Автореферат и диссертация по медицине (14.03.10) на тему:Диагностическое значение различных лабораторных методов выявления трихомоноза у мужчин

11-1

37 На правах рукописи

САПОЖКОВА ЖАННА ЮРЬЕВНА

ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ЛАБОРАТОРНЫХ МЕТОДОВ ВЫЯВЛЕНИЯ ТРИХОМОНОЗА У

МУЖЧИН

14.03.10 - КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА

АВТОРЕФЕРАТ

ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА МЕДИЦИНСКИХ НАУК

Москва - 2010 г.

Работа выполнена на кафедре клинической лабораторной диагностики

ГОУ ДПО Российской медицинской академии последипломного образования

Росздрава

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор медицинских наук, профессор

Шабалова Ирина Петровна

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук

Полонская Н.Ю.

Евдокимов В. В.

Ведущее учреждение - ГОУ ВПО РГМУ им. Н.И.Пирогова

Защита состоится «$

2010 г В 10.00 часов на заседании

Диссертационного Совета Д 208.071.04 при Российской Медицинской Ахадешш последипломного образования (123995, г. Москва, ул. Баррикадная д. 2)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российской Медицинской Академии последипломного образования по адресу: 123445, г.Москва, ул. Беломорская, д. 19

2010 года

Ученый секретарь Диссертационного Совета, доктор медицинских наук, профессор

Морозова В.Т.

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ БИБЛИОТЕКА 2011

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. Показатели заболеваемости инфекций передаваемых половым путем (ИППП) по-прежнему остаются на высоком уровне (WHO, ГМЦ РОССТАТ, 20072008). В структуре ИППП первое место занимает урогенитальный трихомоноз и в последние десятилетия показатели заболеваемости трихомонозом в РФ не имеют тенденции к снижению. У мужчин данная патология выявляется значительно реже, чем у женщин - соотношение достигает 1:4 (Вейнеров И.Б., Рожинский Л.М.. 1956; Sutclifte S el al. 2006; Neha N el al. 2006). ВОЗ констатирует, что у мужчин 11% уретритов негонококковой этиологии вызваны Trichomonas vaginalis (Tr.vaginalis). В 30% случаев трихомоиадный уретрит негонококковой этиологии протекает в острой форме, в 60-70% - в хронической форме или бессимптомно. Кроме уретры при трихомонозе у 30-50% мужчин поражаются семенные пузырьки, предстательная железа, бульбоуретральные (куперовы) железы, мочевой пузырь, почечные лоханки. По данным разных авторов хроническая трихомонадная инфекция может приводить к бесплодию, облегчению передачи ВИЧ-инфекции, повышению риска возникновения рака предстательной железы (Молочков В.А 2000; Раводин Р.А, 2005; Теличко И.Н., 2007; Johnston V.J. et al. 2008, Shafir S.C. et al.,2009).

На протяжении многих десятилетий исследователи занимались изучением структурно-функциональных характеристик Tr.vaginalis типичной грушевидной формы (Беднова В.Н., 1989; Овчинников Н.М., Делекгорский В.В.. 1986; Васильев М. М.,1990; Benchimol М.,2004). Однако в литературе имеются сведения об обнаружении при микроскопическим исследовании окрашенных мазков помимо классических - других морфотипов Tr.vaginalis, в частности амебовидной, округлой, без видимых жгутиков. Мнения о том, являются ли эти формы проявлением реакции на неблагоприятные условия обитания, стадиями развития трихомонады, следствием высушивания препарата на воздухе или особым видом возбудителя весьма противоречивы, однако большинство авторов отрицает наличие особых, «атипичных» форм трихомонад (Клименко Б.В. 1987; Вахнина Т.Е. с соавт., 1990; Ильин И.И., 1991; Борисов Л.Б. с соавт.,1993; Кисина В.И. с соавт.1996; Межевитинова Е.А., 1999; Дмтриев Г.А.. 2005; Раздольская Н.В.. 2009). В связи со сложностями идентификации различных морфологических форм простейших в клиническом материале, а также с их дифференцировкой от других клеточных элементов (Дмитриев Г А. 2003; Petrin D. et al., 1998; Krieger J.N. et al., 1999), возможны ошибки, носящие характер гипердиагностики: трихомонады принимают макрофаги, метаплазированные клетки, дегенеративно измененные эпителиальные клетки и другие

Во избежание подобных ошибок Приказы Минздрава СССР, РФ методические материалы по лабораторной диагностике трихомоноза регламентируют идентификацию '.vaginalis исключительно но наличию типичных морфо-тинкториальных форм Такая осторожность оправдана в связи с тем, что метод световой микроскопии имеет определенные ограничения и в значительной степени зависит от профессионализма и опыта исследователя. В существующей ситуации важно получение объективных, основанных на принципах доказательной медицины, светооптических цитоморфологическнх характеристик различных морфотипов трихомонад. Для объективной интерпретации диагностической значимости микроскопических критериев перспективным направлением могут быть математические подходы в их оценке на основании четко описанных цитоморфологическнх признаков Гг.vaginalis.

Данные о заболеваемости урогешгтальным трихомонозом зависят исключительно результатов лабораторных исследований. Многообразие методов лабораторной агностики трихомоноза наряду с положительным эффектом, в определенной мере, приводит к разночтению результатов исследований. В доступной литературе отсутствует сравнительный анализ информативной значимости методов, применяемых в диагностике урогешггального трихомоноза у мужчин, что, в свою очередь, вызывает разноречивую оценку их чувствительности и специфичности (Лилова Е.В., 2004), Диагностические свойства лабораторных методов варьируют в широких пределах и зависят от целого ряда факторов: длительности заболевания, локализации воспалительного процесса, и соответственно, выбора оптимального биоматериала для исследования, правильности соблюдения преаиалитического этапа лабораторного тестирования и другие. Существующая в лабораторной диагностике трихомоноза ситуация требует усовершенствования диагностической системы анализа, выбора наиболее информативных методов, создашм оптимальных алгоритмов лабораторной диагностики. Последнее невозможно без сравнительного изучения диагностической точности от; льных методов, как традиционных, так и претендующих на практическое внедрение.

