Автореферат и диссертация по медицине (14.03.10) на тему:Разработка и применение ПЦР-технологий для молекулярно-генетической диагностики герпесвирусов

На правах рукописи

005009314

ЕВСЕГНЕЕВА ЖАННА ВИТАЛЬЕВНА

РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ НДР-ТЕХНОЛОГИЙ ДЛЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ГЕРПЕСВИРУСОВ

14.03Л0 - клиническая лабораторная диагностика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 0Е5 2G12

Москва-2012

005009314

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И.Пирогова Минздравсоцразвития России»

Научный руководитель:

доктор биологических наук Щербо Сергей Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Кафарская Людмила Ивановна Сапрыгин Дмитрий Борисович

Ведущая научная организация:

ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования Минздравсоцразвития России»

Защита состоится ОЛИ2012 г. часов на заседании

диссертационного совета' Д./08.072.08 при ГБОУ ВПО РНИМУ по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д.1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО РНИМУ по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1

Автореферат диссертации разослан <М» 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д.208.072.08.

доктор медицинских наук, А.К.Рылова

профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Герпесвирусная инфекция представлена группой ДНК-вирусов, широко распространенных в человеческой популяции. Наиболее существенное социальное и эпидемиологическое значение имеют вирусы простого герпеса (ВПГ); цитомегаловирус (ЦМВ) и вирус Эпштейн-Барра (ЭБВ). Существование передачи герпесвирусов от матери к ребёнку определяет одно из ведущих мест этих инфекций в перинатальной патологии и смертности [Пенкина Н.И. с соавг.,2000; Сухих Г.Т., 2003]. Как показали исследования, [Фёдорова Н.Е. и соавт.,2005], отрицательный результат обследования крови и мочи, полученный в первые дни жизни ребёнка, не исключает возможности отсроченной реализации внутриутробной инфекции, а недоношенные новорожденные дети представляют группу высокого риска по развитию цитомегаловирусной инфекции [УататоШ А.У. й а!., 2001].

Принятые способы диагностики герпесвирусной инфекции - выявление антигенов при помощи иммунохимического анализа и специфических антител различными серологическими тестами являются лишь косвенным свидетельством активности инфекционного процесса. Для понимания этиологии, выявления стадии развития процесса необходимо располагать сведениями о наличии или отсутствии герпесвирусов или их антигенов. Прямое определение вируса путем его изоляции в культуре клеток требует специальных условий и длительно по времени. Разработка и практическое применение современных молекулярно-генетических технологий для выявления и количественной оценки содержания герпесвирусов является актуальной, так как позволит оперативно провести прямое определение присутствия, оценки количества и локализации герпесвирусов в различных клинических образцах для правильной и быстрой постановки диагноза и проведения мониторинга лекарственной терапии. Из молекулярно-генетических технологий наиболее перспективными являются амплификационные методы, в частности, полиме-разная цепная реакция (ПЦР) и ее разновидности.

Цель работы - разработка и клиническая апробация молекулярно-генетических технологий для диагностики герпесвирусных инфекций и сравнительная оценка их возможностей с традиционными методами.

Задачи исследования.

1. Разработка и клиническая апробация набора реагентов мультипрай-мерной ПЦР для одновременного выявления ДНК вируса простого герпеса, цитомегаловируса и вируса Эпштейн-Барра в одной пробе.

2. Оптимизация компонентов реакции и клиническая апробация наборов реагентов для определения ДНК вируса простого герпеса и цитомегаловируса методами ПЦР in situ и ПЦР в режиме реального времени для оценки вирусной нагрузки.

3. Проведение сравнительного анализа возможностей и характеристик ПЦР технологий, иммуноферменгного и быстрого культурального методов.

4. Оценка динамики изменения маркеров цитомегаловирусной инфекции у недоношенных новорожденных детей в течение первого года жизни, находящихся в отделениях реанимации и интенсивной терапии.

5. Поиск неинвазивного клинического материала для выявления внутриутробной цитомегаловирусной инфекции у недоношенных новорожденных детей.

Научная новизна.

1. Проведена разработка, оптимизация компонентов и условий проведения реакций для мультипраймерного ПЦР, ПЦР in situ и ПЦР в режиме реального времени для диагностики герпесвирусных инфекций и последующая клиническая апробация наборов.

2. Впервые разработан и практически использован алгоритм комплексного обследования недоношенных новорожденных детей с клиническими признаками внутриутробной инфекции на основании использования молекулярно-генетических и вирусологических методов для выявления герпесвирусной инфекции.

3. Проведен сравнительный анализ разработанных молекулярно-генетических методов с традиционными, включающими иммуноферментный анализ и вирусологическое исследование быстрым культуральным методом.

4. Показаны возможности количественной оценки вирусной нагрузки методом ПЦР в режиме реального времени.

5. Проведена апробация модифицированного метода ПЦР in situ для выявления ДНК ВПГ, ДНК ЦМВ и сравнительный анализ данной модификации с быстрым культуральным методом и стандартной ПЦР.

Практическая значимость.

1. Использование быстрых, высокочувствительных и высокоспецифичных ПЦР-технологий дает возможность оперативной постановки диагноза, выявления внутриклеточной локализации инфекционного агента и количественной оценки вирусной нагрузки, что особенно важно для неонатологиче-ской и педиатрической практики.

2. Лабораторный скрининг прямых маркеров герпесвирусных инфекций недоношенных новорожденных детей предпочтительнее проводить по моче, гак как в ней вирусные частицы накапливаются в больших количествах, а получение биологического материала проводится неинвазивным способом.

3. Для постановки лабораторного диагноза внутриутробного инфицирования герпесвирусной инфекцией у недоношенных новорожденных детей и детей раннего возраста наиболее оптимальным является сочетание ПЦР и быстрого культурального методов. Серологические тесты применяются в качестве дополнительных для уточнения фазы течения заболевания.

