Автореферат и диссертация по медицине (14.00.11) на тему:Диагностика и лечение трихомоноза: микробиологические и иммунологические аспекты

На правах рукописи

Игорь Николаевич

ТЕЛИЧКО

ДИАГНОСТИКА И ЛЕЧЕНИЕ ТРИХОМОНОЗА: МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ

14.00.11 - кожные и венерические болезни 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

оозиь

Санкт-Петербург - 2007

003061908

Работа выполнена в Военно-медицинской академии имени С М Кирова

Научные консультанты

доктор медицинских наук профессор

доктор медицинских наук

Официальные оппоненты доктор медицинских наук профессор доктор медицинских наук профессор доктор медицинских наук профессор

САМЦОВ Алексей Викторович ИВАНОВ Андрей Михайлович

ГОРЛАНОВ Игорь Александрович КОРОЛЬКОВА Татьяна Николаевна САВИЧЕВА Алевтина Михайловна

Ведущая организация ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени акад ИП Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится «22» октября 2007 года в ^О часов на заседании диссертационного совета Д 215 002 01 при Военно-медицинской академии имени С М Кирова (194044, Санкт-Петербург, ул Академика Лебедева, д 6)

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Военно-медицинской академии имени С М Кирова

Автореферат разослан августа 2007 года

УЧЕНЫЙ СЕКРЕТАРЬ ДИССЕРТАЦИОННОГО СОВЕТА доктор медицинских наук профессор ПОНОМАРЕНКО Геннадий Николаевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. В настоящее время трихомоноз является одним из наиболее распространенных заболеваний, передающихся половым путем, которое по распространенности занимает первое место в мире Ежегодно в мире болеет трихомонозом 250 млн человек (Михайлов А В, Гасанова Т А, 2000, Баткаев ЭА, 2002, Чеботарев В В и др, 2003) Урогенитальный трихомоноз - многоочаговое заболевание, сопровождающееся большим числом осложнений, у мужчин регистрируются простатиты, эпидидимиты, везикулиты, купериты, циститы баланопоститы, рубцовые сужения уретры (Ильин И И, 1999, Gardner W A et al, 1986) У женщин трихомонадная инфекция приводит к развитию не только кольпита, эндоцервицнта, цистита и проктита, но может играть существенную роль в формировании эктопий шейки матки, тубоовариальных гнойных образований, миомы матки Осложнения трихомоноза могут быть причиной бесплодия, патологии беременности, детской смертности, что имеет социальное значение (Васильев М М, 1990, Делекторский В В. и соавт, 1991, Ильин И И, 1991)

В то же время, многие аспекты трихомонадной инфекции остаются нерешенными, а некоторые требуют более глубокого изучения Клиническая картина урогенитального трихомоноза, по мнению ряда авторов, в настоящее время претерпевает патоморфоз, характеризуясь увеличением доли стертых и малосимптомных форм в общей структуре заболеваемости Недостаточно изучена роль атипичных морфологических форм возбудителя в патологии урогенитального тракта (Козлюк А С , Козлюк В А, 2001, Benchimol М , 2001)

В связи с этим важное значение приобретают вопросы своевременной и достоверной диагностики трихомонадной инфекции Микробиологическая диагностика нередко играет существенную роль в постановке диагноза данного заболевания При этом ее свойства варьируют в широких пределах и в значительной степени зависят от целого ряда факторов Наиболее доступными методами лабораторной диагностики трихомоноза являются микроскопия нативных, окрашенных препаратов и культуральное исследование Трудности при микроскопии создают как наличие в биологическом материале от больного разнообразных цитоморфологических форм трихомонад, трудно отличимых от клеток организма хозяина и усложняющих их дифференцировку, так и низкая концентрация простейших в биоматериале и потеря ими подвижности m vitro Предпочтительным методом диагностики трихомоноза является культивирование возбудителя в питательных средах Многочисленные составы питательных сред подобраны эмпирически Их селективность недостаточна для получения чистой культуры В ряде случаев трихомоноз протекает как смешанная инфекция, сочетающаяся с кандидозом Рост дрожжеподобных грибов рода Candida приводит к ингибированию размножения трихомонад и получению ложноотрицательного результата (Васильев ММ, 1980, Беднова В Н , 1985, Borchardt К А , 1991)

В настоящее время новая генодиагностическая технология полимеразной цепной реакции (ПЦР) опережает остальные методы генодиагностики

трихомочоза по уровню чувствительности и специфичности (Сухова ЛП,

2000) Однако для проведения этого исследования необходимо хорошее оснащение лабораторий, соблюдение всех технических требований при обработке материала, что не всегда возможно даже в крупных диагностических центрах Другим альтернативным методом является иммуноферментный анализ При этом роль иммуноферментной диагностики трихомоноза остается неопределенной в связи с недостаточным практическим опытом ее использования В коммерческих иммуноферментных тест-системах встречаются перекрестные реакции с антигенами сапрофитных трихомонад Сравнительные исследования по чувствительности иммуноферментного анализа при диагностике трихомоноза у больных с разными формами заболевания до последнего времени не проводились

До настоящего времени метронидазол, синтезированный в 1958 году, как производное 5-нитроимидазола, остается стандартным и наиболее широко используемым препаратом в лечении трихомоноза Чрезмерно широкое, нередко необоснованное применение метронидазола привело к появлению устойчивых штаммов трихомонад, и, следовательно, к повышению рекомендуемых суммарных доз препарата (Швелидзе М Н, 1988, Абдумаликов Р А, Брашна ЕЕ , 1995, Милевская С Г, 1996) Терапия трихомоноза не всегда приводит к излечению больных По данным ряда авторов, неэффективность лечения составляет 2,2 - 44Д% (Grunberg Е Titsworth Е , 1974, Нарзикулов Р М , 1990) Кроме того, применение препаратов метронидазола нередко сопровождается целым рядом побочных явлений, реакций и осложнений (Маждраков Г Попхристов П, 1973, Жуков В И, 1983, Яковлев С В , 1997)

Недостаточно изучена роль гуморального и клеточного иммунитета при трихомонозе (Терас Ю X, 1964, Кисина В И, 198*8, Alderete J F , 1986, Ackers JP, 1990) Имеются лишь единичные работы, посвященные изучению цитокинового статуса при данном заболевании (Горина Е Ю, Бутов Ю С ,

2001) Сегодня предложено большое количество иммуномодуляторов При этом нередко иммунотропные препараты из разных групп имеют одинаковые показания к применению, отсутствуют четкие критерии выбора того или иного иммуномодулятора Это особенно важно на современном этапе, когда традиционно использовавшиеся препараты из группы нитроимидазолов становятся все менее эффективными ввиду возрастающей резистентности к ним Т vaginalis и возникает вопрос об использовании полноценной и разумно достаточной иммунокоррекции у таких пациентов Остаются дискутабельными вопросы о факторах, определяющих хронизацию инфекционного процесса и неэффективность его терапии

Цель исследования. На основании комплексного клинико-микробиологического, иммунологического обследования и результатов этиотропной терапии разработать диагностическую и терапевтическую стратегию ведения пациентов с трихомонозом

Задачи исследования.

1 Провести анализ клинико-микробиологических особенностей урогенитального трихомоноза

2 Определить цитоморфологические признаки Т vaginalis округлой формы, позволяющие проводить диагностику при отсутствии типичных грушевидных форм

3 Изучить жизнеспособность округлых морфологических форм трихомонад, а также их вирулентность на культурах перевиваемых клеток m vitro

4 На основе сравнительного анализа теоретически обосновать и экспериментально подтвердить оптимальный качественный и количественный состав питательной среды для культивирования трихомонад, а также на основе цельноклеточного трихомонадного антигена сконструировать ИФА тест-систему

5 Установить информативность методов лабораторной диагностики урогенитального трихомоноза и обосновать последовательность их использования при постановке диагноза

6 Провести сравнительный анализ эффективности применения различных противопротозойных препаратов в терапии трихомоноза и разработать методику определения in vitro резистентности Т vaginalis к метронидазолу

7 Изучить характер иммунопатологического процесса при урогенитальном трихомонозе и оценить клинико-микробиологическую эффективность иммуностимулирующего препарата Бестим в комплексной терапии трихомоноза

Научная новизна исследования. Впервые установлено, что и у округлых и у грушевидных форм Т vaginalis наблюдаются сходные ультраструктурные элементы постоянно конденсированные хромосомы в ядре клетки и цитоскелетная структура - коста. В цитоплазме клетки округлой формы отмечены характерные изменения по сравнению с грушевидными клетками частичная деградация синтетического аппарата клетки, редукция околоядерной эндоплазматической сети и связанной с ней аксостиллярной области, изменение характера содержимого гадрогеносом, изменение расположения рибосом и характера расположения кинетосом жгутиков

Доказано, что округлые трихомонады являются одной из морфологических форм в жизненном цикле простейшего Структурные изменения, наблюдаемые в цитоплазме округлых форм, свидетельствуют о снижении физиологической активности клетки Установлено сохранение жизнеспособности трихомонад при переходе в атипичные цитоморфологические формы В тесте на культуре перевиваемых клеток HeLa установлена патогенность округлых трихомонад

Впервые проведена комплексная оценка современных методов лабораторной диагностики мочеполового трихомоноза Сформулированы диагностические алгоритмы Усовершенствована питательная среда для культуральной диагностики трихомоноза Установлено, что серологическая диагностика мочеполового трихомоноза имеет вспомогательное значение в постановке диагноза заболевания Впервые изучены субизотипы

специфических IgG-антител при трихомонозе, что позволило констатировать наличие у пациентов противотрихомонадных антител как к липосахаридным, так и к белковым антигенам простейшего

Установлено, что неблагоприятный прогноз лечения хронического трихомоноза ассоциирован с достоверно более низким, по сравнению с благоприятным прогнозом, содержанием в сыворотке крови иммунокомпетентных клеток с фенотипом CD 19+ Неблагоприятный прогноз терапии проявляется достоверным превышением концентрации ИЛ-1 и ИФН-у в сыворотке крови и смывах со слизистых урогенитального тракта Для лиц с благоприятным прогнозом терапии хронического трихомоноза характерна более высокая системная и местная продукция ИЛ-8

Впервые продемонстрирована клинико-микробиологическая

эффективность комбинированной терапии хронического трихомоноза с использованием иммуностимулятора Бестим Выявлено, что в процессе лечения Бестимом наблюдается увеличение количества клеток с CD3+ и CD4+ фенотипами, в то время как количество клеток с фенотипом CD8+ достоверно не изменялось Также при терапии Бестимом установлено повышение уровня сывороточного интерлейкина-4

Практическая значимость. Показано, что наиболее часто при микробиологической диагностике урогенитальных инфекций (УТИ) выявляется Т vaginalis В структуре УГИ преобладает хронический трихомоноз в виде моноинфекции При смешанных инфекциях с участием Т vaginalis наиболее частым вариантом является сочетание с дрожжеподобной и условнопатогенной бактериальной микрофлорой В структуре жалоб у мужчин наблюдается увеличение числа больных со снижением полового влечения и эрекции, а также пациентов с дискомфортом в области промежности Отличительной особенностью группы мужчин является отсутствие у трети больных местных клинических проявлений, без учета данных лабораторно-инструментальных исследований Одновременно в отношении данной категории населения не предусмотрены плановые организационные и диспансерные мероприятия по выявлению и лечению урогенитальных инфекций Эти обстоятельства в целом могут способствовать сохранению высокого уровня заболеваемости в популяции лиц мужского пола, тем самым являться источником инфекций урогенитального тракта

Установленные клинические особенности хронического трихомоноза в современных условиях определяют приоритеты в выборе методов микробиологической диагностики На основании многофакторного дискриминантного анализа разработаны высоко информативные и значимые математические модели, позволяющие определить прогноз, а также рациональную терапевтическую тактику

Результаты исследования могут использоваться в микроскопической дифференцировке округлых морфологических форм трихомонад при проведении микробиологической диагностики

Разработанная питательная среда для культуральной диагностики трихомоноза сочетает высокие ростовые свойства и низкую себестоимость

Установлено, что результаты ПЦР носят предварительный характер и не могут быть использованы для достоверной диагностики трихомоноза ИФА может применяться в дополнение к существующим диагностическим подходам Обнаружение специфических антител к антигенам белковой природы в перспективе делает возможным получение их искусственных аналогов с целью стандартизации серодиагностики трихомоноза Предложенные диагностические алгоритмы позволяют повысить эффективность диагностики мочеполового трихомоноза при снижении временных и финансовых затрат Метод определения резистентности трихомонад к метронидазолу, отличающийся практической доступностью, может использоваться для определения прогноза и тактики лечения

Одновременное применение в терапии как острого, так и хронического трихомоноза двух дрогаволротозойных препаратов различных фармакологических групп (орнидазол и нифуратель) позволяет достичь более выраженного клинико-микробиологического эффекта по сравнению со стандартными схемами этиотропного лечения Применение Бестима в комплексной терапии хронического трихомоноза оказывает иммуностимулирующее действие и обладает выраженной клинической эффективностью Целесообразно его включение в схему комплексной терапии больных хроническим трихомонозом

Личное участие автора в получении результатов. Автором научно обоснована методология исследования течения трихомоноза, проанализированы клинико-лабораторные и иммунологические проявления заболевания на различных его этапах, разработаны математические модели для оценки прогноза заболевания, создан алгоритм по диагностике и тактике лечения пациентов

Автор планировал исследования, принимал непосредственное участае в клиническом обследовании больных, организовывал и участвовал в проведении всех лабораторно-инструментальных, иммунологических и ультразвуковых исследований, а также осуществлял мониторинг эффективности и безопасности противопротозойной и иммунотропной терапии Автором лично формировалась база данных, проводилась их статистическая обработка и обобщение полученных результатов

Основные положения, выносимые на защиту.

1 В структуре обследованных больных инфекциями урогенитального тракта преобладают пациенты с хроническим трихомонозом в форме моноинфекции Клиническая картина хронического трихомоноза у мужчин характеризуется патоморфозом У трети мужчин при хроническом трихомонозе отсутствуют субъективные и объективные клинические симптомы, без учета результатов лабораторных и инструментальных исследований

2 Округлые морфологические формы Т vagmalls являются одной из стадий жизненного цикла простейшего и обладают прямым циюпатогенным действием на эпителиальные клетки Ультраструктурные изменения, наблюдаемые в цитоплазме клеток округлых форм, указывают на снижение физиологической активности простейшего

3. Культуральное исследование имеет решающее значение в диагностике мочеполового трихомоноза у мужчин У женщин микроскопия нативного препарата, отделяемого из урогенитального тракта, позволяет диагностировать мочеполовой трихомоноз в большинстве случаев Серологическая диагностика мочеполового трихомоноза (ИФА) имеет вспомогательное значение

4 Включение Бестима в комплексную терапию хронического трихомоноза проявляется положительным клинико-лабораторным эффектом лечения, при этом в периферической крови избирательно повышается концентрация иммунокомпетентных клеток с фенотипами СБЗ+ и CD4+ и продукция сывороточного ИЛ-4, а количество клеток с фенотипом С08+ достоверно не изменяется

Реализация и внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в научную, учебную и лечебно-диагностическую работу кафедры и клиники кожных и венерических болезней, кафедры микробиологии ВМедА им СМ Кирова, СПб ГУЗ «КВД №4» и ГУЗ «Областного КВД» (С -Петербург)

Апробация и публикация материалов исследования. Материалы диссертации доложены и обсуждены на VI Всероссийском съезде врачей-инфекционистов (С-Петербург, 2003), Всероссийской научно-практической конференции «Узловые вопросы борьбы с инфекцией» (С -Петербург, 2004), Российско-Шведской конференции «Контроль и профилактика инфекций, передающихся половым путем» (С -Петербург, 2004), Научной конференции с международным участием «Современные средства иммунодиагностики, иммуно- и экстренной профилактики актуальных инфекций» (С -Петербург, 2004), VII Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения больных в многопрофильном лечебном учреж-дении» (С-Петербург, 2005), Российской научно-практической конференции дерматовенерологов «Санкт-Петербургские дерматовенерологические чтения» (С -Петербург, 2005), заседаниях городского общества дерматовенерологов им ВМ Тарновского (С-Петербург, 2004, 2006), Юбилейной научно-практической конференции, посвященной 135-летию кафедры кожных и венерических болезней ВМедА (С-Петербург, 2004), 40-й научно-практической конференции дерматовенерологов и врачей смежных специальностей Санкт-Петербурга «Актуальные проблемы дерматовенерологии Контроль и профилактика инфекций, передающихся половым путем» (С-Петербург, 2005), Научно-практической конференции «Актуальные вопросы дерматовенерологии» (С -Петербург, 2006), V Всемирном конгрессе по иммунопатологии и аллергии (Москва, 2007), XI Всероссийском научном форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (С -Петербург, 2007), V Европейском конгрессе по протистологии и XI Европейской конференции по биологии беспозвоночных (С -Петербург, 2007)

По материалам исследования опубликовано 41 печатная работа, в том числе 1 учебно-методическое пособие, 9 статей, из которых 6 в реферируемых журналах

Объем н структура работы. Диссертация изложена на 349 страницах компьютерного набора, состоит из введения, 7 глав (обзора литературы, описания материалов и методов исследования, пяти глав результатов собственных исследований), обсуждения полученных результатов, выводов, практических

рекомендаций, указателя литературы, включающего 259 источников, в том числе 93 отечественных и 166 зарубежных Текст содержит 93 таблицы, 2 формулы, 7 машинограмм и 25 рисунков

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. За шестилетний (2001-2007) период проведения исследований было обследовано 3759 пациентов, обратившихся с жалобами на урогенитальные расстройства, а также с подозрением на наличие урогенитальных инфекций (УГИ) Из них 46 здоровых лиц (группа контроля)

С целью уточнения клинико-лабораторных особенностей течения УГИ, дополнительное обследование проводилось совместно со специалистами клиник Военно-медицинской академии им С М Кирова Группы обследуемых формировались из пациентов, которые находились на обследовании и лечении в клиниках ВМедА (в том числе в клиниках кожных и венерических болезней, акушерства и гинекологии), в ОКВГ №442 им Соловьева, 1-м Военно-морском госпитале, областном КВД Ленинградской области, КВД №4 Санкт-Петербурга