В этой связи научный анализ и разработка направлений, способных повысить эффективность лабораторной диагностики урогенитального трихомоноза у мужчин, являются актуальными.

Цель исследования повышение эффективности диагностики

урогенитального трихомоноза у мужчин путем оптимизации взятия биоматериала больных и рационального использования лабораторных методов.

Задачи исследования.

1. Выявить наиболее информативный биоматериал для диагностики урогенитального трихомоноза у мужчин.

2. Создать математическую модель описания характерной микроскопической картины с учетом диагностической ценности признаков.

3. Разработать калькулятор рисков ошибочного заключения о наличии трихомонадного процесса.

4. Оценить диагностическую эффективность различных методов выявления

Tr.vaginalis: микроскопического, реакции непрямой иммунофяюоресценцип (РНИФ), культурально-микроскопического исследования диагностикумом «Vagicult» п осадке эякулята.

5. Разработать алгоритм диагностики урогенитального трихомоноза у мужчин при отсутствии Тг.vaginalis в окрашенных препаратах из уретрального отделяемого.

6. Создать документированный архив изображений различных морфотипов Тг.vaginalis в ценгрифугате эякулята.

Научная новизна работы.

На основании научного анализа на большом числе наблюдений установлено, что исследование осадка центрифугата эякулята является наиболее информативным в диагностике трихомоноза мужчин.

С помощью метода бинарной логистической регрессии построена математическая модель вероятной микроскопической картины для определения значения различных микроскопических признаков в постановке диагноза трихомоноза.

Разработан калькулятор рисков формирования ошибочного заключения о наличии трихомонадного процесса.

Показано, что для выявления Tr.vaginalis в осадке центрифугата эякулята из методов, вошедших в данное исследование, наиболее эффективными являются микроскопический метод совместно культурально-микроскошгческим

исследованием диагностикумом «Vagicull»

Разработан алгоритм лабораторной диагностики трихомоноза у мужчин при отсутствии Tr.vaginalis (светооптическип уровень исследования) в окрашенных мазках из уретрального отделяемого.

Установлены цитоморфологические критерии идентификации различных морфотипов Tr.vaginalis в окрашенном осадке центрифугата эякулята.

Практическая значимость исследования.

Микроскопическое и культурально-микроскопическое (диагностикумом «Vagicult») исследование осадка центрифугата эякулята, окрашенного по Маю-Грюнвальду-Гимзе, могут быть рекомендованы в практику клинико-диагностических лабораторий для выявления Tr.vaginalis у мужчин.

Применение математической модели поможет повысить диагностическую значимость микроскопического метода путем объективной оценки признаков.

Калькулятор рисков формирования ошибочного заключения о наличии трнхомоиадного процесса может служить вспомогательным диагностическим инструментом в практической работе врачей клинико-диагностических лабораторий.

Алгоритм обследования мужчин с подозрением на трихомоноз может быть использован в практике клинико-диагностических лабораторий для подтверждения 'лючення диагноза «урогенитальный трихомоноз». при наличии симптомов урогешггалыюй инфекции отсутствии Tr.vaginalis в окрашенных мазках из уретрального отделяемого.

Архив цитологических изображений различных морофотипов трихомонад в осадке центрифугата эякулята может служить основой разработки справочно-информационного пособия для практической работы врачей клинической лабораторной диагностики.

Внедрение результатов в практику .

'льтаты работы внедрены в практику клинико-диагностической лаборатории Городской клинической больницы №1 г Старый Оскол Белгородской обл.: ФГУ «Клиническая больница УДП РФ» г Москва, МУ «Пошнишника ФНПР» г.Москва.

Основные положения, выносимые на защиту:

Микроскопическое исследование осадка центрифугата эякулята, окрашенного по Мага-Грюнвальду-Гимзе, улучшает выявление Tr.vaginalis. Математические подходы в оценке цитоморфологических критериев Tr.vaginalis повышают диагностическую значимость микроскопического метода за счет объективного анализа признаков.

Определена диагностическая ценность микроскопического, культурально микроскопического исследования и РНИФ в осадке центрифугата эякулята для выявления урогенитального трихомоноза у мужчин.

Личный вклад автора.

Результаты, представленные в работе, получены лично автором. Выполнены микроскопические исследования материала у 2114 мужчин; создана база данных в электронном виде из более чем 1000 микрофотографий (видеоизображении) различных морфотипов трихомонад из более чем 1000 микрофотографий в электронном виде, полученных с цитологических препаратов осадка центрифугата эякулята, а также около 100 изображений, полученных с препаратов, по которым допущены диагностические ошибки; выполнялось культурально-микроскопическое исследование с использованием диагностикума «Vagicult».

Автором лично планировались исследования, формировалась база данных, проводилась статистическая обработка и обобщение полученных результатов.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены на совместной научной конференции кафедры клинической лабораторной диагностики и кафедры лабораторной микологии ГОУ ДПО РМАПО Росздрава 03.02.2010г. Доклады по результатам работы публично представлены на Всероссийском Конгрессе по андрологии (Сочи-Дагомыс, апрель, 2007г), научно-практической конференции «Лабораторное обеспечение стандартов медицинской помощи» (Москва, март, 20 Юг), Ш-ей Междисциплинарной научно-практической конференции «Урогенитальные инфекции и репродуктивное здоровье: клинико-лабораторная диагностика и терапия» (Москва, май, 2010 г).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ в периодических медицинских изданиях в России, в том числе в изданиях, рекомендованных ВАК - 1 работа. Остальные работы опубликованы в сборниках научно-исследовательских статей, материалах съездов, конференций и симпозиумов.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения. 4 глав, вюпочая обзор литературы, заключения, выводов, практических рекомендаций списка литературы. Работа содержит 23 таблицы, 21 рисунок, 6 диаграмм, 12 формул, 1 схему - алгоритм. Изложена на 135 страницах машинописного текста. Список литературы включает 150 наименований, из которых 56 отечественных и 94 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа проводились в период с 2000-2008 гг. на базе Городской Клинической

Больницы №1 города Старый Оскол Белгородской области, ФГУ «Клиническая больница Управления делами Президента РФ» города Москвы. В исследование было

включено 2114 мужчин. 2026 из них имели клинические жалобы, не позволяющее исключить наличие трихомонадного процесса. Эти мужчины составили основную группу исследования для сравнения эффективности наиболее доступных современных методов диагностики трихомоноза. 88 клинически здоровых мужчин, которые обращались в поликлинические урологические службы тех же клиник для профилактического осмотра, были отнесет.г к контрольной группе.

