Автореферат и диссертация по медицине (14.00.09) на тему:Дифференцированный подход к ведению недоношенных детей с перинатальной цитомегаловирусной инфекцией

На правах рукописи

Воронцова Юлия Николаевна

ДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫЙ ПОДХОД К ВЕДЕНИЮ НЕДОНОШЕННЫХ ДЕТЕЙ С ПЕРИНАТАЛЬНОЙ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ

14.00.09.-Педиатрия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 2005

Работа выполнена в Российском государственном медицинском университете

Научный руководитель:

Академик РАМН, д.м.н., профессор Н.Н.Володин Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук Е.Н.Байбарина

Доктор медицинских наук В.М.Делягин

Ведущее учреждение: Московский научно-исследовательский институт педиатрии и детской хирургии МЗ РФ

Защита состоится «_»_2005 г. в час

На заседании диссертационного совета Д.208.050.01.ГУ в НИИ детской гематологии МЗ РФ (117513, Москва, Ленинский проспект, 117, корпус 1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ детской гематологии МЗ РФ и библиотеке РГМУ МЗ РФ (117869, Москва, ул. Островитянова, 1)

Автореферат разослан «_»_2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

В.М.Чернов

Актуальность. Последние пятнадцать лет характеризуются интенсивным развитием перинатальной медицины, усовершенствованием существующих диагностических и лечебных методов и интенсивным внедрением в практику новых, высокоэффективных технологий выхаживания новорождённых детей. Это позволило снизить показатели младенческой смертности в Российской Федерации за период 1998-2003 г на 27% (Володин Н.Н., 2004).

Вместе с тем, одной из наиболее частых причин как антенатальной, так и перинатальной заболеваемости и смертности в нашей стране остаются внутриутробные инфекции. ЦМВИ одна из наиболее часто диагностируемых внутриутробных инфекций, которая встречается у 0,5-2,5% новорожденных детей (ВагЫ М. at aL, 2003; Gaytant M.A. at al., 2002). Высокая частота внутриутробного инфицирования вирусом цитомегалии обусловлена целым рядом факторов, основными из которых являются эпидемиологические особенности заболевания, а также особенности иммунитета у беременных женщин, плодов и новорожденных. Внутриутробное поражение плода чаще происходит при первичном инфицировании женщин во время беременности, в этом случае передача вируса происходит более чем в 50% (Demmler G.J. 1991). При реактивации и вторичной ЦМВИ в период беременности частота передачи вируса плодам составляет менее 2% (Fowler K.B., at aL, 2003). Несмотря на значительное количество клинико-лабораторных исследований, многие аспекты ЦМВИ у новорожденных остаются еще недостаточно изученными. Полиморфизм клинической картины у недошенных новорожденных с сочетанной перинатальной патологией создает трудности ранней диагностики внутриутробной ЦМВИ. Среди всех известных внутриутробных инфекций именно ЦМВИ является ведущей причиной поражения головного мозга и потери слуха у новорожденных (Gaytant M.A., at aL 2002; Barbi M., at aL, 2003; Malinger G., at aL, 2003). Поэтому разработка своевременных подходов диагностики ЦМВИ у новорожденных и детей раннего возраста является важной задачей медицинской науки, имеющей не только научный, но и практический интерес.

В настоящее время для диагностики ЦМВИ, наряду с анализом клинических данных, используются лабораторные методы, включающие не только верификацию этиологического агента (идентификация самого вируса, его генома или антигенов) и обнаружение серологических маркеров иммунного ответа (специфических антител), но и определение остроты инфекционного процесса (изучение активности репликации вируса и раздельное определение анти-ЦМВ-АТ классов IgM и IgG с их авидностью). Однако эффективность и информативность указанных методов при диагностике неонатальной формы ЦМВИ неодинаковы.

Несмотря на многочисленные исследования, посвященные этой проблеме, до настоящего времени нет четких рекомендаций по алгоритму диагностики ЦМВИ у недоношенных новорожденных с сочетанной перинатальной патологией. Это и явилось основанием для проведения нашего исследования.

Цель исследования: выработать клинико-лабораторные критерии цитомегаловирусной инфекции у недоношенных новорожденных с сочетанной перинатальной патологией, в том числе родившихся с низкой и экстремально низкой массой тела.

Задачи исследования:

1. Определить частоту внутриутробного инфицирования цитомегаловирусом и факторы, способствующие реализации патологического процесса у недоношенных детей в зависимости от гестационного возраста.

2. Определить клинические особенности течения раннего неонатального периода у инфицированных цитомегаловирусом детей, родившихся с низкой и экстремально низкой массой тела.

3. Установить степень влияния цитомегаловирусного инфицирования на течение неонатального периода.

4. Определить подходы к повышению информативности лабораторных показателей при диагностике цитомегаловирусной инфекции у недоношенных детей, родившихся с низкой и экстремально низкой массой тела.

Научная новизна. Впервые при выпо лнении исследования использован комплексный подход лабораторной диагностики: вирусологический метод (его модификация быстрый культуральный метод), метод ферментной амплификации (полимеразная цепная реакция), серологические методы: иммуноферментный анализ, определение индекса авидности специфических антител, иммуноблотинг.

Путем комплексного лабораторного обследования показано, что частота внутриутробного инфицирования цитомегаловирусом недоношенных новорожденных с сочетанной перинатальной патологией составляет 47%.

Продемонстрировано, что частота выявления цитомегаловирусной инфекции у недоношенных новорожденных быстрым культуральным методом и методом полимеразной цепной реакции более чем в 10 раз выше, чем методом иммуноферментного анализа с количественным определением анти-цитомегаловирусных-антител классов М и О; и почти в 2 раза выше; чем при иммуноферментном анализе с определением авидности антител.

Установлено, что у 27% недоношенных детей с лабораторно подтвержденной цитомегаловирусной инфекцией при рождении клиническая картина характеризовалась

генерализованной формой инфекционного заболевания, у 40% как внутриутробная пневмония с выраженным интгрстициальным компонентом. В 8% случаев внутриутробная цитомегаловирусная инфекция протекала под «маской» синдрома дыхательных расстройств (болезнь гиалиновых мембран), в 25% - гипоксически-геморрагического поражения центральной нервной системы.

Выявлена взаимосвязь между фактом внутриутробной цитомегаловирусной инфекцией и вероятностью развития хронического заболевания легких (бронхо-легочной дисплазии) у недоношенных детей.

Практическая значимость. На основании полученных данных о распространенности цитомегаловирусного инфицирования среди недоношенных детей с сочетанной перинатальной патологией представлено обоснование для организации лабораторного скрининга в отделениях реанимации и интенсивной терапии.

Доказана необходимость использования двух методов лабораторной диагностики: быстрого культурального метода и метода полимеразной цепной реакции, а также исследование двух биологических жидкостей - крови и мочи, в динамике.

Серологические методы диагностики у недоношенных детей, родившихся с низкой и экстремально низкой массой тела, рекомендованы для уточнения фазы течения инфекции.

У недоношенных детей, родившихся с низкой и экстремально низкой массой тела, с клиническими проявлениями генерализованной инфекционной болезни, пневмонией, учитывая высокий риск развития хронического заболевания легких, в раннем неонатальном периоде обосновано использование иммуноглобулинов для внутривенного введения, содержащие высокие титры специфических антител.

Внедрение в практику. Практические рекомендации использованы в работе отделения реанимации и интенсивной терапии новорожденных ГБ №8 КЗ г.Москвы.

Апробация работы. Основные положения диссертации обсуждены на совместной научно-практической конференции кафедры неонатологии ФУВ РГМУ, кафедры детских болезней №2 педиатрического факультета РГМУ и сотрудников детской клинической больницы №13 им. Н.Ф. Филатова г.Москвы (14 мая 2004 года).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ.

Материалы и методы исследования. Работа выполнена на кафедре неонатологии ФУВ (заведующий кафедрой - академик РАМН, профессор Н.Н.Володин) РГМУ (ректор -академик РАМН, профессор В.Н. Ярыгин) за период с сентября 2001 года по октябрь 2003 года.

Комплексное обследование новорожденных детей проводилось на базе ОРИТ 8ГБ Департамента Здравоохранения города Москвы (главный врач - к.м.н. Н.Н.Николаев).

Иммунологические и вирусологические исследования были выполнены в лаборатории клеточной инженерии института вирусологии РАМН им. Д.И.Ивановского (зав. лабораторией доктор биологических наук, профессор А.А.Кущ). ПЦР диагностика в количественном и качественном варианте проводилась с помощью сертифицированных коммерческих наборов Медицинского центра "Авиценна" (Москва, Россия), а также в качественном варианте - с помощью коммерческих наборов ЗАО «Внедрение систем в медицину».

Всего под наблюдением находилось 103 ребенка от 97 матерей (1 тройня и 4 двойни).

Все дети родились недоношенными из группы высокого риска по развитию инфекционных заболеваний в раннем неонатальном периоде, и получали лечение в условиях ОРИТ. Не смотря на проводимую терапию, 12 детей из группы наблюдения умерли (11,7%). В случае смерти новорожденных патологоанатомическое исследование проводилось в прозектуре патологоанатомического отделения Морозовской ДКБ (зав.отд. Л.Н.Каск). На основании результатов гистологического исследования анализировались макро- и микроскопические изменения головного мозга, легких, сердца, печени, почек, поджелудочной железы, тимуса.

