственных веществ. При этом поверхность пластины была разделена на три роматографические зоны в зависимости от величины ЬИГ: зона 1 (ЬЯГ = 0 - 33); зона 2 ЫУ^ 33 - 63); зона 3 (ЫУ = 63-100). Результаты исследования представлены в таблице 2.

аблица 2 - Распределение изучаемых анальгетиков по хроматографическим зонам

Системы растворителем X роматографические зоны

1 2 3

система I метамизол нефопам трамадол морфин тримепередин кодеин парацетамол флупертин кеторолак ибупрофен

система II нефопам кодеин флупиртин трамадол тримеперидин

система III №) метамизол ибупрофен кеторолак парацетамол нефопам трамадол морфин кодеин тримеперидин флупиртин

система IV (ЗД нефопам парацетамол метамизол морфин тримеперидин кодеин флупиртин ибупрофен кеторолак трамадол

В результате проведённого анализа каждому исследуемому анальгетик соответствует определённый порядок чисел, в зависимости от системы растворителе! и порядкового номера зоны. Полученный условный «код» каждого исследуемоп лекарственного вещества приведён в таблице 3.

Таблица 3 - «Код» хроматографической подвижности исследуемых анальгетиков

Вещество Хроматографическая зона

система I - (БО система II - система III - (Эз) система IV - (84)

(вг)

Ибупрофен 3 0 2 2

Кеторолак 3 0 2 3

Метамизол 1 0 2 1

Нефопам 1 1 3 1

Парацетамол 2 0 3 1

Трамадол 1 2 3 3

Морфин 1 0 3 1

Кодеин 1 1 3 1

Тримеперидин 1 2 3 1

Флупиртин 2 1 3 1

Данные таблицы свидетельствуют о том, что при проведении хроматографическог исследования извлечений из мочи в четырех системах растворителей можн предположить наличие одного или нескольких изучаемых анальгетиков при любых и, сочетаниях. В случае получения результатов, не соответствующих данным, приведенны в таблице, можно сделать заключение об отсутствии изучаемых анальгетиков и н проводить их подтверждающее исследование.

Основное исследование изучаемых анальгетиков с помощью химических I физико-химических методов

Хромогенпые и микрокристаллоскопические реакции

В химико-токсикологическом анализе используются хромогенные I микрокристаллоскопические реакции, в случае, если объектом исследования являете вещественное доказательство в виде лекарственного препарата одного из изучаемы анальгетиков; искомое вещество выделено из смеси лекарственных веществ ил1 биологического объекта в виде индивидуального соединения. В результат исследования нами выбраны наиболее характерные хромогенные V микрокристаллоскопические реакции на изучаемые анальгетики.

Реакции окрашивания дают с реактивом Либермана все вещества, кроме еторолака и тримеперидина, с реактивом Марки все, кроме метамизола и трацетамола, а кеторолак, морфин, кодеин дают характерное окрашивание с азотной ислотой концентрированной; метамизол, парацетамола и морфин с 5% раствором елеза(Ш) хлорида. Предел обнаружения исследуемых веществ составляет 0,5-10 кг/в пробе. Из микрокристаллоскопических реакций нами предложены следующие: а ибупрофен с 0,2% раствором метилового оранжевого (1 мкг/в пробе), кеторолак с еактивом Драгендорфа (2 мкг/в пробе), метамизол с 0,2% раствором метилового ранжевого (6 мкг/в пробе), нефопам с солью Рейнеке (2 мкг/в пробе), - парацетамол с % раствором ртути(П) хлорида (2 мкг/в пробе) и трамадол с меднопиридиновым еактивом (1 мкг/в пробе). Таким образом разработаны методики идентификации зучаемых анальгетиков с помощью хромогенных и микрокристаллоскопических еакций, с достаточной чувствительностью, хорошей воспроизводимостью и кспрессностью.

Метод хромато-масс-спектрометрии (ГХ/МС)

Метод ГХ/МС был использован нами в качесгве подтверждающего при адентификации изучаемых анальгетиков. Анализ проводили на хроматографе Agilent 850 с кварцевой капиллярной колонкой HP - 5MS (30 м х 0,25 мм) с неподвижной |>азой 5% фенил-метил силоксан (толщина плёнки неподвижной фазы 0,25 мкм). Газ юситель: гелий, расход через колонку постоянный - 1 мл/мин; температурный режим олонки: от 80 °С до 180 °С в течение 20 мин; от 180°С до 265°С в течение 10 минут; от 65 СС до 290 °С в течение 20 минут; испаритель: режим без деления потока, продувка 0 мл/мин 0,5мин, температура 250°С, объем вводимой пробы 1 мкл; температура штерфейса детектора 290°С. Детектор: масс-спектрометрический квадрупольный SD 5975, тип ионизации: электронный удар (70 эв), температура ионного источника 230°С, масс-фильтра - 150°С. Наблюдаемый диапазон m/z 30-500. Идентификацию «следуемых веществ проводили по временам удерживания, которые соответствовали ременам удерживания их стандартных образцов, а также с помощью библиотеки асс-спектров N1ST 2.0, применяя систему обработки хромато-масс-спектральной шформации AMDIS, со значениями m/z. Результаты приведены в таблице 4.

