Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Химико-токсикологическое исследование лекарственных веществ, применяемых в практике купирования абстинентного синдрома

На правах рукописи

КИРЕЕВА Анна Владимировна

ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ, ПРИМЕНЯЕМЫХ В ПРАКТИКЕ КУПИРОВАНИЯ АБСТИНЕНТНОГО СИНДРОМА

15 00 02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Санкт-Петербург - 2008

003169334

Работа выполнена в ГОУ ВПО Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии Федерального Агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации на кафедре фармацевтической химии, ГУЗ Бюро судебно-медицинской экспертизы Комитета по здравоохранению Правительства Ленинградской области

Научный руководитель"

доктор фармацевтических наук, профессор Куклин Владимир Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор Молдавер Бенюмен Лейбович,

кандидат фармацевтических наук, Горбачева Татьяна Васильевна

Ведущая организация:

ФГУ «Российский центр судебно-медицинской экспертизы Росздрава»

Защита диссертации состоится « » мая 2008 г в « 1t> » часов на заседании диссертационного совета Д 208 088 01 при ГОУ ВПО Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии Росздрава по адресу 197376, г Санкт-Петербург, ул Проф Попова, 14

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии по адресу 197341, г Санкт-Петербург, пр Испытателей, 14

Автореферат разослан «_» апреля 2008 г

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат фармацевтических наук

Марченко Н В

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Масштаб злоупотребления наркотическими средствами, а также соединениями, обладающими подобным действием на организм человека, в Российской Федерации год от года неуклонно расширяется Эта проблема является одной из важнейших социальных проблем современной России. За последнее десятилетие число только официально зарегистрированных наркозависимых людей возросло в 10 раз По данным органов здравоохранения в России на 1 января 2006 года на учете Наркологических диспансеров состояло более 765 тысяч лиц, злоупотребляющих наркотическими средствами, из них 689,5 тысяч -с диагнозом «наркомания». По экспертным оценкам реальное количество потребителей наркотиков превышает данные показатели в 5-10 раз Постоянное увеличение потребления психотропных препаратов отмечается в первую очередь в подростковой и молодежной среде, о чем свидетельствует тот факт, что по сравнению с 2005 годом количество подростков, больных наркоманией, в 2006 году увеличилось на 27,5%

По данным экспертных исследований в незаконное потребление наркотиков и психоактивных веществ фактически вовлечено не менее 2,5 млн россиян, или 1,7% населения страны За истекшее десятилетие количество преступлений, связанных с незаконным оборотом наркотиков, увеличилось в 15 раз В первом полугодии 2005 года зарегистрировано свыше 180 тыс наркопреступлений, что на 15,3% превышает показатели аналогичного периода 2004 года Из них почти 75 тыс. являются тяжкими или особо тяжкими.

Особую озабоченность в последнее время вызывает злоупотребление лекарственными препаратами, обладающими обезболивающим эффектом, а также снотворным и седативным действием, в среде лиц, страдающих наркозависимостью Такие препараты используются в клинической практике в качестве заменителей наркотических средств в период абстиненции К их числу следует отнести буторфанол, доксиламин, кеторолак, имован, феназепам, терпинкод, амитриптилин, пипольфен, диклофенак. В связи с расширением контингента, злоупотребляющего наркотическими средствами, постоянно ведутся поиски новых веществ по анальгетической активности не уступающих, а по безопасности значительно

превышающих современные препараты На фармацевтическом рынке появились новые препараты, такие как буторфанол, декстрометорфан, обладающие мощным анальгезирующим эффектом, сопоставимым по действию с морфином, но с гораздо меньшим наркогенным потенциалом Круг этих лекарственных препаратов постоянно расширяется. Все большая доступность этих веществ способствует распространению наркомании В результате проведенных сотрудниками кафедры ОиУФ СПХФА исследований установлено, что спрос из аптечных организаций на данные препараты возрос, а это в свою очередь привело к увеличению числа острых отравлений ими, в том числе и со смертельным исходом По данным Бюро судебно-медицинской экспертизы (БСМЭ) г. Санкт-Петербурга и Ленинградской области, а также Центра по лечению острых отравлений СПб НИИ Скорой помощи им ИИ Джанелидзе, следует отметить число отравлений препаратом терпинкод составило в 2006 году 18, доксиламином - 46, кеторолаком - 7, имованом - 10, дшслофенаком - 12, буторфанолом - 2, амитриптилином - 280, цроизводными 1,4-бенздиазепина, в том числе феназепамом -1066

В связи с отсутствием методик химико-токсикологического анализа биологических объектов на присутствие доксиламина, буторфанола, кеторолака, диклофенака судебные эксперты химических отделений БСМЭ и врачи-лаборанты химико-токсиколотческих лабораторий наркодиспансеров испытывают значительные затруднения для доказательства отравления или исключения использования этих лекарственных препаратов в немедицинских целях, в том числе при приеме совместно с наркотическими средствами, психотропными и другими токсическими веществами

Цель работы Разработка методик химико-токсикологического анализа доксиламина, буторфанола, кеторолака и диклофенака в вещественных доказательствах и биологических жидкостях при судебно-химическом и химико-токсикологическом исследовании, и внедрение их в практику судебно-химических отделений Бюро судебно-медицинских экспертиз и наркологических диспансеров России.

Задачи исследования. Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи

1 Изучить особенности выделения (изолирования) исследуемых веществ из водных растворов разными органическими растворителями и их смесями, выявить закономерности процесса изолирования и влияния на него разных факторов, определить универсальный изолирующий агент

2 Разработать методики изолирования исследуемых веществ из биологических жидкостей (кровь, моча)

3 Определить возможность использования спектральных методов анализа при судебно-химическом исследовании изучаемых веществ

4 Разработать методики качественного определения доксиламина, буторфанола, кеторолака и диклофенака методами хроматографии в тонком слое сорбента (ТСХ), газожидкостной (ГЖХ), высокоэффективной (ВЭЖХ), газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (ГХ/МС), УФ, ИК-спекгроскопии, хроматоденситометрии, цветных и осадочных реакций

5 Предложить методы количественного определения исследуемых веществ, выделенных из биологических жидкостей. Сравнить сопоставимость и воспроизводимость этих методов.

6 Определить сроки сохраняемости доксиламина, буторфанола, кеторолака и диклофенака в гнилостно разлагающихся биологических жидкостях.

7 Разработать общую схему химико-токсикологического анализа при отравлениях изучаемыми веществами

Научная новизна работы Впервые выявлены особенности изолирования изучаемых веществ из водных растворов и биологических жидкостей разными органическими растворителями и их смесями. Установлено, что на процесс изолирования из биологических жидкостей методом жидкость-жидкостной экстракции влияет структура анализируемого соединения, его рКа, связь с биологической матрицей, рН среды и высаливающий реагент, растворитель или смесь растворителей

На основе методов УФ, ИК-спектроскопии, ТСХ, ВЭЖХ, ГХ/МС разработаны оригинальные методики обнаружения доксиламина, буторфанола, кеторолака и диклофенака при совместном присутствии с наркотическими и психотропными веществами, их качественного и количественного определения с использованием

оборудования, рекомендованного Мигодравсоцразвития РФ для оснащения химико-токсикологических лабораторий и Центров по лечению острых отравлений

Установлено, что ИК-спектроскопия не может быть использована для изучаемых веществ, выделенных из биологических жидкостей, а только для "вещественных доказательств" Метод УФ-спектрометрии не позволяет идентифицировать диклофенак и буторфанол при совместном присутствии с наркотическими анальгетиками, но может быть использован при их совместном присутствии с нестероидными противовоспалительными средствами Для доксиламина и кеторолака этот метод может быть использован При проведении анализа методом ВЭЖХ следует использовать градиентный режим, при ГХ/ЭЗД исследовании - предварительно проводить дериватизацию буторфанола При исследовании методом ГХУМС определены характеристичные иопы, позволяющие идентифицировать исследуемые вещества, выделенпые из биологических жидкостей.