Показаниями для обследования на внутриутробную ЦМВИ явилось сочетание следующих факторов:

1. Анамнестических: дети от женщин, имеющих в анамнезе носительство ЦМВ и/или ВПГ, с обострением во время течения настоящей беременности, перенесенными ОРЗ с повышением температуры (или без) во время беременности; дети от женщин, перенесших в период беременности мононуклеозоподобные заболевания при отсутствии лабораторного подтверждения; дети от женщин с отягощенным акушерско-гинекологическим анамнезом (выкидыши, мертворождения и т.д.).

2. Клинических: недоношенные дети с экстремально низкой массой тела; новорожденные с клиникой поражения ЦНС (очаговая неврологическая симптоматика, судорожный синдром, кома, гидроцефалия, а также нейросонографические находки-кисты, гиперэхогенные включения); дети с проявлениями тяжелого токсикоза, гепатоспленомегалией, геморрагическим синдромом, анемией, тромбоцитопенией, гипербилирубинемией, с отрицательными результатами повторного микробиологического исследования крови, эндотрахеального аспирата.

В качестве исследуемого материала использовались венозная кровь, моча, а также аутопсийный метериал. Забор и хранение биологического материала осуществлялись в соответствии с условиями, необходимыми для сохранения инфекционной активности вируса.

Для диагностики цитомегаловирусной инфекции использованы следующие методы:

1. Быстрый культуральный метод (БКМ). С помощью быстрого культурального метода выявлялась инфекционная активность ЦМВ в крови и в моче детей. Данное исследование проводилось в лаборатории клеточной инженерии института вирусологии РАМН им. Д.И.Ивановского (зав. лабораторией доктор биологических наук, профессор ААКущ). Использовали два варианта БКМ: в стандартной постановке и количественный вариант метода. Стандартный вариант БКМ В культуру клеток фибробластов эмбриона человека (ФЭЧ) вносили на 1-2 часа материал, полученный от больных детей: 0,2 мл осадка мочи или лейкоцитарную фракцию крови, полученных после центрифугирования в течение 10 мин. при 1 000 об./мин. Затем фибробласты инкубировали в течение 3 суток при температуре 37° С. Далее клетки фиксировали охлажденным ацетоном (+4°С) в течение 10 мин. и выявляли антигены ЦМВ с использованием смеси моноклональных антител к сверхраннему (Шр72) и раннему (рр65) белкам вируса. Вторыми антителами служили антимышиные антитела, коньюгированные с флюорохромом FITC (Sigma, США). Количественный вариант БКМ. Клетки ФЭЧ высаживали в 24-луночные планшеты в концентрации 250 тыс. клеток в 1 мл Через 48 часов культивирования вносили образцы осадка мочи или лейкоцитарной фракции крови, приготовленных как указано выше, и проводили центрифугирование в течение 30 мин. при 2 500 об./мин. Фибробласты инкубировали в течение 24 часов, затем фиксировали охлажденным метанолом (-20° С) 20 мин.. Детекцию ЦМВ-инфицированных клеток проводили с помощью антител к Шр72 и рр65 ЦМВ. Выявляющими антителами служили антимышиные антитела, коньюгированные пероксидазой хрена (DAKO, Швеция). Затем проводили подсчет окрашенных клеток на препарате, содержащем 2,5 х 103 фибробластов. БКМ было обследовано 89 детей.

2. Полимеразная цепная реакция (ПНР). ДНК ЦМВ в количественном и качественном варианте выявляли с помощью сертифицированных коммерческих наборов Медицинского центра "Авиценна" (Москва, Россия), а также в качественном варианте - с помощью коммерческих наборов ЗАО «Внедрение систем в медицину». Методом ПЦР было обследовано 82 ребенка.

3. Определение антител к ЦМВ. Антитела (AT) классов М и G в сыворотке крови (анти-ЦМВ) выявляли методом твердофазного иммуноферментного анализа (тИФА), используя коммерческие наборы фирмы "Biomerieux" (Франция). Оценку результатов осуществляли согласно рекомендациям фирмы-производителя.

4. Иммуноблотинг. Спектр анти-ЦМВ IgM и IgG определяли в реакции иммуноблота, используя коммерческую тест-систему фирмы "Enclit" (Германия) согласно инструкции фирмы-производителя.

5. Авидность антител. Индекс авидности (ИА) специфических IgG определяли с помощью тест-системы VIDAS CMV IgG Avidity (bioMerieux, Франция). В соответствии с рекомендацией фирмы значение ИА ниже 0,3 рассматривали как указание на первичное инфицирование ЦМВ, которое произошло не позднее 3-х месяцев к моменту обследования. Значение ИА в пределах 0,3 - 0,6 означало, что с момента инфицирования прошло от 3 до 6 месяцев. Обнаружение ИА более 0,7 исключало недавнюю первичную инфекцию, по крайней мере, в течение предшествующих 6-ти месяцев к моменту обследования.

По результатам клинико-лабораторного и патоморфологического исследования на ЦМВИ дети были разделены на две группы: первую группу составили 48 детей, которые родились от женщин из группы риска по внутриутробному инфицированию и у которых диагноз ЦМВИ был подтвержден гкЬнико-лабораторно; вторую группу - 55 детей, у которых данные анамнеза матери, данные динамики клиники при рождении и неонатального периода позволяли выделить их в группу риска по развитию ЦМВИ, однако результаты лабораторного исследования при этом были отрицательными.

Проводился тщательный сбор акушерско-гинекологического и соматического анамнеза матерей. Осуществлялось динамическое общеклиническое наблюдение за новорождёнными детьми, включающее ежедневный осмотр с регистрацией динамики общего состояния и основных патологических симптомов, динамическим неврологическим осмотром. Мониторинг за жизненно важными функциями включал измерение артериального давления, контроль за показателями сердечно-сосудистой и дыхательной систем. Всем детям основной и контрольной групп проводились следующие обязательные исследования: общий анализ крови и мочи, биохимическое исследование крови, микроскопическое исследование спинно-мозговой жидкости, микробиологическое исследование посевов крови, ликвора, аспирата из трахеи с идентификацией возбудителя и определением его чувствительности к антибактериальным препаратам. По показаниям всем детям проводились лабораторные и инструментальные исследования (рентгенография грудной клетки и брюшной полости, электрокардиография, ультразвуковое исследование органов брюшной полости и головного мозга).

Статистическая обработка полученных результатов проводилась на персональном IBM-совместимом компьютере при помощи программы Microsoft Excel 2000 (Microsoft Office 2000). Вычислялись средняя арифметическая (М), ошибка средней (m), стандартное отклонение (sd), t-критерий Стьюдента при известном числе наблюдений (n), коэффициент корреляции (г) для р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение.

С целью выявления особенностей клинических проявлений ЦМВИ у недоношенных новорожденных с низкой и экстремально низкой массой тела нами проведен анализ клинического течения неонатального периода у детей двух групп.

При сравнении показателей степени зрелости детей, гестационого возраста (ТВ), массы тела при рождении, оценки по шкале Ангар статистически достоверных отличий по указанным показателям у детей первой и второй групп выявлено не было.

Так ГВ детей первой группы составил 29,8 (±0,5) недель. При этом 8 из 48 (17%) детей родились ГВ менее 28 недель. В то время как ГВ новорожденных второй группы составил 30,5 (±0,5) недель, и 11 (20%) детей родилось менее 28 недель (р >0,05).

Масса тела при рождении новорожденных первой группы составила 1445 (±78) гр., второй - 1497 (±82) гр. (р >0,05). Детей с массой тела менее 1000 гр. в первой группе родилось 8 (17%), во второй -12 (22%) (р >0,05).

Все наблюдаемые дети родились в асфиксии различной степени тяжести. Оценка по шкале Апгар к концу первой минуты жизни в первой группе детей составила 5,0 (±0,2) балла, пятой - 6,2 (±0,2) балла; во второй группе - 5,1 (±0,2) и 6,5 (±0,2) балла, соответственно. В асфиксии тяжелой степени в первой группе родилось 12 (25%), во второй -15 (27%) детей. Статистически значимых отличий в степени асфиксии в исследуемых группах выявлено не было (р >0,05). Данные представлены в таблице № 1.

Таблица № 1 Сравнительная характеристика детей двух групп.

Параметры первая группа (4«) Вторая группа (55) Достоверность (Р)

Гестационный возраст (нед) 29,8 (±0,5) 30,5 (+0,5) р>0,05

Масса тела (г) 1445 (±78) 1497 (±82) р>0,05

Оценка по Апгар к концу первой минуты (балл) 5,0 (±0,2) 5,1 (±0,2) рХ>,05

Оценка по Апгар к концу пятой минуты (балл) 6,2 (±0,2) 6,5 (±0,2) р>0,05

Отсутствие достоверных различий между группами свидетельствует о том, что степень неблагоприятного влияния ЦМВ на внутриутробное развитие плода не отличается от степени влияния других возбудителей (вирусов и бактерий), что видимо было обусловлено неспецифическим нарушением маточно-плацентарного барьера под воздействием нескольких патологических факторов.

Для уточнения влияния цитомегаловирусной инфекции на течение неонатального периода у недоношенных новорожденных с сочетанной перинатальной патологией был проведен анализ динамики и степени выраженности основных клинических синдромов у

детей двух групп. Основные клинические синдромы, встречающиеся у детей двух групп, представлены в таблице №2.