Таблица 4 — Результаты идентификации исследуемых анальгетиков с помощью

метода ГХ/МС

Вещество Время удерживания, мин (п=6) Предел обнаружения (мкг/мл) т/г

Ибупрофен 11Ср=7,97;80=0,01; Я80=0,17% 0,032 206, 161, 91, 119, 107

Кеторолак 1^=11,51; 80=0,01 '^0=0,08% 39,88 211,134, 77,106

Метамизол Яср=11,41; 80=0,01; К50=0,07% 0,057 217, 83,56

Нефопам 1^=11,71; 80=0,01; £«0=0,06% 0,01 58, 179, 165, 180, 225,

Парацетамол 1^=9,49; 80=0,01; 1*50=0,05% 0.32 109, 151,43, 80

Трамадол КсР=10,94; 80=0,01; ¡«0=0,1% 0,153 58,263, 135

Данные таблицы свидетельствуют о том, что метод ГХ/МС позволяв-идентифицировать исследуемые вещества как индивидуально, так и в различны, сочетаниях с высокой чувствительностью, специфичностью и воспроизводимостью. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) Метод ВЭЖХ нами использован как для идентификации, так и дл> количественного определения исследуемых анальгетиков. Анализ проводили ш микроколоночном жидкостном хроматографе «Милихром А-02». (г. Новосибирск ЗАО «ЭкоНова») в следующих условиях: хроматографическая колонка Рго^оБП 120 5С-18 А<3; подвижная фаза: элюент А - 0,1% раствор трифторуксусной кислоты элюент Б - ацетонитрил, скорость потока - 100 мкл/мин; аналитические длины волн 230, 244, 262, 272 и 326 нм; время измерения - 0,18 сек; температура термостат колонки - комнатная; градиент ацетонитрила от 10% до 20% за 10 мин, от 20% до 80°/ за 10 мин далее изократично 80% - 5 минут; общее время хроматографирования 2. минут; объем пробы - 10 мкл.

Идентификацию исследуемых лекарственных веществ осуществляли путек сравнения времени удерживания (ибупрофена 1ул=22,39 мин, кеторолака ^=19,05 мин метамизола 1уд=7,26 мин, нефопама ^.,=17,24 мин, парацетамола ^=8,65 мин трамадола ^д=15,92 мин), с временами удерживания стандартных образцо! соответствующих анализируемых лекарственных веществ, а также спектральны отношений их растворов при различных длинах волн: ибупрофена 8262/82Г=1,961 кеторолака ®326/8230=2,326, метамизола 8240/8,м= 1,340, нефопама 8267/8240=1,371 парацетамола Б /8 =1,141, трамадола $^§^--1,112.

Селективность данной методики при анализе смеси изучаемых анальгетиков была подтверждена с помощью расчёта коэффициента разделения пиков, которые составили: метамизол - парацетамол (2,13), парацетамол - трамадол (7,64), трамадол-нефопам (3,95), нефопам - кеторолак (6,12), кеторолак - ибупрофен (10,74). Предел обнаружения исследуемых лекарственных веществ методом ВЭЖХ рассчитывали с помощью метода «3 сигма», значения которых находятся в пределах 0,0017-0,05 мкг/мкл.

2 Количественное определение изучаемых анальгетиков методом ВЭЖХ

Для количественного определения исследуемых анальгетиков предложена методика ВЭЖХ анализа. Условия хроматографирования приведены выше. Расчет проводили по площади пика с использованием внешнего стандарта. Разработанную методику на водных растворах оценивали по следующим валидационным характеристикам: специфичность, линейность, прецизионность (повторяемость), правильность, предел количественного определения.

Специфичность методики определяли набором хроматограмм растворов стандартных образцов изучаемых лекарственных веществ и извлечений из модельной и контрольной проб мочи. Полученные результаты свидетельствуют о специфичности разработанной методики.