4. Использование современных молекулярно-генетических технологий в диагностике герпесвирусных инфекций новорожденных в неонатальном периоде позволяет найти этиологическое объяснение причин врожденных дефектов и снизить смертность детей в раннем возрасте.

5. Внедрение в практику предложенного алгоритма лабораторной диагностики цитомегаловируса у недоношенных новорожденных детей позволит быстро установить диагноз и уменьшить количество осложнений.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Отечественный мультипраймерный набор для ПЦР-анализа с одновременным выявлением ДНК вирусов простого герпеса, Эпштейн-Барра и цитомегаловируса перспективен для проведения скрининговых обследований населения.

2. Метод ПЦР in situ по чувствительности не уступает стандартному ПЦР, а использование указанной технологии наиболее целесообразно для изучения патогенеза инфекции и установления внутриклеточной локализации вирусной ДНК.

3. Определение количества ДНК ВПГ и ДНК ЦМВ с использованием метода ПЦР в режиме реального времени позволяет проводить оценку вирусной нагрузки и осуществлять выбор адекватной лекарственной терапии.

4. Маркеры цитомегаловирусной инфекции у недоношенных новорожденных детей с сочетанной врожденной патологией выявляются достоверно чаще, чем у доношенных новорожденных. Проведение трехкратного вирусологического обследования на наличие цитомегаловирусной инфекции в разные сроки первого года жизни повышает эффективность диагностики.

5. Молекулярно-генетические, вирусологические и серологические методы диагностики герпесвирусных инфекций у недоношенных новорождённых детей рационально применять комплексно согласно разработанному алгоритму.

Внедрение результатов исследования.

Полученные результаты используются в работе отделения реанимации и интенсивной терапии новорожденных ГБ № 8 и ДГКБ № 13 г. Москвы. Материалы диссертационной работы включены в курс лекций и прак-

тических занятий для студентов, клинических ординаторов и интернов кафедры клинической лабораторной диагностики ФУВ ГБОУ ВПО РНИМУ, кафедры неонатологии ФУВ ГБОУ ВПО РНИМУ, аспирантов и ординаторов кафедры кожных и венерических болезней РУДН.

Апробация работы.

Апробация диссертационной работы состоялась 28 февраля 2011 года на совместном заседании кафедры клинической лабораторной диагностики ФУВ и отдела разработки лабораторных технологий ГБОУ ВПО РНИМУ.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертаций, 4 - в сборниках конгрессов и форумов. Результаты работы докладывались на 1 Национальной конференции «Нейроинфекции» с международным участием, 2007; VIII Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке», 2007; VI Российском конгрессе детских инфекционистов «Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилакти-ки у детей», 2007; na VI Российском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии», 2007; на VIII Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке; концепции болезней цивилизации», Москва, 2007; на X Всероссийском съезде дерматовенерологов, 2008; на Ежегодном конгрессе клинической вирусологии, Финляндия, 2008.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, главы с изложением результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, который включает 69 отечественных и 127 иностранных источников. Работа изложена на 118 страницах машинописного текста, иллюстрирована 14 таблицами и 20 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Работа выполнена на кафедре клинической лабораторной диагностики ФУВ ГБОУ РНИМУ (зав. кафедрой, д.б.н. С.Н.Щербо). Практическая часть работы проводилась на базе лаборатории клеточной инженерии ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН и ПЦР-лаборатории ООО «Диасан» г. Москвы. Было обследовано 337 новорожденных детей, а биологическим материалом для исследований являлись: кровь, моча, слюна, ликвор и аутоп-сийный материал.

В работе использовались следующие группы методов:

1. Методы ПЦР в различных модификациях:

• ПЦР стандартная с электрофоретической детекцией для качественного выявления ДНК вирусов проводилась с помощью коммерческих наборов ООО НПФ «Гентех».

• Мультипраймерная ПЦР для одновременного определения ДНК ВГ1Г, ДНК ЦМВ и ДНК ЭБВ. Тест-система разработана с участием автора.

• ПЦР в режиме реального времени для качественного и количественного определения ДНК ВПГ и ДНК ЦМВ. Анализы проводились с использованием разработанных с участием автора нраймеров и зондов на программируемом термостате АНК-32.

• Модифицированный метод ПЦР in situ применялся на фиксированных препаратах культур клеток и отпечатках органов аутопсийного материала с использованием программируемого термостата Thermo-cycler Т1, визуализация метки проводилась с помощью световой микроскопии.

2. Вирусологические методы:

• Быстрый культуральный метод (БКМ) для выявления вирусных частиц и оценки вирусной нагрузки проводился в соответствии с Методическими рекомендациями Роспотребнадзора №02.030-08 [Москва, 2008]. Для определения цитомегаловируса использовали диплоидные фибробласты легкого эмбриона человека, а вируса простого

герпеса - культуру клеток почек зеленой мартышки перевиваемой линии Vero. Детекцию вирусов проводили с помощью моноклональ-ных антител к белкам ВПГ и ЦМВ, полученных в НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского. Результат оценивали под люминесцентным микроскопом Olympus ВХ-51 с цифровой камерой Olympus U-CMAD3 путём подсчёта инфицированных вирусами клеток по наличию темно-коричневых зерен после проведения иммуноцитохимиче-ской реакции. 3. Иммунологические методы:

• Иммуноферментный анализ (ИФА) для определения антител к ВПГ и

ЦМВ классов lgM и IgG в сыворотке крови проводили с помощью коммерческих тест-систем НПО «Диагностические системы».