Таблица №2 Частота встречаемости основных клинических

№ п/п Частота (%) Первая группа (48) Вторая группа (55)

1 пневмония 19(40%) 17(31%)

2 СДР (БГМ) 26(54%) 37(67%)

3 БЛД* 17 из 43 (40%) 12 из 51 (23%)

4 Генерализованное инфекционное заболевание 13 (27%) 12(22%)

5 ВЖК 1-2 ст. 16(33%) 15 (27%)

6 ВЖК 3-4 ст 10(21%) 10(18%)

7 гидроцефалия 5 (10%) 2 (4%)

8 ПВЛ 3 (6%) 6(11%)

9 Судорожный с-м 18 (37,5%) 15 (27%)

10 тромбоцитопения 5(10%) 3 (5%)

11 спленомегалия 6(13%) 3 (5%)

12 гепатомегалия 14 (29%) 7(13%)

13 ранняя желтуха 20 (42%) 16(29%)

* частота развития БЛД рассчитана на количество выживших детей к месяцу жизни

Сравнительный анализ динамики клинического состояния неонатального периода показал, что у детей с ЦМВИ чаще клинико-рентгенологически при рождении диагностировалась пневмония, чем у детей второй группы (40% и 31% соответственно). Характерной особенностью патологии органов дыхания при цитомегаловирусной инфекции является интерстициальное воспаление, но в связи с высокой частотой бактериальной инфекции истинный характер пневмонии при жизни не всегда удавалось установить, так как рентгенографические признаки соответствовали интерстициально-очаговой пневмонии. Достоверных различий по частоте выявления клинико-рентгенологических симптомов пневмонии, а также ее характеру течения у недоношенных новорожденных двух групп выявлено не было (р>0,05).

У детей с ЦМВИ в 1,7 раза чаще развивалось хроническое заболевание легких - БЛД, чем у детей с отрицательными результатами лабораторного обследования на внутриутробную ЦМВИ (40% и 23% соответственно), что явилось статистически значимым (р<0,05).

Клинико-нейросонографически у детей I группы несколько чаще диагностировалось гипоксически-геморрагическое поражение ЦНС (ВЖК), чем у детей П группы: у 26 из 48 детей первой группы против 25 из 55 детей второй группы (54,2% и 45,4% соответственно). При этом у детей в первой группе в следствие гипоксически-геморрагического поражения ЦНС в 2 раза чаще отмечалось развитие гидроцефалии, чем у детей во второй группе (10% и 4% соответственно). Развитие же ПВЛ на фоне гипоксически-ишемического поражения ЦНС

во второй группе регистрировалось чаще, чем в первой (11% и 6% соответственно). Судорожный синдром также чаще диагностировался у детей в первой группе, чем второй (37,5% и 27% соответственно). Однако в связи с ограниченным числом исследований статистические различия были недостоверны (р>0,05).

Несмотря на более высокую частоту ВЖК у детей в первой группе, чем во второй, не было выявлено достоверных различий в частоте тромбоцитопении (р>0,05).

Гепатомегалия, возможно как проявление ЦМВИ, а также спленомегалия и более длительное сохранение желтухи было статистически значимым у детей первой группы (р<0,05). В первой группе при рождении у 14 из 48 детей диагностировалось увеличение размеров печени до 3,5-4,5 см, во второй - у 7 из 55 детей (29% и 13% соответственно). Увеличение размеров селезенки в первые сутки жизни было выявлено у 6 из 48 детей первой группы и у 3 из 55 детей второй (13% и 5%).

Клинические признаки врожденной генерализованной инфекции чаще диагностировалась в первой группе детей, чем во второй: у 13 из 48 детей первой группы и у 12 из 55 детей второй, что составило 27% и 22% соответственно. Однако различия были статистически не достоверны (р>0,05).

Таким образом, анализ особенностей течения неонатального периода позволил установить, что при рождении внутриутробная ЦМВИ протекала в 27% случаев в виде врожденной генерализованной инфекции, в 40% в виде внутриутробной пневмонии с выраженным интерстициальным компонентом. В 8% ЦМВИ протекала под «масками» синдрома дыхательных расстройств (болезнь гиалиновых мембран), в 25% - гипоксически геморрагического поражения центральной нервной системы.

Динамическое наблюдение за детьми внутриутробной ЦМВИ, подтвержденной лабораторно, показало, что частота развития хронического заболевания легких в этой группе детей в 1,7 раза выше, чем у детей с другой инфекционной и неинфекционной патологией. Полученные различия - статистически достоверны, р<0,05.

Наши наблюдения еще раз показали, что клинические симптомы ЦМВИ у недоношенных новорожденных не являются специфичными.

Вместе с тем, данная инфекция оказывает неблагоприятное влияние на структурное и функциональное состояние легких и ЦНС у недоношенных детей с очень низкой и экстремально низкой массой тела и способствует хронизации перинатальной патологии, а также развитию тяжелых неврологических нарушений.

С целью верификации диагноза ЦМВИ в неонатальном периоде нами было проведено исследование крови и мочи у 103 недоношенных новорожденных на присутствие прямых маркеров ЦМВИ.

Методом ПЦР с целью выявления ДНК-емии было обследовано 82 новорожденных, 42 ребенка были обследованы в динамике. 70 детей первично были обследованы в возрасте 4,5 (±1,5) с.ж., 12 детей - в позднем неонатальном периоде. Повторное обследование проводилось с интервалом 5-7 дней. Методом ПЦР ЦМВИ была диагностирована у 27 детей: при первичном обследовании у 25 и еще у 2 в динамике. Однако только у 7 (26%) детей ДНК-ЦМВ выявлено и в крови и моче одновременно (№23,25,26,27 - при первичном обследовании, №2, 7, 17 - при повторном исследовании). Результаты обследования 27 детей, у которых были получены положительные результаты ПЦР при исследовании крови и мочи в динамике, представлены в таблице №3.

Таблица №3. Результаты обследования детей методом ПЦР.

БКМ с целью выявления вирусемии было обследовано 89 детей, в динамике - 23 ребенка. 63 ребенка первично были обследованы в возрасте 6,0 (+1,0) с.ж. 26 детей первично были обследованы в позднем неонатальном периоде. Повторное обследование проводилось с интервалом 5-7 дней. БКМ ЦМВИ была диагностирована у 37 новорожденных детей: при первичном обследовании у 34 и еще у 3 при повторном обследовании, что составило 42%.

Результаты обследования 23 детей, у которых БКМ были получены положительные результаты исследования крови и/или мочи в динамике, представлены в таблице №4.

Таблица №4. Результаты обследования БКМ.

№ БКМ 1 БКМ 2 БКМ 3

п/п С.Ж. кровь моча с.ж. кровь моча с.ж. кровь моча

1 2 пол пол 9 отр н/и 18 пол пол

2 3 отр пол 10 отр отр 15 пол отр

3 5 пол пол 14 пол пол 21 отр пол

4 2 пол пол 5 пол пол

5 2 отр пол 6 пол отр

6 2 пол н/и 9 пол пол

7 2 пол пол 9 пол в/и

8 2 пол пол 14 пол отр

9 3 пол пол 11 отр пол

10 3 отр отр 6 пол и/в

11 3 пол пол 10 отр пол

12 3 отр отр И пол пол

13 3 отр пол 12 отр отр

14 4 пол пол 8 пол пол

15 4 отр отр 12 пол пол

16 5 пол отр 15 пол пол

17 5 пол пол 12 отр пол

18 5 пол пол 12 пол пол

19 5 отр отр 9 отр отр

20 6 отр пол 11 пол пол

21 7 пол н/и 23 отр н/и

22 7 отр пол 14 отр пол

23 8 пол пол 15 пол пол

Обращают на себя внимание несовпадение результатов исследования двумя

лабораторными методами (БКМ и ПЦР) в части анализов. Это объясняется тем, что с помощью БКМ в биологическом материале можно выявить инфекционно активный вирус, а с помощью ПЦР - вирусную ДНК. При анализе 67 образцов крови, исследованных первично двумя методами, было отмечено, что совпадение отрицательных результатов имело место в 38 случаях из 67 (57%), в 14 (21%) случаях положительные результаты БКМ отмечались при отрицательных результатах ПЦР, в 11 (16%) случаях совпадали положительные результата между двумя методами, и только в 4 (6%) случаях имели место отрицательные результаты БКМ при положительных ПЦР. БКМ в крови ЦМВ был выделен в 25 из 67 (37%) случаях, ПЦР - в 15 из 67 (22%). При анализе 28 образцов мочи, изученных двумя методами, БКМ инфекционно активный вирус был выявлен в 20 (71%) случаях, ПЦР - в 8 (29%) случаях. Совпадение отрицательных результатов имело место в 7 случаях (25%). Также в 7 случаях имело место совпадение положительных результатов между двумя методами (25%). В 13 (46%) случаях отмечались положительные результаты исследования мочи БКМ и

отрицательные ПЦР. И только в 1 случае (4%) отрицательный результат БКМ и положительный ПЦР.