Линейная зависимость соблюдается в пределах концентраций изучаемых лекарственных веществ: для ибупрофена (1-50 мкг/мл), кеторолака (0,8 - 10 мкг/мл), метамизола (2-10 мкг/мл), нефопама (1- 50 мкг/мл), парацетамола (60 - 500 мкг/мл), трамадола (1 - 50 мкг/мл). Контроль линейной зависимости по каждому исследуемому объекту проводили с помощью расчета коэффициента корреляции, значения которых было не менее 0,99, что позволяет использовать данную методику для количественного определения изучаемых лекарственных веществ в указанном диапазоне концентраций.

Для установления прецизионности готовили растворы стандартных образцов изучаемых анальгетиков в шести повторностях. Результаты анализа приведены в таблице 5.

Таблица 5 - Результаты установления прецизионности методики количественного

определения изучаемых анальгетиков методом ВЭЖХ (п=6)

Вещество Метрологические характеристики

Ибупрофен Хср=99,69%; 80=0,66; 1180=0,67%;

Кеторолак Хср=99,79%; 80=0,27; 1180=0,27%;

Метам изол Хср=99,84%; Б0=0,92; 1180=0,73%

Нефопам ХсР=99,28%; 80=0.84; 1*80=0,84%

Парацетамол ХсР= 99,84%; 80=0,92; 1^0=0,73%

Трамадол Хср=99,62%; 80=0,72; 1180=0,73%

Из полученных данных следует, что относительное стандартное отклонение не превышает 1%, что является удовлетворительным для методик количественного определения искомых лекарственных веществ с использованием метода ВЭЖХ.

Для установления правильности методики готовили 9 растворов стандартных образцов исследуемых анальгетиков на трёх уровнях концентраций в трёх повторностях. Полученные результаты анализа приведены в таблице 6. Таблица 6 - Результаты установления правильности ВЭЖХ - методики

определения изучаемых анальгетиков (п=6)

Вещество Метрологические характеристики, =2,36

Ибупрофен Кср = 99,44%; 80=0,94,1180=0,95%, ДІЦ =0,74; 1рает. = 1,8

Кеторолак Иср = 99,89%; 80=0,95; 1180=0,95%; А ^ =0,74; грас.,. = 0,3

Метамизол ИсР = 99,89%; 80=0,37; 1180=0,37%; А Б1ср =0,28; 1расч. = 0,9

Нефопам Иср = 99,94%; 80=0,88; 1180=0,88%; А Яср =0,69; 1рает. =0,2

Парацетамол Иср = 100,04%; 80=0,41; 1180=0,409%; А Яср =0,33; ^„.=0,3

Трамадол Иср =99,56%; ЭО= 1,14; 1180=1,15%; А 1^=0,90; ^а« =1,2

Результаты определения свидетельствуют о том, что методика не отягощена систематической ошибкой, поскольку соблюдается неравенство 1выч > 1,а,-л (РД).

3 Изолирование изучаемых анальгетиков из водных растворов и мочи

В химико-токсикологическом анализе важное значение имеет способ изолирования токсического вещества из биологического объекта. Поэтому для максимального извлечения исследуемого вещества необходимо предварительно установить оптимальные условия его изолирования. При изолировании лекарственных веществ из биологических объектов на степень экстракции влияют рН среды, природа органического растворителя, наличие электролита и др.

Изолирование изучаемых лекарственных веществ из водных растворов

Поскольку данные литературы по изолированию нефопама ограничены, нами предварительно были изучены оптимальные условия его выделения из водных растворов с помощью метода математического планирования эксперимента «латинский квадрат». В результате дисперсионного анализа установлено, что значимость факторов на процесс экстракции нефопама из водных растворов располагается в следующий ряд: электролит > значение рН среды > органический астворитель > время экстракции. Полученные результаты, а также данные читературы нами были учтены при разработке методики изолирования изучаемых 1альгетиков.

Так как при ненаправленном химико-токсикологическом анализе изолирование екарственных веществ проводят при значениях рН среды 2-3 и 9-10, мы посчитали еобходимым предварительно определить условия изолирования изучаемых екарственных веществ из водных растворов. Экстракцию проводили хлороформом и тилацетатом, с электролитом и без электролита, время экстракции 5 мин. Выход еторолака (87,02%), ибупрофена (93,34%) выше из кислой среды, а нефопама 92,56%), трамадола (67,08%), парацетамола (63,12%), метамизола (78,50%) из елочной. При этом оптимальным экстрагентом для парацетамола является тилацетат, а для остальных исследуемых анальгетиков - хлороформ. Наличие лектролита существенно повышает степень экстракции метамизола, нефопама и 1арацетамола.