Из 3759 пациентов группу больных с УГИ составили 1878 пациентов (49,9%) Из них у 1528 были диагностированы моноинфекции (81,4%), а у 350 -смешанные УГИ (18,6%) Значительная часть больных (72,5%) находилась в возрасте до 40 лет

Наряду с общепринятым клиническим обследованием больных, проводились дополнительные клинико-лабораторные и инструментальные исследования У больных УГИ оценивалась выраженность таких проявлений заболевания, как уретрит, простатит, ггростатовезикулит, эпидидимит, орхоэпидидимит, цистит, пиелонефрит, цервицит, кольпит, аднексит, а также синдром дизурических явлений, расстройств половой функции и болевой синдром

В связи с вышеизложенным нами использовались следующие лабораторные и инструментальные методы исследований, которые проводились в ВМедА (кафедра микробиологии, кафедра клинической биохимии, кафедра кожных и венерических болезней), Городском Вирусологическом Центре, ГНЦ НИИ ОЧБ МЗРФ, лабораториях КВД (Санкт-Петербург)

Микроскопий проводилась по стандартной методике Мазки отделяемого из УГТ готовились на предметных стеклах, фиксировались и окрашивались метиленовым синим и по Граму Микроскопию полученных препаратов проводили на микроскопе «Биолам» (ЛОМО) с использованием иммерсионного объектива х90 (увеличение х900) Результаты микроскопии оценивали в соответствии с общепринятыми критериями

В качестве материала для исследования служили мазки-соскобы со слизистых оболочек уретры, влагалища и цервикального канала Для проведения ПИФ клинический материал (соскобы) брали разовым универсальным зондом «Асе11оп Ми11л» (МесЬсапс!, Швеция) Исследования

проводили с учетом требований методических рекомендаций Для постановки ПИФ с целью диагностики хламидий, микоплазм и уреаплазм использовали следующие диагностические наборы «ХлаМоноСкрин», «ХлаМоноСкрин2», «Микогомофлюоскрин» и «Уреагенифлюоскрин» (Ниармедик, Россия) Учет результатов проводили визуально Результаты исследования считали положительными, если в препарате были обнаружены морфологически типичные для хламидий и микоплазм элементы, специфически флуоресцирующие зелено-желтым цветом

Культурал»ная диагностика проводилась с использованием общепринятых питательных сред Посев на питательные среды проводился с целью выделения следующих микроорганизмов N gonorrhoeae, Candida spp, М hominis, U urealyticum, возбудителей неспецифических УТИ (в т ч Escherichia coli, Proteus spp, Klebsiella spp , Citrobacter spp, Pseudomonas aeruginosa, Acmetobacter spp , Enterobacter spp, Enterococcus spp, Branhamella spp, Staphylococcus spp, Streptococcus spp)

Для диагностики мочеполового трихомоноза использовались следующие лабораторные методы микроскопия нативного препарата (НП), микроскопия подкрашенного нативного препарата (ПНП), микроскопия фиксированного окрашенного мазка (ФОМ), микроскопия эякулята (МЭ), кулыгуральный метод (КМ), полимеразная цепная реакция (ПЦР), иммуноферментный анализ (ИФА) Нативный препарат (НП) для исследования готовили из клинического материала по методике «раздавленная капля» Для этого биологический материал смешивали с каплей теплого физиологического раствора (температура около 37°С) на поверхности предметного стекла Микроскопия препаратов проводилась не позднее 10 мин после забора материала в световом микроскопе «Биолам» (JIOMO) при увеличении х400 (объектив х40, окулчр х10)

Для приготовления подкрашенного нативного препарата (ПНП) отделяемое из уретры переносилось на предметное стекло, где смешивалось с каплей теплого физиологического раствора (температура около 37°С) и накрывалось покровным стеклом, рядом с краем покровного стекла наносилась капля 1% водного раствора метиленового синего Благодаря действию капиллярных сил, со стороны нанесения красителя происходило частичное (не более половины) окрашивание препарата, при этом вторая половина препарата не окрашивалась Микроскопия выполнялась не позднее 10 минут после приготовления образца У женщин препарат приготавливали следующим образом отделяемое из уретры, влагалища и цервикального канала смешивали с каплей теплого физиологического раствора (температура около 37°С), нанесенной на предметное стекло, накрывали покровным стеклом, затем подкрашивали часть препарата указанным выше способом и микроскопировали не позднее 10 минут после приготовления образца Исследование проводили на световом микроскопе «Биолам» фирмы «JIOMO» по описанной ранее методике Результат оценивался при просмотре нескольких полей зрения (не менее пяти) при увеличении х400 (объектив х40, окуляр х10) Обнаружение в неокрашенной части препарата подвижных простейших, типичной грушевидной или округлой формы, считалось положительным результатом

Для Т vaginalis характерными являлись судорожные, толчкообразные движения, а также вращательные движения вокруг своей оси При положительном результате в окрашенной части препарата у Т vaginalis происходило контрастирование жгутиков и ундулирующей мембраны, которые становились легко различимы, сама же трихомонада выглядела в виде рельефного белого пятна Это позволяло легко отдифференцировать малоподвижные и даже неподвижные особи трихомонад от другого клеточного материала

Все исследуемые клинические образцы, полученные от мужчин и женщин, параллельно окрашивались красителем - метиленовым синим Для этого исследуемый клинический материал больного наносили тонким слоем на предметное стекло и равномерно растирали по всей поверхности Мазок высушивали на воздухе и наносили на него 1% водный раствор метиленового синего на 2 мин, а затем смывали краситель водой Микроскопию полученных препаратов проводили на микроскопе «Биолам» (ЛОМО), с использованием иммерсионного объектива х90 (увеличение х900)

Препараты для проведения фазово-контрастной микроскопии готовили по методике «раздавленная капля» Использовали световой микроскоп DMRXA фирмы Leica

Препараты для проведения дифференциально-интерференционного контраста (ДИК) готовили по методике «раздавленная капля» Для предупреждения высыхания исследуемых препаратов их герметизировали, с применением парафинового масла, смеси равных частей парафина и вазелина

Проводилась микроскопия с дополнительным контрастированием ядра Т vaginalis На поверхность предметного стекла наносили культуру Т vaginalis и флюорохром диаминофенилиндол (DAPI-краситель) в рабочей концентрации 5 мкг/мл Микроскопию проводили с помощью универсального микроскопа DMRXA фирмы Leica при возбуждающем свете с X - 365 нм, максимум экстинкции X = 460 нм

Для электронно-микроскопического исследования штаммы Т vaginalis были выделены от больных трихомонозом с острой и хронической формой заболевания Для накопления биомассы проведено культивирование простейших в полужидкой модифицированной питательной среде Даймонд при температуре 37°С в течение 3-х суток К суспензии клеток трихомонад добавляли фиксатор 3%-ный глутаровый альдегид (Sigma) и 0,1М какодилатный буфер (Serva) (рН-7,2) К осадку добавляли прогретый фиксатор Время фиксации А часа при 37°С Через 2 часа заменяли фиксатор на свежую порцию 3-кратно промывали 0,1М какодилатным буфером (Serva) (рН-7,2) в течение 30 мин Постфиксацию проводили 1% раствором 0s04 в О, IM какодилатном буфере (Serva) (рН-7,2), содержавшим 5мМ СаС12 и 0,4% красной кровяной соли («Химреактив», Россия) Время фиксации 2 часа при комнатной температуре 2- кратная промывка 0,1М какодилатном буфером (Serva) (рН-7,2) в течение 15 мин Материал заключали в агар Difco (3%) Обезвоживание осуществляли в абсолютном этиловом спирте возрастающей концентрации Затем клетки пропитывали смесью смол Спур Полимеризацию проводили в

течение ночи при температуре 68 С Ультратонкие срезы готовили на ультрамикротоме «Reichert-Jung» (Австрия) с пбмощью стеклянных ножей и переносили на медные сеточки, покрытые формварной подложкой Контрастирование срезов осуществляли 1% уравил-ацетатом и цитратом свинца Полученные срезы исследовали в электронном микроскопе JEM-100M при ускоряющем напряжении 70 кВ

ИФА проводили с использованием коммерческой тест-системы «ТрихомоноБест-IgG стрип» (ВекторБест, г Новосибирск) и авторского варианта анализа Постановка исследования в иммуноферментной тест-системе «ТрихомоноБест-IgG стрип» проводилась в соответствии с инструкцией производителя

В модифицированном варианте ИФА трихомонадный антиген получали двумя способами методом замораживание/оттаивание ц ультраозвучиванием Для выявления антител к возбудителю трихомоноза была использована модель твердофазного иммуноферментного анализа Твердой фазой во всех вариантах ИФА служили 96-луночные плоскодонные планшеты из полистирола (Costar США) Специфический комплекс антиген-антитело выявляли с использовальзованием пероксидазных конъюгатов на основе моноклональных антител, направленных к изотипспецифичным эпитопам IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgG, IgM Все из использованных моноклонов были получены из лаборатории гибридомных технологий ЦНИ рентгенорадиологического института МЗ РФ (руководитель д м н , профессор Климович В Б) Оптическую плотность окрашенного продукта ферментативной реакции измеряли на вертикальном фотометре Mulüscan-MC (Labsystems, Финляндия) при длине волны 450 нм

Для ПНР использовали праймеры к фрагменту ДНК Т vaginalis («АмгглиСенс-100,Т vaginalis», ЦНИИ Эпидемиологии, Россия)

Для культуральной диагностики использовали ряд жидких питательных сред Все компоненты, входящие в состав питательных сред, за исключением лошадиной сыворотки, мальтозы и растворов антибиотиков, вносили в основу питательной среды Затем автоклавировали при 112°С в течение 20 мин и добавляли оставшиеся компоненты Печеночный экстракт готовили по общепринятой методике

В работе также использовались коммерческие питательные среды Питательная среда для выделения трихомонад (производство НПФ «Диагност-мед», Омск), Vagicult (производство «Orion Diagnostic», Финляндия) и Питательная среда для выделения трихомонад (НПО «Питательные среды», Махачкала)

Питательные среды Джонсона-Трасселя, 199-СДС (в модификации Ю Ф Захаркива), Даймонд, сывороточно-казеиновая дифференционная среда (СКДС), Терраса и питательная среда для выделения трихомонад (НПО «Питательные среды», г Махачкала) заливали стерильным вазелиновым маслом, толщиной 5 мм, для создания частично анаэробных условий

Для подавления грамотрицательных и грамположительных бактерий в качестве селективных компонентов вносили антибиотики бензилпенициллин 1000 000 ЕД/мл и гентамицин 80 мкг/мл

Питательные среды разливали по микропробиркам объемом 1,5 мл в асептических условиях Во все исследуемые питательные среды вносили стандартный объем инокулята Т vaginalis равный 10 мкл Подсчет клеток проводили с использованием камеры Горяева Инокулят содержал более 10 подвижных клеток в 1 мл Учет результатов производили на 3, 4, 5, 6 и 7 сутки культивирования Исследование нативного препарата проводили на световом микроскопе «Биолам» (JIOMO)

Результат оценивался при просмотре нескольких полей зрения (не менее пяти) при увеличении х400 (объектив х40, окуляр хЮ) Для подвижных форм Т vaginalis характерными являлись судорожные, толчкообразные движения, а также вращательные движения вокруг своей оси В ряде случаев удавалось рассмотреть движения жгутиков и ундулирующей мембраны Часто (в основном в посевах биоматериала от мужчин) определялись круглые неподвижные формы Т vaginalis Обнаружение в препарате подвижных простейших типичной грушевидной или округлой формы, а также значительных количеств круглых неподвижных форм считалось положительным результатом (Дмитриев Г А, 2003, Никитин А Ф , 2001) При отрицательном результате производили повторное исследование засеянной питательной среды на пятые сутки, если вновь рост культуры Т vaginalis не определялся, то выполнялось третье исследование на седьмые сутки инкубации

Для оценки цитопатогенного действия трихомонад использовали перевиваемую культуру клеток HeLa Клетки культивировали в минимальной среде Игла, обогащенной 10% сывороткой крупного рогатого скота, и добавлением пенициллина 100 ЕД/мл, стрептомицина 100 мг Начальная плотность клеток составила 20-30х103, конечная - 50-60х103 Клетки инкубировали 24 часа при 37°С при концентрации С02 - 5% Для культивирования Т vaginalis использовали питательную среду TYM Культуру Т vaginalis в логарифмической фазе роста отмывали 2-кратно в ФСБ Смешивали питательную среду для культур клеток и среду для культивирования трихомонад (TYM), в соотношении 2 1 Далее суспендировали культуру трихомонад в смеси сред 0,1 мл суспензии культуры трихомонад в смеси сред вносили в монослой культуры, инкубировали при 37°С Время инкубации 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 24 ч В качестве контроля использовали культуру клеток без внесения трихомонад Опыты проводили в 3-повторностях По завершении и отмывки культуры ФСБ клетки фиксировали в 2% формальдегидом в ФСБ - 10 мин при комнатной температуре Окрашивали 0,13% кристалл-виолетом, растворенном в соотношении 5 2 (V V) этанол-формальдегидном растворе Окрашенный материал 2-кратно отмывали дистиллированной водой Планшет высушивали на воздухе Штамм сохраняли в 1 % додецилсульфате натрия в 50% этаноле Учет результатов цитопатогенного действия трихомонад по отношению к культуре клеток HeLa проводили спектрофотометрически при 570 нм Разрушение монослоя клеток учитывали с использованием инвертированного микроскопа, применяя фазовую микроскопию препаратов В качестве результата проведенного исследования регистрировало соотношение

экспериментального значения (Е) к контрольному (С) (Е/С) Цитотоксичность 1 -(Б/С)

Иммунологическое исследование крови осуществлялось совместно с лабораторией иммунофармакологии ГосНИИ ОЧБ (Заведующий лабораторией -доктор мед наук, профессор А С Симбирцев) В иммунологический комплекс входили следующие показатели определение количества субпопу чяций лимфоцитов (CD3+ - Т-лимфоциты, CD3+CD4+ - Т-хелперы, CD3+CD8+ -цитотоксические Т-лимфоциты, CD16+ -, CD19+ - В-лимфоциты, CD25+ -) на проточном цитометре Facscan фирмы "Becton Dickinson" (США) с использованием различных комбинаций прямых моноклональных антител и изотопических контролей той же фирмы, спонтанной и индуцированной продукции клетками крови, а также интерлейкина-lp (ИЛ-IP), интерлейкина-2 (ИЛ-2), интерлейкина-4 (ИЛ-4), интерлейкина-8 (ИЛ-8) в сыворотке крови и смывах со слизистых УГТ методом ИФА с применением отечественных диагностикумов (НПО "Протеиновый контур", ТОО "Цитокин")

Для уретроскопии применялся уретроскоп с волоконной оптикой Kail Storz SRI 7, модель оптики 0° (Германия) Для ирригации использовали физиологический раствор в необходимом объеме

В качестве дополнительного метода диагностики поражений органов малого таза использовали УЗИ (аппарат «Siemens», Германия) Для оценки формы и размеров предстательной железы, изучение ее соотношения с другими органами малого таза использовали трансабдоминальное УЗИ, а для выявления нарушений эхоструктуры и появления очаговых изменений применячи трансректальное ультразвуковое сканирование

Этиопатогенетическое лечение проводилось с учетом длительности инфекционного процесса и включало протистоцидные средства в соответствующей разовой и курсовой дозе, ферментотерапию, витаминотерапию, гепатопротекторы, антиоксиданты и физиотерапию Местное лечение назначали при наличии показаний больным с торпидным рецидивирующим течением заболевания

Схемы этиотропного лечения соответствовали требованиям Приказа МЗСР РФ №173 от 28 02 2005 г «Об утверждении стандарта медицинской помощи больным трихомонозом» и предписаниям инструкций разрешенных к использованию в РФ лекарственных средств Применялись следующие препараты метронидазол, тинидазол, нифуратель (макмирор), орнидазол (тиберал) Коме того, проводилось лечение с одновременным использованием двух антипротозойных препаратов различных фармакологических групп -орнидазола и нифурателя, каждый в стандартной суточной и курсовой дозировке

В ходе исследования изучалась специфическая активность иммуностимулятора Бестим - химическое название Y-D-глутамил-триптофан, мононатриевая соль Вводится внутримышечно в объеме 1 мл воды для инъекций 1 раз в сутки ежедневно Курс лечения - 5 инъекций Разовая доза составляет 0,1 мг при массе тела пациента более 40 кг

Статистическая обработка материалов исследований выполнялась на

ПЭВМ с использованием стандартных пакетов программ прикладного статистического анализа Статистический анализ полученных результатов проводили с использованием общеупотребительных методов параметрической и непараметрической статистики Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы (об отсутствии значимых различий или факторных влияний) принимали равным 0,05 Ситуации, при которых значения вероятности р находились в интервале от 0,05 до 0,10, рассматривались как тенденция к изменению признаков При сравнении частотных величин пользовались биноминальным тестом и точным методом Фишера для четырехпольных таблиц Использовались также методы корреляционного анализа, двухфакторного дисперсионного анализа и построения линейных дискриминантных функций

Результаты исследований и их обсуждение

В ходе исследования нами были комплексно обследованы 3713 пациентов, обратившихся с жалобами на урогенитальные расстройства, а также с подозрением на наличие УГИ

Из числа обследованных в 1878 случаях (50,6%) выявлены пациенты с воспалительными заболеваниями УГТ Из них в 1577 (84,0%) случаях наблюдалось хроническое течение инфекций

Среди пациентов с УГИ преобладали лица в возрасте от 21 до 40 лет (72,6%), что подтверждает данные других исследователей (Рищук С В , 2006)

Мужчины только в 48,2% случаев предъявляли жалобы на выделения из уретры, считающиеся основным клиническим признаком УГИ В нашем исследовании, по сравнению с литературными данными, увеличилась доля лиц с жалобами на дискомфорт и болевые ощущения в области промежности (21,2%), а также на снижение полового влечения и эрекции (29,6%) (Юнда И Ф и др , 1988) Большинство таких пациентов ранее проходили патогенетическое лечение у специалистов смежных специальностей без учета микробной этиологии заболевания