Впервые определены необходимые объем и полнота судебно-химического исследования, позволяющие достоверно установить факт отравления изученными препаратами при летальном исходе и при приеме их в немедицинских целях

Практическое значение работы Разработаны оригинальные экономичные методики изолирования, обнаружения и количественного определения буторфанола, кеторолака, диклофенака и доксиламина в биологических жидкостях (кровь, моча). Использование цветных и осадочных реакций (на предварительном этапе), разных видов хроматографиии, УФ, ИК-спектроскопии, ГХ/МС позволяет достоверно установить факт отравления изученными препаратами. Доказано и обосновано применение этих методик в практике химико-токсикологических лабораторий, что позволяет сократить время диагностирования отравления изученными препаратами, дать оценку степени отравления для оказания своевременной медицинской помощи пострадавшему Разработанные методики апробированы, утверждены и внедрены в практику работы судебно-химических отделений Бюро судебно-медицинской экспертизы Ленинградской, Новгородской, Рязанской областей, г. Санкт-Петербурга, химико-токсикологических лабораторий Центра по лечению острых отравлений СПб НИИ Скорой помощи им. И.И. Джанелидзе и ГУЗ МВД № 1, в учебный процесс Региональных центров аналитической диагностики наличия наркотических средств,

психотропных и других токсических веществ, Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической и Пермской государственной фармацевтической академии (Акты о внедрении)

Апробация работы Основные материалы работы доложены на международной научно-практической конференции «Выпускник фармацевтического ВУЗа (факультета) в прошлом, настоящем и будущем», посвященной 85-летию Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии (Санкт-Петербург, 2004), юбилейной конференции «Подготовка кадров для фармацевтической промышленности», посвященной 60-летию факультета промышленной технологии лекарств (Санкт-Петербург, 2005), научных конференциях «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2006, 2007), региональной научной конференции студентов и аспирантов («Молодые ученые - практическому здравоохранению», (Санкт-Петербург, 2007).

Публикации По теме диссертации опубликовано 9 работ Объем и структура работы Диссертациоиная работа изложена на 129 страницах машинописного текста, иллюстрирована 20 рисунками и 29 таблицами, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (4-х глав), выводов, списка литературы, включающего 152 наименования (69 источников зарубежной литературы), приложения

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом исследований Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии На защиту диссертации выносятся следующие положения

1 Обоснование экспериментальных исследований по определению буторфанола, кеторолака, диклофенака и доксиламина на предварительном и подтверждающем этапах судебно-химического исследования биологических жидкостей с использованием современных физико-химических методов

2 Результаты оптимизации условий изолирования исследуемых веществ из биологических жидкостей и вещественных доказательств

3 Результаты разработки методик обнаружения и количественного определения изученных веществ, выделенных из биологических жидкостей с

использованием методов УФ, ИК-спектроскопии, ТСХ, ГЖХ, ВЭЖХ, ГХ/МС и денситометрии.

4 Данные о сохраняемости исследуемых веществ в биологических жидкостях, подвергнувшихся гнилостным изменениям.

5 Схемы судебно-химического исследования биологических жидкостей при отравлениях изученными веществами

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ В качестве объектов исследования были выбраны вещества, которые имеют наибольшее токсикологическое значение и встречаются в судебно-медицинской практике

Буторфанол -

Рис 1 (-)-17-(циклобутилметил)-морфинан-3,14-диол) - относится к группе наркотических анальгетиков, является антагонистом-агонистом опиатных рецепторов, выпускается в виде тартрата

Диклофенак-

Рис2 - натриевая соль 2-[(2,6-дихлорфенил)-амино]-фенилуксусной кислоты, относится к группе нестероидных противовоспалительных средств Кеторолак-

Рис 3 - соль (+) -5-Бензоил-2,3-дигидро-1Н-пирролизин-1-карбоновой кислоты и 2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиола, относится к группе нестероидных противовоспалительных средств

но

о

Доксиламин -

Рис 4 - 2-[а-[2-(диметиламино)этокси]-а-мстилфснил]-гшридин - является снотворным средством -блокатор Н]-гистаминовых рецепторов, выпускается в виде сукцината

При разработке методик определения буторфанола, диклофенака, кеторолака и докенламина были решетя две основные проблемы

- изолирование исследуемых веществ из биологических жидкостей,

- идентификация, в том числе и при совместном присутствии с другими наркотическими и психотропными средствами, и их количественное определение

1. Идентификация буторфанола, диклофенака, кеторолака и доксиламииа

Нами была изучена возможность использования для обнаружения буторфанола, диклофенака, кеторолака и доксиламина всех доступных в настоящее время методов, применяемых в химико-токсикологическом анализе, в частости метод цветных и осадочных реакций, УФ, ИК- спектроскопия, ТСХ, ГХ, ГХ/МС, ВЭЖХ

Хроматографическое исследование проводили в тонком слое сорбента на пластинах «Сорбфил ПТСХ-П-А-УФ» на полимерной подложке, «Лрмсорб ТСХ-КСКГ УФ-254» и «Силуфол УФ-254» на алюминиевых подложках методом одномерной восходящей хроматографии в разных, универсальных системах растворителей с учетом разделения веществ основного, кислого и нейтрального характера Хроматографическая подвижность буторфанола, диклофенака, кеторолака и доксиламина определялась в сравнении с другими нестероидными противовоспалительными (индометацин, метамизол натрия) и наркотическими (кодеин, морфин) средствами, так как необходимо их разделение при совместном приеме Детекцию проводили реактивами Драгендорфа, Марки и в УФ свете Наилучшие результаты по воспроизводимости значений ЯГ и форме пятен получены на пластинах «Сорбфил ПТСХ-П-А-УФ» (табл 1)

Полученные результаты свидетельствуют о том, что оптимальное разделение изучаемых веществ, в том числе и при совместном присутствии с другими

анальгетиками достигается на пластинах «Сорбфил ПТСХ-П-А-УФ» в системах хлороформ-этанол (9 1) и этанол-аммония гидроксида раствор 25% (100 1,5)

Таблица 1 - Значения Ш-буторфанола, диклофенака, кеторолака и доксиламина при хроматографировании в разных системах растворителей на пластинке ___ «Сорбфил» _____

""""--ДТрепараты Система^""""--^^ Диклофенак Кеторолак Доксил амин Бугор' фанол Морфин Кодеин Индоме тацин Метами зол№

Хлороформ-ацетон (9 1) 0,14+ 0,02 0,05+ 0,02 0,46+ 0,05 0,05+ 0,02 0,30± 0,02 0,85+ 0,04 0,05+ 0,01 0,05+ 0,01

Этилацетат-этанол-аммония гидроксида раствор 25% (17 2 1) 0,1+ 0,01 0,05+ 0,01 0,41+ 0,05 0,89+ 0,04 0,22+ 0,04 0,35+ 0,05 0,05+ 0,01 0,05+ 0,01

Этанол-аммония гидроксида раствор 25% (100 1,5) 0,65+ 0,05 0,59± 0,05 0,34+ 0,05 0,82+ 0,05 0,32+ 0,05 0,28+ 0,04 0,62+ 0,05 0,57+ 0,05

Хлороформ-этанол (9 1) 0,641 0,05 0,16+ 0,01 0,29+ 0,05 0,91+ 0,04 0,19+ 0,05 0,31± 0,04 0,43+ 0,05 0,05+ 0,01

Хлороформ-этанол-кислота уксусная (9,5 0,5 1к) 0,38+ 0,05 0,28+ 0,05 0,29+ 0,05 0,05+ 0,01 0,14+ 0,01 0,45+ 0,05 0,53+ 0,04 0,00

Бутанол-этанот-ачмония гидроксида раствор 25% (5 1 1) 0,52+ 0,05 0,49+ 0,05 0,46+ 0,05 0,93+ 0,04 0,88+ 0,05 0,83+ 0,05 0,61+ 0,05 0,38+ 0,06