Сравнительный анализ результатов исследования крови и мочи показал, что инфекционно активный вирус в 2 раза чаще обнаруживался в моче, чем в крови БКМ. Отрицательные результаты ПЦР в образцах мочи, в которых ЦМВ был выявлен с помощью БКМ, возможно, связаны с присутствием в моче ингибиторов ПЦР (Halwachs-Baumann G., at al., 2002). Это означает, что при исследовании образцов мочи вероятность обнаружения ЦМВ значительно выше, чем при анализе крови. В случае когда, положительные результаты ПЦР наблюдались при отрицательных результатах БКМ, возможно, объясняются выявлением ДНК ЦМВ в дефектных вирусных частицах, не обладающих инфекционной активностью, что соответствует литературным данным (Grefte et aL, 1993). Положительные результаты БКМ выявленные при отрицательных результатах ПЦР, можно объяснить большей чувствительностью БКМ. О различной чувствительности сравниваемых методов в клинических условиях свидетельствуют также литературные данные (Lazzarotto T at aL, 1998).

Для уточнения причин расхождения результатов БКМ и ПЦР в ходе данной работы биологический материал (кровь и моча) от 64 детей параллельно были обследованы в другой лаборатории ПЦР. При сравнении результатов, полученных в двух лабораториях ПЦР, было выявлено, что в основном совпадение отмечалось при отрицательных результатах, полученных двумя методами. Положительные реакции ПЦР совпали только в двух случаях при исследовании образцов крови. Расхождение результатов ПЦР отмечалось при исследовании 9 образцов крови. В 4 случаях при отрицательном результате БКМ была выявлена ДНК ЦМВ, и в 1 образце при наличии инфекционно активного вируса результат ПЦР был положительным. В результате этого обследования ЦМВИ была диагностирована еще у 4 детей.

Известно, что результаты ПЦР, выполненные в разных лабораториях, часто не совпадают (Kaiser L. et aL, 2002; Angela M. Caliendo et aL, 2003; Tarrago D. et aL, 2004). Вероятно, это объясняется различной чувствительностью тест-систем ПЦР, используемых в лабораториях. Это зависит от применяемых праймеров, количества циклов амплификации ДНК. В связи с этим необходимо вводить методы стандартизирующие тест системы, используемые в клинических лабораториях.

Двумя количественными методами были обследованы 30 недоношенных детей. Результаты динамического обследования 30 детей в неонатальном периоде с учетом количественных результатов методов представлены в таблице №5. Присутствие маркеров активной репродукции ЦМВ БКМ и ПЦР было выявлено у 27 детей из 30. БКМ у 26

Таблица №5

Результаты обследования детей внеонаталъном периоде сучетом количественныххарактеристикметодов.

№ п/п БКМ1* ПЦР1** БКМ2* ПЦР 2** БКМЗ* ПЦРЗ**

с.ж. кровь моча кровь моча с.ж кровь моча кровь моча с.ж кровь моча кровь моча

1 2 пол (3) пол(1) отр отр 9 отр н/и пол (<4000) пол (<1000) 18 пол (2) пол (2) пол(<1000) отр

2 3 отр пол (2) пол (<1000) отр 10 отр отр отр отр 15 пол(З) отр пол (<1000) пол(>500)

3 5 пол(1) поп(1) отр пол (<1000) 14 пол (2) пал (1) пал (< 1000) пал (< 1000) 21 отр пол(1) пол (<20001 псш (<2000)

4 1 н/и н/и пол (>500) н/и 5 пол (1) отр отр отр 15 поп (5) пол(5) пол (>500) отр

5 2 пол (5) н/и пол (>2000) н/и 9 поп (2) поп (2) пол (<2000) отр

6 3 поп (2) отр отр пол (>500) н/б

7 2 пол(З) пол (1) пол (>2000) отр 9 пол (4) н/и отр н/и

8 3 жш(1) пол (1) отр огр 11 отр пал (5) отр отр

9 3 поп(1) пол (1) пол (>4000) отр) 10 отр пол (5) отр отр

10 4 поп (1) пол (2) поя (<1000) отр н/б

11 4 пол (2) пол (2) отр отр н/б

12 4 пол (1) пол (2) отр отр 8 пол (1) псш (2) отр отр

13 4 пол (2) пол (2) пол (<1000) отр н/б

14 5 пол (1) пол (3) пол (<2000) отр 12 отр пол (1) огр пал (<) 000)

15 2 пол(1) пол (7) пол (<1000) отр 14 пол (2) отр пал (<1000) отр

16 2 пал(1) пол (7) отр пол (>500) 5 пол (1) пол(3) отр отр

17 3 поп (2) пол(14) поп (<1000) пол (<1000) н/б

18 5 пол (2) пол(26) пол (<1000) пол (<1000) 12 пол (1) пол (2) огр пол (<1000)

19 8 пол (2) жит(>100) пол (<1000) пол (>8000) 15 пал (2) пол(>100) огр пал (>8000)

20 7 отр пол(>100) пол (>4000) пол (>4000) 14 отр пол(>100) пал(>10000) пал(>10000)

21 6 отр пал(45) отр отр 11 пал(1) пол(30) отр отр

22 3 отр пол (3) отр пал (<1000) 12 отр отр пол (<1000) пол (<1000)

23 2 отр пол (1) отр пол (<1000) 6 пол (2) отр отр пал (<1000)

24 3 отр отр отр отр 6 пал(З) н/и пол (>2000) отр

25 3 отр отр отр отр 11 пол(1) пол (4) отр отр

26 4 отр отр отр отр 12 пол (2) пап(1) отр огр

27 3 н/и отр пол (<1000) отр

28 5 отр отр отр отр

29 2 отр отр отр отр

30 5 отр отр отр отр 9 огр отр отр отр

*- в скобках указано количество антиген-положительных клеток на 2,5x10 клеток ФЭЧ; **- в скобках указано количество копий ДНК в 1 мл; н/и — не исследовали.

новорожденных: у 23 при первичном обследовании и еще у 3-х при повторном. Методом ПЦР у 21 ребенка, у 19 при первичном обследовании, у 2-х при повторном. У 25 из 30 детей ЦМВ был выявлен на первой недели жизни при исследовании образцов крови и мочи. У 7 детей (№5,7, 9, 18, 19, 20, 21) было выявлено наибольшее содержание ЦМВ в биологических жидкостях с помощью БКМ и/или ПЦР. Так, при анализе БКМ образцов мочи у 4-ти из 7 детей (№18, 19, 20, 21) было определено 25 и более антигенсодержащих клеток на 2,5х105 клеток, что соответствует >100 инфекционным вирусным частицам в 1 мл исследуемого образца. По результатам ПЦР более 2 000 копий/мл вирусной ДНК было определено в образцах крови и мочи у 4-х из 7 детей (№5, 7, 9, 19). У 17 детей количество вирусной ДНК не превышало 1000 копий/мл и количество инфекционных вирусных частиц в среднем составило 10-15 на 1 мл образца, что соответствовало 1-3 окрашенным клеткам на препарат. У 6-ти из 30 новорожденных при первичном обследовании ЦМВ не был обнаружен ни одним из использованных методов. Повторно были обследованы 22 ребенка, 4 из них - на 2-й и на 3-й неделе жизни. У большинства детей 16 из 22, у которых ЦМВ был выявлен в биологических жидкостях, вирус сохранялся в течение всего периода обследования, и его количество оставалось приблизительно на одинаковом уровне. У 2-х новорожденных (№9, 18) отмечалось снижение числа копий вирусной ДНК в крови с 1000 копий/мл и 4000 копий/мл до уровня соответствующего порогу чувствительности ПЦР (<100 копий/мл), но при исследовании образцов мочи у этих детей количественные показатели БКМ и ПЦР сохранялись на прежнем уровне. При повторном обследовании 4-х детей, у которых не был выявлен ЦМВ в первую неделю жизни, у 3-х (№24, 25 , 26) в образцах крови была обнаружена инфекционная активность вируса, соответствующая 5-15 инфекционных частицам в 1 мл крови.

Выявление ЦМВ с помощью количественных вариантов БКМ и ПЦР показало, что совпадение результатов двух методов составило 76% и 50% при исследовании образцов крови и мочи, соответственно. БКМ обнаруживал чаще ЦМВ, чем ПЦР, как в образцах крови (34 против 26 положительных образцов), так и в образцах мочи (36 против 18 положительных образцов). Однако зависимости между количеством инфекционных вирусных частиц и количеством вирусной ДНК в исследуемом материале выявить не удалось.

Дополнительно к БКМ и ПЦР были использованы серологические методы диагностики: тИФА, определение индекса авидности специфических АТ, иммуноблотинг (ИБ).

Сыворотки 29 детей были исследованы на наличие специфических анти-ЦМВ АТ в реакции тИФА и реакции иммуноблота. Кроме того, в 25 сыворотках был определен индекс

авидности (ИА) IgG. Результаты выявления серологических маркеров ЦМВИ представлены в таблице №6.

Таблица №6 Выявление маркеров ЦМВ

у недоношенных новорожденных.