У 74% женщин выявлялись жалобы на выделения из влагалища Треть пациенток предъявляли жалобы на дискомфорт и боль внизу живота, усиливающиеся при половом акте У 52,7% отмечался зуд во влагалище У 33,5% отмечались слизисто-гаойные выделения из уретры

Углубленное клинико-инструментальное обследование мужчин позволило уточнить топический диагноз Передний уретрит установлен у 55,8%, тотальный уретрит - у 25,7%, уретропростатит - у 18,5% больных У женщин распространение воспалительных изменений в целом соответствовало преобладающим клиническим симптомам В 70,8% случаев УГИ протекали в форме вагинита

Анализ частоты выделения микроорганизмов в группе пациентов с УГИ требует отдельного внимания Более чем в 80% случаев нами выявлялись УГИ в виде моноинфекций Преобладающей моноинфекцией был трихомоноз (33,0%) (рисунок 1) Другие этиологические агенты инфекций по убыванию

выявления располагались в следующей последовательности Candida spp -18,1%, U ureaJyticum - 9,7%, М hominis - 8,0%, условно-патогенная микрофлора — 5,6%, С trachomatis - 4,6%, N gonorrhoeae - 1,5%, вирус простого герпеса 1 и 2 типов - 0,6%

Структура возбудителей УТИ в группе мужчин и женщин, наряду с общими чертами, имела некоторые особенности Так при обследовании женщин достоверно чаще с использованием культуральных методов диагностики выделялись дрожжеподобные грибы (43,1%), возбудители микопяазмозов (U urealyticum -20,8%, Mhomims - 17,0%) и условно-патогенная микрофлора (18,7%) (р<0,05) Объединяет обе группы высокая частота выделения Т vaginalis (36,1 и 41,1%)

Т vaginafs N gonorrhoeae С trachomatis N1 hominis и urealyticum Candida spp BIT 1 2 типов УПМ

Рисунок 1 Соотношение частоты выделения микроорганизмов при УГИ

В составе возбудителей микстинфекций УГТ также преобладали Т vaginalis (6,7%) В структуре смешанных инфекций с участием Т vaginalis наиболее частым вариантом является сочетание с дрожжеподобной и условнопатогенной микрофлорой (рисунок 2) Далее по мере убывания частоты встречаемости располагаются сочетания с микоплазменной и хламидийной инфекциями Из числа условнопатогенной микрофлоры наиболее значима кокковая (стафилококки, энтерококки) и энтеробактериальная микрофлора Высокая частота выделения дрожжеподобных грибов и условнопатогенной микрофлоры определяет некоторые обстоятельства ведения пациентов С одной стороны, при культуральной диагностике, рост данных микроорганизмов может приводить к ингибированию размножения трихомонад и получению ложноотрицательного результата С другой стороны , очевидна необходимость учета их присутствия при назначении этиотропной терапии

На следующем этапе исследования мы изучили структуру больных

чрихомсшозом в виде моноинфекции. Ввиду того, что категория больных трихомонозом была наиболее многочисленна (более 80%), а также представляла наибольшие трудности при диагностике и лечении, мы провели более подробный ее анализ. Всем пациентам был поставлен топический диагноз, с учетом которою назначалось этиопатогенетическое лечение.

Распределение больных по возрасту указывает' па преобладание в общей группе пациентов в возрасте до 30 лет. Возрастная структура пациентов с диагнозом хронического трихомоноза существенно не отличалась от структуры пациентов с УГИ . В половине случаев длительность заболевания составляла до ! года, а у каждого пятого превышала 2 года.

N-9°norrhoeaeC. trachomas

Candida spp

27%

Рисунок 2. Частота выделения микроорганизмов при микст-инфекциях с T.vaginalis.

Подтверждение этиологического диагноза при длительном анамнезе заболевания требовало неоднократного микробиологического обследования,

С учетом того, что группа женщин с острым трихомонозом была немногочисленной (5 человек), основное внимание при анализе клинических проявлений острого трихомоноза мы обращали в отношении группы мужчин. Практически во всех случаях были установлены манифестные клинические формы острого трихомоноза. Подавляющее большинство мужчин предъявляли жалобы на жжение и зуд в ypcipe, выделения из уретры, учашение мочеиспускания. Ситуаций отсутствия жалоб не наблюдалось. У 87% пациентов отмечались слизисто-гнойлые выделения из уретры, ассоциированные с топическим диагнозом переднего уретрита. У каждого

десятого пациента (11,1%) был выявлен тотальный уретрит При тщательном сборе анамнеза было установлено, что заражение УТИ у данной категории пациентов было не первым, а ранее они уже проходили лечение по поводу других УГИ

В значительной степени выраженные симптомы заболевания уже на начальных этапах трихомоноза обусловили то, что более чем в 80% случаев пациенты обращались за медицинской помощью самостоятельно

Эффективность терапии оценивалась по динамике жалоб, клинических симптомов, лабораторных (лейкоцитоз в материале из УГТ), микробиологических (микроскопическое и культуральное исследование) и инструментальных исследований (УЗИ, уретроскопия)

Лечение тибералом (орнидазолом) приводило к эффективному результату у 82,4% пациентов (таблица 1) Результативность терапии тинидазолом составила 73,4%, достоверно не отличаясь от эффективности тиберала Использование макмирора и метронидазола достоверно отличалось менее выраженной эффективностью лечения и составила от 56,0% до 65,6% соответственно Терапия с использованием комбинации орнидазола и нифурателя эффективна у 91,3% пациентов

Таблица 1

Эффективность терапии больных острым урогенитальным трихомонозом _ (п=113)___

Группы больных Результаты лечения

Выздоровление Рецидив

абс % абс %

Метронидазол (п=29) 19 65,6±14,8 10 34,4±14,8

Тинидазол (п=19) 14 73,4±21,5 5 26,6±21,5

Орнидазол (п=17) 14 82,4±11,8 3 17,6±11,8

Нифуратель (п=25) 14 56,0±20,6 11 44,0±20 6

Орнидазол+ Нифуратель (п=23) 21 91,3±7,3 2 8,7±4,6

Возрастная структура пациентов с диагнозом хронического трихомоноза принципиально не отличалась от структуры пациентов с УГИ Преобладали лица наиболее репродуктивного возраста от 21 до 40 лет, составляющие 75,6% Подавляющее большинство мужчин обращались за медицинской помощью самостоятельно в связи с наличием клинических симптомов и жалоб со стороны УГТ При обращении зачастую жалобы носили общий (андрологический) характер и не ассоциировались у пациентов с возможностью заражения урогенитальной инфекцией Женщины обращались к врачу самостоятельно только в 46,6% случаев В условиях лечебных учреждений было выявлено 13% женщин из числа наблюдавшихся, при диспансеризации -21,9%, при обследовании по контакту с больными трихомонозом - 18,5%

В 33,8% слз'чаев длительность заболевания составляла до 1 года, а у каждого пятого (21,9%) превышала 2 года Детальный анализ анамнеза

заболевания у большинства пациентов показал, что многие из них имели опыт неоднократного обращения за медицинской помощью При этом в большинстве случаев лечение ограничивалось назначением антибактериальных препаратов широкого спектра действия, неэффективных в отношении простейших Поэтому в общей структуре заболеваемости хроническими УТИ преобладает трихомоноз, как моноинфекция Не исключено, что при наиболее частых схемах лечения УТИ на практике, происходит селективная эрадикация возбудителей бактериальной природы

В большинстве случаев начальные проявления заболевания носили лод-острый характер, а с учетом давности заболевания в 26,9% пациенты затруднялись с ответом

В большинстве наблюдений как в группе мужчин, так и у женщин, были установлены манифестные клинические формы хронического трихомоноза Одновременно, у 28,3% мужчин наблюдалось асимптомное течение инфекции, что достоверно отличало данную группу от женщин (20,6%)

По сравнению с группой пациентов с УТИ у мужчин с хроническим трихомонозом достоверно чаще отмечались тянущие боли в мошонке (10,8%) и отсутствие жалоб в 28,3% случаев (р<0,05)

Женщины с хроническим трихомонозом наиболее часто предъявляли жалобы на зуд, жжение и выделения из влагалища Отсутствие жалоб было описано только у 10,3% пациенток По сравнению с женщинами в группе больных УТИ при хроническом трихомонозе значимо выше частота жалоб на жжение во влагалище (р<0,05)

В группе лиц с установленным диагнозом «хронический трихомоноз» достоверно чаще отмечались слизисто-гнойные выделения из уретры В 34,4% случаев местные клинические симптомы у мужчин отсутствовали Данный факт может свидетельствовать о постепенном уменьшении воспалительных явлений в урогенитальном тракте с течением времени Следует отметить, что в большинстве подобных случаев при углубленном инструментально-лабораторном обследовании выявлялись незначительные признаки воспаления в области передней, задней уретры и в половых железах

Топическая локализация воспалительных изменений в УГТ у мужчин характеризуется преобладанием признаков уретропростатита У всех пациентов диагноз был установлен на основании данных анамнеза, клинических проявлений, лабораторных данных, уретроскопии и УЗИ предстательной железы

У пациенток с урогенитальным трихомонозом наиболее часто отмечались выделения из влагалища (78,8%), гиперемия стенок влагалища (58,9%), достоверно реже присутствовали эрозии наружных половых органов и эрозия шейки матки (р<0,05) Таким образом, наличие выделений из влагалища являлось одним из основных клинических симптомов мочеполового трихомоноза у женщин При сравнении частоты встречаемости жалоб на выделения из влагалища с фактическим наличием данного клинического симптома у заболевших выяснилось, что данный клинический признак имелся достоверно чаще, чем указания на него (р<0,05) Полученные результаты могут

свидетельствовать о том, что большинство женщин с трихомонозом, имея выделения из влагалища, считают себя «здоровыми» Возможно, это является одной из эпидемиологических предпосылок столь широкого распространения данного заболевания

В 43,8% у женщин с хроническим трихомонозом наблюдались распространенные воспалительные изменения, включая уретрит, эндоцервицит и вагинит Изолированные поражения УГТ выявлялись достоверно реже (р<0,05)

При лабораторном исследовании эякулята мужчин с хроническим трихомонозом достоверных различий в различные сроки заболевания не выявлено Оценивая эякулят по количеству сперматозоидов, можно отметить отсутствие отклонений от нормальных значений данного показателя В то же время функциональное состояние сперматозоидов существенно снижено при хроническом трихомонадном процессе Уже в сроки заболевания от 2-х месяцев наблюдается снижение доли активно подвижных сперматозоидов по сравнению с нормой (р<0,05) Количество лейкоцитов во всех группах пациентов превышало нормальные значения (от 7 до 10 в 10 квадратах камеры Горяева)

Показатель лейкоцитоза в эякуляте во всех группах наблюдения достоверно снижался после проведенной терапии При этом по окончании лечения установлена положительная динамика количества активно подвижных сперматозоидов в эякуляте больных хроническим трихомонозом со сроками инфекции до 12 месяцев (р<0,05) У этой же группы пациентов после лечения достоверно увеличивается количество сперматозоидов в эякуляте У мужчин со сроками заболевания до 2-х лет и более 2-х лет достоверной нормализации количества сперматозоидов и доли среди них активно подвижных клеток не установлено С учетом выявленной тенденции в положительной динамике перечисленных лабораторных показателей (р<0,1) можно предположить, что при сроках хронического трихомоноза более 12 месяцев нормализация количественного и качественного состава спермограммы происходит в более поздние сроки

Уретроскопическое исследование оказалось достаточно информативным при обследовании мужчин с хроническим трихомонозом Наиболее часто отмечалась воспалительная реакция сосудов слизистой в виде инъекции и гиперемии (27,8% и 35,4% соответственно) Примечательно, что часть из пациентов с такими уретроскопическими данными субъективно чувствовали себя удовлетворительно и не предъявляли жалоб Обращает внимание высокая доля пациентов со стриктурами уретры различной степени выраженности (58,1%) Таким образом, наши данные подтверждают результаты исследований НП Шамшина и ТА Кисловой (1977), которые, проводя переднюю уретроскопию, выявили очаговые изменения у каждого из 299 больных хроническим уретритом ОР Зиганшин (1997) при проведении тотальной уретроскопии 122 больным хроническим простатитом обнаружил различные патологические изменения стенок уретры в 96% случаев

При динамическом уретроскопическом обследовании после терапии отмечалась положительная динамика Достоверно снизилось число лиц с

гиперемией слизистой уретры, а пациенты с инъекцией сосудов слизистой выявлены не были В результате проведенного лечения доля больных со стриктурами уретры также достоверно снизилась (14,8%)

Ультразвуковое исследование предстательной железы позволило установить в процессе лечения снижение частоты обнаружения гипоэхогенных включений, очагов фиброза и склероза, диффузной неоднородности структуры Опыт использования УЗИ предстательной железы позволяет рекомендовать данный инструментальный метод для оперативного контроля эффективности терапии и своевременной профилактики развития осложнений

Результаты пальцевого ректального исследования отличались выявлением меньшего числа патологических изменений предстательной железы по сравнению с уретроскопией и УЗИ Наиболее часто выявлялись очаги размягчения (13,6%), пастозность (18,6%), сглаженность срединной борозды (11,9%) и выраженность болезненности при пальпации (9,4%) Через месяц после лечения указанные симптомы встречались достоверно реже (р<0,05)

Для формирования прогноза исхода терапии хронического трихомоноза (благоприятный, сомнительный, неблагоприятный) были отобраны 14 клинико-лабораторных показателей По данным историй болезни больных с тремя видами прогноза сформирована информационная матрица В матрице наблюдений содержатся значения в баллах 14 признаков и пятнадцатый — группировочный признак, указывающий к какой группе относится больной Группа с благоприятным исходом терапии состояла из 38 больных, ее группировочный признак - 1 Больные с сомнительным исходом терапии - 13 человек — объединены в группу с признаком 2 Группа с неблагоприятным исходом содержит 23 наблюдения, ее группировочный признак - 3

В ходе статистического анализа требовалось определить 1) информативность симптомов, включенных и не включенных в линейную дискриминантную функцию (ЛДФ), 2) вклад ЛДФ в дисперсию признаков, 3) коэффициенты канонических ЛДФ, 4) факторную структуру ЛДФ, 5) координаты центроидов трех групп; 6) график положения объектов трех групп, 7) классификационную матрицу с оценками чувствительности диагностики групп информационной матрицы

Решение статистических задач выполнялось с использованием ППП БТАТКИСА 5 0В результате дисперсионного анализа было выявлено, что наиболее информативными показателями (с уровнями значимости р<0,05) являются

XI - Количество возбудителя при культуральном исследовании, Х5 - Наличие осложнений,

Х6 - Наличие жалоб,

Х7 - Длительность заболевания;

Х8 - Количество протистоцидных препаратов в анамнезе лечения, Х9 - Наличие выделений из уретры,

XII - Лейкоциты в отделяемом из УГТ,

Для решения диагностической задачи возможно применение двух канонических ЛДФ, рассчитываемых по формулам

Б, = -4,53x1 + 5,42х5 - 2,85х6 - 3,39х7 + 1,83х8 - 7,06х9 + 3,55хп, ¥2 = -0,3 5х, - 0,09х5 - 0,85х6 - 0,15х7 + 0,29х8 + 0,07х9 - 0,49х„ Решение диагностической задачи выполняется по графику на рисунке 3 на котором нанесены центроиды трех прогнозируемых групп Пациента, для которого по его диагностическим признакам определены ¥] и Р2 (ЯооН и Кхкн2) следует отнести к группе по минимальному расстоянию от соответствующего центроида Как видно, пациенты по результатам статистического анализа распределились в разных центроидах, что указывает на возможность прогнозирования неблагоприятного исхода лечения по совокупности клинико-лабораторных признаков, доступных врачу на практике

Принципиально ценным является возможность использования рассчитанных ЛДФ с целью назначения целенаправленного и обоснованного лечения Окончательно о состоятельности представленной диагностической процедуры можно будет судить после ее широкого клинического испытания Не исключено, что в отношении группы пациентов с неблагоприятным исходом стандартной терапии требуется назначение иммунокорректоров

Ргодпсн

3,5

0_11 0,22 в 33

Рисунок 3 Положение пациентов трех групп (1 - благоприятный прогноз терапии, 2 - сомнительный прогноз, 3 - неблагоприятный прогноз) в координатах первой и второй канонических ЛДФ

Эффективность терапии оценивалась по динамике жалоб, клинических симптомов, лабораторных (лейкоцитоз в материале из УГТ), микробиологических (микроскопическое и культуральное исследование) и инструментальных исследований (УЗИ, уретроскопия)

Результаты клинико-микробиологического мониторинга позволили

провести сравнительную оценку противотрихомонадной активности препаратов (таблица 2) До назначения лечения проводилась рандомизация больных с использованием всего комплекса клинических, лабораторных и инструментальных данных Достоверно выше доля пациентов с успешными результатами терапии наблюдалась при использовании тиберала (орнидазола) (выздоровление в 71,0% случаев) Частота выздоровления при использовании метронидазола, тинидазола и макмирора (нифуратель) характеризовалась более низкими значениями по сравнению с тибералом (орнидазолом) и составляла от 39,3 до 52,9% (р>0,05) Как и при остром трихомонозе, наиболее эффективной оказалась терапия с одновременным использованием орнидазола и нифурателя (85,2%)

Полученные результаты по изучению успешности противопротозойной терапии отличаются в меньшую сторону от литературных данных (Гомберг М А, Плахова К И, 2006) На наш взгляд, это может быть обусловлено распространением среди популяции возбудителя резистентных к противотрихомонадным препаратам штаммов Также нельзя исключить влияние на снижение активности препаратов группы 5-нитроимидазола за счет факторов резистентности, продуцируемых представителями сопутствующей бактериальной анаэробной микрофлоры УГТ

Таблица 2

Эффективность терапии больных хроническим трихомонозом (п=50б)

Группы больных Результаты лечения

Выздоровление Рецидив

абс % абс %

Метронидазол (п=54) 25 4б,7±12,2 29 53,3±12,2

Тинидазол (п=68) 36 52,9±10,9 32 47,1±10,9

Орнидазол (п=262) 186 71,0±5,1 76 29,0±5,1

Нифуратель (п=61) 24 39,3± 11,4 37 60,7±11,4

Орнидазол+ Нифуратель (п=61) 52 85,2±9,2 9 14,8±4,4

Группа пациентов с рецидивами трихомоноза была представлена преимущественно мужчинами Анализ группы пациентов с рецидивами заболевания после терапии выявил достоверно более высокий процент осложнений со стороны УГТ, выявляемых пальпаторно, уретроскопически и при УЗИ предстательной железы