У всех 88 человек контрольной группы и 195 пациентов основной группы было полу чено 4 вида биоматериала с целью установления самого диагностически значимого для выявления трихомоноза у мужчин: уретральное отделяемое (УО), первая порция мочи (ППМ), секрет предстательной железы (СПЖ) и эякулят (ЭЯ). Остальные мужчины основной группы (1831 человек) по различным причинам отказались участвовать в этом клиническом эксперементе.

Для анализа морфологии Tr.vaginalis использовали методику световой микроскопии в сочетании с окрашиванием осадка ППМ, СПЖ, УО, цельного ЭЯ по Маю-Грюнвальду-Гимзе (набор Kit Ral 555) (Reactifs RAL, Франция); реакцию непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) с окрашиванием того же клинического материала флюоресцентными красителями (набор ТрихоСкан, ООО «Лабди агностика», Россия); микроскопический метод с окрашиванием осадка эякулята по Маю-Грюнвальду-Гимзе. Для просмотра окрашенных препаратов использовали световой микроскоп «Биолам» (JTOMO. С.-Петербург), микровизор проходящего света |rVizo -103 (ЛОМО. С.-Петербург), люминесцентный микроскоп Микмед-2В.11 (ЛЮМАМ РГЮ-] 1).

Микрофотографии в электронном виде получали помощью системы цитологических изображений "ВидеоТесТ - Морфология-4.0" и jrVizo-103 (ЛОМО, С.Петербург).

Для культурально-микроскопического исследования Tr.vaginalis использовали днагпостикум «Vagicult» (Orion Diagnostica Оу, Финландия) - триптиказно-основной питательный бульон во флаконах добавлением овечьей сыворотки

(модифицированный вариант среды Diamonds).

Статистическую обработку полученных результатов осуществляли методами параметрической статистики с вычислениями доверительных интервалов абсолютных и относительных величин и доверительности разницы результатов. Для этого в исследуемых выборках определяли среднее арифметическое значение частоты встречаемости исследуемого показателя среднеквадратичную ошибку.

Достоверность различий средних значений в двух сравниваемых выборках оценивали

с использованием двустороннего критерия Стыодента. При множественных

сравнениях выборок с контрольной группой применяли поправку Бонферрони.

Расчетные значения сравнивали с критическими значениями, указанными в таблице

(Гланц С. 1999). Достоверными считали различия при уровне значимости не больше

0,05. Расчеты проводились с помощью компьютерной программы «Microsoft Excel».

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выбор панболее информативного биоматериала для обнаружения Tr.vaginalis у мужчин

Для решения этой задачи исследовали материал, полученный у 195 мужчин с

урогенитальными жалобами (основная группа) и у 88 человек без жалоб (контрольная группа). Для обследования мужчин обеих групп методом микроскопии окрашенного мазка (MOM), культурально-микроскопическим диагностикумом «Vagicult» и РНИФ пациентами было предоставлено 4528 образцов клинического материала: УО, ГШМ, СПЖ и цельного ЭЯ (табл. 1).

Таблица 1

Сравнительная оценка выявления Tr.vaginalis у мужчин основной группы (п=195) в различном биоматериале

Методы Количество пациентов основной группы (абс, %), у которых выявлены трихомонады

УО ППМ СПЖ ЭЯ цельный

Абс., и % Абс..п % Абс.,п % Абс..п %

МОМ 15 7,69±1,91 16 8,21±1,97 17 8,72±2,02 24 12,30±2,35

РНИФ 13 6,67±1,79 14 7,18±1,85 12 6,15±1,72 20 10,25±2Л7

«Vagicult» 15 7,69±1,91 16 8,21±1,97 18 9,23±2,07 21 10,77±2,22

р > 0,05

У мужчин без жалоб трихомонады обнаружены не были. У пациентов с урогенитальными жалобами (табл.1) наблюдалось достоверного отличия

выявления трихомонад в цельном ЭЯ и УО, Г1ПМ, СПЖ всеми используемыми методами (р>0,05), однако наибольший процент выявления трихомонад (12,3%) отмечен при исследовании эякулята с помощью МОМ. Учитывая этот факт, проведена сравнительная оценка результатов выявления Tr.vaginalis в цельном эякуляте и его центрифугате. С этой целью у 2026 мужчин с урогенитальными жалобами (основная группа) и 88 мужчин без жалоб были исследованы образцы спермы с помощью микроскопии окрашенного осадка эякулята (МОЭя). Отличие МОЭя от МОМ в преаналитическом этапе лабораторного тестирования: для анализа используется не

цельный эякулят, а его осадок после центрифугирования и отделения спермоплазмы.

(табл.2).