Наилучшей системой растворителей для разделения буторфанола, доксиламина, морфина и кодеина является система этилацетат-этанол-аммония гидроксида раствор 25% (17 2 1) Кеторолак и диклофенак достаточно хорошо разделяются между собой и другими нестероидными противовоспалительными средствами в системе растворителей хлороформ-этанол (9 1), являющейся универсальной для хроматографирования веществ различной природы Для детекции и идентификации буторфанола, диклофенака, кеторолака и доксиламина на хроматографических пластинах применялись реактивы Драгепдорфа, Марки, доксиламина - облучение УФ-светом, кеторолака и диклофенака - раствор дифенилкарбазона в хлороформе 0,02% и раствор ртути (II) сульфата 5% Пределы обнаружения исследуемых веществ при анализе методом тонкослойной хроматографии составляют реактив Драгендорфа - буторфанол - 8 мкг, диклофенак

- 5 мкг, кеторолак - 4 мкг, доксиламин - 5 мкг, реактив Марки - буторфанол - 10 мкг, дшотофенак - 5 мкг, кеторолак - 5 мкг, доксилачин - 10 мкг

Хроматоденситометрия, как еще один современный физико-химический метод, проводилась с помощью видеоденситометра «ДенСкан» Исследование изучаемых веществ осуществлялось после хроматографировапия образцов на пластинках «Сорбфил ПТСХ-П-А-УФ» в системах растворителей, перечисленных выше. Проявление хроматограмм проводилось при длине волны 254 нм При детектировании нанесенных на хроматографическую пластинку стандартных растворов буторфанола не удалось добиться стабильных результатов, поэтому данный метод нельзя использовать для его определения Предел обнаружения изучаемых веществ методом хроматоденситометрии составил диклофенак - 1 мкг, кеторолак - 0,5 мкг, доксиламин - 0,5 мкг Метод хроматоденситометрии значительно превосходит традиционную ТСХ по чувствительности и позволяет в одной пробе проводить идентификацию и количественное определение исследуемых веществ

Анализируемые вещества дают цветные и осадочные реакции с реактивами, буторфанол - Марки, Фреде, Драгендорфа, с кислотой азотной концентрированной, с сахарозой в присутствии кислоты серной концентрированной, кеторолак - с реактивами Марки, Драгендорфа, Майера, Манделина, Зонненштейна, с кислотой серной концентрированной, диклофенак - с реактивами Марки, Манделина, Драгендорфа, с кислотой серной концентрированной, доксиламин - с реактивами Марки, Драгендорфа, Зонненштейна, с кислотами серной и азотной концентрированной В тех случаях, когда обстоятельства проведения экспертизы (на месте происшествия) или оснащение лаборатории не позволяет использовать высокочувствительную аппаратуру, данный метод может использоваться в качестве одпого из этапов предварительного исследования

Нами была исследована возможность применения ИК-спектроскопии для идентификации буторфанола, диклофенака, кеторолака и доксиламина, выделенных из биожидкостей Сухие остатки, полученные в результате экстракции исследуемых веществ из биожидкости, таблетировали с калия бромидом, снимали ИК-спектры на спектрофотометре «Спекорд М-80» в пределах 400-4000 см'1 и сравнивали со спектрами стандартных образцов Однозначного вывода при определении веществ,

выделенных из биожидкостей, этим методом сделать не удалось, и ИК-спегароскопия может быть использована только для вещественных доказательств этих соединений.

Сравнительный анализ буторфанола, кеторолака, диклофенака, доксиламина и других ненарготических и наркотических анальгетиков проводился с использованием ультрафиолетовой спектрометрии УФ-спекгры поглощения буторфанола, диклофенака, кеторолака и доксиламина были записаны в растворе кислоты хлористоводородной 0,1 М, в растворе натра едкого 0,1 М и в спирте этиловом 95° на спектрофотометре "8ресогс1-М-40" в пределах длин волн 220-400 нм (табл 2)

В растворе натра едкого 0,1 М и в спирте этиловом 95° наблюдается опалесценция основания буторфанола, поэтому спектры в этих растворителях записать не представляется возможным УФ-спекгры буторфанола, диклофенака, морфина и кодеина имеют близкие значения максимумов абсорбции, поэтому метод УФ-спектрометрии не может быть применен для анализа этих соединений при совместном присутствии без предварительного их разделения

Таблица 2 - Максимумы абсорбции исследуемых веществ в различных _растворителях_

Вещество (НСЬ 0,1 М), пм Зч,„ ОЧаОН 0,1 М), нм ^м« (С2Н5ОН 95°),нм

Буторфанол 278+2 - -

Доксиламип 261+2 248+2 261+2

Диклофенак 273+2 273+2 285+2

Кеторолак 248,317+2 248, 323+2 245, 317+2

Морфин 285+2 298+2 282+2

Кодеин 285+2 - -

Индометацин 273,318+2 281+2 268, 319+2

Метамизол Ыа 239,258+2 275+2 275+2

Разработаны условия обнаружения исследуемых веществ методом газовой хроматографии с электронозахватпым (ЭЗД) и масс-селективным детекторами (МС)

Исследование осуществляли на газовом хроматографе «Кристалл»-2000М, оснащенном модулем детекторов ЭЗД, ТИД, ПИД (рабочий детектор ЭЗД), капиллярной колонкой НР-1 размерами 30 м х 0,32 мм Температуру колонки программировали от 130°С до 240°С со скоростью 25°С/мин, с последующим повышением ее до 290°С со скоростью 7°С/мин, температура детектора и испарителя

соответственно 290°С и 270°С Расход газа-носителя (азота) составлял 1,35 мл/мин Пробу объемом 1 мкл вводили в газовый хроматограф в режиме деления потока газа-носителя 1 4

Таблица 3 - Результаты ГХ/ЭЗД исследования

Соединение Время удерживания (мин сек)

Буторфанола ПФП производное 13 44

Диклофенак 10 30

Морфина ди-ПФП производиое 11 23

6-Моиоадетилморфина пентафторпропионильное производное 12 41

Исследование буторфанола методом ГХ/ЭЗД возможно только после преобразования его в соединение, обладающее заместителями с электрон-акцепторными свойствами Поэтому определение буторфанола проводилось в виде продукта дериватизации его пентафторпропионовым ангидридом, а диклофенака - в нативной форме Установлены абсолютные времена удерживания диклофенака и иентафторпропионильного производного буторфанола, отличающиеся от времен удерживания пентафторпропионильных производных морфина и 6-моноацетилморфина (табл 3) Пределы обнаружения диклофенака - 2 нг/мл, буторфанола - 5 нг/мл

Идентификацию доксиламина, кеторолака, диклофенака, буторфанола, а также его пентафторпропионильного и тримешлсилильных производных методом газовой хроматографии-масс-спектрометрии проводили на квадрупольном хроматомасс-спектрометрическом комплексе Agilent Technologies в следующих условиях газовый хроматограф Agilent Technologies 6890N Колонка капиллярная HP-5MS размерами 30 м х 0,25 мм Температура инжектора 260°С, интерфейса - 290°С, источника - 230°С Программирование температур термостата колонок от 130°С до 290°С Скорость газа-носителя (гелия) 1 мл/мин Масс-селективный детектор 5973N, состоящий из ионного источника с энергией ионизации 70 эВ (табл 4)

В масс-спектре основания буторфанола с незначительной интенсивностью присутствует пик молекулярного иона m/z 327. Наибольшую интенсивность имеет ион m/z 272, образующийся в результате выброса циклобутильного фрагмента В

масс-спектре диклофенака наблюдается пик М* m/z 296 с невысокой интенсивностью и характеристичные пики m/z 279(277) р/Г-НгО], 214(100%) В масс-спектрах кеторолака и доксиламина отсутствуют пики молекулярных ионов, но наблюдаются характеристичные ионы для кеторолака m/z 211 (100%), образующийся в результате выброса го молекулярного иона молекулы СОг, для доксиламина - три интенсивных иона, два из которых (m/z 58, 71) относятся к четвертичным аммониевым и один (m/z 182) - третичный карбкатионовый

Таблица 4 -Хроматомасс-спекгральные характеристики исследуемых веществ и

их производных

Соединение Характеристичные ионы Молекулярная масса Время удерживания (мин.)