Изолирование изучаемых лекарственных веществ из модельной пробы мочи

Найденные оптимальные условия изолирования из водных растворов изучаемых нальгетиков методом ВЭЖХ были использованы для определения степени кстракции из модельной пробы мочи. В качестве объекта исследования нами ыбрана моча, как наиболее предпочтительный биологический объект для проведения имико-токсикологических исследований. Известно, что изучаемые анальгетики реимущественно выводятся с мочой, главным образом в виде глюкуронидных и ульфатных конъюгатов, в том числе в неизмененном виде. Поэтому с целью овышения степени экстракции ибупрофена, кеторолака, метамизола, нефопама,

парацетамола и трамадола из мочи при экспертном исследовании, необходимо проводить гидролиз коньюгатов в биологической жидкости.

В связи с этим, нами было изучено влияние условий кислотного и щелочного гидролиза на стабильность изучаемых анальгетиков в модельной пробе мочи. Результаты исследования представлены в таблице 7.

Таблица 7 - Результаты определения степени экстракции изучаемых анальгетиков

условиях гидролиза методом ВЭЖХ (Хср ±АХср)

Вещество Кислотный гидролиз Щелочной гидролиз Без гидролиза

Ибупрофен 84,01±3,1 81,24±3,55 86,16±3,48

Кеторолак 88,95±4,48 59,63±3,3 52,93±3,08

Метамизол 25,55± 1,81 54,21 ±3,13 61,71± 3,30

Нефопам 60,91±3,04 91,23±4,61 89,72±5,08

Парацетамол 18,33± 1.45 54,6± 3,87 65,13± 4,18

Трамадол 52,1±3,25 70,64±4,33 69,1± 3,71

Таким образом, для извлечения из мочи при проведении экспертизы метамизола нефопама, парацетамола и трамадола, необходимо использовать щелочной гидролиз, -для ибупрофена, кеторолака - кислотный гидролиз, поскольку исследуемые веществ наиболее стабильны в указанных условиях гидролиза. В связи с этим намг разработаны методики изолирования изучаемых анальгетиков с максимальньиу выходом из кислой среды, из щелочной среды и в случае их совместного присутствия схемы которых приведены ниже.

1. Методика изолирования ибупрофена и/или кеторолака - 25 мл мочи подкислял хлористоводородной кислотой концентрированной до рН 2-3, затем нагревали н кипящей водяной бане в течение 10 минут. После чего проводили двукратну экстракцию хлороформом. Хлороформные извлечения выпаривали до сухого остатка растворяли в 10 мл 96% этанола и анализировали.

2. Методика изолирования метамизола, нефопама, парацетамола1 и трамадола (ка индивидуально, так и в любых сочетаниях) - 25 мл мочи подщелачивали 30° раствором натрия гидроксида до значения рН среды 9-10, затем нагревали на кипящи водяной бане в течение 10 минут. К полученной жидкости добавляли натрия хлорид д насыщения и экстрагировали двукратно хлороформом. Полученные органически

извлечения выпаривали до сухого остатка, растворяли в 10 мл 96% этанола и анализировали.

3. Методика изолирования ибупрофена или кеторолака с метамизолом, нефопамом, парацетамолом и трамадолом (в различных сочетаниях) - 25 мл мочи подкисляли хлористоводородной кислотой концентрированной до рН 2-3, затем нагревали на кипящей водяной бане в течение 10 минут и экстрагировали хлороформом двукратно. К водной фазе добавляли натрия хлорид до насыщения и 30% раствор натрия гидроксида до рН 9-10 и экстрагировали2 хлороформом. Полученные органические «влечения объединяли и выпаривали до сухого остатка, растворяли в 10 мл 96% танола и анализировали.

1 - в случае изолирования парацетамола, его экстракцию проводят двукратно этилацетатом; прн сочетании парацетамола с другими анальгетиками экстракцию проводят вначале хлороформом, затем эгнлацетатом, извлечения объединяют и выпаривают до сухого остатка.

2 -в присутствии парацетамола, с другими анальгетиками экстракцию проводят вначале хлороформом, затем этилацетатом, извлечения объединяют и выпаривают до сухого остатка. Далее проводили идентификацию изучаемых анальгетиков в извлечениях из

одельных проб мочи по разработанным ранее методикам с использованием методов іСХ, ГХУМС, ВЭЖХ, хромогенных и микрокристаллоскопических реакций, роведенные исследования показали, что комбинированное использование азработанных методик позволяет надежно идентифицировать изучаемые нальгетики.

Следующим этапом исследования явилось количественное определение оучаемых лекарственных веществ с помощью ранее разработанной методики ВЭЖХ -нализа и её валидация.