• Индекс авидности (ИА) специфических IgG антител к ВПГ и ЦМВ в

сыворотке крови определяли с помощью тест-систем НПО «Диагностические системы».

Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использованием пакета прикладных программ Statistika V6.0. Достоверными считали различия при уровне значимости (р) не больше 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Разработка и сравнительный анализ ПЦР-технологий для диагностики

герпесвирусов.

Ранее при обследовании взрослых пациентов дерматовенерологических клиник и центров г. Москвы было показано, что выявляемость герпесвирус-ных инфекций составила для ВПГ 1,2 - 11,7%, ЦМВ - 9,1 %, причем только у 25% пациентов обнаружена моноинфекция [Щербо С.Н., 2005]. В связи с широким распространением герпесвирусной инфекции и высоком проценте смешанного инфицирования актуальна разработка эффективных мультип-раймерных систем, которые позволяют одновременно определять несколько инфицирующих агентов в одной пробе биологического материала.

Наборы реагентов для определения более одного герпесвируса существуют [Zhang Y., Kimura Т., et al.,2003; Jackson R., Morris D., et al.,1996], однако стоимость коммерческих тест-систем высокая. Для создания отечественного мультипраймерного набора автором и сотрудниками НПФ «Гентех» были подобраны праймеры для ЭБВ (610 н.п.), ЦМВ (340 н.п.) и ВПГ 1,2 (220 н.п.) и оптимизированы концентрации компонентов реакционной смеси. Проведённая апробация указанного мультипраймерного набора на соскобах из цервикального канала, уретры и в моче, а также сравнительный анализ с сертифицированными наборами для определения ДНК одного вируса, показали одинаковую чувствительность (101 молекул вирусной ДНК на 1 мл) и специфичность. Мультипраймерный набор был использован для оценки сезонной выявляемое™ герпесвирусов.

Таким образом, созданный отечественный мультипраймерный диагностический набор позволяет обнаруживать в одном клиническом образце все три вируса, удешевляет, ускоряет анализ и является перспективным для скрининговых исследований по выявлению герпесвирусных инфекций.

Современная технология ПЦР в режиме реального времени, в отличие от стандартной ПЦР, позволяет не только качественно идентифицировать возбудитель, но и определять его количество (вирусную нагрузку) в более короткие сроки по сравнению с вирусологическими методами. Прямой анализ клинических образцов затруднен из-за присутствия избытка неспецифической ДНК, которая может значительно влиять на специфичность и чувствительность определения. Поэтому необходимо использовать оптимизированную методику выделения нуклеиновой кислоты, позволяющую получать высокоочищенный препарат целевой ДНК с максимальным выходом для определения ДНК исследуемых герпесвирусов. Сравнительный анализ четырех отечественных наборов для выделения ДНК из клинических образцов различной природы «ДНК-Сорб-В» (ИнтерЛабСервис); «Diatom™DNA Prep-100» (Изоген); «Magnetic DNA Prep 100» (Изоген); «Проба-НК» (ДНК-Технология) показал, что максимальный выход ДНК наблюдался при выде-

пении биоматериала набором «Проба-НК», который и использовался ь дальнейших исследованиях.

Разработаны и апробированы на клиническом материале наборы реагентов для качественного и количественного обнаружения ДНК ВПГ 1,2 и ДНК ЦМВ методом ПЦР в режиме реального времени в присутствии ДНК человека (ген b-актин) и ДНК внутреннего положительного контроля (плаз-миды р!РС2). Контроли количества ДНК гена b-актина и плазмид р1РС2 необходимы для оценки эффективности выделения ДНК из клинических образцов и исключения ложноотрицательных результатов, так как отсутствие положительной динамики изменения содержания ДНК по всем трём реакциям свидетельствует об ингибировании ПЦР. Чувствительность наборов реагентов - не менее 50 копий ДНК на 100 мкл пробы. Апробацию указанных наборов провели на клинических образцах 13 новорожденных детей с подозрением на наличие герпесвирусной инфекции. Анализ результатов показал, что ДНК ВПГ и ДНК ЦМВ была выявлена только в 5 образцах крови и 11 образцах мочи, причем содержание вирусов в моче было на несколько порядков выше, чем в крови. Полученные данные согласуются с результатами других исследователей, которые показали, что в моче ЦМВ обнаруживается в количестве в 180 раз большем, чем в крови [Halwachs-Baumann G.,Genser B.,Pailer S. etal.,2002].

Выявление вируса в количестве 1000 геномэкв./мл (или копий ДНК/мл) и более соответствовало обнаружению вируса в биоматериалах методом БКМ. Из 12 образцов, положительных по ВПГ, в 4 пробах крови и 4 пробах мочи содержание ДНК ВПГ составляло не более 100 геномэкв./мл. При наличии 10-100 геномэкв./мл вирус методом БКМ не обнаруживался (р < 0,01), что свидетельствует о более высокой чувствительности метода ПЦР в режиме реального времени при меньших временных затратах и простоте определения. Большая чувствительность ПЦР по сравнению с культуральным методом была также показана в работах других авторов [Bruisten S.M. et al., 2001; van Doornum G.J. J. et al., 2003; Wald A. et al., 2003].

Выявление ДНК ВПГ методом ПЦР in situ в клетках эякулятов.

Для установления локализации вируса применяли метод ПЦР in situ для выявления ДНК ВПГ в клетках эякулятов. Использовали фиксированные препараты клеток эякулятов от пациентов с проблемами фертильности. Детекцию клеток, зараженных вирусом, проводили по наличию темно-коричневых зерен. В качестве отрицательных контролей использовали препараты культуры клеток, не зараженные вирусом. При отработке методики для выявления ДНК ВПГ 1,2 применялись две пары различных праймеров по отдельности и одновременно. При использовании каждой пары праймеров количество клеток, содержащих метку на зараженных препаратах, было приблизительно одинаковым. Анализ был более эффективным при применении смеси из двух пар праймеров, так как наблюдалось повышение интенсивности окрашивания зараженных вирусом клеток.