Буторфанол 272,273,327*, 254,41 327 18,87

Буторфанол-диТМС 416,73,417,326,471* 471 18,83

Буторфанол-ТМС 344, 73,345,399*, 326 399 18,52

Буторфанол-ПФП 418,419,119,271,207,472* 472 16,79

Доксиламин 58, 71, 77,167, 182 270 11,62

Диклофенак 214,277,279,242,296* 296 13,61

Кеторолак 211,210,134,77,106 255 12,41

* Молекулярный ион Ионы даны в порядке уменьшения интенсивности

Метод ВЭЖХ является широко распространенным в практике судебно-химических и токсикологических лабораторий для скрининговых исследований Анализ проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографическом комплексе НР-1100 с диодно-матричным детектором (ДМД), оснащенном колонкой Hypersyl ODS CI8 250x4,6 мм, размер частиц сорбента - 5 мкм Условия анализа-температура термостата колонки - 30°С, диапазон длин волн 180-400 нм, объем вводимой пробы - 25 мкл

Наилучшие результаты определения и разделения исследуемых веществ были получены при использовании градиентного режима анализа; с использованием в качестве компонентов подвижной фазы ацетонитрила и фосфатного буфера (pH 3,8), а в качестве внутреннего стандарта 5-(4-метилфенил)-5-фенилгидантоина (МРРН). Идентификация веществ проводилась по абсолютному и относительному временам удерживания. Использование вышеуказанного метода позволяет эффективно

разделять и осуществлять идентификацию изучаемых веществ в присутствии порядка

200 других лекарственных веществ (табл 5) Пределы обнаружения буторфанол 25

нг/мл, кеторолак 3 нг/мл, диклофенак 2 нг/мл, доксиламин 2 нг/мл

Таблица 5 - Абсолютное и относительное (ПЯТ) времена удерживания исследуемых веществ и некоторых наркотических и лекарственных средств (метод

ВЭЖХ, концентрация исследуемых соединений -10 мкг/мл)

№ Вещество (мин.) Ш*Т

1 Буторфанол 7,87 0,53

2 Доксиламин 6,57 0,46

3 Кеторолак 11,49 0,77

4 Диклофенак 21,90 1,49

5 Морфин 1,66 0,11

6 Кодеин 2,85 0,19

7 Амфетамин 3,73 0,25

8 Метадон 13,91 0,94

9 Димедрол 10,44 0,71

10 Фенобарбитал 8 92 0,61

11 МРРН (внутр стандарт) 14,77 1

Вышеописанные методы обнаружения, разработанные нами, использовались для идентификации буторфанола, доксиламина, диклофенака и кеторолака, выделенных из биологического жидкостей

2. Количественное определение буторфанола, диклофенака, кеторолака и

доксиламина

Для количественного определения буторфанола, диклофенака, кеторолака и доксиламина, выделенных из вещественных доказательств и извлечений из биожидкосгей, нами разработаны методы УФ-спектрометрии, хроматоденсигометрии и высокоэффективной жидкостной хроматографии

УФ-спектрофотометрический метод. Спектрофотометрическое определение буторфанола, кеторолака, диклофенака и доксиламина проводили в растворе кислоты хлористоводородной 0,1М на спектрофотометре «Спекорд-М-40» (кювета 1 см) по предварительно построенным графикам зависимости оптической плотности от концентрации, подчиняющимся закону Бугера-Ламбсрта-Бера. Определение буторфанола производили при длине волны 278 нм в интервале концентраций 25-125

мкг/мл, кеторолака - при длине волны 317 нм в интервале концентраций 5-35 мкг/мл, диклофенака - при длине волны 285 нм в интервале концентраций 1-50 мкг/мл, доксиламина - при длине волны 261 нм в интервале концентраций 20-120 мкг/мл. Относительная погрешность определения исследуемых веществ спекгрофотометрическим методом составляет 1,02-2,83%, т.е. результаты метода можно считать достоверными с вероятностью 95%

Хроматоденситометричсский метод. Использован нами для количественного определения диклофенака, кеторолака и доксиламина. Исследования проводились с применением видеоденситометра «ДенСкан» после хроматографирования образцов на пластинах «Сорбфил ПТСХ-П-А-УФ». Количественное содержание определяли по предварительно построенным калибровочным графикам. Относительная погрешность определения исследуемых веществ этим методом составляет 2,01-2,21%, т.е. результаты метода можно считать достоверными с вероятностью 95%

Метод ВЭЖХ. Количественное определение буторфанола, диклофенака, кеторолака и доксиламина проводили методом ВЭЖХ, который позволяет проводить определение нескольких веществ одновременно, по разработанной методике Калибровочные графики для определения исследуемых веществ строили в интервале концентраций буторфанола 1,1-10,0 мкг/мл, диклофенака - 4,7-20,0 мкг/мл, кеторолака- 0,3-10,0 мкг/мл, доксиламина - 1,5-20,0 мкг/мл Метод ВЭЖХ позволяет проводить количественное определение нескольких веществ одновременно в одной пробе. Относительная погрешность определения исследуемых веществ методом ВЭЖХ составляет для буторфанола - 0,97%, диклофенака- 2,17%, кеторолака -1,70%, доксиламина - 1,87% При сравнении методов количественного определения установлено, что результаты, полученные при их использовании сопоставимы.

3. Экстракция буторфанола, диклофенака, кеторолака а доксиламина из водных растворов и биологических жидкостей

Нами были проведены исследования с целью изучения влияния рН среды и природы органического растворителя на степень экстракции буторфанола, кеторолака, диклофенака и доксиламина из водных растворов.

В качестве экстр агентов использовали органические растворители и их смеси: хлороформ, диэтиловый эфир, гексан, этилацетат, хлороформ-2-пропанол (9 1),

хлороформ-2-пропанол-гептан (5(И7 33). На основании полученных данных (Приложение, табл.1) установлено, что максимальное количество буторфанола извлекается при рН среды 11,0-12,0 смесью растворителей хлороформ-2-пропанол (9:1), максимальное количество доксиламина - при рН среды 9,0-10,0 смесью растворителей хлороформ-2-пропанол-гептан (50.17 33) Диклофенак эффективно извлекается в кислой среде всеми исследуемыми органическими растворителями Наибольшая степень экстракции диклофенака и кеторолака была достигнута при рН среды 2,0 при использовании хлороформа. При совместном присутствии исследуемых веществ их изолирование целесообразно проводить смесью растворителей хлороформ-2-пропанол-гептан (50'17'33) при рН среды 9,0-10,0.

Д ля изучения % извлечения исследуемых веществ из биологических жидкостей использовались контрольные образцы крови и мочи с концентрацией веществ 10 мкг/мл, жидкости подвергались гидролизу. Извлечение в % из мочи, крови составляет для диклофенака - 92,7, 68,8, кеторолака - 85,0, 73,4, доксиламина - 93,3, 80,3; буторфанола - 90,1, 78,3 соответственно. Относительные погрешности определения исследуемых веществ в биожидкостях составили 5-10%.

4. Изолирование и определение исследуемых веществ в крови и моче

Исследование проводилось на экспериментальных животных - белых беспородных крысах-самцах массой 180-220 г. Буторфанат, диклофенак и кеторолак вводили в токсической дозе внутрибрюшинно, однократно (8 мг/кг - буторфанол, 125 мг/кг - диклофенак, 150 мг/кг - кеторолак) с последующей водной нагрузкой. Дохсиламнн (15 мг) вводился в желудок через зонд в виде взвеси с 10 мл воды очищенной. Забор крови производили через 1 ч, мочу собирали в течение 24 ч.