Линейность методики определяли по модельным пробам исследуемых альгетиков в моче. Установлено, что зависимость площади пика от концентрации ісследуемьіх веществ имеет линейный характер. Коэффициент корреляции во всех лучаях составляет не менее 0,99. Далее для установления прецизионности методики количественного определения изучаемых анальгетиков готовили по шесть модельных фоб мочи, содержащие количества их стандартных образцов, соответствующие инимальной терапевтической, максимальной суточной и токсической дозам,

найденных, исходя из среднесуточного объёма мочи (1500 мл), кинетики изучаемых анальгетиков, а также с учетом интервала линейности методики. Результаты определения представлены в таблице 8.

Таблица 8 - Результаты количественного определения изучаемых

лекарственных веществ в модельной пробе мочи методом ВЭЖХ (п=6)

Вещество Внесено

мг/25мл Метрологические характеристики

Ибупрофен 4,1 Хср=83,72; 813=3,79; 1*80=4,52%

20,0 Хср= 83,78; 80=3,26; 1180=3,9%

200 Хс0= 84,59; 80=3,24; 1180=3,83%

Кеторолак 0,17 Хсв=88,04;80=4,45; 1180=5,06%

0,50 Хср=87.49; 80=4,3; 1^0=4,91%

1,70 Хс„=89,29; 8Б=3,49; Ї^О=3,9%

Метамизол 4,2 Хс„= 60,11; 80=3,53;К80=5,87%

50,0 Хср=62,8; 80=3,25; 1^0=5,18%;

83,0 Хср= 63,16; 8П=3,16;1«Г)-5.01%

Нефопам 0,5 Хср= 60,11;80=3,53^0=5,87%

3,0 Хср=62,8; 80=3,25; 11815=5,18%;

5,0 Хс1)= 63,16; 80=3,16^0=5,01%

Парацетамол 8,3 Хср=91.97; вО=5,32; 1180=5,78%

50 Хс1)=92,403; 80=4,1; 1^0=4,18%

115 Хср=94,47; 80=3,95; 1^0=5,18%

Трамадол 0,83 Хср= 56,12; 80=3,64; 1180=6,5%

6,6 Хс„= 55,7; 80=3,33; 1«0=5,98%

8,3 Х№=55,1; 80=3,23; И80=5,87%

Данные таблицы свидетельствуют о том, что разработанные методик! позволяют определять количественное содержание исследуемых лекарственны, веществ в моче с относительным стандартным отклонением, не превышающим 6,5% что является удовлетворительным для методик количественного определени лекарственных веществ из биологических объектов с использованием метода ВЭЖХ.

Далее, нами проведена сравнительная оценка методик количественног определения изучаемых лекарственных веществ в модельной пробе мочи и водны, растворах с учетом степени их экстракции. Исследование проводили на трёх уровня концентраций, в трёх повторностях, соответствующих их минимально" терапевтической, максимальной суточной и токсической дозам. Полученны результаты приведены в таблице 9.

Таблица 9 - Результаты количественного определения изучаемых

лекарственных веществ в модельной пробе мочи, (п=9)

Лекарственно е вещество Внесено, мг/25мл Найдено ,мг/25мл (п=3) R%, водные растворы Й ос и Найдено с учетом ^пересчета, мг/25мл R%, модельные пробы мочи Метрологические характеристики

Ибупрофен 4,1 3,38 93,34 1,13 3,83 93,18 Rcp=95,71;SD=3,95; RSD=4,13%; AR =±3,32;

20 17,01 19,40 97,02

200 171,59 193,89 96,95

Кеторолак 0,17 0,15 87,02 1,03 0,157 91,02 Rcp=91,30; SD=4,64; RSD=5,08%; AR =±8,61;

0,5 0,44 0,454 90,68

1,7 1,52 1.56 92,21

Нефопам 0,5 0,45 92,56 1,02 0,46 91,33 Rcp=94,64; SD=5,63; RSD=5,95%; AR==4,44

3 2,74 2,80 93,26

5 4,87 4,96 99,33

Метамнзол 8,3 2,57 78,50 1,32 3,31 78,89 Rcp=81,43; SD=4,43; RSD=5,44%; Д R =±3,49

50 31,63 41,54 83,07

83 51.76 68,32 82,32

Парацетамол 8,3 4,69 63,12 1,22 5,813 69,78 Rcp=68,51; SD=3,51; RSD=5,13%; Д R =±2,76

50 28.05 34,22 68,45

115 63,65 77,40 67,31

Трамадол 0,83 0,60 67,08 1,01 0,61 74,32 Rcp=72,84;SD=4,69; RSD=6,44%; Д R =±3,68

6.6 4,69 4,74 71,82

8,3 5,96 6,01 72,38

Данные таблицы свидетельствуют о том, что на всех трех уровнях концентраций

нализируемых модельных проб мочи с учётом коэффициента пересчета получены езультаты, сопоставимые с результатами их количественного определения в водных астворах. Относительное стандартное отклонение методики не превышает 6,4%.