Использование метода ПЦР in situ для выявления ДНК ЦМВ и ДНК ВПГ на отпечатках органов от мертворожденных детей.

Апробированный на клетках эякулятов метод ПЦР in situ был использован в Морозовской детской городской клинической больнице г. Москвы при патологоанатомических исследованиях аутопсийного материала 147 органов от 48 мертворожденных и детей, умерших на первом году жизни с подозрением на врожденную вирусную инфекцию. Для сравнения эффективности выявления ВПГ и ЦМВ методом ПЦР in situ с традиционными лабораторными методами изучали частоту обнаружения указанных герпесвирусов в одних и тех же образцах аутопсии (табл.1).

Сравнительный анализ выявления герпесвирусов в материалах аутопсии показал, что оптимальными для установления этиологического агента в данном материале являются методы, основанные на обнаружении ДНК, а ПЦР in situ обладает не меньшей чувствительностью, чем стандартный метод ПЦР. Указанная технология позволяет не только обнаружить на-

личие вируса и оценить интенсивность синтеза вирусной ДНК, но и выявить индивидуальную внутритканевую и внутриклеточную локализацию.

Таблица 1.

Сравнительный анализ выявления герпесвирусов в материалах аутопсии различными лабораторными методами

"\Методы Вирусы ПЦР ПЦР in situ Реакция иммунофлуо-ресценции БКМ

ЦМВ 28(19.0%) 34(23,1%) 11 (7,5%) 3 (2,0%)

ВПГ 29(19,7%) 35 (23,8%) 31 (21,1%) 20(13,6%)

Примечание: число исследований п=147

При анализе аутопсийного материала было обнаружено относительно низкое выявление вирусов Б КМ. Сравнение данных ПЦР и БКМ позволяет сделать вывод, что БКМ не является методом выбора при анализе аутопсийного материала, так как сохранение инфекционной активности вируса требует либо содержания аутопсийных материалов при низких температурах (-20-70 С0) до исследования, либо внесение пробы в культуру клеток в течение суток после смерти ребенка. Оба этих условия не всегда могут быть соблюдены. Кроме того, БКМ требует ведения культуры клеток, что также в условиях лабораторий практического здравоохранения затруднено. Метод ПЦР in situ сложен в исполнении, однако позволяет найти вероятное этиологическое объяснение причин младенческих и перинатальных потерь и врожденных дефектов, расширяя возможности диагностики внутриутробной инфекции.

Выявление внутриутробной герпесвирусной инфекции у новорождён!,ix

детей.

Проведен сравнительный анализ эффективности выявления прямых маркеров ВПГ и ЦМВ и выбор оптимального алгоритма обследования новорождённых детей с подозрением на внутриутробную герпесвирусную инфек-

цию. Обследовано 163 ребенка, которые родились с ноября 2006 г. по ноябрь 2007 г. В основную группу вошли 115 детей, находившихся в отделении реанимации и интенсивной терапии с подозрением на внутриутробную инфекцию (гестационный возраст: 25-40 недель). Контрольную группу составили клинически неинфицированные дети (гестационный возраст: 32-41 неделя). Результаты первичного обследования на первой неделе жизни методами ПЦР и БКМ представлены в таблице 2. ВПГ был выявлен с помощью БКМ у 37,3% детей 1-й группы (43/115) и только у 14,6% детей контрольной группы (7/48) (р-0,007); методом ПЦР ДНК ВПГ была обнаружены у 23,2% (23/99) больных детей и у 6,2% (3/48) детей 2-ой группы без подозрения на внутриутробную инфекцию (р=0,02). Методом БКМ ЦМВ среди больных детей обнаружен в 18,3% случаев (21/115), тогда как в контрольной группе ЦМВ не выявлялся ни в одном из изученных случаев (р=0,004). Методом ПЦР ДНК ЦМВ выявлена у 18% больных детей (18/100) и у 6,2% (3/48) детей контрольной группы (р=0,09). Анализ данных показал, что одновременно ВПГ и ЦМВ с помощью БКМ были обнаружены у 17 из 115 (14,8%) больных новорожденных и не были выявлены ни у одного из 48 детей контрольной группы (р=0,01). Суммарно два метода (ПЦР + БКМ) позволили обнаружить прямые маркеры вирусов в 1-й группе у 46 из 99 обследованных новорожденных детей, что составило для ВПГ 46,5%, а для ЦМВ-30%. Приведенные данные позволили сделать вывод, что применение двух методов лабораторной диагностики повышает эффективность выявления прямых маркеров исследованных герпесвирусов. Результаты анализа показали, что чаще всего ВПГ и ЦМВ были обнаружены в моче (суммарно методами БКМ + ПЦР в 45% всех изученных образцов), реже в крови - 28,5%, что согласуется с предыдущими результатами, полученными методом ПЦР в режиме реального времени. В слюне и ликворе двумя методами герпесвирусы обнаруживались реже - в 10% и 12% образцов соответственно.

Анализ распределения проб по количеству ВПГ и ЦМВ методом БКМ выявил различия между изученными вирусами. Было показано, что в 80%

проб через одну неделю после рождения детей определялось низкое количество ВПГ, соответствующее 5 вирусным частицам (в.ч.) в 1 мл, а в 20% проб - от 25 до 500 в.ч./мл. В контрольной группе у 8 из 9 детей, инфицированных ВПГ, количество вируса не превышало 5 в.ч./мл. ЦМВ методом БКМ в большинстве положительных проб (60%) выявлялся в количестве более 50 в.ч./мл, и лишь в единичных случаях - 35000-50000 в.ч./мл.