Нами производилась оценка информативности методов лабораторной диагностики урогенитального трихомоноза у 75 мужчин и 62 женщин Ограниченность представленной выборки пациентов объясняется тем, что только в отношении этих лиц одновременно использовались все из сравниваемых методов диагностики

У мужчин наибольшей специфичностью (100%) и чувствительностью (87,8%) среди всех использовавшихся лабораторных методов обладал посев

6Ч

отделяемого из уретры

Высокой чувствительностью (88,5% и 89,3% соответственно) характеризовались микроскопия и посев эякулята Однако вследствие малого числа отрицательных контролей специфичность, прогностическая ценность отрицательного результата и диагностическая эффективность данных методов не определялись

ПЦР отделяемого из уретры имела чувствительность 63,2%, низкую специфичность 27,8% и, вследствие этого, невысокую диагностическую эффективность - 46%

Микроскопия фиксированных окрашенных мазков отделяемого из уретры обладала наименьшей диагностической эффективностью (35%) среди всех изучавшихся методов лабораторной диагностики мочеполового трихомоноза у мужчин

При микроскопии нативных и подкрашенных нативных препаратов у мужчин во всех случаях были получены отрицательные результаты

У женщин наибольшей диагностической эффективностью (95%) обладала микроскопия подкрашенного натявного препарата

Нами изучалась зависимость диагностических свойств методов лабораторной диагностики трихомоноза от количества лейкоцитов в исследуемом биоматериале Для оценки выраженности лейкоцитоза в исследуемом биоматериале выполнялась микроскопия фиксированного и окрашенного метиленовым синим мазка с подсчетом количества лейкоцитов не менее, чем в пяти полях зрения с их максимальным скоплением Мы определяли только чувствительность и прогностическую ценность положительного результата использовавшихся лабораторных тестов ввиду малого количества пациентов без трихомоноза в обследуемых группах У мужчин при количестве лейкоцитов в фиксированном окрашенном мазке отделяемого из уретры более 50 в поле зрения (увеличение х900, объектив 90, окуляр 10) культуральный метод характеризовался максимальной чувствительностью, приближаясь по этому показателю к 100%, что позволяет рекомендовать его однократное использование при данном количестве лейкоцитов для достоверной диагностики трихомоноза При количестве лейкоцитов в отделяемом из уретры менее 50 в поле зрения чувствительность культурального исследования не превышала 93,8%, что не позволяло исключить заболевание при однократном отрицательном результате посева отделяемого из уретры и требовало проведения повторных исследований

Микроскопия ФОМ отделяемого из уретры уступала по чувствительности культуральному методу во всех обследованных группах пациентов, достоверно не отличаясь от него по этому показателю только в группе больных с количеством лейкоцитов в отделяемом из уретры от 11 до 20 в поле зрения (р>0,05)

Метод ПЦР характеризовался разнонаправленными изменениями чувствительности (от 50% до 80%) и прогностической ценности положительного результата (от 53% до 100%) с увеличением количества лейкоцитов в отделяемом из уретры При этом его чувствительность и

прогностическая ценность положительного результата были достоверно ниже соответствующих показателей культурального метода у пациентов с количеством лейкоцитов в отделяемом из уретры более 20 в поле зрения (р<0,05)

Микроскопия и посев эякулята характеризовались высокой чувствительностью, превосходя по этому показателю посев отделяемого из уретры Однако из-за малого числа отрицательных контролен, сложностей дифференциальной диагностики Т уа§ша118 и «круглых клеток» в эякуляте, на наш взгляд, нельзя сделать окончательных выводов об информативности исследования эякулята (в том числе и культурального) при диагностике мочеполового трихомоноза

Ввиду меньшей концентрации возбудителя, трудностей его выделения из мочеполовых органов у мужчин (в сравнении с женщинами) и предъявляемых в связи с этим повышенных требований к качеству забора биоматериала нами исследовалась зависимость диагностических свойств методов лабораторной диагностики мочеполового трихомоноза у мужчин от количества эпителиальных клеток в отделяемом из уретры При этом наибольшей чувствительностью во всех обследованных группах характеризовался посев отделяемого из уретры При количестве эпителиальных клеток в ФОМ отделяемою из уретры менее 5 в пяти полях зрения с их максимальным скоплением чувствительность культурального метода была наименьшей В связи с этим мы предлагаем использовать в качестве критерия качества забора биоматериала из уретры у мужчин наличие не менее 5 эпителиальных клеток в пяти полях зрения с их максимальным скоплением при микроскопии ФОМ отделяемого из уретры (увеличение х900, объектив 90, окуляр 10)

У женщин с мочеполовым трихомонозом достоверно чаще встречался цервицит, при этом количество лейкоцитов в цервикальном отделяемом было наибольшим По этой причине мы исследовали зависимость диагностических свойств методов лабораторной диагностики трихомоноза от количества лейкоцитов в цервикальном отделяемом

Во всех обследованных группах больных женщин микроскопия подкрашенного нативного препарата и культуральный метод характеризовались наиболее высокими значениями чувствительности При этом чувствительность микроскопии ПНП колебалась от 90% до 100%, а культурального исследования от 85% до 95%

Микроскопия фиксированных окрашенных мазков и ПЦР имели сравнимую чувствительность во всех обследованных группах пациенток, которая не превышала 93%

При количестве лейкоцитов в цервикальном отделяемом менее 20 в поле зрения (увеличение х900, объектив 90, окуляр 10) отсутствовали достоверные отличия по чувствительности между микроскопией подкрашенного нативного препарата и фиксированными окрашенными мазками отделяемого из уретры, цервикального канала и влагалища Это позволяет с одинаковой эффективностью применять как микроскопию ПНП, так и микроскопию фиксированных окрашенных мазков для диагностики мочеполового

трихомоноза при лейкоцитозе в цервикаяьном отделяемом менее 20 в поле зрения При большем количестве лейкоцитов в отделяемом из цервикального канала нередко возникают затруднения при микроскопической диагностике мочеполового трихомоноза В связи с этим результаты микроскопии фиксированных окрашенных мазков отделяемого из уретры, цервикального канала и влагалища должны учитываться при комплексной оценке данных культурального исследования и/или микроскопии подкрашенного нативного препарата

Исследование ультраструктурной организации основных морфологических форм Т vaginalis было проведено в целях уточнения возможности образования цист в жизненном цикле простейшего С целью получения доказательств принадлежности округлых форм к одной из жизненных стадий простейшего проведена электронная микроскопия штаммов Т vaginalis, полученных от больных с хронической формой заболевания Ультраструктурное изучение двух морфотипов показало ,что и округлая, и грушевидная формы Т vaginalis окружены только унитарной цитоплазматической мембраной, без дополнительной оболочки В обоих случаях гликопротеиновый слой не выявляется

Ядро у грушевидных клеток овальной формы расположено ближе к переднему концу клетки Особенность ядра грихомонад - наличие постоянно конденсированных хромосом У округлых форм ядро круглое, окруженное типичной двухслойной ядерной мембраной Поровые комплексы встречаются на срезах редко у обоих морфотипов Нуклеоплазма у грушевидных форм гомогенная, у округлых гетерогенная по плотности Содержит зоны конденсированного хроматина, не входящие в конденсированные хромосомы Ядрышко присутствует во всех типах клеток, но его трудно различить среди конденсированного хроматина у округлых форм Особенностью трихомонад является наличие зоны околоядерного эндоплазматического ретикулума

Аппарат Гольджи грушевидных трихомонад состоит из двух диктиосом и располагается вблизи ядра, но не связан с ним напрямую, везикулы и цистерны сильно уплощены, отсутствует выраженная полярность По-видимому, цис-зона ассоциирована с околоядерной ЭПС, имеются указания на тесное взаимодействие диктиосом с аксостиллярным комплексом (Honmgberg В М, 1990) Косвенным признаком транс-области аппарата Гольджи могут служить многочисленные округлые везикулы В цитоплазме клетки грушевидной формы имеются дополнительные стопки уплощенных мембранных цистерн, не входящие в комплекс диктиосом, они считаются частью секреторного аппарата трихомонад (секреторные ламеллы), но биохимические маркеры этой структуры не исследованы (Овчинников НМ, Делекторский ВВ, 1986) У округлых форм происходит редукция уплощенных цистерн, типичные диктиосомы отсутствуют, нет и секреторных ламелл В области парабазального аппарата у округлых форм наблюдается скопление различных по форме и по плотности везикул

Рибосомы грушевидных форм очень многочисленны, локализованы во всех частях клетки В области ядра, ЭПР, вблизи парабазального аппарата,

базальных тел жгутиков, аксостилярного комплекса и различных включений они организованы в полисомы, причем часть полисом находится на мембранах ЭПС, а часть - вне мембран Упорядоченность в расположении рибосом совершенно не свойственна округлым формам В цитоплазме рибосомы распределены неравномерно, в отдельных областях они собираются в агрегированные кластеры, а некоторые зоны цитоплазмы свободные от рибосом

Синтетический аппарат клетки, в который входят ЭПС, парабазальные структуры, системы полисом (Овчинников НМ, Делекторский ВВ, 1986), у округлых форм по сравнению с грушевидными частично редуцируется

Грушевидные формы обладают выраженной ундулирующей мембраной -вырост цитоплазматической мембраны, укрепленный цитоскелетными фибриллярными элементами Внутри ундулирующей мембраны проходит маргинальная ламелла Помимо этого, в области контакта возвратного жгутика и ундулирующей мембраны можно наблюдать дополнительную ламеллу Область контакта опорных структур ундулирующей мембраны не изучена У округлых форм ундулирующая мембрана и ее цитоскелет не обнаружены

Жгутиковый аппарат Т vaginalis организован достаточно сложно У грушевидных форм 4 кинетосомы располагаются параллельно на переднем конце У округлых форм, также как и у грушевидных, кинетосомальный комплекс включает 5 кинетосом (базальные тела), которые располагаются параллельно Друг другу В отличие от грушевидных клеток, у округлых форм происходит редукция фибриллярных связок между кинетосомами У Т vaginalis округлой формы пельта сохраняется лишь частично В области кинетосом отчетливо видна коста, но отсутствуют фибриллярные корешки

Аксостиль у грушевидных форм огибает ядро и механически укрепляет задний конец клетки, у округлых форм происходит полная редукция аксостиля

У грушевидных клеток отмечено, что в области контакта аксостиля с перинуклеарным пространством ядра формируется особая зона, в которой сосредоточены мембраны ЭПС и большое количество полирибосом Мембраны шероховатой ЭПС тесно контактируют с микротрубочками аксостиля У округлых форм характерной области контакта ЭПР с аксостилем не было обнаружено

В цитоплазме грушевидной клетки Т vaginalis присутствует большое количество разнообразных везикул и вакуолей У округлых форм отмечено меньшее разнообразие везикул и вакуолей В округлых формах Т vaginalis наблюдается деградация внутреннего содержимого гидрогеносом, они теряют правильную округлую форму

В результате проведенного электронно-микроскопического исследования показано, что округлые формы Т vaginalis имеют конденсированные хромосомы, 5 кинетосом (базальных тел), пельту, косту и гидрогеносомы Следует отметить, что у округлых форм в цитоплазме клетки отмечены характерные изменения по сравнению с грушевидными клетками частичная, структурная деградация синтетического аппарата, редукция околоядерной ЭПС и связанной с ней аксостиллярной области, изменение характера содержимого

шдрогеносом Следствием подобных изменений может быть снижение секреторной активности клеток Т vaginalis округлой формы (Ribeiro КС et al, 2000) Отсутствие фагосом у округлых клеток указывает на изменение физиологического статуса

Таким образом, результаты исследования свидетельствуют о том, что округлые формы Т vaginalis являются одной из стадий жизненного цикла простейшего Структурные изменения, наблюдаемые в цитоплазме клетки округлых форм, свидетельствуют о снижении физиологической активности простейшего Вместе с тем, у округлых форм Т vaginalis отсутствуют ключевые особенности, характерные для цист (изменение в организации ядра, наличие дополнительных покровов) (Pereira-Neves A et al, 2003) Округлые формы Т vaginalis нельзя рассматривать как стадии покоя, хотя их появление свидетельствует о неблагоприятных условиях

С целью изучения возможности проведения диагностики при отсутствии типичных морфологических форм простейшего в методе нативной микроскопии были исследованы клинические препараты, полученные от мужчин и женщин Критериями регистрации положительных результатов при микроскопии считается активная подвижность, грушевидная форма клетки простейших, наличие жгутиков, характерная вакуолизация цитоплазмы Однако, округлые клетки малоподвижны, жгутики и ядро на светооптическом уровне не различаются, отсутствуют колебательные движения ундулирующей мембраны Округлые формы Т vaginalis отличаются от клеток макроорганизма характерной вакуолизацией и меньшими размерами

При исследовании клинического материала больного с помощью нативной микроскопии к ложноположительным результатам может привести присутствие большого количества полиморфноядерных лейкоцитов (от 30 до 50 клеток в поле зрения), эритроцитов, клеток базального и парабазального слоя эпителия урогенитального тракта, подобных клеткам Т vaginalis Следует обращать внимание на очевидные отличия клетки эпителия значительно крупнее, в них просматривается ядро неправильной формы, цитоплазма слабо гранулированная, гомогенная, лейкоциты отличаются от трихомонад характером вакуолизации, а именно варьированием размеров вакуолей и их плотности

При изучении окрашенных препаратов необходима дифференцировка Т vaginalis от эпителиальных клеток, дегенеративно измененных макрофагов и нейтрофильных гранулоцитов Эпителиальные клетки с эксцентрично расположенным ядром и ячеистой цитоплазмой сходны с Т vaginalis Также к ложным результатам может привести присутствие в клиническом материале макрофагов, хотя ядро макрофага отличается по форме

Фазово-контрастная микроскопия почти не применяется в рутинной диагностике трихомоноза, но может оказаться перспективной, поскольку позволяет выявить тонкие детали организации клетки, в частности жгутики и псевдоподии Для описания морфологии округлых форм Т vaginalis был использован клинический материал пациентов, у которых методом нативной микроскопии идентифицировались округлые формы Цитоплазма выглядит

гранулированной, с многочисленными четко очерченными включениями по всему объему клетки Эти включения у подвижных форм сконцентрированы в околоядерной области и не столь многочисленны Округлые клетки неподвижны, но на переднем конце обнаруживаются укороченные свободные 2-3 жгутика, иногда несколько удаленные друг от друга У грушевидных клеток 5 жгутиков, 4 из которых тесно сомкнуты и отчетливо видны на переднем конце Фазово-контрастная микроскопия особенно эффективна при выявлении слизистых капсул и тонких внеклеточных покровов У округлых и грушевидных клеток таких покровов не обнаружено У округлых форм отсутствует ундулирующая мембрана и не отмечено формирование псевдоподий Морфология округлых форм у мужчин и женщин не различалась При использовании нативной микроскопии в препаратах отмечаются амебоидные формы Т vaginalis (Клименко Б В и др, 2001) Фазово-контрастная микроскопия позволила проследить процесс формирования амебоидных клеток из типичных грушевидных форм Амебоидные клетки способны образовывать разные по форме и размерам псевдоподии (ризоподии, лобоподии) Этот процесс происходит при контакте простейшего с эпителиальной клеткой макроорганизма Формирование псевдоподий начинается на переднем конце клетки, проходит вдоль тела простейшего и заканчивается на заднем конце Псевдоподии амебоидных форм Т vaginalis маскируют место отхода свободных жгутиков

Клинический материал, исследованный с помощью фазово-контрастной микроскопии дополнительно изучался в ДИК В отличие от фазово-контрастной микроскопии ДИК позволяет установить истинный размер исследуемого объекта

Размер округлых морфологических форм Т vaginalis, наблюдаемых у мужчин и женщин, существенно не отличался В среднем у мужчин он составил 10-12 мкм и 12-14 мкм у женщин Анализ микроскопической картины округлых форм Т vaginalis позволил более отчетливо выявить в цитоплазме клетки включения, элементы парабазального аппарата В некоторых случаях в клиническом материале преобладают полиморфноядерные лейкоциты, сходные по морфологии с округлыми атипичными формами Безусловным отличием является строение ядра Это легко выявить с помощью окрашивания -флюохромом диаминофенилиндолом (DAPI) и при использовании комбинированной микроскопии Она сочетает в себе фазово-контрастную и флюоресцентную микроскопию Комбинированная микроскопия позволяет оценить положение ядра относительно кинетосом свободных жгутиков

При сравнительной оценке микроскопических подходов в дифференцировке Т vaginalis округлой формы фазово-контрастная микроскопия и дифференциально-интерференционный контраст являются наиболее информативной Данная методика позволяет однозначно дифференцировать все доступные на светооптическом уровне цитоморфологические признаки округлых: клеток Т vaginalis форму и размеры ядра, вакуолизацию цитоплазмы, наличие жгутиков Характерная вакуолизация цитоплазмы Т vaginalis связана с наличием в ней особых органелл -

гидрогеносом

Оценка эффективности модифицированной питательной среды в сравнении с известными питательными средами для культивирования Т vaginalis

В сравнительное исследование были включены, помимо модифицированной питательной среды Даймонд с оптимальными концентрациями флуконазола, еще 6 широко используемых составов питательных сред среда Джонсона-Трасселя, СКДС, 199-СДС, Тераса, Даймонд и модифицированная тиогликолевая среда, 3 коммерчески выпускаемых питательных сред производства НПФ «Диагност-мед» (г Омск, Россия), Orion. Diagnostica — «Vagicult» (Финляндия) и питательная среда для выделения трихомонад (г Махачкала, Россия)

Сравнительное исследование питательных сред проводилось на основании оценки основных параметров роста культуры Т vaginalis урожай и подвижность простейшего в динамике на 3, 5 и 6 сутки культивирования Всего проведено 30 исследований