Апробация методики химико-токсикологического анализа изучаемых начъгетиков на лабораторных животных

Разработанная схема изолирования изучаемых анальгетиков, их идентификация i количественное определение была апробирована на лабораторных животных — елых беспородных крысах - самцах массой 180 - 200 граммов. Экспериментальные сследования при работе с лабораторными животными проводились с соблюдением тических норм. Исследуемые лекарственные вещества в виде водных растворов водили перорадьно крысам (п=3) в концентрациях соответствующих их ерапевтической и токсической дозам индивидуально, а также их смеси в

терапевтических дозах (п=3), в пересчёте на массу крысы. Сбор мочи у крыс проводили в течение 12 часов. Отобранные объекты (по 5 мл) были подвергнуты изолированию с последующей идентификацией и количественным определением. Параллельно проводили исследование контрольных опытов (п=3).

Обнаружение и идентификацию изучаемых анальгетиков в извлечениях из моч1 крыс проводили методами ТСХ, ГХ/МС, ВЭЖХ и химических реакций. Полученные результаты свидетельствуют о том, что комплексное использование указанны методов позволяет достоверно идентифицировать изучаемые лекарственные веществ; в моче крыс. Далее нами проведено количественное определение изучаемы, анальгетиков в моче лабораторных животных с помощью ранее разработанно! методики ВЭЖХ анализа. Полученные данные представлены в таблице 10.

Таблица 10 - Результаты количественного определения изучаемых анальгетиков в _извлечениях из мочи методом ВЭЖХ__

Вещество Терапевтическая доза Метрологические характеристики Токсическая доза Метрологические характеристики

внесено, мг найдено, мг/5мл выход, % внесено, мг найдено, мг/5мл выход, %

Ибупрофен 3,375 0,228 0,208 0,226 6,76 6,16 6,70 Х,р= 6>54% 8хср=0,19 ЛХср=0,82 £св= 12,54% 202,300 9,470 8,700 9,160 4,68 4,30 4,58 Хср= 4,50% Sxcp =0,11 ДХср=0,48 £св= 10,56%

Кеторолак 0,170 0,097 0,104 0,096 57,06 60,58 56,47 Хс = 58,02% 8ХсР=1,50 ЛХср=6,46 ес„= 11,14% 1,686 0,761 0,714 0,707 45,14 42,35 41,93 Хср= 43,14% Sx,-P=l,01 АХср=4,33 Ecd = 10,04%

Метамизол 8,43 1,676 1,849 1,818 19,88 21,93 21,57 Хср= 21,13% 8хср=0,63 АХф=2,72 Е№= 12,86% 84,30 13,390 12,470 12,280 15,88 14,79 14,57 Хср= 15,08% Sxcp=0,41 дХср= 1,74 £„= 11,55%

Нефопам 0,510 0,384 0,394 0,418 75,29 77,25 81,96 Хср=78,17% 8хср=1,98 ЛХср=8,51 Еср= 10,89% 5,06 1,585 1,699 1,603 31,32 33,58 31,68 Хср=32,19% Sxcp=0,70 АХСр=3,01 £ср = 9,36%

Парацетамол 8,43 0,652 0,586 0,628 7,73 6,95 7,45 Хср=7,38% 8хСр =0,23 ДХчГО.98 Ес= 13,29% 118,00 5,970 5,650 5,490 5,06 4,79 4,65 Хср=4,83% Sxcp=0,12 АХср= 0,52 Ес„= 10,71%

Трамадол 0,85 0,637 0,585 0,638 74,94 68,82 75„06 Хср=72,94% 8хср=2,06 ЛХсР= 8,86 £с0= 12,15% 8,43 2,381 2,333 2,437 28,24 26,49 28,91 Хср=27,88% Sxcp=0,72 АХср=3,10 £„=11,17%

Данные таблицы свидетельствуют о том, что разработанная методика позволяет определить количественное содержание изучаемых анальгетиков в моче лабораторных животных в присутствии эндогенных соединений как при введении ерапевтических, так и токсических доз. При введении крысам смеси всех изучаемых нальгетиков в терапевтических дозах, было определено их количественное одержание за исключением парацетамола. Данный факт, очевидно, связан с тем, что сасывание парацетамола в присутствии пяти исследуемых лекарственных веществ амедленно и его содержание ниже предела количественного определения методики, тносительная погрешность используемой методики не превышает 14%.

Поскольку отравление всей смесью изучаемых лекарственных веществ аловероятно, то разработанная методика позволит надежно идентифицировать омбинированные отравления, в том числе и парацетамолом.