Таблица 2.

Выявление прямых маркеров ВПГ и ЦМВ у новорожденных с подозрением

на внутриутробную инфекцию при первичном обследовании

Группы детей ПЦР (ДНК вирусов) БКМ (вирусные частицы)

ВПГ ЦМВ ВПГ ЦМВ

Группа-1 (основная) 23/99 18/100 43/115 21/115

п=115 (23,2%) (18%) (37,3%) (18,3%)

Группа-2 (контрольная) 3/48 3/48 7/48 0

п=48 (6,2%) (6,2%) (14,6%) (0%)

Примечание: п - количество обследованных детей; различия в частоте выявления прямых маркеров вируса в основной группе детей по сравнению с контрольной считали статистически значимыми при р<0,05.

Дополнительно у детей обеих групп при рождении определяли параметры гуморального иммунитета: наличие специфических антител (AT) классов IgM и IgG к ВПГ и ЦМВ и авидность IgG-AT (рис.1).

К вирусу простого герпеса были обнаружены только IgG-AT, причем в 93,7% высокой авидности. Низкоавидные IgG-AT к ВПГ были обнаружены только у 5 (4,3%) детей первой группы. К ЦМВ IgM-антитела были выявлены у 5 (4,5%) детей основной группы, что сочеталось с высоким содержанием вируса (>50 в.ч./мл). Низкоавидные IgG-антитела к ЦМВ встречались в 5 раз чаще (21/115, 18,3%), чем к ВПГ, и более половины таких детей (12/21; 57,1%) имели высокую нагрузку цигомегаловирусом. У большинства детей отсутствие антител класса IgG или присутствие низкоавидных IgG-антител

совпадало с обнаружением вируса БКМ в количестве более 5-10 в.ч./мл и наличием ДНК ЦМВ в клинических образцах.

А Б

1. 93,7% ^Ст-АТ высокой авидности к ВПГ 1. 71,7% ^С-АТ высокой авидности к ЦМВ

2. 4,3% ^О-АТ низкой авидности к ВПГ 2. 18,3% ^О-АТ низкой авидности к ЦМВ

3. 2,0% отсутствие ^в-АТ к ВПГ 3. 10% отсутствие ^О-АТ к ЦМВ

Рис. 1. Частота выявления противовирусных антител и их авидность в крови новорожденных детей при рождении: А - к ВПГ; Б - к ЦМВ.

Обследование детей в динамике через 1-3 месяца после рождения показало, что только у 14% детей ВПГ и у 11% детей ЦМВ были выявлены повторно. В то же время у значительной части детей, инфицированных на 1-й неделе жизни, ВПГ и ЦМВ обнаружены не были (у 53% детей - ВПГ и у 46% - ЦМВ), что может быть следствием проведения комплексной терапии. Однако у части детей, отрицательных по обоим вирусам на 1-й неделе жизни, через 1-3 месяца ВПГ и ЦМВ были выявлены впервые (в 33% и 35% случаев соответственно). К 4-7 месяцу жизни ВПГ не был обнаружен ни в одном из изученных материалов, а ЦМВ через 6 месяцев выявлялся у 8 из 37 (22%) детей, обследованных в динамике.

Таким образом, обследование новорожденных детей с подозрением на внутриутробную инфекцию ВПГ и ЦМВ необходимо проводить неоднократно в течение первого года жизни. Учитывая, что ВПГ у всех обследованных детей элиминировал к 4-7 месяцам жизни, а ЦМВ через 6 месяцев выявлялся у 22% недоношенных новорожденных детей, следующим этапом работы явилась разработка рекомендаций по лабораторному обследованию недоношенных новорожденных детей с подозрением на внутриутробную ЦМВ - инфекцию. Недоношенные новорожденные дети представляют группу высокого

риска по развитию цитомегаловирусной инфекции (ЦМВИ) [Yamamoto A.Y., Mussi-Pinhata М.М., Cristina Р. et al.,2001].

С этой целью было обследовано 174 новорожденных ребенка (в период с 2007 по 2009 гг.), у 124 из которых имелись признаки внутриутробной инфекции. Всего было исследовано 569 клинических образцов (мочи - 235, крови - 195, слюны - 78 и ликвора - 61), причем ребенка считали инфицированным, если ЦМВ был обнаружен хотя бы в одном из полученных от него клинических образцов. В результате анализа было установлено, что наиболее часто ЦМВ методом БКМ выявлялся в моче - в 34/235 (14,5%) проб, реже в слюне - в 8/78 (10,3%) проб. В крови и ликворе вирус обнаруживался редко -в 1% (2/195) и 3,3% (2/61) соответственно. ДНК ЦМВ методом ПЦР также чаще обнаруживалась в моче (18,7%) и реже в крови (13,3%). Частота выявления ДНК вируса в слюне составила 11,5%, в ликворе - 8,2%. ДНК ЦМВ в образцах обнаруживалась чаще, чем вирусные частицы БКМ, так как всего положительных образцов методом БКМ было выявлено 46 из 569 (8,1%), а методом ПЦР - 75 из 569 (13,2%) (р=0,0052).

В 91,4% исследованных образцов наблюдалось совпадение данных, полученных двумя методами (преимущественно отрицательных результатов). Результаты анализов не совпали при исследовании 49 клинических образцов, причем выявление ДНК ЦМВ методом ПЦР было выше, чем вирусных частиц методом БКМ (табл.3).

Таблица 3.