Все исследованные питательные среды для культивирования Т vaginalis условно можно подразделить на две группы в зависимости от физиологических показателей (урожая и подвижности) Первая группа включает в себя следующие питательные среды модифицированный вариант среды Даймонд, Даймонд, Джонсона-Трасселя, СКДС, питательная среда для выделения трихомонад (Махачкала, Россия), во вторую группу входят питательные среды - 199-СДС, Тераса, тиогликолевая модифицированная среда, а также коммерческие среды производства Финляндии и Омска При культивировании Т vaginalis на всех указанных питательных средах наблюдается придонный рост культуры в виде плотного осадка беловатого цвета

Первая группа питательных сред характеризуется накоплением культуры трихомонад на 3 сутки культивирования, в среднем до 15,8х10^кл/мл, и снижением количества клеток на 5 сутки до 10,5x103кл/мл и 6 сутки культивирования, в среднем до 6,8x103кл/мл При оценке подвижности клеток, культивируемых в питательных средах, входящих в первую группу , показано, что на 3 сутки выявляется наибольший процент подвижных клеток Т vaginalis (71,6%), а при увеличении срока культивирования (5 и 6 сутки) наблюдается тенденция к снижению количества подвижных форм до 23,3%

Во вторую группу входят питательные среды, в которых не отмечается накопление культуры Т vaginalis при их использовании На 3 сутки культивирования в среднем наблюдается 5,7х103кл/мл, а подвижность составляет не более 23% При увеличении срока культивирования (5 и 6 сутки) наблюдается тенденция к снижению количества клеток в среднем до 2,8х103кл/мл и подвижных форм до 3,9%

Обобщая полученные результаты, можно отметить, что все имеющиеся на сегодняшний день питательные среды не позволяют культивировать Т vaginalis, а способны лишь кратковременно поддерживать культуру Увеличение срока культивирования не позволяет производить оценку результатов, поскольку происходит задержка роста и потеря подвижности

возбудителя

В период с 2003 по 2005 г проводилось культивирование Т vaginalis на модифицированной питательной среде Даймонд с добавлением в ее состав оптимальной концентрации флуконазола Результаты исследований показывают, что на модифицированной среде Даймонд удалось повысить частоту выявления Т vaginalis в клинических образцах больных со среднего 30% до 75%

При разработке и использовании модифицированного варианта ИФА для сравнения использовалась отечественная ИФА тест-система («ТрихомоноБест-IgG-стрип», г Новосибирск)

В качестве исследовательского инструмента нами применялся вариант ИФА, основанный на использовании нативных трихомонадных антигенов, полученных путем культивирования простейших и выделенных физическими способами Для сенсибилизации планшетов использовался ультраозвученный трихомонадный антиген, который отличался более высокой степенью дезинтеграции белковых структур клеточной стенки простейшего

Для изучения чувствительности модифицированного варианта ИФА, с использованием в качестве иммуносорбента ультраозвученного антигена тестировалась панель сывороток крови, представленная 89 образцами, полученными от мужчин и женщин с подтвержденным диагнозом урогенитального трихомоноза

Все обследованные пациенты были разделены на группы в зависимости от формы заболевания В первую группу были включены пациенты с острой формой заболевания (41 образец), во вторую - с хронической формой (48 образцов)

Для сравнения использовалась иммуноферментная тест-система «TpHX0M0H0BecT-IgG-CTpHn» Всего было исследовано 103 образца сыворотки крови, полученных от мужчин и женщин с разными формами заболевания острой (46 образцов) и хронической (57 образцов)

При постановке модифицированного варианта ИФА общая чувствительность обнаружения специфических иммуноглобулинов составила 30,3% (п=27), а с использованием тест-системы «ТрихомоноБест-IgG-cTpmi» этот показатель равнялся 25,2% (п=26)

Исследование сывороток крови больных острой формой трихомоноза показало, что частота обнаружения положительных результатов была выше с использованием модифицированного варианта ИФА (29,3%), по сравнению с ИФА тест-системой «ТрихомоноЕест-1§0-стрип» (19,6%)

При сравнительном исследовании сывороток крови больных хронической формой трихомоноза с использованием модифицированного варианта ИФА и тест-системы «ТрихомоноБест-IgG-CTpHn» не было отмечено значимых различий (31,3% и 29,8%, соответственно)

При использовании модифицированного варианта ИФА не наблюдается различий по частоте встречаемости положительных результатов у больных острой и хронической формой заболевания (29,3% и 31,3%, соответственно) Чувствительность ИФА при использовании тест-сисгемы «ТрихомоноБест-

^О-стрип» выше у больных хронической формой (29,8%), по сравнению с группой больных, страдающих острой формой заболевания (19,6%) (р<0,05)

При обследовании мужчин чувствительность тест-системы «ТрихомоноБест-^С-стрип» выше (28,8%), по сравнению с модифицированным вариантом ИФА (8,9%) Отмечались различия между результатами ИФА при обследовании больных острой формой заболевания При использовании модифицированного варианта показатель чувствительности у данной группы больных составил 3,4%, а при постановке «ТрихомоноБест-^О-стрип» - 20,7% При обследовании больных с хронической формой трихомоноза нет достоверных различий в результатах ИФА (14,8% - при постановке с использованием модифицированного варианта и 36,7% -«ТрихомоноБест-1^0-стрип») (р>0,05)

При использовании модифицированного ИФА у мужчин с хроническим трихомонозом частота обнаружения положительных результатов ИФА была несколько выше, чем у больных с острой стадией заболевания (14,8% и 3 4% соответственно) Однако наблюдаемые различия были статистически незначимы (р>0,05)

Сходная картина наблюдалась при использовании тест-системы «ТрихомоноБест-^О-стрип» При хроническом течении урогенитального трихомоноза у мужчин наблюдается увеличение частоты встречаемости положительных результатов, по сравнению с острой формой заболевания (36,7% и 20,7% соответственно)

Проводили сравнительные исследования двух вариантов ИФА в группе женщин с разными формами заболевания Отмечено, что чувствительность модифицированного варианта ИФА выше (66,7%), по сравнению с тест-системой «ТрихомоноБест-^О-стрип» (20,5%) Сравнение частоты встречаемости положительных результатов при обследовании женщин с острой формой заболевания двумя вариантами ИФА показало, что с использованием модифицированного варианта ИФА этот показатель был выше (91,7%), по сравнению с чувствительностью ИФА тест-системой «ТрихомоноБест-^О-стрип» при обследовании той же группы пациентов (17,6%)

У женщин с хронической формой трихомоноза отмечается тенденция к увеличению частоты обнаружения положительных результатов при использовании модифицированного варианта ИФА (52,4%) Чувствительность тест-системы «ТрихомоноБест-^О-стрип» при обследовании той же группы пациентов составляет 22,2%

При использовании модифицированного варианта ИФА для исследования сывороток крови женщин показано, что частота обнаружения положительных результатов у женщин с острым трихомонозом была выше, по сравнению с хроническим течением этого заболевания (91,7% и 52,4%, соответственно)

Чувствительность модифицированного варианта ИФА при обследовании больных мужчин и женщин различалась У женщин частота обнаружения положительных результатов была выше (66,7%), по сравнению с мужчинами (8,9%) Представленные данные статистически достоверны (р<0,05)

Показаны значительные различия между пациентами с острой формой заболевания У женщин частота выявления положительных результатов при этой форме заболевания была выше и составляла 91,7%, а у мужчин 3,4% Отмечена тенденция к увеличению иммунологической реактивности у мужчин и женщин при остром трихомонозе по сравнению с хронической формой заболевания (52,4% и 14,8%, соответственно)

У женщин, положительных в ИФА, в клиническом материале преобладали типичные жгутиковые грушевидные формы трихомонад, а у мужчин - округлые Можно предположить, что жгутиковые грушевидные формы трихомонад обладают более выраженной иммуногенностью, и характеризуются наличием большего количества антигенов Помимо этою, в уротенитальном тракте женщин вследствие благоприятных условий существования (рН, наличие факторов роста) наблюдается большая концентрация возбудителя У мужчин вследствие анатомических особенностей регулярное мочеиспускание приводит к динамике физико-химических условий в уретре и снижению концентрации возбудителя Предполагается, что высокая интенсивность формирования пула антителпродуцирующих лимфоцитов и последующая выработка иммуноглобулинов в организме женщин может быть связана со сравнительно большей площадью взаимодействия микробных антигенов и слизистых оболочек урогенитального тракта

К другой группе факторов, влияющих на чувствительность ИФА можно отнести особенности получения антигенов возбудителя условия культивирования простейших (состав питательной среды, длительность размножения), способ и режимы дезинтеграции микробного антигена Следует отметить, что в модифицированном варианте ИФА в качестве иммуносорбента использовали культуры Т vaginalis грушевидной формы

При использовании тест-системы «ТрихомоноБест-^О-стрип» частота обнаружения положительных результатов у мужчин и женщин достоверно не отличалась (р>0,05) (28,8% и 20,5%, соответственно)

Таким образом, сравнительное исследование модифицированного варианта ИФА и тест-системы «ТрихомоноБест-^О-стрип» показало значительное различие при обследовании одной и той же группы больных Выявлено, что показатель чувствительности достоверно выше в группе женщин с острым трихомонозом (р<0,05) Полученные результаты позволяют прогнозировать большую диагностическую эффективность модифицированного варианта ИФА у женщин при острой форме заболевания

Анализ уровней IgG-антител в положительных образцах при использовании модифицированного варианта ИФА показал, что они характеризовались наиболее высокими значениями оптической плотности при остром урогенитальном трихомонозе у женщин, по сравнению с мужчинами в той же стадии заболевания Наблюдаемые различия в выработке IgG-антител у мужчин и женщин с острым воспалительным процессом, вероятно, отражают различную концентрацию возбудителя в мочеполовых путях у представителей разного пола и выраженность гуморального иммунного ответа При

хроническом трихомонозе у женщин уровень 1§0-антител был несколько ниже, чем при остром процессе, однако различия были статистически незначимы (р>0,05) У мужчин с хроническим заболеванием уровень противотрихомонадных антител был более высоким, по сравнению с острой формой, что отражает известные закономерности в динамике иммуноглобулинов класса в при инфекционном процессе

При анализе уровней противотрихомонадных 1»0-антител с использованием тест-системы «ТрихомоноБест-^О-стрип» обращает на себя внимание отсутствие достоверных различий между больными мужчинами и женщинами с острым и хроническим трихомонозом Это может быть связано с наличием перекрестно реагирующих антител (например, к кишечным трихомонадам или трихомонадам полости рта), а также с преимущественным синтезом специфических 1§0-аятител против соматических антигенов Т \^та115

Для изучения эффективности проведенного лечения, нами была сформирована панель сывороток крови пациентов, взятых после лечения В модифицированном варианте ИФА тестировались 22 образца сывороток крови, полученных спустя 2-3 недели после окончания лечения , и 2 образца , спустя 2 месяца после лечения. В ИФА тест-системе «ТрихомоноБест-Т£С-стрип» исследовались сыворотки крови ряда больных , спустя 2-3 недели после лечения - 31 образец, и 2 месяца после лечения - 6 образцов Уменьшение количества исследуемых образцов при динамичном обследовании объясняется отказом ряда пациентов от обследования

При использовании модифицированного варианта ИФА, спустя 2-3 недели после окончания антипротозойной терапии, наблюдается тенденция к уменьшению числа положительных результатов, по сравнению с результатами, полученными перед началом лечения По-видимому, это связано как с уменьшением пула циркулирующих вследствие элиминации возбудителя, так и с недостаточно большим числом исследуемых образцов сывороток крови

При анализе обнаружения иммуноглобулинов класса в сыворотках крови пациентов в ИФА тест-системе «ТрихомоноБест-^С-стрип» .спустя 2-3 недели, а также 2 месяца после лечения, обращает на себя внимание тенденция к увеличению числа положительных результатов (29,0% и 33,3%, соответственно), по сравнению с результатами исследования до лечения (25,2%) Данное обстоятельство возможно связано с длительной циркуляцией в сыворотке крови иммуноглобулинов класса в на фоне элиминации специфических антигенов Окончательно данное предположение может быть уточнено при изучении большего числа клинического материала от больных Сохранение доли положительных результатов ИФА после проведенного лечения не позволяет использовать данную тест-систему для контроля за эффективностью терапии у обследованных категорий больных

Одним из путей увеличения информативности ИФА является изучение субизотипической структуры пула противотрихомонадных ^й-антител Данный подход с успехом применяется для диагностики вирусных гепатитов, сифилиса, хламидиоза, ВИЧ-инфекции (Климович В Б , 1996)

Для исследования были отобраны сыворотки крови больных, позитивные в модифицированном варианте ИФА Всего было исследовано 18 сывороток крови, из них 16 образцов, полученных от женщин, и 2 образца от мужчин

При анализе подклассов специфических ^О-антител у представителей разного пола установлено отсутствие достоверных различий по частоте встречаемости 1еС1, ^ОЗ и У мужчин специфические иммуноглобулины класса ^02 отсутствовали, что может быть связано с малым числом наблюдений Одновременно наличие у мужчин специфических 1еО!, 1°03 и отсутствие '^02-антител может свидетельствовать о преобладании у них трихомонадных антигенов белковой природы При сравнении частоты встречаемости противотрихомонадных ^Ст-антител по подклассам при остром и хроническом трихомонозе отсутствовали статистически значимые различия (р>0,05), что указывает на наличие антител класса в к специфическим антигенам как белковой, так и полисахаридной природы у больных обеих групп При остром и хроническом трихомонозе статистически значимые различия не наблюдаются При острой форме заболевания у женщин присутствовали все подклассы ^С-антител, достоверно не отличаясь, друг от друга по частоте встречаемости При хроническом трихомонозе у женщин отсутствовали ^01-антитела, что не позволяет сделать однозначных выводов о преобладании специфических антител к полисахаридным антигенам у данной категории больных

У мужчин с хроническим трихомонозом ^02~антитела отсутствовали, что при обнаружении специфических ^01, 1§03 позволяет говорить о преобладании иммунного ответа к антигенам белковой природы

Анализ результатов проведенного ИФА по обнаружению противотрихомонадных подклассов иммуноглобулинов позволяют

разделить полученные показатели на 3 группы и выявить несколько типов иммунного ответа у больных Первый тип иммунного ответа характеризуется абсолютным преобладанием субизотипов При втором типе иммунного

ответа наблюдаются подклассы и 1^03 Третий тип иммунного ответа отличается относительным преобладанием в пуле противотрихомонадных антител субизотипа СЗ

Такое предварительное разделение исследуемых образцов позволяет, исходя из общебиологических закономерностей синтеза иммуноглобулинов класса в, предположить химическую природу антигенов, преимущественно реагирующих в составе иммуносорбента По всей вероятности при первом типе в связывании антител основное место принадлежит полисахаридам, а при третьем- антигенам белковой природы Второй тип иммунореактивности может быть связан с антителами как к белковым, так и полисахаридным антигенам

Одну из проблем современного трихомоноза составляет выбор эффективного этиотропного лечения В настоящее время для лечения мочеполового трихомоноза широко применяются метронидазол - 5-нитроимидазол и группа его производных Показано, что часть современных изолятов трихомонад обладают резистентностью к действию метронидазола Механизм формирования устойчивости трихомонад к метронидазолу до конца

не изучен (Гомберг М А, Плахова К П, 2006, Swygart Н et al, 2004, Scwebke J R, Barrientes F J, 2006)

На сегодняшний момент отсутствуют простые и доступные для широкого использования в лабораторной практике методики определения m vitro резистентности Т vaginahs к противопротозойным препаратам группы нитроимидазолов (Narcisi ЕМ., Secor WE, 1996, Meri Т, 2000) Нами разработан и предлагается новый способ определения чувствительности влагалищных Т vaginalis m vitro, не требующий предварительного накопления культуры возбудителя Используют две среды без метронидазола и с концентрацией метронидазола 8 мкг/мл Эта концентрация объясняется следующим По данным литературы, в отношении клинически чувствительных штаммов Т vagmalis МИК метронидазола ш vitro не превышает 6 мкг/мл, а в отношении клинически резистентных штаммов определяется на уровне не ниже 10 мкг/мл Таким образом, концентрация метронидазола 8 мкг/мл в питательной среде гарантировано ингибирует рост чувствительных Т vagmalis и не препятствует размножению резистентных микроорганизмов Учет результатов производят через 72 часа культивирования на световом микроскопе При контроле посевов материал берется со дна пробирки Капли просматривают в препарате «раздавленная капля» в затемненном поле микроскопа При обильном росте в среде без метронидазола наблюдаются от 5 до 50 и более типичных морфологических форм Т vagmalis в одном поле зрения Одновременно оценивается характер роста на питательной среде с метронидазолом Определение резистентности возбудителя проводят путем сравнения с результатами культивирования Т vaginaüs в питательной среде без метронидазола Отсутствие роста на питательной среде с метронидазолом свидетельствует о чувствительности возбудителя к указанному препарату Размножение Т vaginalis в двух питательных средах указывает на резистентность Т vaginalis к метронидазолу

В литературе имеются достаточно обширные сведения о наличии сдвигов в иммунном статусе при различных ИППП Показано, что изменения обладают специфичными чертами и касаются различных звеньев иммунитета (неспецифические факторы защиты, показатели функциональной активности нейтрофилов, Т- и В-клеточные звенья) (Позняк AJI, 2001) Большинство исследователей предполагают взаимосвязь и взаимообусловленность подобных изменений Установлена взаимосвязь иммунных нарушений и стадий инфекционного процесса Исходя из этого, прогнозируется, что эффект иммунотерапии может быть обусловлен этапом патологического процесса (ГоринЕЮ и др , 2001)

Анализ общепринятых клинических лабораторных сведений не выявил различий в группах пациентов с острым и хроническим трихомонозом по сравнению с группой сравнения (р>0,05)

Изучение клеточных показателей иммунитета у больных острым трихомонозом позволило выявить динамику иммунного статуса в процессе терапии После лечения установлено достоверное снижение абсолютного числа клеток периферической крови с фенотипом CD3+ и CD4+ Этот факт может

быть связан со снижением воспалительных проявлений в УГТ на фоне эффективной терапии Динамика концентрации ИЛ-4 и ИЛ-8 характеризовалась разнонаправленностъю Концентрация сывороточного ИЛ-4 достоверно повышалась в ближайшие после окончания лечения сроки Подобная динамика ИЛ может быть обусловлена активацией возбудителем трихомоноза иммунного ответа по ТЪ2 типу Уровень сывороточного ИЛ-8 напротив снижался в результате лечения, что, скорее всего, связано со снижением местной воспалительной реакции на слизистых УГТ