№ Гестационпый Месса тела Сутки ИБ** Анти-ЦМВ*

п/п возраст жизни авидностцИА

1 25 710 7 26 0,51

2 32 920 7 4 0,60

3 34 2340 5 21 0,42

4 30 ИЗО 6 19 0,72

5 29 1230 2 21 0,80

6 30 1250 3 27 0,67

7 29 1260 2 10 0,78

8 34 1990 6 12 0,60

9 34 2000 5 и/и н/и

10 25 840 3 23 0,71

11 26 910 5 14 0,83

12 28 1040 4 8 0,74

13 28 1040 2 10 0,90

14 30 1070 4 10 0,72

15 28 1090 5 0 н/и

16 30 1170 3 6 0,80

17 30 1240 3 20 0,69

18 28 1260 3 7 0,71

19 31 1430 2 14 0,56

20 30 1500 3 я/и н/и

21 29 1630 2 6 н/и

22 32 1710 4 14 0,96

23 36 2180 3 16 0,81

24 33 2210 2 19 0,60

25 35 2210 4 10 0,75

26 33 1070 5 5 н/и

27 29 1110 5 н/и 0,68

28 29 1300 3 4 0,76

29 30 1340 4 10 0,73

30 31 1530 2 14 0,79

* - антитела класса М выявлены у одного ребенка (№2), AT класса G - у всех изученных детей;

** - иммуноблот, анти-ЦМВ IgG (количество полос).

AT класса М были выявлены только у 1-го ребенка (№1). Невысокая частота выявления AT класса М у новорожденных отмечалась также другими авторами (Donner С, at al, 1997). Это связано с тем, что способность продуцировать IgM зависит от срока гестации и от функционирования иммунной системы. Имеются сведения о том, что 50% новорожденных с признаками ЦМВИ не продуцируют анти-ЦМВ IgM AT (Donner С, at al., 1993, Nelson С.Т., at aL, 1997). Результаты ИБ показали, что IgM AT этого ребенка были направлены к белкам с М.м. 28 кДа, 38 кДа, 52 кДа и 65 кДа (рис. 1а). Эта белки являются наиболее иммунногенными полипептидами для AT класса М (Landini M.P., at aL, 1995). В литературе имеются сведения о том, что выявление AT класса М, взаимодействующих с вирусным белком р38, свидетельствует об остром инфекционном процессе (Kraat Y.J., at aL,

1996). Кроме того, в сыворотке этого ребенка были выявлены материнские вирусспецифические IgG AT с низким индексом авидности (ИА) 0,51. Согласно имеющимся данным ИА < 0,6 свидетельствует об инфицировании матери в течение предшествующих 6-ти месяцев (Baccard-Longere M., at al., 2001). Учитывая возраст гестации ребенка (25 недель), вероятно, заражение матери произошло в первом триместре беременности. Хорошо известно, что инфицирование беременных женщин в течение первого триместра наиболее часто приводит к внутриутробному инфицированию плода (Bodeus M, at aL, 2002; Fowler R.B., at aL, 1992). У этого ребенка в моче было выявлено большое количество инфекционно активного вируса, не менее 500 вирусных частиц в 1 мл (более 100 антиген-положительных клеток на 2,5x105 клеток ФЭЧ). Результаты ПЦР также были положительными при исследовании, как образцов крови, так и мочи. Полученные серологические данные, данные БКМ и ПЦР, позволяют заключить, что у ребенка в момент рождения наблюдалась острая форма внутриутробной ЦМВИ, вероятно, вследствие первичного ЦМВ-инфицирования матери в первый триместр беременности. В остальных 28 из 29 сывороток, изученных методом тИФА, было выявлено высокое содержание анти-ЦМВ IgG (таблица №6).

У 29 детей в качестве подтверждающего теста и для определения спектра взаимодействия анти-ЦМВ IgG с индивидуальными вирусными белками сыворотка также была изучена в реакции иммуноблотинга (ИБ) (рис 1) Анализ данных показал, что как при узком, так и широком спектре анти-ЦМВ IgG у большей части детей (75% и 68%, соответственно) были выявлены небольшие количества копий ДНК и низкая инфекционная активность вируса. Таким образом, данные ИБ не позволяют однозначно судить о вирусной нагрузке и активности инфекционного процесса у недоношенных новорожденных детей.

Рисунок 1.

Взаимодействие антител из сывороток детей с белками ЦМВ.

'J '!

( ' I

I ' и 1

I 4 I » '

Подписи к рисунку: а) антитела класса М; б,в) антитела класса О; г) отрицательный контроль (антитела к ЦМВ в сыворотке отсутствуют); д) положительный контроль.Цифрами обозначены М.м. белков (кДа). Цифры справа - маркеры М.м. (кДа), "ЕпсШ" (Германия).

Авидность анти-ЦМВ ^О была определена в сыворотке 21 детей. Низко авидные анти-ЦМВ ^О были определены в сыворотке 6 детей (26,6%). Согласно имеющимся данным ИА < 0,6 свидетельствует об инфицировании матери в течение предшествующих 6-ти месяцев (Вассагё-Ьо^еге М., а! а1., 2001). В нашем исследовании при низкой авидности (ИА < 0,6) у 3-х детей было выявлено большое количество ДНК ЦМВ и высокая инфекционная активность вируса, у 3-х других детей из этой группы - низкие показатели БКМ и ПНР. При высокой авидности АТ (ИА >0,6) у 5-ти из 15 детей данные ПЦР и БКМ были высокими, тогда как у 10-ти детей - низкими. Это означает, что высокая авидность ^О анти-ЦМВ коррелирует с низкой вирусной нагрузкой и слабой инфекционной активностью ЦМВ. Можно заключить, что высокоавидные материнские АТ защищают в первую неделю жизни большую часть новорожденных от развития ЦМВИ. Возможно, что для проявления активности ЦМВ у новорожденных важную роль играет не только авидность и репертуар материнских ^О АТ, содержащихся в сыворотке ребенка, но и нейтрализующие свойства этих АТ. Однако надо учитывать, что у недоношенных новорожденных детей доля АТ, обладающих нейтрализующими свойствами, зависит от возраста гестации. Так, только к 34 неделям гестации 99% нейтрализующих АТ достигают сыворотки плода (Мшя-РшЬа1а М.М., а! а1., 2003).

Особый интерес представляют случаи, когда прямые маркеры ЦМВ не были обнаружены в первую неделю жизни. У 5 из 6 обследованных детей из этой группы было выявлено высокое значение ИА анти-ЦМВ ^О (0,68 и более). При этом спектр АТ, направленных к вирусным белкам, различался. В сыворотках 3-х детей (№4, №29, №30) АТ взаимодействовали не менее, чем с 20 белками, в то время как у 2-х детей (№26, №28) - с 4-5 белками (рис.16). При повторном обследовании на 2-й неделе жизни у 3-х детей (№4,28,29) были выявлены ДНК и инфекционная активность вируса.

Анализ результатов серологического обследования, позволяет сделать следующие выводы: широко применяемый в лабораторной практике метод тИФА для качественного определения анти-ЦМВ ^О и ^М не позволяет охарактеризовать компетентность специфического иммунного ответа у новорожденных детей в связи с присутствием материнских АТ и с незрелостью иммунного ответа; метод иммуноблота, обладающий высокой специфичностью, может служить подтверждающим тестом для выявления анти-ЦМВ АТ; прямой корреляции между спектром АТ в сыворотках недоношенных новорожденных и обнаружением прямых маркеров ЦМВ выявлено не было.

Учитывая трудности прижизненной диагностики, большое значение придавалось анализу результатов патологоанатомического исследования. В первой группе детей, имеющих клинико-лабораторные признаки внутриутробной ЦМВИ, умерло 6 из 48 детей (12,5%). Заключительным клиническим диагнозом у 5 детей являлась генерализованная внутриутробная инфекция, у 1 - гипоксически-геморрагическое поражение ЦНС тяжелой степени (ВЖК 3-4ст.) и БГМ. Патоморфологическим и вирусологическим методом были исследованы препараты - отпечатки органов всех умерших детей. Диагноз ЦМВИ был подтвержден при патоморфологическом исследовании органов и тканей погибших новорожденных в 5 случаях, диагностированных прижизненно. По данным результатов патоморфологического исследования у 2-х из 5 новорожденных инфекция протекала как острый инфекционный процесс с признаками воспаления в различных органах (менингоэнцефалитом, миокардитом, панкреатитом, пневмонией), а у 3 - как врожденная хроническая инфекция с формированием стигм дисэмбриогенеза, и фетодисплазий. И только в одном случае диагноз ЦМВИ был установлен только после дополнительного исследования аутопсийного материала (образцов тканей печени и головного мозга) БКМ и ПЦР. Важно отметить, что ни в одном из представленных случаев при гистологическом исследовании не было обнаружено специфических морфологических признаков заболевания - клеток типа «совиный глаз».

В результате патоморфологического исследования умерших 6 детей из 55 второй группы (11%), имеющих отрицательные результаты прижизненного обследования на ЦМВИ, было установлено, что у 1 ребенка имели место множественные врожденные пороки развития: порок развития стенки желудка и тонкой кишки с нарушением закладок мышечно-серозного слоя, у 1 ребенка - ВЖК 3 ст с образованием геморрагических сгустков, множественные мелкие субэпендимальные гематомы, некоторые из них с разрывом, гиалиново-мембранозная пневмопатия, дистрофические изменения внутренних органов. Важно отметить, что у 4 детей имела место врожденная генерализованная инфекция неуточненной этиологии: у 3 детей диагностирована двусторонняя мелкоочаговая пневмония, у 1 - интерстициальная, у 1 - плеврит; у всех детей также выявлялись различные поражения ЦНС: у 1 микроцефалия, у 2 альтеративно-продуктивный менингоэнцефалит с фиброзом мягких мозговых оболочек, у 1 - вентрикулоэктазия и дефицит массы мозга, у 1 -энцефалит; у 1 имел место портальный и паропортальный гепатит с очагами некрозов; у 1 -пиелит, у 2 - пшодисплазия тимуса с явлениями жирового метаморфоза.