Совпадение и несовпадение результатов, полученных методами ПЦР и БКМ,

при выявлении ЦМВ в клинических образцах

Образцы количество Совпадение Несовпадение

БКМ+, ПЦР+ БКМ-, ПЦР- БКМ+, ПЦР- БКМ- ПЦР+

Всего 569 36 (6,3%) 484 (85,1%) 10(1,8%) 39 (6,8%)

По разделам Итого 520 (91,4%) Итого 49 (8,6%)

Для дальнейшего обследования и анализа полученных результатов дети были разделены на 4 группы (табл. 4).

Таблица 4.

Количество, гестационный возраст и наличие признаков внутриутробной ин-

фекции обследованных групп детей

Группа, количество детей Гестационный возраст (недели и в среднем) Признаки внутриутробной инфекции

1 основная, 107 ННД 25 - 36 (29,8±2,8) Есть

2 сравнения, 18 ННД 32 - 37 (34,6±1,2) Нет

3 контрольная, 32 ребенка 38 -41 (38,9±0,8) Нет

4 дополнительная, 17 детей (возраст 1-3 месяца) - Есть

Примечание: ННД - недоношенные новорожденные дети

В первую группу были включены недоношенные новорожденные дети с клиническими признаками внутриутробной инфекции, во вторую - недоношенные дети без признаков инфекции, в третью - доношенные дети без признаков инфекции. Дети, вошедшие в 1-ю, 2-ю и 3-ю группы, были первично обследованы на первой неделе жизни. Дополнительную 4-ую группу составили дети, поступившие в ДГКБ № 13 в возрасте 1-3 месяца, когда и были первично обследованы на наличие ЦМВ. Наличие ЦМВ методом БКМ было выявлено у 16,8% детей 1-й группы и 29,4% 4-й группы при первичном обследовании в возрасте 1-3 месяца (табл. 5). ДНК ЦМВ методом ПЦР была обнаружена у детей всех четырех групп, но чаще в 1-ой и 4-ой группах. Расхождения в результатах ПЦР и БКМ могут быть следствием более высокой чувствительности ПЦР и/или высокой прогностической значимости БКМ [Воронцова Ю.Н. и соавт.,2004]. С одновременным использованием двух методов - ПЦР и БКМ, в 1-й группе детей прямые маркеры ЦМВ выявлялись у большего количества новорожденных (28/107, 26,2%) по сравнению с использованием одного из методов.

Обнаружение прямых маркеров ЦМВ у ребенка в течение первых 3 недель жизни свидетельствует о внутриутробном инфицировании от матери к ребенку [Ъаг/агойо Т. с! а1.,2008]. Количество вируса во всех образцах детей первой группы не превышало 5-15 в.ч./мл, кроме одного образца мочи (70000 в.ч./мл). В то же время у детей 4-ой группы во всех положительных пробах был выявлен ЦМВ в количестве от 500 до 7500 в.ч./мл пробы. Выделение вируса после 3-й недели жизни ребенка может отражать как врожденную, так и постнатальную инфекцию [вгага А. й а1.,2004]. Следовательно, для детей 4-ой группы инфицирование могло произойти как внутриутробно, так и после рождения.

Таблица 5.

Выявление прямых маркеров ЦМВ у детей по группам при первичном обсле-

довании

Группы детей ДНК ЦМВ (ПЦР) Вирусные частицы ЦМВ (БКМ)

1-я (основная) 15,9% (17/107) 16,8% (18/107)

2-я (сравнения) 5,6% (1/18) 0% (0/18)

3-я (контрольная) 6,3% (2/32) 0% (0/32)

4-я (дополнительная) 47,1% (8/17) 29,4% (5/17)

Для изучения динамики выявления прямых маркеров ЦМВ у 26 детей из первой группы, клинические образцы были проанализированы двумя методами (ПЦР+БКМ) трижды: на 1-й неделе жизни, через 1-3 и 5-7 месяцев после рождения. На 1-й неделе жизни прямые маркеры ЦМВ были обнаружены у 9 из 26 детей (34,6%). При повторном обследовании через 1-3 месяца после рождения у 7 из 9 первично инфицированных детей вирус обнаружен не был, и только у 2 детей ЦМВ был выявлен повторно. Возможно, отсутствие ЦМВ являлось результатом сочетанного действия терапии и активации собственного иммунитета. У 5 из 17 детей, отрицательных по маркерам вируса на 1-й неделе жизни, через 1-3 месяца ЦМВ был обнаружен впервые, причем у 3 из 5 детей вирусная нагрузка была высокой: 1000-200000 в.ч./мл БКМ и 2,3x104 - 6,3x106 геномэкв./мл ПЦР в режиме реального времени. У 2

из 5 детей была выявлена только ДНК ЦМВ в количестве 10 и 100 гено-мэкв./мл.

Всего в возрасте 1-3 месяцев у 7 из 26 детей были определены прямые маркеры ЦМВ, и данный показатель был близок к частоте выявления прямых маркеров БКМ у детей 4-й группы при их первичном обследовании в таком же возрасте. Выявление ЦМВ через 1-3 месяца может быть как отсроченным проявлением внутриутробной бессимптомной инфекции, так и инфицированием уже в неонатальном периоде. Обследование детей через 5-7 месяцев после рождения показало, что у 1 из 7 детей, у которых в возрасте 1-3 месяцев выявлялись прямые маркеры ЦМВ, вирус не был обнаружен. У 6 детей вирус продолжал определяться. Еще у 3 детей на этом сроке впервые появились прямые маркеры ЦМВ. В целом на первом году жизни у 17 из 26 детей (65,4%) в клиническом материале присутствовал ЦМВ.

Для определения стадии заболевания и необходимости назначения лекарственной терапии были изучены показатели специфического гуморального иммунитета (табл. 6).

Таблица 6.