Таблица 2

Сравнительная оценка частоты обнаружения ТгуайшаИБ у мужчин МОМ и МОЭя

Группы обследования п МОМ (цельный эякулят) МОЭя (центрифугат эякулята)

Абс. (%) Абс. (%)

Пациенты с урогекитальными жалобами 2026 300 14,81±0,79 729* 35,98±1,07

Контрольная группа 88 0 0 0 0

*р< 0,001

В контрольной группе простейшие этим методом также обнаружены не были. Анализ полученных данных (табл. показал достоверные отличия результатов, полученных при МОМ и МОЭя (р<0,001), а также достоверные отличия результатов, полученных в соновной группе по сравнению с контрольной (р<0,001). У пациентов основной фуппы Tr vaginalis в центрифугате эякулята выявляли в 2,6 раза (на 21%) чаще, чем в цельной сперме. Данный факт указывает на то, что у мужчин с урогенитапъными жалобами при отсутствии трихомонад в уретральном отделяемом исследование осадка спермы предпочтительнее исследования цельног о эякулята.

Диагностическое значение используемых лабораторных методов выявления трихомонад в цеитрнфугате эякулята.

В пашей работе оценка методов основывалась на сравнении результатов теста с

результатом микроскопии окрашенного осадка ценгрифугата эякулята (МОЭя). Тщательный пересмотр препаратов независимым экспертом с учетом различных морфотипов арихомонад позволил подтвердить первично установленный диагноз в 729 из 794 наблюдений, которые в дальнейшей работе расценивались как положительные по наличию трихомоиад. Результаты были подтверждены клинически: у всех 729 больных лечение оказачось эффективным. У 1297 мужчин, у которых трихомонады микроскопически не были найдены, диагноз «урогешггальный трихомоноз» был исключен.

Сравнение результатов обнаружения Tr. vaginalis в центрифугате спермы различными методами представлено в таблице 3.

Оценка результатов МЕТОДЫ

РНИФ,п «Уайюик»,п

Истинноположительные (ИП) 548(75,17± 1,6)* 717(98,35±0.47)**

Критерий Стьюдента (1) 15,43 3,2

Истинноотрицательные (ИО) 1180(86,2±0,96)* 1056(81,42±1,8)*

Критерий Стьюдента (1) 14,33 17,13

Ложноотрицательные (ЛО) 181 12

Ложноположительные (ЛП) 117 241

*р< 0,001 **р>0,05

В скобках указаны дота совпадений с результатами микроскопии.

Для оценки доли совпадений методов с результатами микроскопии (табл.3), были рассчитаны критерии Стьюдента По количеству полученных отрицательных результатов все методы достоверно отличаются от микроскопии (р<0,001). По количеству полученных положительных результатов только РНИФ достоверно отличается от микроскопии (р<0,001). Как видно из табл.3, достоверного отличия между положительными результатами микроскопии и культурального метода наблюдается (р>0,05). Полученные данные послужили основой расчета информационной значимости методов лабораторной диагностики трихомоноза в осадке ценгрифугата эякулята.

Информационная значимость РНИФ, культурально-мнкроскопнческого днагностнкума «\^киИ» в окрашенном осадке эякулята.

Для оценки информативности используемых методов лабораторной диагностики

применяли следующие характеристики: чувствительность (Ч), специфичность (С), прогностическая ценность положительного (ПЦ+) и отрицательного (ПЦ-) результатов. Чтобы оценить диагностическую значимость используемых в нашей работе клинических тестов, мы рассчитывали долю пациентов с нормальным и патологическим результатом, совпадающим микроскопией. Термины «положителъньш результат теста» и «отрицательный результат теста» использовали в их обычном значении для обозначения наличия или отсутствия заболевания соответственно.

Мы расчитали информативную значимость для каждого метода исследования осадка центрифугата эякулята, используя ИП, ЛО, ЛП и ИО результаты (табл.4).

Сравнительная оценка информационной значимости методов выявления трихомонад

в центрифугате эякуляте

Параметры информационной значимости РНИФ «Уа§1си1&>

Чувствительность,% 75,2% 98,3%

Специфичность, % 90,9% 81,4%

Прогностическая ценность, %: положительного результата +РУ=82,4 +РУ=74,8

отрицательного результата -РУ=0,13 -РУ=0,01

Анализ результатов (табл.4) позволяет судить об информативности методов выявления трихомонад в осадке спермы. Культурально-микроскопическнй диагностикум «Уа^рсии» отличается высокой чувствительностью (98,3%), прогностической ценностью положительного результата (74,8%), но невысокой специфичностью (81,4%). РНИФ показала высокую специфичность (90,9%) при низкой чувствительности (72,5%).

Параметры эякулята при обнаруженной Тгла^паНз

Основываясь на микроскопическом опыте обнаружения различных морфотипов трихомонад в осадке центрифугата спермы, мы выделили некоторые разновидности микроскопической картины эякулята и его физико-химических свойств.

Наиболее частая разновидность параметров спермограммы была представлена асгспотсратозооспермисй, днскынезией, пиоснермисй, гемоспсрмисй при нормальном объеме эякулята и физико-химических свойствах. Другая разновидность параметров эякулята - нарушение вязкости спермы - вискозипатия (при наличии слизи), как \чсдствие агглютинация, агрегация сперматозоидов, а также пноспермия, гемоспсрмия. Третья разновидность картины спермы - олигоастеиотератозоосаермия, Д11СКН11СЗИЯ, гемоспсрмия при нормальном уровне лейкоцитов. Четвертая разновидность - астснозооспермня при неизмененных других показателях эякулята. Пятая разновидность параметров эякулята - отсутствие отклонений в физико-химических свойствах и морфологии сперматозоидов на фоне пноспермии и гемоспермин. Шестая разновидность спермограммы пормозооспсрмия. Необходимо отметить, что при постановке диагноза «урогенитальный трихомоноз» важно принимать во внимание три косвенных признака присутствия трихоманад: характер осадка центрифугата эякулята -он представляет собой штатную «песочную» субстанцию с примесью гноя, эритроцитов, слизи; бон окрашенного препарата осадка центрифугата спермы - он, как правило, лишен гомогенного оксифильного вещества эякулята, а представлен обильным

мелкозернистым веществом, массами клеточного распада и массами продуктов жизнедеятельности трихомонад; зернистый не «стекловидный» характер препарата па предметном стекле. Наличие этих трех показателей может сориентировать врача клинической лабораторной диагностики на более тщательный поиск трихомонад в осадке спермы.