Иммунологические показатели при хроническом трихомонозе принципиально не отличались от таковых при остром заболевании В то же время отмечены достоверно более низкие абсолютные значения содержания клеток с фенотипами СОЗ+ и СБ4+ при хроническом трихомонозе вследствие большей длительности инфекционного процесса и снижения выраженности местных воспалительных реакций Положительная динамика ИЛ-8 в процессе терапии хронического трихомоноза может объясняться развитием неспецифической воспалительной реакции после эрадикации простейших

Отличий в иммунологических показателях при обследовании мужчин и женщин выявлено не было Группа мужчин характеризовалась повышением в динамике лечения уровней сывороточных ИЛ-1 и ИЛ-8 Повышение концентрации ИЛ-1 мы объясняем возможной активацией иммунной системы по ТЫ типу, а повышение ИЛ-8 с усилением неспецифических воспалительных изменений на слизистых УГТ

Таким образом, были выявлены зависимости в данных иммунологических исследований от диагноза (острый и хронический трихомоноз) и сроков обследования С целью уточнения характера иммунологических изменений при трихомонадной инфекции мы суммировали данные исследований с учетом длитезгьности заболевания на момент обследования пациентов

Данные исследований до лечения указывают на то, что при длительности заболевания от 12 до 24 месяцев характерно достоверное снижение клеток с фенотипом СВЗ+ Этот факт отражает развивающееся иммунодефицитное состояние, природа которого требует дополнительного изучения Следует отметить, что эффективное лечение способствует нормализации клеточных факторов иммунитета у данной категории пациентов

Одновременно, при сроках заболевания более 6 месяцев, установлено достоверное повышение концентрации сывороточных ИЛ-4 и ИЛ-8, отражающих интенсификацию иммунного ответа при хронизации заболевания Уровни данных ИЛ у пациентов с меньшими сроками трихомоноза отличаются снижением, вероятно связанным с повышенным потреблением факторов иммунитета при остром инфекционном процессе Эффективная терапия приводит к компенсаторному повышению концентрации ИЛ

Наибольший интерес представляло обобщение иммунологических данных с учетом прогноза терапии хронического трихомоноза По результатам ретроспективного анализа, были выделены три группы пациентов, успешность терапии которых была известна Первую группу составили больные, однократная терапия которых оказалась успешной Во вторую группу были

объединены лица с промежуточным эффектом терапии В третью группу вошли больные с неудачными итогами терапии

Наиболее показательным является сравнительный анализ иммунологических исследований в первой и третьей группах Установлено, что неблагоприятный прогноз лечения хронического трихомоноза ассоциирован с достоверно более низким содержанием в сыворотке крови иммунокомлетентных клеток с фенотипом СБ 19+ При неблагоприятном прогнозе терапии отмечается тенденция к преимущественному иммунному реагированию по ТЫ типу, что проявляется достоверным превышением концентрации ИЛ-1 и ИФН-у (в сыворотке крови и смывах со слизистых УГТ) по сравнению с пациентами первой группы Одновременно очевидна достоверная активация системной и местной продукции ИЛ-8 у лиц с благоприятным прогнозом успешности терапии

Таким образом, выявлены две возможные тенденции в регуляции иммунного ответа при хроническом трихомонозе, играющие прогностическое значение В первом случае иммунный ответ имеет преимущественную склонность к ТЫ типу, что коррелирует с неблагоприятным прогнозом терапии В таком случае возможна местная воспалительная реакция на возбудителя, обусловленная преимущественным участием клеточных элементов макрофагального типа Как известно, в подобной ситуации возможно формирование местных осумкованных очагов воспаления, препятствующих проникновению этиотропных препаратов в место локализации возбудителя и достижению их эффективных концентраций В случае благоприятного прогноза терапии регуляция иммунного ответа имеет тенденцию к ТЬ2 типу, связанному с преимущественной стимуляцией гуморальных звеньев иммунной защиты

Мы провели сравнительный анализ эффективности терапии трихомоноза у больных с хронической формой заболевания, ввиду того, что данная категория больных представляет наибольшие трудности в лечении

Иммунологические показатели до начала лечения в группах пациентов с различной терапией не отличались, что подтверждает соблюдение принципов рандомизации Это касается как клеточных, так и цитокиновых факторов иммунитета (р>0,05)

В качестве основного препарата иммуномодулирующей терапии нами был выбран Бестим, который является, по данным предыдущих исследований, наиболее адекватным, целенаправленным, эффективным и удобным из группы иммуномодуляторов, хорошо переносится больными, не вызывая осложнений (Левашова Ю Н, Симбирцев А С, 2007) 74 пациента с хроническим трихомонозом были распределены с их согласия на две равноценные группы -опытную (этиотропное лечение орнидазолом и бестим) и контрольную (этиотропное лечение орнидазолом без иммунотерапии)

Открытию иммуномодулируюгцих свойств дипептида у-В-глутамил-Ь-триптофана, получившего впоследствии название «Бестим», предшествовали результаты масштабных исследований коротких пептидов с а- и у-связями, в состав которых входили Ь- и Б-аминокислоты Эти пептиды исследовались т уйго в тестах Конканавалин А (КонА)-индуцированной продукции ИЛ-2

спленоцитами и усиления экспрессии маркера ТЬу1 клетками костного мозга мыши В делом было установлено, что парентеральное введение Бестима интактным мышам приводит к стимуляции Т-клеточного лимфопоэза, влияет на созревание Т-клеток в тимусе, а также усиливает функциональную активность зрелых Т-клеток селезенки, стимулируя при этом поляризацию Т-лимфоцитов в направлении Т-хелперов 1-го типа (Левашева Ю Н , Симбирцев А С, 2007) Следствием стимулирующего эффекта Бестима на дифференцировку и функциональную активность ТЫ является его выраженное и стойкое активирующее действие на макрофаги, чрезвычайно важное при большинстве инфекционных патологий Таким образом, в экспериментальных исследованиях Бестим показал существенный иммуномодулирующий эффект

Иммунологические показатели до начала лечения в группах пациентов с различной терапией не отличались, что подтверждает соблюдение принципов рандомизации Это касается как клеточных, так и цитокиновых факторов иммунитета (р>0,05)

Включение Бестима в комплексную терапию хронического трихомониза проявилось более выраженной положительной клинико-лабораторной динамикой по сравнению с контролем (р<0,05) В частности, у половины пациентов отмечалось исчезновение жалоб на момент окончания лечения Через месяц после лечения только у 15% пациентов сохранялись жалобы Контрольная группа пациентов характеризовалась менее выраженной динамикой жалоб Более половины из них предъявляли жалобы через месяц после лечения

Динамика воспалительных изменений в УГТ также имела отличия Микроскопические исследования материала из УГТ выявляли повышенный лейкоцитоз в среднесрочный период после лечения в опытной группе в 2,5 раза реже, чем в контрольной (р<0,05)

Подобная динамика наблюдается и при анализе результатов микробиологических исследований В большинстве случаев сохранение воспалительного синдрома сопутствовало персистенции возбудителя При этом достоверные отличия в ее частоте имели место только на момент окончания лечения, что демонстрирует преимущество дополнительной иммунотерапии (р<0,05)

Наличие комплекса иммунологических данных и их динамики позволили выяснить некоторые механизмы действия Бестима у пациентов с различной давностью заболевания

В процессе лечения Бестимом наблюдается системное повышение клеток с С.ОЗ^ и СБ4+ фенотипами Наиболее репрезентативной является выборка пациентов со сроками заболевания от 6 до 24 мес, в которой различия в содержании данных показателей были достоверными (рисунок 4) При сроках заболевания от 6 до 24 месяцев также отмечалось снижение СШ6+ клеток периферической крови Более подробный анализ данных в группах больных со сроками заболевания от 6 до 24 месяцев, указывает на то, что при применении бестима наблюдалась тенденция к селективной стимуляции клеток с С04+ фенотипом, в то время как содержание клеток с фенотипом СТ>8+ достоверно

не повышалось Также отмечалась достоверная тенденция к повышению уровня сывороточного ИЛ-4

90,00 у-------------—-------------------------

80,00 70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00

Рисунок 4 Динамика иммунологических показателей при лечении Бестимом в зависимости от длительности заболевания

Таким образом, включение Бестима в комплексную терапию хронического трихомоноза оказывает иммуностимулирующее действие и клиническую эффективность у данной категории больных На основании проведенных исследований мы считаем целесообразным включение Бестима в схему терапии больных хроническим трихомонозом

ВЫВОДЫ

1 В структуре обследованных больных урогенитальными инфекциями Северо-западного региона России с урогенитальными инфекциями преобладают пациенты с хроническим трихомонозом в форме моноинфекции (33%) Отличительной особенностью хронического трихомоноза у мужчин является отсутствие у трети больных жалоб и объективных клинических симптомов, не смотря на проведенные лабораторные и инструментальные исследования Течение трихомоноза у мужчин характеризуется слабой выраженностью клинических симптомов

Клиническая картина мочеполового трихомоноза у женщин характеризуется преобладанием манифестных форм заболевания

Наиболее часто при смешанных инфекциях с участием Т vagшa!ls встречается сочетание с дрожжеподобной и условнопатогенной бактериальной микрофлорой Далее по мере убывания частоты встречаемости располагаются сочетания с микоплазменной и хламидийной инфекциями Из числа

СОЗ+(б-12мес) СМ+ (12-24 мес) С04+(б-12мес) С04+ (12-24 мсс) С08+(б Имес) С08+(12-24 мес)

иммунологические маркеры

бактериальной условнопатогенной микрофлоры наиболее значима кокковая (стафилококки, энтерококки) и энтеробактериальная микрофлора

2 Округлые формы Т vaginalis являются одной из стадий жизненного цикла простейшего Структурные изменения, наблюдаемые в цитоплазме клетки округлых форм, указывают на снижение физиологической активности простейшего У округлых форм Т vaginalis отсутствуют ключевые особенности, характерные для цист (изменение в организации ядра, наличие дополнительных покровов) Округлые формы Т vaginalis нельзя рассматривать как стадии покоя, хотя их появление свидетельствует о неблагоприятных условиях

3 При культивировании округлых морфологических форм трихомонад на культуре перевиваемых клеток (HeLa) наблюдается их адгезия с последующим цитотоксическим действием При культивировании трихомонад в течение 2-х суток и более выявляется нарушение целостности монослоя клеток с последующим полным его разрушением

4 В результате сравнительных исследований установлено, что все исследованные питательные среды для культивирования Т vaginalis можно подразделить на две группы в зависимости от физиологических показателей (урожая и подвижности) Первая группа питательных сред характеризуется накоплением культуры трихомонад на 3 сутки культивирования, в среднем до 15,8x103кл/мл, и снижением количества клеток на 5 сутки до 10,5x10 кл/мл и 6 сутки культивирования, в среднем до 6,8x103кл/мл Во вторую группу входят питательные среды, в которых не отмечается накопление культуры Т vaginalis при их использовании

Разработанный модифицированный вариант питательной среды Даймонд для культивирования Т vaginalis существенно не отличается по физиологическим показателям от известных питательных сред, относящихся к первой группе, но при этом является более стандартизованной по составу с наиболее оптимальной концентрацией флуконазола

5 Микроскопия нативного отделяемого из урогенитального тракта у женщин обладает наибольшей чувствительностью (96,2%) и специфичностью (94,4%) Микроскопия отделяемого из уретры у мужчин характеризуется низкой чувствительностью (47,4%) и специфичностью (22,2%) и отражает выраженность местной воспалительной реакции и качество забора биоматериала

Культуральный метод диагностики урогенитального трихомоноза у женщин имеет чувствительность 88,7% и специфичность 94,4% У мужчин наибольшей чувствительностью (87,7%) и специфичностью (100%) обладает культуральное исследование (посев отделяемого из уретры), что позволяет рассматривать его в качестве ведущего метода лабораторной диагностики мочеполового трихомоноза у мужчин ПЦР отделяемого из урогенитального тракта у мужчин и женщин характеризуется невысокой чувствительностью (63,2% и 86,81% соответственно) и специфичностью (27,8% и 33,3% соответственно) и может использоваться в качестве вспомогательного метода диагностики мочеполового трихомоноза

6 ИФА на наличие сывороточных противотрихомонадных IgG-антител ввиду недостаточной чувствительности (31,5%) может применяться в качестве вспомогательного диагностического теста, при этом положительные результаты носят предварительный характер, а отрицательные не исключают заболевание При анализе подклассов специфических IgG-антител у мужчин и женщин выявлено отсутствие достоверных различий по частоте встречаемости IgGl, IgG2, IgG3 и IgG4 С учетом общебиологических особенностей формирования иммунного ответа можно констатировать наличие у них противотрихомонадных антител как к липосахаридным, так и к белковым антигенам простейшего

7 Противопротозойные препараты при терапии трихомоноза отличаются по показателям клинико-микробиологической эффективности При лечении острого трихомоноза в форме моноинфекции назначение метронидазола приводит к выздоровлению в 66,7%, тинидазола - в 73,7%, орнидазола - в 80,6%, нифурателя - в 55% случаев Терапия хронического трихомоноза метронидазолом успешна у 45,3%, тинидазолом у 52,6%, орнидазолом у 71,2%, нифурателем у 38,9% пациентов Терапия с одновременным использованием двух этиотропных препаратов нифурателя и орнидазола эффективна при остром трихомонозе в 91,3%, а при хроническом трихомонозе у 85,3% больных

Для определения in vitro резистентности Т vaginalis к противопротозойным целесообразно использование двух питательных сред без метронидазола и с концентрацией метронидазола 8 мкг/мл Учет результатов производят через 72 часа культивирования Отсутствие роста на питательной среде с метронидазолом свидетельствует о чувствительности возбудителя к указанному препарату Размножение Т vaginalis в двух питательных средах указывает на резистентность Т vaginalis к метронидазолу

8 При хроническом трихомонозе существенных патологических изменений в системе клеточного иммунитета и цитокиновом профиле не выявлено Установлено, что неблагоприятный прогноз лечения хронического трихомоноза ассоциирован с достоверно более низким, по сравнению с благоприятным прогнозом, содержанием в сыворотке крови иммунекомпетентных клеток с фенотипом CD 19+ Неблагоприятный прогноз терапии проявляется достоверным превышением концентрации ИЛ-1 и ИФН-у в сыворотке крови и смывах со слизистых УГТ Для лиц с благоприятным прогнозом терапии характерна более высокая системная и местная продукция ИЛ-8

Включение Бестима в комплексную терапию пациентов с хроническим трихомонозом проявилось более выраженной положительной клинико-лабораторной динамикой по сравнению с контрольной группой больных У 50% пациентов отмечалось исчезновение жалоб на момент окончания лечения Контрольная группа пациентов характеризовалась менее выраженной динамикой жалоб Микроскопические исследования материала из УГТ выявляли повышенный лейкоцитоз после лечения в опытной группе в 2,5 раза реже, чем в контрольной В процессе лечения Бестимом наблюдается повышение клеток с фенотипами CD3+ и CD4+ в периферической крови

Содержание клеток с фенотипом СБ8+ достоверно не повышалось Отмечалась достоверная тенденция к повышению уровня сывороточного интерлейкина-4

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 Высокая частота выделения дрожжепоДобных грибов и условнопатогенной микрофлоры определяет некоторые обстоятельства ведения пациентов с трихомонозом При культуральной диагностике, рост данных микроорганизмов может приводить к ингибированию размножения трихомонад и получению ложноотрицательного результата, что может быть исключено при добавлении в состав питательных сред селективных компонентов Необходимо также учитывать присутствие сопутствующих микроорганизмов при назначении этиотропной терапии

2 При проведении культурального исследования на трихомонады у мужчин необходимо исключить посев гнойного и слизисто-гнойного отделяемого Для повышения результативности лабораторной диагностики предпочтение отдается посеву соскоба со слизистых УГТ и секрета предстательной железы

3 Для культуральной диагностики трихомоноза целесообразно использовать питательную среду следующего состава глюкоза - 5,5 г, мальтоза

- 6,0 г, казитон - 15 г, дрожжевой экстракт - 12,0 г, хлористый натрий - 2,5 г, тиогликолят натрия - 0,5 г, Ь-цистеин (солянокислый цистеин) - 0,5 г, агар-агар

- 0,75 г, аскорбиновая кислота - 0,24 г, дистиллированная вода - 900 мл Стерилизация питательной среды осуществлялась при 0,5 атмосферах, в течение 30 мин Основу питательной среды обогащали лошадиной сывороткой без консерванта — 120 мл

4 При постановке диагноза «урогенитальный трихомоноз» у мужчин необходимо применение комплекса методов лабораторной диагностики, включающего посев материала из уретры, микроскопию фиксированного окрашенного мазка отделяемого из уретры, ИФА сыворотки крови и ПЦР отделяемого из уретры, что позволяет повысить эффективность выявления инфекции При этом культуральное исследование является ведущим в диагностике урогенитального трихомоноза у мужчин

Культуральный метод при диагностике урогешлального трихомоноза у женщин предпочтительнее использовать в качестве арбитражного при отрицательном результате микроскопии нативного препарата и положительном результате микроскопии ФОМ отделяемого из уретры, влагалища и цервикального канала при количестве лейкоцитов в отделяемом из цервикального канала более 20 в п/зр

5 При лечении трихомоноза для достижения наилучшего эффекта рекомендуется одновременное использование двух этиотропных препаратов нифурателя и орнидазола в соответствующих разовых и курсовых дозах

6 Высокий процент рецидивов при проведении специфической терапии как острого, так и хронического трихомоноза обуславливает необходимость комплексной терапии, включая физиотерапевтическое, иммунотропное и местное лечение При терапии хронического трихомоноза перед назначением

этиотропного лечения целесообразно применение Бестима по следующей схеме по 0,1 мг ежедневно внутримышечно всего 5 инъекций

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Самцов А В Диагностика, лечение и профилактика инфекций, передающихся преимущественно половым путем в армии и на флоте Учебно-методическое пособие / А В Самцов, В В Гладько, В В Барбинов, В Б Сбойчаков, А В Сухарев, А В Стаценко, А М Иванов, И Н Теличко - М ГВМУ МО РФ, 2003. - 62 с