Таким образом, анализ результатов патологоанатомического исследования показал, что одной из наиболее частых причин гибели в неонатальном периоде детей с очень низкой и экстемально низкой массой тела является врожденная генерализованная острая или,

преимущественно, хроническая инфекция. В связи с отсутствием специфических морфологических признаков заболевания - клеток типа «совиный глаз», по характеру и выраженности воспалительных изменений в органах умерших детей не всегда можно поставить диагноз внутриутробной ЦИВИ после гистологического исследования без дополнительных методов лабораторной диагностики.

В результате комплексного лабораторного обследования у 48 новорожденных (47%), из группы высокого риска по внутриутробному инфицированию, в биологическом материале было обнаружено присутствие цитомегаловируса (у 47 прижизненно и у 1 посмертно). Важно отметить, что высокий процент выявления ЦМВ в данной категории детей связан с тем, что нами для диагностики были использован высоко чувствительный и специфичный метод - быстрый культуральный метод (БКМ). По результатам обследования ДНК ЦМВ в биологическом материале была обнаружена у 33% новорожденных. Присутствие же инфекционно активного вируса в биологическом материале БКМ было обнаружено у 42% детей из группы риска. Необходимо также отметить, что высокий процент выявления ЦМВ связан с исследованием двух биологических жидкостей: крови и мочи. Методом ПЦР частота выявления ДНК ЦМВ в крови составила 21%, а при исследовании и крови, и мочи частота обнаружения ДНК ЦМВ в биологическом материале увеличилась до 33%; в крови БКМ инфекционно активный вирус был обнаружен в 33% случаев, а при исследовании и крови, и мочи - в 42% соответственно.

У 41 ребенка инфицирование ЦМВ было установлено в раннем неонатальном периоде. Обнаружение маркеров активной репродукции ЦМВ на первой неделе жизни подтверждает внутриутробный характер инфицирования (Revello M.G., at aL, 2002). В литературе имеются многочисленные сведения об отсроченном проявлении внутриутробной ЦМВИ, так как ЦМВ может длительно персистировать в лимфоцитах и моноцитах, вызывая абортивную инфекцию (Barbi M., at aL, 2003, Malinger G., at al., 2003). He исключено, что инфицирование этих детей произошло уже в неонатальном периоде. Возможно также инфицирование и через препараты крови (Demmler G.J. 1991).

По данным литературы, частота встречаемости ЦМВ у недоношенных новорожденных выше, чем у доношенных, и что риск возникновения ЦМВИ выше у тех недоношенных детей, которые рождаются с более низким весом (Maschmann J., at aL, 2001). Наибольшая частота внутриутробного инфицирования ЦМВ была отмечена в группе недоношенных детей с ГВ от 28 до 32 недель. При этом частота внутриутробного инфицирования ЦМВ в 1,4 раза выше у новорожденных с ГВ < 32 недели (36 из 71 - 51%), чем у детей, родившихся на сроке беременности более 32 недель (12 из 32 - 37,5%). Эти

данные представлены в таблице №7. Таким образом, ГВ менее 32 недель можно считать фактором риска развития ЦМВИ у данной категории детей. Таблица №7 Частота инфицирования ЦМВ у новорожденных

в зависимости от гестационного возраста.

Гестационный Количество Количество %

возраст обследованных инфицированных (п=48)

детей (н=103) детей (п=48)

менее 28 недель 19 8 17%

28 - 32 недели 52 28 58%

более 32 недель 32 12 25%

Известно, что развитию внутриутробной инфекции также способствует наличие

хронических очагов инфекции у матери, заболевания мочеполовой системы, а также отягощенный акушерско-гинекологический анамнез (Кулаков В.И., 2001). В связи с тем, были проанализированы факторы риска развития внутриутробной ЦМВИ у 44 матерей, дети которых имели клинико-лабораторные признаки внутриутробной ЦМВИ, и у 53 женщин, дети которых имели отрицательные результаты обследования на ЦМВИ. Данные анамнеза матерей представлены в таблице №8.

Таблица № 8. Факторы риска развития внутриутробной инфекции.

Факторы\частота (%) I 44 женщины | 53 женщины

1. Соматической анамнез

Хр.заболевания ЖКТ (гастрит, гастродуоденит, панкреатит) 8 (18%) 4 (7%)

Хр.пиелонефрит 3 (7%) 2 (4%)

Хр.цистит 4(9%) 1 (2%)

Хр.тонзиллит 6(14%) 2(4%)

Хр.бронхит 7(16%) 2 (4%)

анемия 9(20%) 6(11%)

2. Акушерско-гинекологический анамнез

Хр.аднексит, сапышнгоофарит 35 (79%) 20(38%)

Эрозия шейки матки 25 (57%) 20 (38%)

Дисфункция яичников 16(36%) 7 (13%)

Вторичное бесплодие 6(14%) 5 (9%)

Самопроизвольные выкидыши 14 (32%) 11 (21%)

Преждевременные роды 5(11%) 6(11%)

сочетание нескольких хронических соматических и гинекологических заболеваний 37(84%) 28 (53%)

3. Патологии течения настоящей беременности

Токсикоз 24(54%) 23 (43%)

Угроза прерывания 42(95%) 21 (40%)

Многоводне 6 (14%) 0

Хроническая внутриутробная гипоксия плода 20(45%) 18 (34%)

ОРВИ 25 (57%) 9 (17%)

4. Факторы иитранатяльного риска.

Преждевременное излитие околоплодных вод 32(73%) 19(36%)

Длительный безводный промежуток_

И (25%)

17(32%)

Анализ соматического и акушерско-гинекологического анамнеза выявил, что у матерей, дети которых были инфицированы ЦМВ, в 3 раза чаще наблюдались обострения хронических заболеваний во время беременности (хронического цистита, пиелонефрита, тонзиллита, бронхита), чем у матерей, дети которых не имели клинико-лабораторных признаков ЦМВ инфекции (64% и 21% соответственно). Полученные различия были статистически достоверными (р<0,05). Статистически достоверные различия были получены и по частоте выявления хронических гинекологических заболеваний (хронический аднексит, солыпингоофарит) (79% против 38%), угрозы прерывания беременности (95% и 40% соответственно), а также преждевременного излитая околоплодных вод (73% и 36% соответственно) у матерей первой группы, чем второй, р<0,05. Также чаще у матерей первой группы, чем второй, во время течения настоящей беременности диагностировалась анемия (20% и 11% соответственно), токсикоз (54% и 43%), многоводие (14% - только в первой группе), хроническая внутриутробная гипоксия плода (45% и 34%), наличие в анамнезе самопроизвольных выкидышей (32% и 21%). Однако статистически достоверных различий выявлено не было (рХ),05).

Таким образом, факторами, способствующими повышению риска развития внутриутробной ЦМВИ инфекции, можно считать обострение хронических соматических (64%) и гинекологических заболеваний (79%) во время течения настоящей беременности, угрозу прерывания беременности (95%), многоводие (14%), наличие в анамнезе матерей самопроизвольных выкидышей (32%), а также преждевременное излитие околоплодных вод (73%).

Согласно литературным данным наиболее опасна первичная инфекция у матери (Фарбер НА, 1981). В нашем исследовании во время течения настоящей беременности только у 8 (19%) женщин лабораторно был выявлен ЦМВ методом ИФА и/или ПЦР в мазках, и только у 1 (2%) - имела место острая ЦМВИ.

Следовательно, внутриутробное инфицирование детей было выявлено не только в случаях развития первичной инфекции у матери или обострения латентной инфекции, но и в случаях бессимптомного носительства, что подтверждает литературные данные о широком распространении ЦМВ в популяции. Таким образом, отсутствие клиники ЦМВИ у матери во время течения настоящей беременности не гарантирует того, что ребенок не инфицируется.

Выводы.

1. Частота внутриутробной цитомегаловирусной инфекции у недоношенных

новорожденных с сочетанной перинатальной патологией составила 47%.

Установлено, что наибольшая частота внутриутробной цитомегаловирусной

инфекции отмечается у недоношенных новорожденных с гестационным возрастом 2832 недели - 54%, менее 28 недель -17%, более 32 недель - 25%.

2. К факторам, повышающим риск внутриутробного инфицирования плода цитомегаловирусом, относятся: обострение во время настоящей беременности хронических заболеваний соматических в 64% и гинекологических в 79% случаев, угроза прерывания беременности - 95%, многоводие - 14%, наличие в анамнезе матерей самопроизвольных выкидышей - 32%, преждевременное излитие околоплодных вод - 73%, ГВ менее 32 недель.

3. Течение внутриутробной ЦМВИ у недоношенных новорожденных с очень низкой и экстремально низкой массой тела в неонатальном периоде характеризуется выраженным клиническим полиморфизмом. При рождении внутриутробная ЦМВИ протекала в 27% случаев в виде генерализованного инфекционного заболевания, в 40% как внутриутробная пневмония с выраженным интерстициальным компонентом. В 8% случаев внутриутробная цитомегаловирусная инфекция протекала под «масками» синдрома дыхательных расстройств (болезнь гиалиновых мембран), в 25% - гипоксически-геморрагического поражения центральной нервной системы.

4. Динамическое наблюдение за детьми с верифицированной ЦМВИ позволило установить, что частота развития хронического заболевания легких в этой группе детей в 1,7 раза выше, чем у детей с другой инфекционной и неинфекционной патологией.