Методика изолирования. 3 Ми мочи (крови, разведенной водой очищенной), помещают в экстракционную тубу, добавляют 1 мл буферного раствора с соответствующим рН среды, 3 г натрия хлорида и 3 мл экстрагеша. Экстрагируют 5 мин., центрифугируют 3 мин при скорости 3000 об/мин (табл.6) Органический слой отбирают пастеровской пипеткой в виалу и испаряют в токе азота. В связи с образованием конъюгатов с белками, при анализе мочи и крови, содержащей буторфанол, и крови, содержащей диклофенак и кеторолак, стадии экстракции предшествует стадия кислотного гидролиза. К 3 мл мочи (крови) добавляют 300 мкл

кислоты хлористоводородной концешрированной Герметично закрытый флакон термостатируют при 100°С 30 мин (при исследовании на буторфанол после охлаждения флакона рН среды доводят раствором аммония гидроксида 25% до значения рН 12,0) Содержимое флакона помещают в тубу и экстрагируют

Таблица 6 - Условия экстраги] эования

Соединение Буферный раствор Экстрагент

Буторфанол раствор аммония гидроксида (25%) (рН 12,0) Хлороформ-2-пропанол (91)

Кеторолак кислота хлористоводородная 0,1 М (рН 2,0) Хлороформ

Диклофенак кислота хлористоводородная 0,1 М (рН 2,0) Хлороформ

Доксиламин Карбонатный буфер (рН 9,0) Хлороформ-2-пропанол-гептан (50 17 33)

Результаты, полученные при идентификации извлечений из биожидкостей методами ТСХ, ГХ и УФ спектрометрии, совпадали с результатами анализа ГСО и веществ, выделенных из лекарственных препаратов При исследовании извлечений из крови и мочи экспериментальных животных, кроме нативных соединений методами ГХУМС и ВЭЖХ были идентифицированы и метаболиты изучаемых соединений.

Количественное определение исследуемых веществ, выделенных из биожидкостей, проводили параллельно методами УФ-спеюрометрии, хроматоденситометрии и ВЭЖХ. Экстракцию проводили по вышеописанной методике Для ВЭЖХ определения к пробе добавляли 10 мкл раствора внутреннего стандарта (МРРН) с концентрацией 30 мкг/мл (табл 7).

Таблица 7 - Результаты количественного определения

Метод Содержание исследуемого вещества (мкг/мл)

Буторфанол Диклофенак Кеторолак Доксиламин

кровь моча кровь моча кровь моча кровь моча

УФ-спектрометрия 12,1+ 0,8 13,6± 1,0 54,6± 4,9 32,7± 2,7 519,7+ 41,6 800,6+ 72,0 765,2± 68,9 80,3± 6,4

Хромато-денситометрия 56,0± 5,0 35,4+ 2,8 538,6+ 43,0 776,3+ 69,9 740,0+ 66,6 78,3+ 6,3

ВЭЖХ 10,2± 0,7 16,2+ и 62,0± 5,4 38,7± 3,1 570,8+ 45,7 814,3+ 73,2 780,0+ 70,2 79,9± 6,4

Полученные результаты свидетельствуют о сопоставимости трех предложенных методов количественного определения исследуемых веществ

5. Определение изучаемых веществ в моне при совместном присутствии с другими опоидными анальгетиками Для определения изучаемых веществ при совместном присутствии с метаболитами героина использовалась моча, доставленная для судебно-химического исследования, в которой предварительно был обнаружен морфин в концентрации 2,1 мкг/мл и б-моноацетнлморфнн В мочу были добавлены стандартные метанолыше растворы буторфанола, диклофенака, кеторолака и докенламина. Таким образом, в 1 мл мочи содержалось по 10 мкг исследуемых веществ и 2,1 мкг морфина, и присутствовал 6-моноацетилморфин

Моча экстрагировалась по разработанной нами методике с кислотным гидролизом и без него, с использованием экстрагента хлороформ-2-пропанол-гептан (50 17 33) прирН среды 9,0-10,0

Подтверждение совместного присутствия в моче изучаемых веществ и морфина осуществляли методом ТСХ на пластинках «Сорбфил - ПТСХ-П-А-УФ» в следующих системах растворителей- I - этанол-аммония гидроксида раствор 25% (100 1,5), II - этил ацетат-этанол-аммония гидроксида раствор 25% (17 2 1) Детекция проводилась реактивами Драга щорфа и Марки При этом наблюдались пятна, по значениям ИГ и окраскам соответствующие метчикам буторфанола (Ш=0,82), диклофенака (Л£=0,65), кеторолака (1*£=0,59), докенламина (Ш="0,34), морфина (Ш=0,30) - система I, доксиламнна (ЕМ),42), буторфанола (Ш=0,87), морфина (Ш=0,20), диклофенака и кеторолака (М=0,07) - система П.

При исследовании изучаемых веществ, выделенных из мочи без гидролиза, методом газовой хроматотрафии с электронозахватным детектированием после дериватизации пентафторпропионовым ангидридом на хроматограмме были идентифицированы пики диклофенака, продуктов дериватизации буторфанола, морфина и 6-моноацетилморфина (Приложение, рис 1)

При исследовании пробы методом ВЭЖХ были идентифицированы пики, по времени удерживания и УФ-спектрам совпадающие со стандартными веществами

буторфанолом, диклофенаком, кеторолаком, доксиламином и морфином (Приложение, рис 2)

При хроматомасс-спектрометрическом исследовании негадролизованной мочи без дериватизации идентифицированы пики только диклофенака, кеторолака, доксиламина и буторфанола Производные буторфанола, морфина и 6-моноацетилморфина были определены после обработки пробы дериватизирующими агентами (Приложение, рис 3)

С помощью разработанных методик исследуемые вещества можно определить совместно и в присутствии других опиоидных анальгетиков

б Сохраняемость буторфанола, диклофенака, кеторолака и доксиламина в

биологических жидкостях Сохраняемость исследуемых веществ изучалась с использованием крови и мочи экспериментальных животных Биологические жидкости хранились при 4°-б°С Химико-токсикологическое исследование крови и мочи осуществляли через 1,2,3 и 6 месяцев после забора Данные, представленные на диаграмме, свидетельствуют о том, что исследуемые вещества могут бьпъ обнаружены в крови и в моче спустя 6 месяцев после захоронения

Сохраняемость (%) исследуемых веществ в крови и моче крыс

буторфанол дикпофенак кеторолак |доксиламин месяцы

ВЫВОДЫ

1 Впервые выявлены особенности и определены оптимальные условия изолирования изучаемых веществ из водных растворов и биологических жидкостей при совместном присутствии и при целенаправленном исследовании Установлено, что на процесс изолирования из биологических жидкостей влияет растворитель или смесь растворителей, строение анализируемого соединения, его рКа, связь с биологической матрицей, pH среды и высаливающий реагент

2 Разработанные методики изолирования исследуемых веществ при целенаправленном исследовании просты, экономичны и позволяют выделить из крови около 80% буторфанола а доксиламина, 70% диклофенака, 75% кеторолака, из мочи - около 90% буторфанола, диклофенака и доксиламина, 85% кеторолака

3 Разработаны условия обнаружения и разделения буторфанола, диклофенака, кеторолака и доксиламина методами ГСХ, ВЭЖХ, ГХ/ЭЗД, ГХ/МС и ИК-, УФ-спектроскошш, применяемыми в химико-токсикологическом анализе Доказано экспериментально, что ИК-спекгроскопия не может быть использована для изучаемых веществ, выделенных из биологических жидкостей, а только для "вещественных доказательств". Метод УФ-спсктромегрии не позволяет идентифицировать диклофенак и буторфанол при совместном присутствии с наркотическими анальгетиками, но может быть использован при их совместном присутствии с НПВС. Для доксиламина и кеторолака этот метод может быть использован При проведении анализа методом ВЭЖХ следует использовать градиентный режим, при ГХ/ЭЗД исследовании - предварительно проводить дериватизацию буторфанола