2 Теяичко ИН Проблемы лабораторной диагностики трихомоноза 1 И Н Теличко, А М Иванов, Р А Раводин, Н В Раздольская // Материалы VI Рос съезда врачей-инфекционистов - СПб, 2003 - С 375

3 Иванов AM Актуальные проблемы диагностики урогенитального трихомоноза / А М Иванов, И Н Теличко, Р А Раводин, Н В Раздольская, Ю Г Горбунов//Журн дерматовенерологии и косметологии -2004 - №1 - С 17-21

4 Теличко ИН Изменение содержания половых гормонов сыворотки крови у лиц с хроническим специфическим уретрогенным простатитом / ИН Теличко, РА Раводин, Н.В Раздольская и др // Журн дерматовенерологии и косметологии -2004 -№>2 - С 32-34

5 Раводин РА Современные аспекты диагностики урогенитального трихомоноза / Р.А Раводин, ИН Теличко, НВ Раздольская // Актуальные вопросы дерматовенерологии Сб тр научно-прак конф, поев 80-летию иркутского областного кожно-венерологического диспансера - Иркутск, 2004 -С 132-133

6 Теличко И Н ПЦР в диагностике урогенитального трихомоноза / И Н Теличко, РА Раводин, НВ Раздольская, AM Иванов // Сб тр. науч конф с международным участием «Современные средства иммунодиагностики, иммуно-и экстренной профилактики актуальных инфекций» - СПб ВМедА, 2004 - С 198-199

7 Иванов А М. Способ микроскопии мазка для выявления Т vaginalis / А М Иванов, И Н Теличко, Р А Раводин, Н В Раздольская // Удостоверение на рационализаторское предложение № 8894/4 от 11 06 2004 г ВМедА, 7 10 2004 г

8 Раводин Р А Способ забора биоматериала у женщин для культурального исследования Тvaginalis / РА Раводин, ИН Теличко, НВ Раздольская, А М Иванов // Удостоверение на рационализаторское предложение № 8958/5 от 18 10 2004 г ВМедА, 9 11 2004 г

9 Раводин РА Совершенствование микроскопической диагностики урогенитального трихомоноза /РА Раводин, И Н. Теличко, А М Иванов, Н В Раздольская // Материалы Рос науч -практ конф «Узловые вопросы борьбы с инфекцией» - СПб ВМедА, 2004 - С 198-199

10 Раводин РА Проблемы диагностики урогенитального трихомоноза / Р А. Раводин, И Н Теличко, Н В Раздольская // Журн акушерства и женских болезней -2004 -Т LIII,специальный выпуск - СПб, 2004 - С 129-130

11 Раводин Р А Оценка информативности методов лабораторной

диагностики урогенитального трихомоноза у женщин /РА Раводин, ИН Теличко, АМ Иванов // Сб тр 40-й науч-практ конф дерматовенерологов и врачей смежных специальностей «Актуальные проблемы дерматологии Контроль и профилактика инфекций, передаваемых половым путем» - СПб , 2005 - С 8384

12 Раводин РА Оценка информативности методов лабораторной диагностики трихомоноза у мужчин /РА Раводин, И Н Теличко, А М Иванов // Сб гр 40-й науч -практ конф дерматовенерологов и врачей смежных специальностей «Актуальные проблемы дерматологии Контроль и профилактика инфекций, передаваемых половым путем» - СПб , 2005 - С 85-86

13 Раводин РА Оптимизация микроскопической диагностики мочеполового трихомоноза /РА Раводин, И Н Теличко, А М Иванов // Сб тр 40-ой науч -практ конф дерматовенерологов и врачей смежных специальностей «Актуальные проблемы дерматологии Контроль и профилактика инфекций, передаваемых половым путем» - СПб , 2005 - С 86-87

14 Раводин РА Клинюсо-лабораторная диагностика мочеполового трихомоноза у женщин /РА Раводин, А М Иванов, И Н Теличко // Материалы Российской научно-практической конференции дерматовенерологов «Санкт-Петербургские дерматологические чтения» - 15-16 сентября 2005 года. - С 93

15 Раводин РА Клинико-лабораторная диагностика мочеполового трихомоноза у мужчин /РА Раводин, АМ Иванов, ИН Теличко // Материалы Российской научно-практической конференции дерматовенерологов «Санкт-Петербургские дерматологические чтения» - 15-16 сентября 2005 года - С 93

16 Раводин РА Оценка информативности ИФА в диагностике мочеполового трихомоноза / РА Раводин, АМ Иванов, ИН Теличко // Материалы Российской научно-практической конференции дерматовенерологов «Санкт-Петербургские дерматологические чтения» — 15-16 сентября 2005 года -С 94

17 Раводин РА Оценка информативности методов лабораторной диагностики урогенитального трихомоноза у мужчин с учетом количества лейкоцитов в исследуемом биоматериале / РА Раводин, ИН Теличко, АМ Иванов // Тез VII Всерос науч -практ конф «Актуальные вопросы диагностики и лечения в многопрофильном стационаре» - 2005 - С 259

18 Гаврилова О В Ультраструктурные особенности различных морфотипов влагалищных трихомонад / О В Гаврилова, АМ Иванов, НВ Раздольская, ИН Теличко, РА Раводин, ЕВ Ходосевич, А Б Криворучко // Материалы Рос науч-практ конф,посвящ 110-летию кафедры инфекционных болезней ВМедА им СМ Кирова «Инфекционные болезни проблемы здравоохранения и военной медицины» - СПб ВМедА, 2006 - С 71-72

19 Теличко ИН Особенности диагностики мочеполового трихомоноза / ИН Теличко, РА Раводин, АМ Иванов, НВ Раздольская // Клинич дерматология и венерология -2006 -№3 - С 17-20

20 Теличко ИН Цитоморфологические особенности Т vagmahs / ИН. Теличко, АМ Иванов, А Б Криворучко, О В Гаврилова, ЕВ Ходосевич // Материалы IV науч -практ конф памяти проф A JI Машкилейсона - М, 2006 -

С 143-144

21 Теличко И H Использование иммуноферментного анализа в диагностике мочеполового трихомоноза / И H Теличко, A M Иванов, А Б Криворучко, О В Гаврилова, Е В Ходосевич // Материалы IV науч -пракг конф памяти проф AJ1 Машкилейсона -М., 2006 - С 145-146

22 Теличко И H Современные диагностические аспекты мочеполового трихомоноза / И H Теличко, Р А Раводин, A M Иванов, H В Раздольская, А Б Криворучко // Вестник Российской Военно-медицинской академии — 2006 — №2 (16) - С 60-63

23 Раводин РА Мочеполовой трихомоноз эитология, классификация, клиника, диагностика, лечение / Р А Раводин, И H Теличко//Медлайн экспресс -

2006 -№1 (185) - С 40-46

24 Теличко И H Иммунокоррегирующая терапия у больных хроническим трихомонозом / И H Теличко, H В Раздольская, А Б Криворучко, А С Симбирцев, A M Иванов // Материалы науч -практ конф «Актуальные вопросы диагностики и терапии трудноизлечимых заболеваний кожи» - СПб,

2007 - С 79-81

25 Теличко И H Клинико-микробиологические особенности трихомоноза в современных условиях / И H Теличко, A M Иванов, H В Раздольская, А Б Криворучко // Материалы науч-практ конф «Актуальные вопросы диагностики и терапии трудноизлечимых заболеваний кожи» - СПб, 2007 -С 81-82

26 Теличко И H Клинические особенности хронического трихомоноза / И H Теличко, A M Иванов, Е В Ходосевич, H В Раздольская, А Б Криворучко, Д В Заславский // Вестник Российской Военно-медицинской академии - 2007 -№ 1,ПриложениеЧ 1 -С 452

27 Теличко И H Гормональные нарушения у мужчин с хроническим специфическим уретрогенным простатитом / И H Теличко, A M Иванов, В В Деренчук, Д В Заславский // Вестник Российской Военно-медицинской академии -2007 -№ 1,ПриложениеЧ 1 -С 452

28 Теличко И H Микробиологическая характеристика хронического трихомоноза в современных условиях / И H Теличко, A M Иванов, H В Раздольская, ЕВ Ходосевич, А Б Криворучко, ДВ Заславский // Вестник Российской Военно-медицинской академии - 2007 - № 1, Приложение Ч 1 - С 453

29 Теличко И.Н. Способ определения чувствительности Т vagmalis к метронидазолу / И H Теличко, A M Иванов, H В Раздольская, А Б Криворучко, Д В Заславский // Вестник Российской Военно-медицинской академии - 2007 -№ 1, Приложение Ч 1 - С 454

30 Теличко ИН. Изучение клинической эффективности иммуномодулятора Бестим при хроническом трихомонозе / И H Теличко, H В Раздольская, А Б Криворучко, А.М Иванов, А С Симбирцев // Тез докл XIV Рос конгресса «Человек и лекарство» -М,2007 - С 590-591

31 Теличко И H Влияние комплексной терапии на показатели иммунного статуса у больных хроническим трихомонозом / И H Теличко, A M

Иванов, НВ Раздольская, ДВ Заславский, АС Симбирцев // Аллергология и иммунология - 2007 - Т 8, № 1 - С 96-97

32 Иванов AM Сравнительная характеристика питательных сред для культивирования Т vaginalis / А М Иванов, Н В Раздольская, И Н Теличко, В Н Вербов, А Б Криворучко // Материалы IX съезда ВНПОЭМП «Итога и перспективы обеспечения эпидемического благополучия населения РФ» - Т 3 -М Санэпидмедиа, 2007 - С 36-37

33 Теличко И Н Перспективы серологической диагносгики трихомоноза / И Н Теличко, А М Иванов, Н В Раздольская, Р А Раводин, Е А Базолина // Медицинская иммунология -2007 -Т 9, №2-3 - Материалы XI Всерос научного Форума с международным участием им акад В И Иоффе - Дни иммунологии в Санкт-Петербурге «Молекулярные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунотерапии» - СПб 2007 - С 249-250

34 Теличко И Н Подклассы специфических IgG при трихомонозе / И Н Теличко, AM Иванов, НВ Раздольская, В Б Климович, ЕА. Базолина // Медицинская иммунология - 2007 - Т 9, № 2-3 - Материалы XI Всерос научного Форума с международным участием им. акад В И Иоффе - Дни иммунологии в Санкт-Петербурге «Молекулярные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунотерапии» - СПб 2007 - С 250

35 Раздольская НВ Изучение ультраструктурной организации вирулентных форм Trichomonas vaginalis / Н В Раздольская, О В Гаврилова, И Н Теличко, AM Иванов, А Б Криворучко // Рос биомед журн Medlmeru (www medlme ru) - 2007 - T 8, № 7 - С 283-291

36 Раздольская НВ Значение микроскопического и культурального методов в диагностике трихомоноза / НВ Раздольская, ИН Теличко, AM Иванов, А Б Криворучко // Материалы юбил Рос науч конф с международным участием, посвящ 175-летию со дня рождения СП Боткина - СПб ВМА, 2007 -С 283

37 Теличко ИН Современный взгляд на микроскопический мегод диагностики мочеполового трихомоноза / ИН Теличко, AM Иванов, НВ Раздольская, А Б Криворучко // Клинич дерматология и венерология - 2007 - № 2 - С 28-32

38 Иванов AM Способ определения резистентности Trichomonas vaginalis к метронидазолу / AM Иванов, ИН Теличко, НВ Раздольская, А Б Криворучко, В Н Вербов // Заявка на изобретение №2006134593 от 20 09 2006 г -6с

39 Теличко ИН Клинико-иммунологические особенности урогенитального трихомоноза / AM Иванов, АС Симбирцев // Рос биомед хсурн Medlme ru (www medlme ru) - 2007 - T 8, № 8 - С

40 Razdolskaya N Peculiarity of the clinical isolates of Trichomonas vaginalis / N Razdolskaya, О Gavnlova, A Ivanov, I Telichko, A Krivoruchko // Piotistology An International Journal -2007 -Vol5,№l -P 66

Подписано в печать 23.08.07,

Объем 2 пл_ Тираж 100 экз

Формат 60x84 '/16 Заказ №

Типография ВМедА,

194044, СПб , ул Академика Лебедева, 6

Актуальность исследования. В настоящее время трихомоноз является одним из наиболее распространенных заболеваний, передающихся половым путем, которое по распространенности занимает первое место в мире. Ежегодно в мире болеет трихомонозом 250 млн. человек (Михайлов А.В., Гасанова Т.А., 2000; Баткаев Э.А., 2002; Чеботарев В.В. и др., 2003). Урогенитальный трихомоноз - многоочаговое заболевание, сопровождающееся большим числом осложнений; у мужчин регистрируются простатиты, эпидидимиты, везикулиты, купериты, циститы, баланопоститы, рубцовые сужения уретры (Ильин И.И., 1999; Gardner W.A. et al., 1986). У женщин трихомонадная инфекция приводит к развитию не только кольпита, эндоцервицита, цистита и проктита, но может играть существенную роль в формировании эктопий шейки матки, тубоовариаль-ных гнойных образований, миомы матки. Осложнения трихомоноза могут быть причиной бесплодия, патологии беременности, детской смертности, что имеет социальное значение (Васильев М.М., 1990; Делекторский В.В. и соавт., 1991; Ильин И.И., 1991).

В то же время, многие аспекты трихомонадной инфекции остаются нерешенными, а некоторые требуют более глубокого изучения. Клиническая картина урогенитального трихомоноза, по мнению ряда авторов, в настоящее время претерпевает патоморфоз, характеризуясь увеличением доли стертых и малосимптомных форм в общей структуре заболеваемости. Недостаточно изучена роль атипичных морфологических форм возбудителя в патологии урогенитального тракта (Козлюк А.С., Козлюк В.А., 2001; Benchimol М., 2001).

В связи с этим важное значение приобретают вопросы своевременной и достоверной диагностики трихомонадной инфекции. Микробиологическая диагностика нередко играет существенную роль в постановке диагноза данного заболевания. При этом ее свойства варьируют в широких пределах и в значительной степени зависят от целого ряда факторов. Наиболее доступными методами лабораторной диагностики трихомоноза являются микроскопия нативных, окрашенных препаратов и культуральное исследование. Трудности при микроскопии создают как наличие в биологическом материале от больного разнообразных цитоморфологических форм трихомонад, трудно отличимых от клеток организма хозяина и усложняющих их дифференци-ровку, так и низкая концентрация простейших в биоматериале и потеря ими подвижности in vitro. Предпочтительным методом диагностики трихомоноза является культивирование возбудителя в питательных средах. Многочисленные составы питательных сред подобраны эмпирически. Их селективность недостаточна для получения чистой культуры. В ряде случаев трихомоноз протекает как смешанная инфекция, сочетающаяся с кандидозом. Рост дрожжеподобных грибов рода Candida приводит к ингибированию размножения трихомонад и получению ложноотрицательного результата (Васильев М.М., 1980; Беднова В.Н., 1985; Borchardt К.А., 1991).

В настоящее время новая генодиагностическая технология полимераз-ной цепной реакции (ПЦР) опережает остальные методы генодиагностики трихомоноза по уровню чувствительности и специфичности (Сухова Л.П., 2000). Однако для проведения этого исследования необходимо хорошее оснащение лабораторий, соблюдение всех технических требований при обработке материала, что не всегда возможно даже в крупных диагностических центрах. Другим альтернативным методом является иммуноферментный анализ. При этом роль иммуноферментной диагностики трихомоноза остается неопределенной в связи с недостаточным практическим опытом ее использования. В коммерческих иммуноферментных тест-системах встречаются перекрестные реакции с антигенами сапрофитных трихомонад. Сравнительные исследования по чувствительности иммуноферментного анализа при диагностике трихомоноза у больных с разными формами заболевания до последнего времени не проводились.

До настоящего времени метронидазол, синтезированный в 1958 году, как производное 5-нитроимидазола, остается стандартным и наиболее широко используемым препаратом в лечении трихомоноза. Чрезмерно широкое, нередко необоснованное применение метронидазола привело к появлению устойчивых штаммов трихомонад, и, следовательно, к повышению рекомендуемых суммарных доз препарата (Швелидзе М.Н., 1988; Абдумаликов Р.А., Брагина Е.Е., 1995; Милевская С.Г., 1996). Терапия трихомоноза не всегда приводит к излечению больных. По данным ряда авторов, неэффективность лечения составляет 2,2 - 44,1% (Grunberg Е. Titsworth Е., 1974; Нарзикулов P.M., 1990). Кроме того, применение препаратов метронидазола нередко сопровождается целым рядом побочных явлений, реакций и осложнений. (Маждраков Г. Попхристов П., 1973; Жуков В.И., 1983; Яковлев С.В., 1997).

Недостаточно, изучена роль гуморального и клеточного иммунитета при трихомонозе (Терас Ю.Х., 1964; Кисина В.И., 1988; Alderete J.F., 1986; Ackers J.P., 1990). Имеются лишь единичные работы, посвященные изучению цитокинового статуса при данном заболевании (Горина Е.Ю., Бутов Ю.С., 2001). Сегодня предложено большое количество иммуномодуляторов. При этом нередко иммунотропные препараты из разных групп имеют одинаковые показания к применению, отсутствуют четкие критерии выбора того или иного иммуномодулятора. Это особенно важно на современном этапе, когда традиционно использовавшиеся препараты из группы нитроимидазолов становятся все менее эффективными ввиду возрастающей резистентности к ним T.vaginalis и возникает вопрос об использовании полноценной и разумно достаточной иммунокоррекции у таких пациентов. Остаются дискутабель-ными вопросы о факторах, определяющих хронизацию инфекционного процесса и неэффективность его терапии.

Все вышеизложенное и предопределило цель и задачи настоящего диссертационного исследования.

Цель работы: На основании комплексного клинико-микробиологи-ческого, иммунологического обследования и результатов этиотропной терапии разработать диагностическую и терапевтическую стратегию ведения пациентов с трихомонозом.

Задачи исследования:

1. Провести анализ клинико-микробиологических особенностей уроге-нитального трихомоноза.