Цитоморфологические критерии идентификации различных морфотинов "Гг. vaginalis в осадке эякулята. Анализ диагностических ошибок.

Во всех окрашенных по Маю-Грюнвальду-Гимзе препаратах центрифугата

спермы выявляли различные морфотины Tr.vaginalis со значительными вариациями размера, формы, цвета цитоплазмы и ядра. Простейшие отличались друг от друга в пределах одного препарата и у разных пациентов. К признакам, позволяющим идентифицировать обнаруженную клетку как трихомонаду, относится сильно вакуолизированная цитоплазма, ядро, имеющее форму сливовой косточки и миндалевидное, неравномерно прокрашенные внутриядерные зоны, синяя линия перипласта по краям цитоплазмы, отчетливые жгутиковые корешки и свободные жгутики, даже при отсутствии ундулирующей мембраны и асксостиля (признаю! представлены в табл.5). Типичная микроскопическая картина Tr.vaginalis представлена на рис. 1.

<& %

Рис.1 Астенотератозооспермия. Трихомонада на фоне элементов спермы (сперматозоиды, д.* „ эпителиальные клетки, смешанная

флора и т.д.) Препарат осадка эякулята (микроскопический метод). Окраска по Маю-Грюнвальду - Гимзе. хМОО

В процессе работы имели место случаи неподтвержения первично найденных трихомонад при пересмотре окрашенных препаратов осадка спермы независимыми специалистами: за Тгл^шаПз были приняты другие клеточные элементы эякулята -сперматиды, цитоплазматические капли, остаточные тельца и артефакты (рис.2).

I . Ш w

Jt* m Рис 2

Ш Щ * * WV *» ис /

%

If Астенозооспермия.

^ЩШ- л Клетка (указана стрелкой) - вероятно,

Л**/*? ''■:" „«С * диагностическая ошибка при

> 9 f

^ ^ ^ . микроскопической диагностике - # Л трихомоноза.

% - # ^ ц? Препарат осадка эякх'лята

(микроскопический метод). Окраска по ^ ^ * ^Оь ч, Маю-Грюнвалъду - Гимзе. хЮОО.

и' V: Л* *

В результате проведенных исследований, заключение о диагностической значимости перечисленных морфоцитологических признаков являлось субъективным, и без использования разработанной математической модели могло бы привести к ошибкам первичного заключения о наличии Тг.vaginalis в образце при микроскопическом исследовании.

Математическая модель формирования ошибочного заключения о наличии Тг.vaginalis в образце по микроскопической картине. Теоретическая оценка эффективности модели.

Для оценки значения различных цитоморфологических критериев при формировании экспертного заключения о наличии различных морфотипов Tr.vaginalis в образце необходимо оценить вероятность (риск) ошибочного диагноза в присутствии каждого из исследованных микроскопических признаков и их сочетаний. Оценка факторов риска осуществлялась с использованием метода логистической регрессии. Процесс построения модели осуществлялся в несколько этапов. На первом этапе была введена кодировка микроскопических признаков (табл.5) по принципу: «1» - признак, с которым связан максимальный риск ошибки, «О» - признак, с которым связан минимальный риск ошибки.

Цитоморфологические признаки идентификации различных морфотипов Тг. vaginalis __в осадке эязсулята* *. _

Признаки Проявление признаков Код

Размер (х1)* 1-6 мкм 0

7-12 мкм 1

Форма цитоплазмы (х2) округлая или округло-грушевидная 1

Иная 0

Контур цитоплазмы (хЗ) Ровный 0

Неровный 1

Цвет цитоплазмы (ч4) сиреневая или сиренево-голубая 1

нежно-голубая 0

Включения цитоплазматические (х5) наличие мелких и крупных вакуолей и включений 1

отсутствие вакуолей и включений 0

синяя линия перипласта по краям цитоплазмы (хб) присутствует по всему краю цитоплазмы 1

отсутствует или присутствует частично по краям цитоплазмы 0

Жгутики (х7) Отсутствуют 0

присутствуют жгутиковые корешки 1

Форма ядра(х8) округлое или неправильной формы 0

миндалевидное или в форме «сливовой косточки» 1

Расположение ядра относительно центра клетки (х9) по центру цитоплазмы или ближе к ее центру 1

эксцентрическое, ближе к периферии цитоплазмы 0

Окраска ядра (хЮ) розово-фиолетовое равномерно прокрашенное 0

розово-фиолетовое, имеющее неравномерно-прокрашенные зоны 1

*в скобках указано обозначение соответствующей переменной

** указана кодировка значений морфощггологических критериев для построения уравнения бинарной логистической регрессии

Достоверность первичного микроскопического заключения о наличии трихомонады в образце считали зависимой переменной, если, по мнению экспертов, первичное заключение было ошибочным, переменной присваивали значение (максимальный риск ошибочного диагноза), если эксперты подтверждали первичное выявление трихомонады в образце - «О» (минимальный риск ошибочного диагноза). При построении модели оценивали совокупность выявленных в каждом случае морфощггологических критериев и риск ошибочного заключения. С учетом условий, описанных выше, была построена модель формирования заключения о наличии

трихомонады по совокупности морфоцитологических критериев с использованием метода бинарной логистической регрессии вида:

'=ехр(Ь(0)+Ь(1)*х1+Ь(2)*х2+Ь(3)*хЗ+Ь(4)*х4+Ь(5)*х5+Ь(6)*х6+ +Ь(7)*х7н-Ь(8)^х8+Ь(9)*х9+Ь(10)*х^ Ь(5)*х5+Ь(6)*х6-1- +Ь(7)*х7+Ь(8)*х8+Ь(9)*х9+Ь(10)*х10)],

вероятность ошибочного заключения (1 диагноз, подвергнутый экспертами сомнению, 0 - истинное заключение);

независимые переменные, в качестве которых были использованы микроскопические характеристики, значения которых были закодированы (таблица 7).