4 При исследовании изученных соединений, выделенных из биологических жидкостей, методом ГХ/МС установлено, что в масс-спектре основания буторфанола и диклофенака с незначительной интенсивностью присутствует пик молекулярного иона m/z 327, 296, для кеторолака и доксиламина - отсутствует Поэтому буторфанол следует идентифицировать по иону m/z 272(100%), образующемуся в результате выброса из молекулярного иона циклобутилыюго фрагмента, кеторолак - по иону m/z 211(100%), образующемуся в результате [М* -СО2], доксиламин - по трем интенсивным ионам, два из которых (m/z 58(100%), 71) относятся к четвертичным

аммониевым и один (m/z 182) - третичный карбкатионовый, диклофенак - по ионам m/z 279(277) - [М+-Н20], 214(100%) и полном совпадении масс-спектров со спектрами стандартного образца и данными библиотек масс-спектров

5 Разработаны методики количественного определения буторфанола, диклофенака, кеторолака и доксиламина с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, спектрофотометрии и для трех последних соединений -высокоэффективной денситометрии Установлено, что методы ВЭЖХ и денситометрия позволяют одновременно проводить качественный и количественный анализ исследуемых веществ, в том числе в присутствии с наркотическими и ненаркотическими анальгетиками Относительные погрешности определения буторфанола, диклофенака, кеторолака и доксиламина в биологических жидкостях составляют 5-10%

6 При сравнении методов количественного определения исследуемых веществ, выделенных из биологических жидкостей, установлено, что полученные результаты близки и воспроизводимы, и эти методы могут быть использованы в БСМЭ и наркологических диспансерах с разной степенью оснащенности приборами

7 При изучении сохраняемости исследуемых веществ в гнилостно измененных биологических жидкостях впервые установлено, что в течение 6-ти месяцев в крови и моче сохраняется соответственно 25 и 30% от первоначального количества буторфанола, 26 и 47% - диклофенака, 56 и 58% - кеторолака, 62 и 74% -доксиламина

8 По результатам исследования разработаны общая схема и схемы для целенаправлешюго судебно-химического исследования биологических жидкостей на буторфанол, диклофенак, кеторолак и доксиламин, позволяющие установить или исключить факт отравления исследуемыми веществами

Список работ, опубликованных по теме диссертации-

1 Определение кеторолака при судсбно-химических исследованиях / Л В Киреева, А.Б. Вожева, Г С Самоукова, С M Бахтина, В H Куклин // Материалы международной научно-практической конференции «Выпускник фармацевтического вуза (факультета) в прошлом, настоящем и будущем» - СПб, 2004 - С, 271-274

2 Химико-токсикологическое исследование донормила в вещественных доказательствах и биожидкостях / А В Киреева, А Б Вожева, С M Бахтина, В H Куклин // Сборник научных трудов юбилейной конференции, посвященной 60-летию факультета промышленной технологии лекарств «Подготовка кадров для фармацевтической промышленности» - СПб, 2005 -С. 158-160.

3 Изучение лекарственных препаратов, используемых при абстинентном синдроме и их фармакологическое исследование / Е H Степанова, В H Куклин, А В. Киреева // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции сб науч тр / Пятигорская гос. фармац академия - Вып. 61 - Пятигорск, 2006 -С 385-386

4 Определение доксиламина при химико-токсикологических исследованиях / А В. Киреева, А Б Вожева, С M Бахтина, В.Н Куклин // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции сб науч тр / Пятигорская гос фармац академия -Вып 61 - Пятигорск, 2006 - С 219-221

5 Химико-токсикологическое определение кеторолака / А Б Вожева, А В Киреева, Т С Самоукова, С M Бахтина, В.Н Куклин // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции сб науч тр / Пятигорская гос фармац академия - Вып 61 - Пятигорск, 2006 - С 173

6 Киреева, А В Химико-токсикологическое исследование некоторых анальгетиков, применяемых в период абстинентного синдрома / А В. Киреева // Материалы региональной научной конференции студентов и аспирантов «Молодые ученые практическому здравоохранению». - СПб, 2007 - С.41-42.

7 Химико-токсикологическое исследование диклофенака в биологических жидкостях и вещественных доказательствах / ЕА. Бадягин, А В Киреева, А Б Зеленцова, В H Куклин // Разработка, исследование и маркетинг новой

фармацевтической продукции: сб науч тр / Пятигорская гос фармац. академия -Вып 62 - Пятигорск, 2007 - С 248-249

8 Химико-токсикологическое исследование доксиламина / А В Киреева, А Б Вожева, СМ. Бахтина, С В Волченко, ВН. Куклин // Судебно-медиципская экспертиза -2007 -№3 -С.22-25

9 Химико-токсикологическое исследование буторфанола / А В Киреева, А.Б Вожева, H В Сайгушкин, А А Ваталев, С В Волченко, В H Куклин // Судебно-медицинская экспертиза - 2008 - № 2 - С 37-39

ПРИЛОЖЕНИЕ

(й г

Г)

I

с §

'ШЭДЩЯР 1111

Рис. 1. ГХ/ЭЗД хроматограмма извлечения из мочи, содержащей исследуемые наркотические вещества (после дериватизации).

"1 I 0№1 А $¡(=250,80 Яе(=ЗКиОО (URS02.ro I I 0А01 0. 51д=240,10 РеГ-ЗЮ.ЮО (Ш?802.П) Г"1 0АП1 Е. £¡8=280,16 Нб1=звв,юо(иягог.В)

Рис. 2. ВЭЖХ хроматограмма извлечения то мочи, содержащей исследуемые и наркотические вещества.

' к» 414Л) (417.70 к}413.?ЭД,' ЙХОСйЛ кш 68.03 (67.70 й 58.70* ШОЕЯЛ

ч--'п ¿ч *(г«млгЕис кл 2!1.Ю <210.701021! ТВ* ИЯХЯО 1оп 414 СО (413.70 4о4М 707 МИЛЕЯ О кп <73.00 «72 70 Ь 473.71?: ШСБШ

14 38

ИйпЗап«-МОООО

ш

130000 138000

ояооо 11КХИ-110300;

«боса;

100030-»да.

80000-мсоо

65503 73000" 70000 05000 ЮООО 55000 «моо

45000 43«0 35000

яхт

45000

гоосо 1ЙОО: 100СЭ

«га о

Птж-» 1МЮ Я&0 11Я0 11:80 «ДО 12Ь 13Д0 13Я0 14Я) 14Я0 <¡¿00 1В'.Ю 1В<Э0 16Л0 1Г» <7.50 »"00 1&50

Рис 3 ГХ/МС хроматограмма извлечения из мочи, содержащей исследуемые и наркотические вещества (после дериватизации)

Таблица 1 - Влияние природы органического растворителя и рН среды на % извлечения исследуемых веществ из водных растворов

Экстрагент рН % извлечения

Буторфянол Диклофенак Кеторолак Доксиламин

Хлороформ 2 0,0 98,0 86,4 0,0

4 23,8 94,7 77,3 43,9

7 51,3 87,4 74,4 60,1

9 89,2 82 7 50,8 67,5

12 93,0 66,8 24,6 64,2

Диэтиловый эфир 2 0,0 93,8 79,6 0,0

4 0,0 88,9 74,1 47,5

7 4,1 82,4 63,6 64,6

9 32,9 71,9 55,4 75,4

12 45,0 53 2 22,7 72,6

Этил ацетат 2 0,0 95,6 67,5 0,0

4 17,3 94 5 63,2 7,0

7 27,1 82,3 60,5 23,4

9 81,8 74,6 43,7 68,6

12 95,0 62,6 21,3 63,1

Гексан 2 0,0 92,3 44,4 0,0

4 12,4 85,6 18,3 48,1

7 35,2 76,4 10,6 73,4

9 71,0 69,7 5,0 76,2

12 95,0 65,0 0,0 73,9

Хлороформ 2-иропанол гептан (50 17 33) 2 0,0 97,4 69,4 0,0

4 19,5 94,0 62,4 52,6

7 43,8 88,7 59,6 73,3

9 90,5 84,2 53,3 97,5

12 92,5 60,8 22,9 95,3

Хлороформ 2-пропанол (9 1) 2 0,0 91,8 76,9 0,0

4 21,3 86,9 69,0 38,2

7 49,7 78,5 60,8 62,8

9 86,4 62,8 45,6 65,4

12 97,0 57,4 21,8 63,4

Рис 4 Схема химико-токсикологического исследования буторфанола, доксиламина, кеторолака и диклофенака в биожидкостях при совместном присутствии их с наркотическими веществами