5. Сопоставление результатов лабораторного обследованиям показало, что частота выявления цитомегаловирусной инфекции у недоношенных новорожденных в клинических условиях быстрым культуральным методом выше, чем и методом полимеразной цепной реакции.

6. Сравнительный анализ результатов исследования крови и мочи показал, что быстрым культуральным методом вирус цитомегалии в биологическом материале обнаруживался в 2 раза чаще в моче, чем в крови; в тоже время методом полимеразной цепной реакции ДНК цитомегаловируса выявляется практически с одинаковой частотой, как в моче, так и в крови.

7. Серологические тесты у недоношенных новорожденных не являются специфичным и в раннем неонатальном периоде не позволяют уточнить, приведет или нет инфицирование цитомегаловирусом к развитию инфекционной болезни.

8. Сопоставление данных патоморфологического исследования с результатами клинико-лабораторного обследования недоношенных новорожденных показало, что по характеру и выраженности воспалительных изменений в органах умерших детей не

всегда можно поставить диагноз внутриутробной ЦМВИ после гистологического исследования в связи с отсутствием специфических морфологических признаков заболевания - клеток типа «совиный глаз», что еще раз повышает значение лабораторных методов исследования в комплексной диагностике. Практические рекомендации.

1. Все дети с низкой и экстремально низкой массой тела, поступающие в отделения реанимации и интенсивной терапии, требуют включения обследования на

2. Информативность лабораторных методов исследования повышается в случае использования в клинической практике сочетания быстрого культурального метода и метода полимеразной цепной реакции в моче и крови.

3. Специфическая противовирусная терапия должна проводиться в случаях получения положительных результатов исследования у недоношенных новорожденных с сочетанной перинатальной патологией.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Федорова Н.Е., Меджидова М.Г., Воронцова Ю.Н., Дегтярев Д.Н., Pustowoit В., Асади Мобархан С.М., Саматова М.М., Кущ А.А., Володин Н.Н. Количественные лабораторные методы для диагностики цитомегаловирусной инфекции у недоношенных новорожденных детей. / «Вопросы вирусологии». 2005 - т. 50, № 1, с. 9-14.

2. Воронцова ЮЛ., Володин Н.Н., Дегтярев Д.Н., Кущ А.А., Федорова Н.Е., Меджидова М.Г., Асади Мобархан АХ, Асади Мобархан СМ., Ряполова И.В. Особенности клинических проявлений врожденной цитомегаловирусной инфекции у недоношенных новорожденных. / «Российский вестник перинатологии и педиатрии», Москва, 2004 - т. 49, №2, с. 60-66.

3. Адуева СМ., Меджидова АА, Меджидова М.Г., Федорова Н.Е., Кущ А.А., Ильина Е.Н., Малахова М.В., Говорун В.М., Алямасольская Г.А., Кешищян Е.С., Воронцова Ю.Н., Солдатова И.Г., Дегтярева М.В. Лабораторная диагностика цитомегаловирусной инфекции у детей раннего возраста. // мат. научно-практического симпозиума «Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении» в рамках Международной конференции «Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины», Москва, 20-21 июня, 2002, с.249-251.

4. Воронцова Ю.Н., Дегтярев Д.Н. Комплексный подход к диагностике цитомегаловирусной инфекции у недоношенных детей. 2003 // Тезисы докладов. В сборнике материалов V-oгo Российского Форума «Мать и дитя». Москва стр.518.

5. Дегтярев Д.Н., Воронцова Ю.Н., Бабак ОЛ. Диагностика перинатальной цитомегаловирусной инфекции у новорожденных детей // Материалы 2-ого Российского Конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии». Москва. 2003, Стр.188.

6. Дегтярева М.В., Бояджан М.Б., Солдатова И.Г., Лесникова Ю.Н. Опыт применения Ронколейкина у детей с хроническими инфекционно-воспалительными заболеваниями мочевой системы. // Тезисы докладов IX Российского Национального Конгресса «Человек и лекарство». Москва. 2002 Стр.127.

7. Дегтярёва М.В., Солдатова И.Г., Воронцова Ю.Н. Влияние виферона на апоптоз лимфоцитов при неонатальных инфекциях. // Материалы 4-ого Российского Форума «Мать и дитя», часть 2, г. Москва. 2002 Стр.543.

8. Дегтярева М.В., Солдатова И.Г., Воронцова Ю.Н., Симбирцев А.С. Диагностическая и прогностическая роль цитокинов при сепсисе у глубоконедоношенных детей. // Материалы 4-ого Российского Форума «Мать и дитя», часть 2, г.Москва. 2002 Стр.544.

9. Дегтярёва М.В., Солдатова И.Г., Воронцова Ю.Н. Применение препарата Виферон-1 в комплексной терапии неонатальных бактериальных пневмоний. // Тезисы докладов X Российского Национального Конгресса «Человек и лекарство». г.Москва. 2003 Стр.167

Список использованных сокращений

• АТ- антитела

• БКМ- быстрый культуральный метод

• БЛД- бронхолегочная дисплазия

• ВПГ- вирус простого герпеса

• ВЖК- внутрижелудочковое кровоизлияние

• ГВ- гестационный возраст

• ДНК- дезоксинуклеиновая кислота

• ИА- индекс авидности

• ИБ- иммуноблотинг

• ПВЛ- перивентрикулярная лейкомаляция

• СДР- синдром дыхательных расстройств

• тИФА- твердофазный иммуноферментный анализ

• ЦМВ- цитомегаловирус

• ЦМВИ- цитомегаловирусная инфекция

Заказ №508. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». Г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 www.postator.ru

2 2 ¿Eli ?005

Актуальность. Последние пятнадцать лет характеризуются интенсивным развитием перинатальной медицины, усовершенствованием существующих диагностических и лечебных методов и интенсивным внедрением в практику новых, высокоэффективных технологий выхаживания новорождённых детей. Это позволило снизить показатели младенческой смертности в Российской Федерации за период с 1998 по 2003 г более чем на 25% (10).

Вместе с тем, одной из наиболее частых причин как антенатальной, так и перинатальной заболеваемости и смертности в нашей стране являются внутриутробные инфекции. ЦМВИ встречается у 0,5-2,5% новорожденных детей (13,55,57,68,109,122). Высокая частота внутриутробного инфицирования вирусом цитомегалии обусловлена целым рядом факторов, основными из которых являются эпидемиологические особенности заболевания, а также особенного иммунитета у беременных женщин, плодов и новорожденных (65). По данным литературы, внутриутробное инфицирование ЦМВ в 82-95% случаев не сопровождается клиническими проявлениями в неонатальном периоде (108,112). У 5-18% инфицированных детей, вскоре после рождения, выявляется классический TORCH-синдром, большая часть признаков которого обусловлена нарушением внутриутробного развития плода и системной воспалительной реакцией организма новорожденного ребенка. У многих недоношенных детей симптомы хронической внутриутробной инфекции могут протекать под маской хронической внутриутробной гипоксии, при этом системная воспалительная реакция при этом слабо выражена, а признаки инфекционного токсикоза, вызванного ЦМВ, трудноотлнчимы от симптомов полиорганной недостаточности, связанной с неинфекционными причинами. У 80% детей, перенесших тяжелую форму внутриутробной ЦМВИ, в дальнейшем отмечаются разнообразные соматические и психоневрологические осложнения. При бессимптомном течении внутриутробной ЦМВИу 5-17% детей в последствии имеются также различные нарушения здоровья (сенсорная глухота, задержка психомоторного, речевого развития) (29,108,112). Внутриутробное инфицирование плода ЦМВ также создает предпосылки для развития иммунологической толерантности к этому возбудителю с формированием длительной его персистенции и реактивации в постнатальном периоде. Среди всех известных внутриутробных инфекций именно ЦМВИ является ведущей причиной поражения головного мозга и потери слуха у новорожденных (3, 10). Внутриутробная ЦМВИ часто носит генерализованный характер, протекая с преимущественным поражением центральной нервной системы, желудочно-кишечного тракта, почек и легких. Поэтому разработка своевременных подходов диагностики ЦМВИ у новорожденных и детей раннего возраста является важной задачей медицинской науки, имеющей не только научный, но и практический интерес.

За последние пятнадцать лет было разработано и внедрено в клиническую практику большое количество современных методов лабораторной диагностики, включающих не только верификацию этиологического агента (идентификация самого вируса, его генома или антигенов) и обнаружение серологических маркеров иммунного ответа (специфических антител), но и определение остроты инфекционного процесса (изучение активности репликации вируса и раздельное определение антн-ЦМВ-АТ классов IgM и IgG с их авидностыо). Однако эффективность и информативность указанных методов при диагностике неонаталыюй формы ЦМВИ неодинаковы.

Именно с учетом этого положения чрезвычайно важным как с научной, так и с практической точек зрения является необходимость разработки четких клинико-лабораторных критериев диагностики ЦМВИ у недоношенных новорожденных. Это и явилось основанием для проведения нашего исследования.

Цель исследования

Выработать клинико-лабораторные критерии цитомегаловируснои инфекции у недоношенных новорожденных с сочетанной перинатальной патологией, в том числе родившихся с низкой и экстремально низкой массой тела.

Задачи исследования

1. Определить частоту внутриутробного инфицирования цитомегаловирусом и факторы, способствующие реализации патологического процесса у недоношенных детей в зависимости от гестационного возраста.

2. Определить клинические особенности течения раннего неонатального периода у инфицированных цитомегаловирусом детей, родившихся с низкой и экстремально низкой массой тела.