Ь(0 - коэффициенты уравнения логистической регрессии; Ь(0) свободный член уравнения, описывающий эффекты, возникающие независимо от признаков XI Были рассчитанны коэффициенты логистической регрессии (табл.6) и найдено значение величины логарифмического правдоподобия -2*log(Likelihood) составляло: 417,82. Величина критерия «хи-квадрат» равна 56,80520, что свидетельствует о том, что вероятность независимости значения у от переменных х(г) очень мала (р 0,00001).

Таблица 6

Коэффициенты логистической регрессии

Переменная Признак Значение коэффициента, b (i)

х(1) Форма цитоплазмы -9,82557

х(2) Размер -8,06452

х(3) Контур -3,57881

х(4) Цитоплазма цвет -38.0449

х(5) Цитоплазма включения -4,61660

х(6) Синяя линяя перипласта -14,5159

х(7) Жгутики -41,5532

х(8) Форма ядра -7,26645

х(9) Расположение ядра 0,123713

х(10) Ядро окраска -0,247125

х(0) 58,48078

Качество модели оценивали по характеристической кривой (ROC). Площадь под кривой, являясь показателем надежности модели, составляет 0,918.

В соответствии с рекомендациями О.Ю.Ребровой (2002), предсказательная способность представленной модели классифицировалась как «очень хорошая». Также рассчитывали параметр «Отношение несогласия» (ОН), который представляет собой отношение произведения чисел правильно классифицированных наблюдений к произведению чисел неправильно классифицированных. Отношение большее показывает, что данная модель работает лучше, чем отбор параметров случайным образом. Для данной модели ОН выше 9,5. Таким образом, можно предположить, что полученная модель обладает высокой прогностической ценностью и может быть использована для сравнения рисков ошибочного заключения о наличии Тг. vaginalis в образце по выявленным морфоцитологическим признакам. Рассчитывали порговое значение, при котором риск ошибочного первичного заключения минимален. Пороговое значение у для данной модели составило 0,0343, при этом специфичность (показатель количества истинно отрицательных результатов) составил 98,5 %, а чувствительность модели 98,4% (показатель количества истинно положительных результатов). Согласно литературным данным, такая величина чувствительности и специфичности достаточна для того чтобы правильно оценить факторы риска.

Показатель вероятности ошибочного первичного заключения рассчигывапись путем подставления в уравнение логистической регрессии соответствующих коэффициентов из таблицы 6. Полученные результаты не являются абсолютной величиной вероятности возникновения ошибки в присутствии того или иного морфологического признака, но пропорциональны ей. Соответственно, используя указанную формулу, можно сделать шкал}' классификации исследованных морфоцитологических признаков по их значению в постановке верного микроскопического диагноза (таблица 7).

Кумулятивные показатели вероятности ошибочного микроскопического

заключения Tг.vagшalis в образце по выявленным морфоцитологическим признакам*

Признаки н их сочетание Кумулятивный показатель вероятности ошибочного диагноза

Наитие э/сгутиков 0,99

Пороговое значение 0,034

Отсутствие жгутиков, размер 5-8 мкм, цитоплазма сиреневая или сиренево-голубая, форма клетки округлая, округло-грушевидная или иная другая, контур клетки неровный, ядро полиморфное расположено центрально или ближе к переферии. 0,019

Наличие или отсутствие жгутиков или жгутиковых корешков, размер клетки 7 — 12 мкм, цитоплазма голубая или сиренево-голубая, форма клетки округлая, округло-грушевидная, контур клетки неровный, форма ядра округлое, миндалевидное или в виде «сливовой косточки», расположено центрально или ближе к переферии, наличие мелких н крупных" вакуолей в цитоплазме. 1,36 хЮ^

Наличие или отсутствие жгутиков или жгутиковых корешков, размер клетки 7-12 мкм, цитоплазма голубая или сиренево-голубая, форма клетки округлая или округло-грушевидная, контур клетки неровный, форма ядра миндалевидное или в виде «сливовой косточки», расположено центрально или ближе к переферии. наличие мелких и крупных вакуолей в цитоплазме, синяя лнняя иериплаета частично или по всему периметру цитоплазмы 2,00 х 10 ^

Наличие или отсутствие жгутиков или жгутиковых корешков, размер клетки 5-12 мкм, цитоплазма сиренево-голубая или нежно-голубая «ячеистая», форма клетки округлая или округло-грушевидная, контур клетки ровный и перовный, форма ядра миндалевидное или в виде «сливовой косточки» эксцентрическое, синяя линяя периспласта частично или по всему периметру цитоплазмы. 6,02 х 10"4

Наличие жгутиков или жгутиковых корешков, размер клетки 5 - 12 мкм, цитоплазма сиренево-голубая или нежно-голубая «ячеистая», форма клетки округлая или округло-грушевидная, контур клетки ровный, форма ядра миндалевидное или в виде «сливовой косточки» эксцентрическое, синяя линяя периспласта по всему периметру цитоплазмы. 6,74 х 10

* Показаны сочетания признаков, при которых риск ошибочного заключения мшпшален.

Анализ показал, что ни один исследуемых признаков, выявленных самостоятельно, не гарантирует правильности первичной идентификации Тгл^таНз. Снижение риска ошибочного заключения ниже порогового значения

наблюдается только при выявлении сочетаний признаков, представленных в таблице 7. Наименьший риск ошибки в первичном заключении бывает при обнаружении сочетания жгутиков, «ячеистой» сиренево-голубой или нежно-голубой окраски цитоплазмы, миндалевидного или в виде «сливовой косточки» ядра, расположенного эксцентрически, синей линии перипласта по всему периметру цитоплазмы (6,74x10' ш). Если жгутики не обнаруживаются, только выявление характерной формы клетки и окраски цитоплазмы, полиморфного ядра расположенного центрально или ближе к переферии цитоплазмы в сочетании с другими признаками или в их отсутствии снижает риск ошибочного диагноза до 0,019 ниже порогового. Таким образом, все перечисленные признаки имеют разное диагностическое значение. Установлено, что простое их накопление не оказывает влияния на истинность диагноза. Наличие только одного признака (даже жгутиков) роли не играет. Риск диагностической ошибки минимизирован только для определенных сочетаний признаков.