Результаты обследования новорожденных детей на цитомегаловирусную ин-

фекцию серологическими методами при первичном обследовании

Группы детей Выявление Отсутствие Авидность

анти-ЦМВ- анти-ЦМВ- анти-ЦМВ-ДО-АТ

^М-АТ 1цС5 -АТ ИА ИА

- <0,6 >0,6

1 (основная) 1,1% (1/93) 9,7% (9/93) 38,6%(32/83) 61,4%(51/83)

2 (сравнения) 0% (0/18) 16,7%(3/18) 33,3%(5/15) 66,7%(10/15)

3 (контрольная) 0% (0/32) 9,4% (3/32) 13,8%(4/29) 86,2%(25/29)

4 (дополнительная) 23,5%(4/17) 5,9% (1/17) 13,3%(2/15) 66,7%(10/15)

Примечание: 1уМ, ] уО — иммуноглобулины М и С, АТ - антитела, И А - индекс авидности.

Маркеры острого инфекционного процесса (анти-ЦМВ-lgM-AT) были идентифицированы у одного ребёнка 1-й группы и у 4/17 детей 4-й группы (возраст 1-3 месяца). У детей с анти-ЦМВ-lgM-AT отсутствовали анти-ЦМВ-IgG-AT и были выявлены прямые маркеры ЦМВ, что свидетельствовало об активном инфекционном процессе, инкубационный период которого колеблется до 3-х месяцев. Антитела к ЦМВ класса IgG присутствовали у 90,3% и отсутствовали у 9,7% детей 1-ой группы. Оценка авидности (прочности связи антигена с антителом) IgG-AT показала, что в 38,6% детей 1-ой группы индекс авидности (ИА) был представлен низким или промежуточным значением (<0,6), что наиболее характерно для первичного иммунного ответа, а у 61,4% - высоким значением (>0,6), что свидетельствует о ранее перенесенной инфекции. Было установлено, что у 65,4% детей с внутриутробной инфекцией, в крови которых IgG-AT отсутствовали, либо имели низкую авид-ность (<0,6), были выявлены прямые маркеры вируса. У остальных 34,6% детей, имеющих прямые маркеры ЦМВ, в крови присутствовали только высо-коавидные IgG. Возможно, что для проявления активности ЦМВ у недоношенных детей важную роль играет не только наличие и авидность IgG-AT, содержащихся в сыворотке ребенка, но и нейтрализующие свойства IgG-AT. У недоношенных новорожденных детей доля антител, обладающих нейтрализующими свойствами, зависит от гестационного возраста. Ранее было показано, что 99% нейтрализующих материнских антител обнаруживаются в периферической крови плода только к 34-й неделе гестации [Karen B.Fowler,Robert F. Et al., 2006]. В группе детей без внутриутробной инфекции соотношение IgG-AT высокой и низкой авидности приблизительно соответствовало таковому для группы недоношенных новорожденных детей с внутриутробной инфекцией, однако анти-ЦМВ-lgM-AT обнаружено не было. В группе доношенных новорожденных детей без признаков внутриутробной инфекции маркеры острого инфекционного процесса также отсутствовали, и доля детей с низкоавидными анти-ЦМВ-IgG-AT была достоверно ниже -13,8%. Высокоавидные анти-ЦМВ-IgG-AT преобладали в 86,2% случаев.

Выявление антител классов 1^М и к ЦМВ, оценка авидности [цС-антител позволяет установить стадию инфекционного процесса и необходимость проведения лекарственной терапии. При наличии высокоавидных антител к ЦМВ у большинства обследованных детей прямые маркеры цитоме-галовируеной инфекции не выявлялись. Отсутствие антител к ЦМВ или присутствие низкоавидных 1§0-антител ассоциируются с появлением прямых маркеров ЦМВ через 1-6 месяцев после рождения. Таким образом, оценка авидности антител имеет прогностическое значение.

На основании полученных данных предлагается следующий алгоритм лабораторного обследования недоношенных новорожденных детей с подозрением на внутриутробную цитомегаловирусную инфекцию: •Анализ мочи на наличие прямых маркеров ЦМВ на 1-й неделе жизни двумя методами (БКМ+ПЦР).

•Исследование клинического материала на наличие прямых маркеров ЦМВ в динамике через 1-3 и 6-7 месяцев после рождения для установления возможной реактивации вируса.

•Оценка вирусной нагрузки: обнаружение в биологическом материале вируса БКМ в количестве более 5-10 в.ч./мл и/или ДНК вируса более 1000 гено-мэкв./мл методом ПЦР в режиме реального времени является одним из оснований для проведения лекарственной терапии.

•Использование серологических тестов (определение наличия ^М и ^О антител, авидности ^О антител) в качестве дополнительных для определения стадии инфекционного процесса.

ВЫВОДЫ:

1. Разработан и клинически апробирован мультипраймерный набор для одновременного определения ДНК вирусов простого герпеса, цитомегалови-руса и вируса Эпштейн-Барра, который может быть использован для проведения скринннговых исследований.

2. Апробация оптимизированных наборов реагентов для определения ДНК вируса простого герпеса и цитомегаловируса методами ПЦР in situ и ПЦР в режиме реального времени показала эффективность указанных технологий для оценки локализации вирусов и вирусной нагрузки в различных клинических образцах.

3. Для выявления прямых маркеров вируса оптимально одновременное использование ПЦР и быстрого культурального метода, а серологические маркеры необходимы в качестве дополнительных тестов для определения стадии инфекционного процесса.

4. Исследование динамики появления прямых и серологических маркеров цитомегаловирусной инфекции у недоношенных новорожденных детей с клиническими признаками внутриутробной инфекции показало необходимость проведения трехкратного обследования в течение первого года жизни.