3. Установить степень влияния цитомегаловирусного инфицирования на течение неонатального периода.

4. Определить подходы к повышению информативности лабораторных показателей при диагностике цитомегаловируснои инфекции у недоношенных детей, родившихся с низкой и экстремально низкой массой тела.

Научная новизна.

Впервые при выполнении исследования использован комплексный подход лабораторной диагностики: вирусологический метод (его модификация быстрый культуральный метод), метод ферментной амплификации (полимеразная цепная реакция), серологические методы: иммуноферментный анализ, определение индекса авидности специфических антител, иммуноблотинг.

Путем комплексного лабораторного обследования показано, что частота внутриутробного инфицирования цитомегаловирусом недоношенных новорожденных с сочетанной перинатальной патологией составляет 47%.

Продемонстрировано, что частота выявления цитомегаловирусной инфекции у недоношенных новорожденных быстрым культуральным методом и методом полимеразной цепной реакции более чем в 10 раз выше, чем методом иммуноферментного анализа с количественным определением анти-цитомегаловирусных-антнтел классов М и G; и почти в 2 раза выше; чем при иммуноферментном анализе с определением авидности антител.

Установлено, что у 27% недоношенных детей с лабораторно подтвержденной цитомегаловирусной инфекцией при рождении клиническая картина характеризовалась генерализованной формой инфекционного заболевания, у 40% как внутриутробная пневмония с выраженным интерстициальным компонентом. В 8% случаев внутриутробная цитомегаловирусная инфекция протекала под «маской» синдрома дыхательных расстройств (болезнь гиалиновых мембран), в 25% ~ гипоксически-геморрагического поражения центральной нервной системы.

Выявлена взаимосвязь между фактом внутриутробной цитомегаловирусной инфекцией и вероятностью развития хронического заболевания легких (бронхо-легочной дисплазии) у недоношенных детей.

Практическая значимость.

На основании полученных данных о распространенности цитомегаловирусного инфицирования среди недоношенных детей с сочетанной перинатальной патологией представлено обоснование для организации лабораторного скрининга в отделениях реанимации и интенсивной терапии.

Доказана необходимость использования двух методов лабораторной диагностики: быстрого культурального метода и метода полимеразной цепной реакции, а также исследование двух биологических жидкостей -крови и мочи, в динамике.

Серологические методы диагностики у недоношенных детей, родившихся с низкой и экстремально низкой массой тела, рекомендованы для уточнения фазы течения инфекции.

У недоношенных детей, родившихся с низкой и экстремально низкой массой тела, с клиническими проявлениями генерализованной инфекционной болезни, пневмонией, учитывая высокий риск развития хронического заболевания легких, в раннем неонатальном периоде обосновано использование иммуноглобулинов для внутривенного введения, содержащие высокие титры специфических антител.

Внедрение в практику.

Практические рекомендации использованы в работе отделения реанимации и интенсивной терапии новорожденных ГБ №8 КЗ г.Москвы.

Выводы.

1. Частота внутриутробной цитомегаловирусной инфекции у недоношенных новорожденных с сочетанной перинатальной патологией составила 47%. Установлено, что наибольшая частота внутриутробной цитомегаловирусной инфекции отмечается у недоношенных новорожденных с гестационным возрастом 28-32 недели - 54%, менее 28 недель - 17%, более 32 недель - 25%.

2. К факторам, повышающим риск внутриутробного инфицирования плода цитомегаловирусом, относятся: обострение во время настоящей беременности хронических заболеваний соматических в 64% и гинекологических в 79% случаев, угроза прерывания беременности - 95%, многоводие - 14%, наличие в анамнезе матерей самопроизвольных выкидышей - 32%, преждевременное излитне околоплодных вод - 73%, ГВ менее 32 недель.

3. Течение внутриутробной ЦМВИ у недоношенных новорожденных с очень низкой и экстремально низкой массой тела в неонатальном периоде характеризуется выраженным клиническим полиморфизмом. При рождении внутриутробная ЦМВИ протекала в 27% случаев в виде генерализованного инфекционного заболевания, в 40% как внутриутробная пневмония с выраженным интерстициальным компонентом. В 8% случаев внутриутробная цитомегаловирусная инфекция протекала под «масками» синдрома дыхательных расстройств (болезнь гиалиновых мембран), в 25% -гипокснчески-геморрагического поражения центральной нервной системы.

4. Динамическое наблюдение за детьми с верифицированной ЦМВИ позволило установить, что частота развития хронического заболевания легких в этой группе детей в 1,7 раза выше, чем у детей с другой инфекционной и неинфекционной патологией.

5. Сопоставление результатов лабораторного обследованиям показало, что частота выявления цитомегаловирусной инфекции у недоношенных новорожденных в клинических условиях быстрым культуральным методом выше, чем и методом полимеразной цепной реакции.

6. Сравнительный анализ результатов исследования крови и мочи показал, что быстрым культуральным методом вирус цитомегалии в биологическом материале обнаруживался в 2 раза чаще в моче, чем в крови; в тоже время методом полимеразной цепной реакции ДНК цитомегаловируса выявляется практически с одинаковой частотой, как в моче, так и в крови.

7. Серологические тесты у недоношенных новорожденных не являются специфичным и в раннем неонатальном периоде не позволяют уточнить, приведет или нет инфицирование цитомегаловирусом к развитию инфекционной болезни.

8. Сопоставление данных патоморфологического исследования с результатами клинико-лабораторного обследования недоношенных новорожденных показало, что по характеру и выраженности воспалительных изменений в органах умерших детей не всегда можно поставить диагноз внутриутробной ЦМВИ после гистологического исследования в связи с отсутствием специфических морфологических признаков заболевания - клеток типа «совиный глаз», что еще раз повышает значение лабораторных методов исследования в комплексной диагностике.

Практические рекомендации.

1. Все дети с низкой и экстремально низкой массой тела, поступающие в отделения реанимации и интенсивной терапии, требуют включения обследования на цитомегаловирусную инфекцию.

2. Информативность лабораторных методов исследования повышается в случае использования в клинической практике сочетания быстрого культурального метода и метода полимеразной цепной реакции в моче и крови.

3. Специфическая противовирусная терапия должна проводиться в случаях получения положительных результатов исследования у недоношенных новорожденных с сочетанной перинатальной патологией.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Федорова Н.Е., Меджидова М.Г., Воронцова Ю.Н., Дегтярев Д.Н., Pustowoit В., Асади Мобархан С.М., Саматова М.М., Кущ А.А., Володин Н.Н. Количественные лабораторные методы для диагностики цитомегаловирусной инфекции у недоношенных новорожденных детей. / «Вопросы вирусологии». 2005 - т. 50, № 1, с. 9-14.

2. Воронцова Ю.Н., Володин Н.Н., Дегтярев Д.Н., Кущ А.А., Федорова Н.Е., Меджидова М.Г., Асади Мобархан А.Х., Асади Мобархан С.М., Ряполова И.В. Особенности клинических проявлений врожденной цитомегаловирусной инфекции у недоношенных новорожденных. / «Российский вестник перинатологни и педиатрии», Москва, 2004 — т. 49, №2, с. 60-66.

3. Адуева С.М., Меджидова А.А., Меджидова М.Г., Федорова Н.Е., Кущ А.А., Ильина Е.Н., Малахова М.В., Говорун В.М., Алямасольская Г.А., Кешищян Е.С., Воронцова Ю.Н., Солдатова И.Г., Дегтярева М.В. Лабораторная диагностика цитомегаловирусной инфекции у детей раннего возраста. // мат. научно-практического симпозиума «Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении» в рамках Международной конференции «Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины», Москва, 20-21 июня, 2002, с.249-251.

4. Воронцова Ю.Н., Дегтярев Д.Н. Комплексный подход к диагностике цитомегаловирусной инфекции у недоношенных детей. 2003 // Тезисы докладов. В сборнике материалов V-ого Российского Форума «Мать и дитя». Москва стр.518.

5. Дегтярев Д.Н., Воронцова Ю.Н., Бабак О.А. Диагностика перинатальной цитомегаловирусной инфекции у новорожденных детей // Материалы 2-ого Российского Конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии». Москва. 2003, Стр.188.

6. Дегтярева М.В., Бояджан М.Б., Солдатова И.Г., Лесникова Ю.Н. Опыт применения Ронколейкина у детей с хроническими инфекционновоспалительными заболеваниями мочевой системы. // Тезисы докладов IX Российского Национального Конгресса «Человек и лекарство». Москва. 2002 Стр.127.

7. Дегтярёва М.В., Солдатова И.Г., Воронцова Ю.Н. Влияние виферона на апоптоз лимфоцитов при неонатальных инфекциях. // Материалы 4-ого Российского Форума «Мать и дитя», часть 2, г. Москва. 2002 Стр.543.

8. Дегтярёва М.В., Солдатова И.Г., Воронцова Ю.Н., Симбирцев А.С. Диагностическая и прогностическая роль цитокинов при сепсисе у глубоконедоношенных детей. // Материалы 4-ого Российского Форума «Мать и дитя», часть 2, г.Москва. 2002 Стр.544.

9. Дегтярёва М.В., Солдатова И.Г., Воронцова Ю.Н. Применение препарата Виферон-1 в комплексной терапии неонатальных бактериальных пневмоний. // Тезисы докладов X Российского Национального Конгресса «Человек и лекарство». г.Москва. 2003 Стр.167