Таким образом, разработанная схема химико-токсикологического анализа озволяет надежно проводить дифференциальную диагностику отравлений ]бупрофеном, кеторолаком, метамизолом, нефопамом, парацетамолом и трамадолом шдивидуально и при сочетанном применении.

Схема химико-токсикологического анализа ибупрофена, кеторолака, етамизола, нефопама, парацетамола и трамадола представлена на рисунке 1.

1 - г случае изолирования парацетамола экстракцию его проводят двукратно этилацетатом; при сочетании парацетамола с другими анальгетиками, экстракцию проводят вначале хлороформом, затем этилацетатом, извлечения объединяют и выпаривают до сухого остатка.

2 - в присутствии парацетамола, с другими анальгетиками, экстракцию проводят вначале хлороформом, затем этилацетатом, извлечения объединяют и выпаривают до сухого остатка.

Рисунок 1 - Схема химико-токсикологического анализа некоторых ненаркотических анальгетиков

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Разработаны методики разделения и обнаружения ибупрофена, кеторолака метамизола, нефопама, парацетамола, трамадола и сочетаемых с ними морфина, кодеина, тримеперидина или флупиртина методом ТСХ, с использованием 4-х оптимальных систем растворителей, с детекцией зон их адсорбции УФ светом и реактивом Драгендорфа. Предел обнаружения изучаемых анальгетиков составляет 0,2 - 1,5 мкг/в пробе.

Предложена ТСХ - методика обнаружения изучаемых анальгетиков на предварительном этапе анализа при направленном, с использованием «свидетелей», и при ненаправленном анализе (группа анальгетиков) в зависимости от их распределения по соответствующим хроматографическим зонам.

Показана возможность использования хромогенных и

микрокристаллоскопических реакций для идентификации изучаемых анальгетиков при анализе вещественных доказательств (лекарственных препаратов) или выделенных из мочи индивидуальных соединений. Предел обнаружения исследуемых лекарственных веществ с помощью хромогенных реакций составляет 0,5 - 10 мкг в пробе, микрокристаллоскопических реакций 1 -6 мкг в пробе.

Разработана методика идентификации изучаемых лекарственных веществ методом хромато - масс - спектрометрии индивидуально и в различных сочетаниях. Методика отличается высокой чувствительностью (0,032 - 39,88 мкг/мл), специфичностью и воспроизводимостью, с относительным стандартным отклонением не превышающего 1%.

Разработана методика идентификации изучаемых анальгетиков методом ВЭЖХ как индивидуально, так и в различных сочетаниях. Валидационная оценка предложенной методики анализа показала, что она чувствительна, специфична, воспроизводима, с относительным стандартным отклонением не превышающим 1%.

Разработана методика количественного определения изучаемых лекарственных веществ методом ВЭЖХ. Валидационная оценка методики по параметрам: специфичность, линейность, прецезионность, правильность и предел количественного определения подтвердила пригодность её использования.

7. Определены оптимальные условия изолирования изучаемых анальгетиков н водных растворов. Установлено, что на процесс экстракции оказывает влияни значение рН среды, природа экстрагента, наличие электролита. Максимальна степень экстракции достигается при значении рН среды 2-3 - для ибупрофеп (93,34±1,36%) и кеторолака (87,02±1,4%); при рН среды 9-10 - для метамизол (78,50±0,44%), нефопама (92,56±0,38), парацетамола (63,12±0,71%), трамадол (67,08±0,47%), с использованием в качестве экстрагента хлороформа, а дл парацетамола - этилацетата. Определена кратность экстракции, равная двум.

8. Изучено влияние условий кислотного и щелочного гидролиза на стабильное! изучаемых анальгетиков в модельной пробе мочи. Установлено, что пр изолировании из мочи ибупрофена, кеторолака следует проводить кислотны гидролиз, а для нефопама, метамизола, парацетамола и трамадола - щелочной.

9. Установлена степень экстракции, изучаемых анальгетиков при их изолировани из модельной пробы мочи в оптимальных условиях, которая составила д) ибупрофена (84,01±3,1%), кеторолака (88,95±4,48%), метамизола (61,71±3,3% нефопама (91,23±4,61%), парацетамола (54,6±3,87%), трамадола (70,64±4,33%).

10. Подтверждено, что комплексное использование методов ТСХ, ГХ/МС, ВЭЖ хромогенных и микрокристаллоскопических реакций позволя идентифицировать изучаемые анальгетики в извлечениях из модельных пр мочи, с достаточно высокой чувствительностью и надёжностью. Доказа! валидность методики количественного определения изучаемых анальгетиков извлечениях из модельных проб мочи с помощью метода ВЭЖХ.