5. Предпочтительным неинвазивным клиническим материалом для диагностики внутриутробной цитомегаловирусной инфекции является моча, в которой вирус накапливается в больших количествах, чем в других биологических пробах.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. Для проведения скрининговых исследований оптимально использовать мультипраймерный набор для одновременного определения ДНК вирусов простого герпеса, цитомегаловируса и вируса Эпштейн-Барра, что ускорит проведение анализа и снизит его себестоимость.

2. Для диагностики внутриутробной герпесвирусной инфекции у недоношенных новорожденных детей рекомендуется применять одновременно быстрый культуральный метод и ПЦР.

3. Для выявления прямых маркеров герпесвирусов у новорожденных детей рационально использовать мочу, так как в ней вирус содержится чаще, накапливается в больших количествах, и биологический материал является неинвазивным.

4. Рекомендуется трехкратное обследование недоношенных детей с клиническими признаками внутриутробной инфекции на наличие цитомега-ловируса: на первой неделе жизни, через 1-3 месяца и 4-7 месяцев после рождения из-за длительной персистенции вируса и возможной реактивации инфекции.

5.Показано проведение серологического обследования на наличие специфических IgM и IgG антител с оценкой авидности IgG-антител, которая имеет прогностическое значение, так как присутствие низкоавидных антител класса IgG к цитомегаловирусу сочетается с появлением прямых маркеров цитомегаловируса через 1 -6 месяцев после рождения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Адиева A.A., Гаджиева М.В., Павлова Е.Г., Гетия Е.Г., Володин H.H., Евсегнеева Ж.В., Щербо С.Н., Выжлова E.H., Климова P.P., Федорова Н.Е., Васильев А.Н., Дегтярева М.В., Малиновская В.В., Кущ A.A. Динамика маркеров герпесвирусных инфекций у недоношенных новорожденных детей в отделениях реанимации и интенсивной терапии.// Журнал «Педиатрия», 2008, том 87,№ 3,143-144.

2. Ю.С.Аляпкина, Д.А.Варламов, Ю.П.Пашко, Я.И.Алексеев, Ж.В. Евсегнеева, О.Н.Филатова, И.В.Щербо. Разработка и апробация тест-систем «CMV-РВ-КОЛИЧЕСТВО» и «HSV1,2-РВ-КОЛИЧЕСТВО» для выявления и количественного определения герпесвирусов в клиническом материале методом ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ). /Журнал «Клиническая лабораторная диагностика» 2008, № 9,42.

3. Гаджиева З.С., Павлова М.В., Климова P.P., Федорова Н.Е., Щербо С.Н., Евсегнеева Ж.В., Гущин B.C., Выжлова E.H., Малиновская В.В., Кущ А.А, Гетия Е.Г., Деггярева М.В. Выявление маркеров герпесвирусных инфекций у недоношенных новорожденных детей. VI Конгресс детских инфекционистов России "Актуальные вопросы инфекционной патологии и вак-цинопрофилактики", 13-14 декабрь, Москва - 2007, 18-19.

4. Евсегнеева Ж.В., Щербо С. Н., Тогузов Р. Т. Разработка и применение ПЦР-технологий для генодиагностики герпесвирусных инфекций. //Журнал «Клиническая лабораторная диагностика», 2007, №9,38.

5. Павлова М.В., Федорова Н.Е., Гаджиева З.С., Евсегнеева Ж.В., Щербо С.Н., Гетия Е.Г., Солдатова И.Г., Дегтярева М.В., Володин Н.Н., Малиновская В.В., Кущ А.А. Алгоритм вирусологического лабораторного обследования недоношенных новорожденных детей с врожденной цитоме-галовирусной инфекцией в течение первого года жизни и влияние терапии Вифероном на исход внутриутробной инфекции. // Журнал «Педиатрия», 2009, Т.87, № 2, 55-62.

6. Павлова М.В., Федорова Н.Е., Гаджиева З.С., Гетия Е.Г., Дегтярева М.В., Щербо С.Н., Евсегнеева Ж.В., Гущин B.C., Выжлова Е.Н., Малиновская В.В., Кущ А.А. Цитомегаловирусная инфекция у недоношенных новорожденных детей: количественные методы лабораторного анализа. VIII Международный конгресс "Здоровье и образование в XXI веке; концепции болезней цивилизации", 14-17 ноябрь, РУДН, Москва - 2007, 473-474.

7. Щербо С.Н., Евсегнеева Ж.В., Мандрыкина Н.Е., Тогузов Р.Т. Генодиагностика герпесвирусных инфекций. Аннотированные доклады Первой Национальной конференции с международным участием «Нейроинфекции», 2007,161-163.

8. Pavlova М., Fedorova N., Adieva F„ Gadzhieva , Z., Kushch A., Getiya E., Degtyareva M., Malinovskaya V., Shcherbo S., Evsegneeva Zh. Quantitative methods of analysis of cytomegalovirus infection in preterm infants during the 6 months, ESCV 2008, Clinical Virology Annual Meeting Saariselka, Lapland, Finland 12-15 March 2008, 28.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ:

АТ - антитела

БКМ- быстрый культуральный метод

ВПГ 1,2 - вирус простого герпеса 1 и 2 типа

в.ч. - вирусные частицы

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИА - индекс авидности антител

н.п. - пары нуклеотидов (нуклеотидные пары)

НЦР - - полимеразная цепная реакция

ЦМВ - цитомегаловирус

ЭБВ - вирус Эпштейн-Барра

Подписано в печать 23 января 2012 г.

Формат 60x90/16

Объём 1,5 пл.

Тираж 50 экз.

Заказ № 170112413

Оттиражировано на ризографе в ООО «УниверПринт»

ИНН/КПП 7728572912\772801001

Адрес: г. Москва, улица Ивана Бабушкина, д. 19/1.

Тел. 740-76-47,989-15-83.

http://www.univerprint.ru