На правах рукописи

Киреева Анна Владимировна

ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ, ПРИМЕНЯЕМЫХ В ПРАКТИКЕ КУПИРОВАНИЯ АБСТИНЕНТНОГО СИНДРОМА

Специальность 15 00.02 —Фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Печать Н В Андриановой

П0Д""С2"0 печати 16 04 2008 Формат 60 х 50/16 Бумага тип печать ризограф

_Гарнитура «Тайме» Печ л 3,0 Тираж! 00 экз Заказ 725_

Санкт-Петербург 2008

Актуальность проблемы. Масштаб злоупотребления наркотическими средствами, а также соединениями, обладающими подобным действием на организм, в Российской Федерации год от года неуклонно расширяется. Эта проблема становится одной из важнейших социальных проблем [27,78]. За последнее десятилетие число только официально зарегистрированных наркозависимых людей в России возросло в 10 раз [18,39]. По данным органов здравоохранения в России на 1 января 2006 года на учете Наркологических диспансеров состояло более 765 тысяч лиц, злоупотребляющих наркотическими средствами, из них 689,5 тысяч - с диагнозом «наркомания». По экспертным оценкам реальное количество потребителей наркотиков превышает данные показатели в 5-10 раз [11]. Постоянное увеличение потребления психотропных препаратов отмечается в первую очередь в подростковой и молодежной среде, о чем свидетельствует тот факт, что по сравнению с 2005 годом количество подростков, больных наркоманией, в 2006 году увеличилось на 27,5%. Особую тревогу вызывает снижение среднего возраста людей, употребляющих наркотические средства и психотропные вещества. В 2005 году поставлен диагноз наркомания свыше 9 тыс. детей в возрасте до 14 лет [34,82]. По данным отделений интенсивной терапии острых отравлений частота отравлений психотропными препаратами составляет 75-85% от общего числа поступающих больных. Следует обратить внимание на тот факт, что средний возраст пациентов, доставляемых в отделения острых отравлений в связи с острой интоксикацией наркотическими средствами, не превышает 27 лет [4]. Подавляющее большинство наркоманов (67,3%) составляют лица в возрасте до 30 лет [82].

Токсикологическую ситуацию в стране усугубляет целый ряд факторов. Во-первых, распространение психотропных веществ, изготовляемых кустарным способом, зачастую затрудняет проведение клинической и лабораторной диагностики. Токсическое действие кустарных наркотических средств усиливается вследствие загрязнения их в процессе изготовления растворителями, добавками, используемыми с целью усиления токсического эффекта или с целью обмана «покупателя» (тальк, мел, крахмал, сода, сахарная пудра, хингамин, сульфат, силикат магния) [20,22]. В таких случаях клиническая картина обусловлена не только действием самих наркотических анальгетиков, но и «эффектом второго соединения». Во-вторых, в токсикологической практике часто встречаются отравления накротическими средствами в комбинации с психотропными препаратами. При этом на фоне клиники отравления опиоидами чаще всего обнаруживаются проявления, связанные с приемом бензодиазепинов, атропина, димедрола, амфетаминов. Особенно тяжело протекают отравления смесями наркотических средств, например, комбинацией героин/кокаин («спид-болл»). Подобная ситуация наблюдается и в других странах. Так, по данным центрального департамента и центра токсикологического контроля г. Нью-Йорка за период 2004-2005 гг. зарегистрировано 465 случаев передозировки «уличными наркотиками»; в клинической картине отравления героином преобладали клинические эффекты скополамина, антихолинергических веществ [3,39].

Особую озабоченность в последнее время вызывает злоупотребление лекарственными препаратами, обладающими обезболивающим эффектом, а также снотворным и седативным действием, в среде лиц, страдающих наркозависимостью. Такие препараты используются в клинической практике в качестве заменителей наркотических средств в период абстиненции. К их числу следует отнести буторфанол, доксиламин, кеторолак, имован, феназепам, терпинкод, амитриптилин, пипольфен, диклофенак. В связи с расширением контингента, злоупотребляющего наркотическими средствами, постоянно ведутся поиски новых веществ по анальгетической активности не уступающих, а по безопасности значительно превышающих современные препараты. Круг этих лекарственных препаратов постоянно расширяется. Все большая доступность этих веществ способствует распространению наркомании. В результате проведенных сотрудниками кафедры ОиУФ СПХФА исследований установлено, что спрос из аптечных организаций на данные препараты возрос [25,63]. Это в свою очередь (по данным бюро судебно-медицинской экспертизы (БСМЭ)) привело к увеличению числа острых отравлений ими, в том числе и со смертельным исходом. При одновременном применении буторфанола, кеторолака, диклофенака и доксиламина с опийными алкалоидами, производными барбитуровой кислоты, производными 1,4-бензодиазепина, нейролептиками, транквилизаторами отмечается усиление угнетающего влияния на центральную нервную систему, что также приводит к летальному исходу. По данным БСМЭ г. Санкт-Петербурга и Ленинградской области, а также Центра по лечению острых отравлений СПб НИИ Скорой помощи им. И.И. Джанелидзе, следует отметить: число отравлений доксиламином составило в 2006 году 46, кеторолаком - 7, имованом - 10, диклофенаком - 12, буторфанолом - 2, препаратом терпинкод - 18, амитриптилином - 280, производными 1,4-бенздиазепина, в том числе феназепамом - 1066.

Анализ литературных данных показал, что данные химико-токсикологического анализа буторфанола, диклофенака, кеторолака и доксиламина противоречивы, нет систематических исследований по разработке методик изолирования, обнаружения и количественного определения. В связи с отсутствием методик химико-токсикологического анализа биологических объектов на присутствие буторфанола, кеторолака, диклофенака, доксиламина судебно-химические отделения БСМЭ и химико-токсикологические лаборатории наркодиспансеров испытывают значительные затруднения для доказательства отравления или исключения использования этих лекарственных препаратов в немедицинских целях, в том числе при приеме совместно с наркотическими средствами, психотропными и другими токсическими веществами.

Целью работы является разработка методик химико-токсикологического анализа буторфанола, кеторолака, диклофенака, доксиламина в вещественных доказательствах и биологических жидкостях при судебно-химическом и химико-токсикологическом исследовании, и внедрение их в практику судебно-химических отделений БСМЭ и химикотоксикологических лабораторий наркологических диспансеров России.

Задачи, которые необходимо было решить для достижения поставленной цели:

- изучить особенности выделения (изолирования) исследуемых веществ из водных растворов разными органическими растворителями и их смесями, выявить закономерности процесса изолирования и влияния на него разных факторов, определить универсальный изолирующий агент.

- разработать методики изолирования исследуемых веществ из биологических жидкостей (кровь, моча).

- определить возможность использования спектральных методов при судебно-химическом исследовании изучаемых веществ.

- разработать методики качественного определения доксиламина, буторфанола, кеторолака и диклофенака методами хроматографии в тонком слое сорбента (ТСХ), газожидкостной (ГЖХ), высокоэффективной (ВЭЖХ), газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (ГХ/МС), УФ, ИК-спектроскопии, хроматоденситометрии, цветных и осадочных реакций.