11. Предложена схема изолирования изучаемых анальгетиков из мочи, I идентификации и количественного определения индивидуально и при различнь сочетаниях, с использованием комплекса физико-химических и химичесм методов.

12. Проведена апробация разработанной схемы химико-токсикологического анали изучаемых анальгетиков на лабораторных животных. Установлено, ч предложенная схема позволяет проводить диагностику отравлений изучаемым анальгетиками как индивидуально, так и в различных сочетаниях.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Саркисян, М.С. Разработка методики идентификации и количественного определения нефопама и трамадола с помощью ВЭЖХ и её валидация/ М.С. Саркисян, Д.С. Лазарян// Вестник РУДН. (г. Москва). Серия: Медицина.- М., 2009.-№4.- С. 229-230. (Из перечня журналов, рекомендуемых ВАК РФ).

2. Саркисян М.С. Химико-токсикологическое исследование метамизола в моче / М.С. Саркисян, Д.С. Лазарян // Токсикологический вестник. -2012. - №1. - С. 44-48. (Из перечня журналов, рекомендуемых ВАК РФ).

3. Саркисян, М.С. Идентификация некоторых анальгетиков методом тонкослойной хроматографии М.С. Саркисян // Профессия и здоровье: Материалы VI Всероссийского конгресса - 30 окт.-1 нояб.-М.: «Дельта», 2007г. - С. 615-617.

4. Саркисян М.С. Идентификация нефопама методом тонкослойной хроматографии М.С. Саркисян // Медико-фармацевтический конгресс 14-я международная фармацевтическая выставка 23-26 октября 2007г. Материалы научной программы С.149-151.

5. Саркисян, М.С. Определение степени экстракции некоторых анальгетиков из водных растворов методом УФ-спектрофотометрии / М.С. Саркисян, Д.С. Лазарян, М.Г. Цыбулина// Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб.науч. тр.- Пятигорск, 2008. - Вып. 63. - С. 330-331.

6. Саркисян, М.С. Дифференциальная диагностика отравлений некоторыми анальгетиками методами ТСХ и ВЭЖХ / М.С. Саркисян, Д.С. Лазарян, М.Г. Цыбулина// Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб.науч. тр.- Пятигорск, 2009. - Вып. 64. - С. 335-337.

7. Изучение оптимальных условий экстракции нефопама из водных растворов /М.С. Саркисян/ Человек и лекарство: тез. докл. 16 Рос. нац. конгресса 6-10 апр. 2009 г. -М„ 2009,- С.733.

8. Саркисян, М.С. Валидационная оценка методики анализа некоторых нестероидных противовоспалительных препаратов методом вэжх Актуальные вопросы судебно-химических, химико-токсикуологических исследований и фармацевтического анализа / М.С. Саркисян, Д.С. Лазарян // Материалы Российской научно-практической конференции с международным участием, 28 сентября- 3октября 2009года, г. Пермь, Пермь ГОУ ВПО ПГФА Росздрава, 2009. С. 103-108.

9. Саркисян, М.С. Применение хромогенных и микрокристаллоскопических реакций для идентификации некоторых анальгетиков/ М.С. Саркисян, Д.С. Лазарян // О проблемных вопросах организации производства судебно-медицинских экспертиз: сб. материалов Всерос. науч.-практ. конф. 5-6 ноябр. 2009г. -М.: РИО ФГУ РЦМСМЭ Минздравсоцразвития России, 2009. - С. 344-349.

10. Саркисян, М.С. Химико-токсикологический анализ кеторолака в моче методами ВЭЖХ и ТСХ при комбинированных отравлениях/ М.С. Саркисян, Д.С. Лазарян // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб.науч. тр.- Пятигорск, 2010. - Вып. 65. — С. 385-390.

11. Саркисян, М.С. Химико-токсикологическое исследование нефопама в моче/ М.С. Саркисян, Д.С. Лазарян // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб.науч. тр.- Пятигорск, 2011. - Вып. 65. - С. 3457460.

САРКИСЯН МАРГАРИТА СЕРГЕЕВНА

ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА НЕКОТОРЫХ НЕНАРКОТИЧЕСКИХ АНАЛЬГЕТИКОВ ПРИ ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОМ ИССЛЕДОВАНИИ МОЧИ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Подписано к печати 25.02.2012г. формат бумаги 60x84-1/16 Бумага книжно-журнальная. Усл. печ. л. 1,06 Тираж 100 экз. Заказ № 138

Отпечатано в типографии ООО «РИА-КМВ» 357500, г. Пятигорск, ул. Февральская, 54, тел. (8793) 33-36-56, тел. /факс 39-09-03