Калькулятор риска ошибочного заключения.

В итоге проведенного статистического анализа полученных результатов нашей работы был создан кулькулятор рисков формирования ошибочного заключения о наличии трихомонадного процесса. Приведенные примеры результатов (рис.4,5), полученных при применении калькулятора, демонстрируют достоверность и надежность этого математического инструмента при поиске трихомонады в окрашенном образце осадка спермы.

Признаки

Форма

Размер

Контур

Цитоплазма цвет

Цитоплазма включения

синяя линяя периспласта

жгутики

Ядро форма

Расположение ядра относительно центра клетки

Ядро окраска

Циагноз

Показатель риска ошибочного первичного заключения__

Проявление признака

Округлая и округло-грушевидная

7-12 тм

Неровный

Сиреневая или сиренеес-голубая

Наличие мелких и крупных вакуолей и включений

Отсутствует или присутствует частично по краям цитоплазмы

Присутствуют жгутиковые корешки

Миндалевидное или в форме «сливовой косточки»

Эксцентрическое, ближе к переферии цитоплазмы

Розово-фиолетовое, имеющее неравномерно прокрашенные зоны

Первичный диагноз Т. vaginalis

0,00000

Рис. 4. Минимальный риск ошибочного заключения - 0,00000. Первичный диагноз Tr.vaginalis.

Признаки Проявлений признака

Форма Иная

Размер 1-5 мкм

Контур Неровный

Цитоплазма цвет Сиреневая или сиренево-голубая

Цитоплазма включения Наличие мелких и крупных вакуолей и включений

синяя линяя периспласта Отсутствует или присутствует частично по краям цитоплазмы

жгутики Отсутствуют

Ядро форма Миндалевидное или в форме «сливовой косточки»

Расположение ядра относительно центра клетки Эксцентрическое, ближе к переферии цитоплазмы

Ядро окраска Розово-фиолетовое, равномерно прокрашенное

Диагноз Первичный диагноз Т. vaginalis сомнительный

Показатель риска ошибочного первичного заключения 0,99313

Рис.5./'мск ошибочного заключения приближен к максимальному - 0,99313. Первичный диагноз сомнительный.

Алгоритм диагностики урогенигалытого трихомоноза у мужчин с жалобами, при отсутствии Тгла^шаНэ в результате микроскопии окрашенного мазка уретрального отделяемого.

Цешрифугат спермы исследуется параллельно двумя методами - культурально-

шпфоскопическим диагностикумом «Vagicult» и МОЭя. При совпадешш результатов этих методов поставить диагноз не составляет труда. В случае, когда результаты методов взаимоисключающие, врачу клинической лабораторной диагностики необходимо быть осторожным при постановке диагноза. Рекомендуем воспользоваться предположительным цитологическим заключением «Нельзя исключить положительный диагноз «урогешггальньш трихомоноз» или «Требуется дообследование пациента для исключения или подтверждения диагноза» или «Наблюдение и повторное исследование».

Схема-алгоритм 1

Предполагаемый алгоритм диагностики урогепитального трихомоноза у мужчин при отсутствии Тг.уа^паЦз в окрашенном мазке из уретрального отделяемого

Архив изображений с цитологических препаратов различных морфотипов Tr.vaginalis.

За 8-летний период работы цитологических препаратов осадка центрифугата эякулята было сделано 1000 микрофотографий в электронном виде с различными морфотипами Tr.vaginalis и 82 микрофотографии (8,2%) с препаратов, по которым допущены диагностические ошибки по заключениям экспертов. Результаты, полученные без применения математической модели, составили 91,8% в сравнении с результатами, полученными с помощью модели - 98,5% (диаграмма 1).

Процент совпадений результатов микроскопии с мнением экспертов с учетом и без учета полученной модели на основе документированных данных архива микроскопических изображений (п =1000).

юо 1.....................................................................................................................

1 --— !

| : | |

95 -----1

1 I

I ®

90 -----------1

35 -|-----------1

I |

! ;

80 -----------

в отсутствие модели с использованием модели

Таким образом, достоверность микроскопического заключения благодаря использованию математической модели увеличилась на 6,7 %.

ВЫВОДЫ

1. В диагностике трихомоноза у мужчин исследование осадка центрифугата эякулята является в 2,6 раза более эффективным методом, по сравнению с анализом цельного эякулята (отличия достоверны (р<0,001). Достоверных отличий выявления трихомонад в цельном эякуляте и уретральном отделяемом, а также первой порции мочи, секрете предстательной железы всеми используемыми методами не отмечено (р>0,05).

2. Математические подходы в оценке комплекса цитоморфологических признаков Tr.vagmalis способствуют объективной интерпретации диагностической значимости микроскопических критериев, исключая вероятность ошибки в 98,5% случаев.

3. В диагностике трихомоноза путем исследования осадка эякулята чувствительность метода «\'а§1си!ь> составила 98,3%, специфичность - 81,4%, и поэтом}' метод не может быть рекомендован в качестве самостоятельного метода для выявления трихомоноза у мужчин.

4. Исследование осадка эякулята с помощью реакции непрямой иммунофлюоресценщш показала специфичность диагностического теста - 90,9%, чувствительность — 72,5%, и поэтом}' метод может быть рекомендован только в качестве дополнительного в диагностике трихомоноза у мужчин.

5. Разработан алгоритм лабораторного обследования мужчин на трихомоноз, позволяющий увеличить чувствительность лабораторной диагностики в выявлении трихомонад на 21 %

6. На основании иследования документированного архива показано, что достоверность микроскопического заключения с использованием математической модели увеличилась на 6,7 %.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Микроскопическое и культурально-микроскопическое (диагностикумом «Vagicult») исследование осадка центрифугата эякулята, окрашенного по Маю-Грюнвальду-Гимзе, может быть рекомендовано для выявления Tr.vaginalis у мужчин.