- предложить методы количественного определения исследуемых веществ, выделенных из биологических жидкостей. Сравнить сопоставимость и воспроизводимость этих методов. определить сроки сохраняемости доксиламина, буторфанола, кеторолака и диклофенака в гнилостно разлагающихся биологических жидкостях.

- разработать общую схему химико-токсикологического анализа при отравлениях изучаемыми веществами.

Научная новизна: Впервые выявлены особенности изолирования изучаемых веществ из водных растворов и биологических жидкостей разными органическими растворителями и их смесями. Установлено, что на процесс изолирования из биологических жидкостей методом жидкость-жидкостной экстракции влияет структура анализируемого соединения, его рКа, связь с биологической матрицей, рН среды и высаливающий реагент, растворитель или смесь растворителей.

На основе методов УФ, ИК-спектроскопии, ТСХ, ВЭЖХ, ГХ/МС разработаны оригинальные методики обнаружения доксиламина, буторфанола, кеторолака и диклофенака при совместном присутствии с наркотическими и психотропными веществами, их качественного и количественного определения с использованием оборудования, рекомендованного МЗ CP РФ для оснащения химико-токсикологических лабораторий и Центров по лечению острых отравлений.

Установлено, что ИК-спектроскопия не может быть использована для изучаемых веществ, выделенных из биологических жидкостей, а только для "вещественных доказательств". Метод УФ-спектрометрии не позволяет идентифицировать диклофенак и буторфанол при совместном присутствии с наркотическими анальгетиками, но может быть использован при их совместном присутствии с нестероидными противовоспалительными средствами. Для доксиламина и кеторолака этот метод может быть использован. При проведении анализа методом ВЭЖХ следует использовать градиентный режим, при ГХ/ЭЗД исследовании следует проводить дериватизацию буторфанола. При исследовании методом ГХ/МС определены характеристичные ионы исследуемых веществ. Установлено, что для ГХ/МС определения буторфанола необходимо синтезировать его пентафторпропионильные и триметисилильные производные.

Впервые определены необходимые объем и полнота судебно-химического исследования, позволяющие достоверно установить факт отравления изученными препаратами при летальном исходе и при приеме их в немедицинских целях.

Практическая значимость. Разработаны оригинальные экономичные методики изолирования, обнаружения и количественного определения буторфанола, кеторолака, диклофенака и доксиламина в биологических жидкостях (кровь, моча). Использование цветных и осадочных реакций (на предварительном этапе), разных видов хроматографиии, УФ, ИК-спектроскопии, ГХ/МС позволяет достоверно установить факт отравления изученными препаратами. Доказано и обосновано применение этих методик в практике химико-токсикологических лабораторий, что позволяет сократить время диагностирования отравления изученными препаратами, дать оценку степени отравления для оказания своевременной медицинской помощи пострадавшему. Разработанные методики апробированы, утверждены и внедрены в практику работы судебно-химических отделений БСМЭ Ленинградской, Новгородской, Рязанской областей, г. Санкт-Петербурга, химико-токсикологических лабораторий Центра по лечению острых отравлений СПб НИИ Скорой помощи им. И.И. Джанелидзе и ГУЗ МНД № 1; в учебный процесс Региональных центров аналитической диагностики наличия наркотических средств, психотропных и других токсических веществ, Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической и Пермской государственной фармацевтической академий (Акты о внедрении).

Апробация работы. Основные материалы работы доложены на международной научно-практической конференции «Выпускник фармацевтического ВУЗа (факультета) в прошлом, настоящем и будущем», посвященной 85-летию Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической ' академии (Санкт-Петербург, 2004), юбилейной конференции «Подготовка кадров для фармацевтической промышленности», посвященной 60-летию факультета промышленной технологии лекарств (Санкт-Петербург, 2005), научных конференциях «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2006, 2007), региональной научной конференции студентов и аспирантов («Молодые ученые - практическому здравоохранению», (Санкт-Петербург, 2007).

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 129 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (4-х глав), выводов, списка литературы, включающего 152 наименования (69 источников зарубежной литературы), приложения, содержит 29 таблиц и 20 рисунков.

выводы

1. Впервые выявлены особенности и определены оптимальные условия изолирования изучаемых веществ из водных растворов и биологических жидкостей при совместном присутствии и при целенаправленном исследовании. Установлено, что на процесс изолирования из биологических жидкостей влияет растворитель или смесь растворителей, строение анализируемого соединения, его рКа, связь с биологической матрицей, рН среды и высаливающий реагент.

2. Разработанные методики изолирования исследуемых веществ при целенаправленном исследовании просты, экономичны и позволяют выделить из крови около 80% буторфанола и доксиламина, 70% диклофенака, 75% кеторолака; из мочи - около 90% буторфанола, диклофенака и доксиламина, 85% кеторолака.

3. Разработаны условия обнаружения и разделения буторфанола, диклофенака, кеторолака и доксиламина методами ТСХ, ВЭЖХ, ГХ/ЭЗД, ГХ/МС и ИК-, УФ-спектроскопии, применяемыми в химико-токсикологическом анализе. Доказано экспериментально, что ИК-спектроскопия не может быть использована для изучаемых веществ, выделенных из биологических жидкостей, а только для "вещественных доказательств". Метод УФ-спектрометрии не позволяет идентифицировать диклофенак и буторфанол при совместном присутствии с наркотическими анальгетиками, но может быть использован при их совместном присутствии с НПВС. Для доксиламина и кеторолака этот метод может быть использован. При проведении анализа методом ВЭЖХ следует использовать градиентный режим, при ГХ/ЭЗД исследовании - предварительно проводить дериватизацию буторфанола.

4. При исследовании изученных соединений, выделенных из биологических жидкостей, методом ГХ/МС установлено, что в масс-спектре основания буторфанола и диклофенака с незначительной интенсивностью присутствует пик молекулярного иона m/z 327; 296, для кеторолака и доксиламина - отсутствует. Поэтому буторфанол следует идентифицировать по иону m/z 272(100%), образующемуся в результате выброса из молекулярного иона циклобутильного фрагмента, кеторолак - по иону m/z 211(100%), образующемуся в результате [М1"' -С02], доксиламин - по трем интенсивным ионам, два из которых (m/z 58(100%), 71) относятся к четвертичным аммониевым и один (m/z 182) - третичный карбкатионовый, диклофенак - по ионам m/z 279(277) - [МГ-НгО], 214(100%) и полном совпадении масс-спектров со спектрами стандартного образца и данными библиотек масс-спектров.

5. Разработаны методики количественного определения буторфанола, диклофенака, кеторолака и доксиламина с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, спектрофотометрии и для трех последних соединений - высокоэффективной денситометрии. Установлено, что методы ВЭЖХ и денситометрия позволяют одновременно проводить качественный и количественный анализ исследуемых веществ, в том числе в присутствии с наркотическими и ненаркотическими анальгетиками. Относительные погрешности определения буторфанола, диклофенака, кеторолака и доксиламина в биологических жидкостях составляют 5-10%.

6. При сравнении методов количественного определения исследуемых веществ, выделенных из биологических жидкостей, установлено, что полученные результаты близки и воспроизводимы, и эти методы могут быть использованы в БСМЭ и наркологических диспансерах с разной степенью оснащенности приборами.

7. При изучении сохраняемости исследуемых веществ в гнилостно измененных биологических жидкостях впервые установлено, что в течение 6-ти месяцев в крови и моче сохраняется соответственно 25 и 30% от первоначального количества буторфанола, 26 и 47% - диклофенака, 56 и 58% - кеторолака, 62 и 74% - доксиламина.

8. По результатам исследования разработаны общая схема и схемы для целенаправленного судебно-химического исследования биологических жидкостей на буторфанол, диклофенак, кеторолак и доксиламин, позволяющие установить или исключить факт отравления исследуемыми веществами.