Математическая модель созданный на ее основе кулькулятор рисков формирования ошибочного заключения о наличии трихомонадного процесса могут быть использованы в практической работе врачей клинико-диагностических лабораторий для снижения риска формирования ошибочного заключения о наличии Tr.vaginalis.

3. Алгоритм обследования мужчин с подозрением на трихомоноз может быть использован в практике клинико-диагностических лабораторий для подтверждения или исключения диагноза «урогенитальный трихомоноз» при наличии урогешггальных жалоб у мужчин, но при отсутствии у пациентов Tr.vaginalis в окрашенном мазке уретрального отделяемого.

4. Архив цитологических изображений различных морофотипов трихомонад в осадке центрифугата эякулята может служить основой дальнейшей разработки справочно-информационного пособия для практической работы врачей клинической лабораторной диагностики.

5. Врач клинической лабораторной диагностики должен учитывать возможность диагностических ошибок Tr.vaginalis в осадке эякулята, быть осторожным в установлении положительного диагноза и воспользоваться предположительным цитологическим заключением: «требуется дальнейшее дообследование пациента для подтверждения или исключения диагноза».

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Сапожкова. Ж.Ю. Гугуцидзе Е.Н. Зубков М.Н. Трихомониаз у мужчин: проблема остается. // Актуальные проблемы клинической медицины, сборник научных работ научно-практической конференции 2006 года, Москва - ФГУ «Клиническая больница» Управления делами Президента РФ -2006г. С.56-

2. Саножкова. Ж.Ю., Гугуцидзе Е.Н. Зубков М.Н.. Трихомониаз у мужчин: проблема остается. //Материалы научных трудов Всероссийского Конгресса по андрологип 27-29 апреля 2007г., Сочи, ОК «Дагомыс» Управления делами Президента РФ, Профессиональная ассоциация андрологов России, Москва, 2007г.-С.66.

Сапожкова Ж.Ю. Эякулят материал выбора в диагностике мужского трихомонназа. //Материалы научных трудов Всероссийского Конгресса по андрологии 27-29 апреля 2007г., Сочи, ОК «Дагомыс» Управления делами Президента РФ, Профессиональная ассоциация андрологов России, Москва, 2007г.-С.66.

4. Сапожкова Ж.Ю.Сравнительная оценка частоты обнаружения некоторых возбудителей урогешггальных инфекций мужчин методом световой микроскопии окрашенных препаратов цельного эякулята и его цснтриф\тата.//Материалы научных трудов Всероссийского Конгресса по андрологии 27-29 апреля 2007г Сочи, ОК «Дагомыс» Управления делами Президента РФ. Профессиональная ассоциация андрологов России, Москва, 2007г.-С.65.

Сапохкова Ж.Ю. Целесообразность определения уровня фруктозы лимонной кислоты в спермоплазме наряду рутинным исследованием эякулята.//Материалы научных трудов Всероссийского Конгресса по андрологии 27-29 апреля 2007г Сочи, ОК «Дагомыс» Управления делами Президента РФ, Профессиональная ассоциация андрологов России, Москва, 2007г.-С.

6. Сапожкова Ж.Ю. Влияние мужского носительства атипичной формы трихомонады на частоту дисбаланса влагалищного нормоценоза. // Материалы научных трудов Всероссийского Конгресса по андрологии 27-29 апреля 2007г Сочи. ОК «Дагомыс» Управления делами Президента РФ, Профессиональная ассоциация андрологов России, Москва, 2007г.-С.62.

7 Сапожкова Ж.Ю. Параметры эякулята при бессимптомном носитедьсгве атипичной формы Тг. vaginalis. // Материалы научных трудов Всероссийского Конгресса по андрологии 27-29 апреля 2007г Сочи, OK «Дагомыс» Управления делами Президента РФ, Профессиональная ассоциация аидрологов России, Москва, 2007г.-С.64.

8. Сапожкова Ж.Ю. Современный взгляд на проблему трихомониаза у мужчин. //Вестник Федерального государственного учреждения Клиническая больница Управления делами Президента Российской Федерации.-№2.2007г С. 10-12.

9. Сапожкова Ж.Ю. Диагностическое значение лабораторных методов выявления трихомоноза мужчин. //Вестник последипломного медицинского образования, Москва, -№3-4. 2009г

10. Сапожкова Ж.Ю., Шабалова И.П. Сравнительная оценка информационной значимости лабораторных методов выявления трихомонад в центрифутате эякулята. //«Лаборатория», Москва, Лабдиаг- №2.2010г. С. 15.

11. Сапожкова Ж.Ю. Диагностическое значение лабораторных методов выявления трихомоноза у мужчин. //Материалы научных трудов Ш-ей Междисциплинарной научно-практической конференции «Урогениталыше инфекции и репродуктивное здоровье: клинико-лабораторная диагностика и терапия», Москва, -№3. 20 Юг, С.65-68.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

MOM - Микроскопический метод окрашенного мазка

МОЭя - Микроскопия окрашенного осадка эякулята

РНИФ - Реакция непрямой иммунофлюоресценщш

УО - Уретральное отделяемое

ГГПМ - Первая порция мочи

СПЖ - Секрет предстательной железы

ЭЯ - Эякулят

Tr.vaginalis -Trichomonas vaginalis

п -Объем выборки (численность группы)

р - Вероятность справедливости нулевой гипотезы

t - Критерий Стьюдента

Сдано в печать 11.11.2010 Печать 2 печ. лист

Бумага 80г/кв. м. Формат 147x210 мм

Заказ № 2010/06 Тираж 100 экз.

Отпечатано: РМАПО, 123995, Баррикадная ул., д.2/1, г. Москва тел.: (499 255-9008

2010

75853

2010175853