2. Определить цитоморфологические признаки Т. vaginalis округлой формы, позволяющие проводить диагностику при отсутствии типичных грушевидных форм.

3. Изучить жизнеспособность округлых морфологических форм трихо-монад, а также их вирулентность на культурах перевиваемых клеток in vitro.

4. На основе сравнительного анализа теоретически обосновать и экспериментально подтвердить оптимальный качественный и количественный состав питательной среды для культивирования трихомонад, а также на основе цельноклеточного трихомонадного антигена сконструировать ИФА тест-систему.

5. Установить информативность методов лабораторной диагностики урогенитального трихомоноза и обосновать последовательность их использования при постановке диагноза.

6. Провести сравнительный анализ эффективности применения различных противопротозойных препаратов в терапии трихомоноза и разработать методику определения in vitro резистентности Т. vaginalis к метромидазолу.

7. Изучить характер иммунопатологического процесса при урогениталь-ном трихомонозе и оценить клинико-микробиологическую эффективность иммуностимулирующего препарата Бестим в комплексной терапии трихомоноза.

Научная новизна исследования. Впервые установлено, что и у округлых и у грушевидных форм Т. vaginalis наблюдаются сходные ультраструктурные элементы: постоянно конденсированные хромосомы в ядре клетки и цито-скелетная структура - коста. В цитоплазме клетки округлой формы отмечены характерные изменения по сравнению с грушевидными клетками: частичная деградация синтетического аппарата клетки; редукция околоядерной эндо-плазматической сети и связанной с ней аксостиллярной области; изменение характера содержимого гидрогеносом; изменение расположения рибосом и характера расположения кинетосом жгутиков.

Доказано, что округлые трихомонады являются одной из морфологических форм в жизненном цикле простейшего. Структурные изменения, наблюдаемые в цитоплазме округлых форм, свидетельствуют о снижении физиологической активности клетки. Установлено сохранение жизнеспособности трихомонад при переходе в атипичные цитоморфологические формы. В тесте на культуре перевиваемых клеток HeLa установлена патогенность округлых трихомонад.

Впервые проведена комплексная оценка современных методов лабораторной диагностики мочеполового трихомоноза. Сформулированы диагностические алгоритмы. Усовершенствована питательная среда для культу-ральной диагностики трихомоноза. Установлено, что серологическая диагностика мочеполового трихомоноза имеет вспомогательное значение в постановке диагноза заболевания. Впервые изучены субизотипы специфических IgG-антител при трихомонозе, что позволило констатировать наличие у пациентов противотрихомонадных антител как к липосахаридным, так и к белковым антигенам простейшего.

Установлено, что неблагоприятный прогноз лечения хронического трихомоноза ассоциирован с достоверно более низким, по сравнению с благоприятным прогнозом, содержанием в сыворотке крови иммунокомпетентных клеток с фенотипом CD 19+. Неблагоприятный прогноз терапии проявляется достоверным превышением концентрации ИЛ-1 и ИФН-у в сыворотке крови и смывах со слизистых урогенитального тракта. Для лиц с благоприятным прогнозом терапии хронического трихомоноза характерна более высокая системная и местная продукция ИЛ-8.

Впервые продемонстрирована клинико-микробиологическая эффективность комбинированной терапии хронического трихомоноза с использованием иммуностимулятора Бестим. Выявлено, что в процессе лечения Бестимом наблюдается увеличение количества клеток с CD3+ и CD4+ фенотипами, в то время как количество клеток с фенотипом CD8+ достоверно не изменялось. Также при терапии Бестимом установлено повышение уровня сывороточного интерлейкина-4.

Практическая значимость. Показано, что наиболее часто при микробиологической диагностике урогенитальных инфекций (УГИ) выявляется Т. vaginalis. В структуре УГИ преобладает хронический трихомоноз в виде моноинфекции. При смешанных инфекциях с участием Т. vaginalis наиболее частым вариантом является сочетание с дрожжеподобной и условнопатоген-ной бактериальной микрофлорой. В структуре жалоб у мужчин наблюдается увеличение числа больных со снижением полового влечения и эрекции, а также пациентов с дискомфортом в области промежности. Отличительной особенностью группы мужчин является отсутствие у трети больных местных клинических проявлений, без учета данных лабораторно-инструментальных исследований. Одновременно в отношении данной категории населения не предусмотрены плановые организационные и диспансерные мероприятия по выявлению и лечению урогенитальных инфекций. Эти обстоятельства в целом могут способствовать сохранению высокого уровня заболеваемости в популяции лиц мужского пола, тем самым являться источником инфекций урогенитального тракта.

Установленные клинические особенности хронического трихомоноза в современных условиях определяют приоритеты в выборе методов микробиологической диагностики. На основании многофакторного днскриминантного анализа разработаны высоко информативные и значимые математические модели, позволяющие определить прогноз, а также рациональную терапевтическую тактику.

Результаты исследования могут использоваться в микроскопической дифференцировке округлых морфологических форм трихомонад при проведении микробиологической диагностики.

Разработанная питательная среда для культуралыюй диагностики трихомоноза сочетает высокие ростовые свойства и низкую себестоимость. Установлено, что результаты ПЦР носят предварительный характер и не могут быть использованы для достоверной диагностики трихомоноза. ИФА может применяться в дополнение к существующим диагностическим подходам. Обнаружение специфических антител к антигенам белковой природы в перспективе делает возможным получение их искусственных аналогов с целью стандартизации серодиагностики трихомоноза. Предложенные диагностические алгоритмы позволяют повысить эффективность диагностики мочеполового трихомоноза при снижении временных и финансовых затрат. Метод определения резистентности трихомонад к метронидазолу, отличающийся практической доступностью, может использоваться для определения прогноза и тактики лечения.

Одновременное применение в терапии как острого, так и хронического трихомоноза двух противопротозойных препаратов различных фармакологических групп (орнидазол и нифуратель) позволяет достичь более выраженного клинико-микробиологического эффекта по сравнению со стандартными схемами этиотропного лечения. Применение Бестима в комплексной терапии хронического трихомоноза оказывает иммуностимулирующее действие и обладает выраженной клинической эффективностью. Целесообразно его включение в схему комплексной терапии больных хроническим трихомонозом.

Личное участие автора в получении результатов. Автором научно обоснована методология исследования течения трихомоноза, проанализированы клинико-лабораторные и иммунологические проявления заболевания на различных его этапах, разработаны математические модели для оценки прогноза заболевания, создан алгоритм по диагностике и тактике лечения пациентов.

Автор планировал исследования, принимал непосредственное участие в клиническом обследовании больных, организовывал и участвовал в проведении всех лабораторно-инструментальных, иммунологических и ультразвуковых исследований, а также осуществлял мониторинг эффективности и безопасности противопротозойной и иммунотропной терапии. Автором лично формировалась база данных, проводилась их статистическая обработка и обобщение полученных результатов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. В структуре обследованных больных инфекциями урогениталыюго тракта преобладают пациенты с хроническим трихомонозом в форме моноинфекции. Клиническая картина хронического трихомоноза у мужчин характеризуется патоморфозом. У трети мужчин при хроническом трихомонозе отсутствуют субъективные и объективные клинические симптомы, без учета результатов лабораторных и инструментальных исследований.

2. Округлые морфологические формы Т. vaginalis являются одной из стадий жизненного цикла простейшего и обладают прямым цитопатогенным действием на эпителиальные клетки. Ультраструктурные изменения, наблюдаемые в цитоплазме клеток округлых форм, указывают на снижение физиологической активности простейшего.

3. Культуральное исследование имеет решающее значение в диагностике мочеполового трихомоноза у мужчин. У женщин микроскопия нативного препарата, отделяемого из урогениталыюго тракта, позволяет диагностировать мочеполовой трихомоноз в большинстве случаев. Серологическая диагностика мочеполового трихомоноза (ИФА) имеет вспомогательное значение.

4. Включение Бестима в комплексную терапию хронического трихомоноза проявляется положительным клинико-лабораторным эффектом лечения, при этом в периферической крови избирательно повышается концентрация иммунокомпетентных клеток с фенотипами CD3+ и CD4+ и продукция сывороточного ИЛ-4, а количество клеток с фенотипом CD8+ достоверно не изменяется.

Реализация и внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в научную, учебную и лечебно-диагностическую работу кафедры и клиники кожных и венерических болезней, кафедры микробиологии ВМедА им. С.М. Кирова, СПб ГУЗ «КВД №4» и ГУЗ «Областного КВД» (С.-Петербург).

Апробация и публикация материалов исследования. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: VI Всероссийском съезде врачей-инфекционистов (С.-Петербург, 2003); Всероссийской научно-практической конференции «Узловые вопросы борьбы с инфекцией» (С.-Петербург, 2004); Российско-Шведской конференции «Контроль и профилактика инфекций, передающихся половым путем» (С.-Петербург, 2004); Научной конференции с международным участием «Современные средства иммунодиагностики, иммуно- и экстренной профилактики актуальных инфекций» (С.-Петербург, 2004); VII Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения больных в многопрофильном лечебном учреж-дении» (С.-Петербург, 2005); Российской научно-практической конференции дерматовенерологов «Санкт-Петербургские дерматовенерологические чтения» (С.-Петербург, 2005); заседаниях городского общества дерматовенерологов им. В.М. Тарновского (С.-Петербург, 2004,

2006); Юбилейной научно-практической конференции, посвященной 135-летшо кафедры кожных и венерических болезней ВМедА (С.-Петербург, 2004); 40-й научно-практической конференции дерматовенерологов и врачей смежных специальностей Санкт-Петербурга «Актуальные проблемы дерматовенерологии. Контроль и профилактика инфекций, передающихся половым путем» (С.-Петербург, 2005); Научно-практической конференции «Актуальные вопросы дерматовенерологии» (С.-Петербург, 2006); V Всемирном конгрессе по иммунопатологии и аллергии (Москва, 2007); XI Всероссийском научном форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (С.-Петербург,

2007), V Европейском конгрессе по протистологии и XI Европейской конференции по биологии беспозвоночных (С.-Петербург, 2007).

По материалам исследования опубликовано 40 печатных работа, в том числе 1 учебно-методическое пособие, 9 статей, из которых 6 в реферируемых журналах.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 349 страницах компьютерного набора, состоит из введения, 7 глав (обзора литературы, описания материалов и методов исследования, пяти глав результатов собствен

315 ВЫВОДЫ

1. В структуре обследованных больных урогенитальными инфекциями Северо-западного региона России преобладают пациенты с хроническим трихомонозом в форме моноинфекции (33%). Отличительной особенностью хронического трихомоноза у мужчин является отсутствие у трети больных жалоб и объективных клинических симптомов, несмотря на проведенные лабораторные и инструментальные исследования. Течение трихомоноза у мужчин характеризуется слабой выраженностью клинических симптомов.

Клиническая картина мочеполового трихомоноза у женщин характеризуется преобладанием манифестных форм заболевания.

Наиболее часто при смешанных инфекциях с участием Т. vaginalis встречается сочетание с дрожжеподобной и условнопатогенной бактериальной микрофлорой. Далее по мере убывания частоты встречаемости располагаются сочетания с микоплазменной и хламидийной инфекциями. Из числа бактериальной условнопатогенной микрофлоры наиболее значима кокковая (стафилококки, энтерококки) и энтеробактериальная микрофлора.

2. Округлые формы Т. vaginalis являются одной из стадий жизненного цикла простейшего. Структурные изменения, наблюдаемые в цитоплазме клетки округлых форм, указывают на снижение физиологической активности простейшего. У округлых форм Т. vaginalis отсутствуют ключевые особенности, характерные для цист (изменение в организации ядра, наличие дополнительных покровов). Округлые формы Т. vaginalis нельзя рассматривать как стадии покоя, хотя их появление свидетельствует о неблагоприятных условиях.

3. При культивировании округлых морфологических форм трихомонад на культуре перевиваемых клеток (HeLa) наблюдается их адгезия с последующим цитотоксическим действием. При культивировании трихомонад в течение 2- суток и более выявляется нарушение целостности монослоя клеток с последующим полным его разрушением.

4. В результате сравнительных исследований установлено, что все исследованные питательные среды для культивирования Т. vaginalis можно подразделить на две группы в зависимости от физиологических показателей (урожая и подвижности). Первая группа питательных сред характеризуется накоплением культуры трихомонад на 3 сутки культивирования, в среднем л до 15,8x10 кл/мл, и снижением количества клеток на 5 сутки до

1 л

10,5x10 кл/мл и 6 сутки культивирования, в среднем до 6,8x10 кл/мл. Во вторую группу входят питательные среды, в которых не отмечается накопление культуры Т. vaginalis при их использовании.

Разработанный модифицированный вариант питательной среды Дай-монд для культивирования Т. vaginalis существенно не отличается по физиологическим показателям от известных питательных сред, относящихся к первой группе, но при этом является более стандартизованной по составу с наиболее оптимальной концентрацией флуконазола.

5. Микроскопия нативного отделяемого из урогенитального тракта у женщин обладает наибольшей чувствительностью (96,2%) и специфичностью (94,4%). Микроскопия отделяемого из уретры у мужчин характеризуется низкой чувствительностью (47,4%) и специфичностью (22,2%) и отражает выраженность местной воспалительной реакции и качество забора биоматериала.

Культуральный метод диагностики урогенитального трихомоноза у женщин имеет чувствительность 88,7%) и специфичность 94,4%. У мужчин наибольшей чувствительностью (87,7%) и специфичностью (100%) обладает культуральное исследование (посев отделяемого из уретры), что позволяет рассматривать его в качестве ведущего метода лабораторной диагностики мочеполового трихомоноза у мужчин. ПЦР отделяемого из урогенитального тракта у мужчин и женщин характеризуется невысокой чувствительностью (63,2% и 86,81% соответственно) и специфичностью (27,8% и 33,3% соответственно) и может использоваться в качестве вспомогательного метода диагностики мочеполового трихомоноза.

6. ИФА на наличие сывороточных противотрихомонадных IgG-антител ввиду недостаточной чувствительности (31,5%) может применяться в качестве вспомогательного диагностического теста, при этом положительные результаты носят предварительный характер, а отрицательные не исключают заболевание. При анализе подклассов специфических IgG-антител у мужчин и женщин выявлено отсутствие достоверных различий по частоте встречаемости IgG 1, IgG2, IgG3 и IgG4. С учетом общебиологических особенностей формирования иммунного ответа можно констатировать наличие у них противотрихомонадных антител как к липосахаридным, так и к белковым антигенам простейшего.

7. Противопротозойные препараты при терапии трихомоноза отличаются по показателям клинико-микробиологической эффективности. При лечении острого трихомоноза в форме моноинфекции назначение метронидазола приводит к выздоровлению в 66,7%, тинидазола - в 73,7%, орнидазола - в 80,6%, нифурателя — в 55% случаев. Терапия хронического трихомоноза метронида-золом успешна у 45,3%, тинидазолом у 52,6%, орнидазолом у 71,2%, нифура-телем у 38,9% пациентов. Терапия с одновременным использованием двух этиотропных препаратов нифурателя и орнидазола эффективна при остром трихомонозе в 91,3%, а при хроническом трихомонозе у 85,3% больных.

Для определения in vitro резистентности Т. vaginalis к противопротозой-ным целесообразно использование двух питательных сред: без метронидазола и с концентрацией метронидазола 8 мкг/мл. Учет результатов производят через 72 часа культивирования. Отсутствие роста на питательной среде с метронидазолом свидетельствует о чувствительности возбудителя к указанному препарату. Размножение Т. vaginalis в двух питательных средах указывает на резистентность Т. vaginalis к метронидазолу.

8. При хроническом трихомонозе существенных патологических изменений в системе клеточного иммунитета и цитокиновом профиле не выявлено. Установлено, что неблагоприятный прогноз лечения хронического трихомоноза ассоциирован с достоверно более низким, по сравнению с благоприятным прогнозом, содержанием в сыворотке крови иммунокомпетентных клеток с фенотипом CD 19+. Неблагоприятный прогноз терапии проявляется достоверным превышением концентрации ИЛ-1 и ИФН-у в сыворотке крови и смывах со слизистых УГТ. Для лиц с благоприятным прогнозом терапии характерна более высокая системная и местная продукция ИЛ-8.

Включение Бестима в комплексную терапию пациентов с хроническим трихомонозом проявилось более выраженной положительной клинико-лабораторной динамикой по сравнению с контрольной группой больных. У 50% пациентов отмечалось исчезновение жалоб на момент окончания лечения. Контрольная группа пациентов характеризовалась менее выраженной динамикой жалоб. Микроскопические исследования материала из УГТ выявляли повышенный лейкоцитоз после лечения в опытной группе в 2,5 раза реже, чем в контрольной. В процессе лечения Бестимом наблюдается повышение клеток с фенотипами CD3+ и CD4+ в периферической крови. Содержание клеток с фенотипом CD8+ достоверно не повышалось. Отмечалась достоверная тенденция к повышению уровня сывороточного интерлейкина-4.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Высокая частота выделения дрожжеподобных грибов и условнопатогенной микрофлоры определяет некоторые обстоятельства ведения пациентов с трихомонозом. При культуральной диагностике, рост данных микроорганизмов может приводить к ингибированию размножения трихомонад и получению ложноотрицательного результата, что может быть исключено при добавлении в состав питательных сред селективных компонентов. Необходимо также учитывать присутствие сопутствующих микроорганизмов при назначении этиотропной терапии.

2. При проведении культурального исследования на трихомонады у мужчин необходимо исключить посев гнойного и слизисто-гнойного отделяемого. Для повышения результативности лабораторной диагностики предпочтение отдается посеву соскоба со слизистых УГТ и секрета предстательной железы.

3. Для культуральной диагностики трихомоноза целессобразно использовать питательную среду следующего состава: глюкоза - 5,5 г, мальтоза - 6,0 г, казитон - 15 г; дрожжевой экстракт - 12,0 г; хлористый натрий - 2,5 г; тиог-ликолят натрия - 0,5 г; L-цистеин (солянокислый цистеин) - 0,5 г; агар-агар -0,75 г; аскорбиновая кислота - 0,24 г; дистиллированная вода - 900 мл. Стерилизация питательной среды осуществлялась при 0,5 атмосферах, в течение 30 мин. Основу питательной среды обогащали лошадиной сывороткой без консерванта - 120 мл.

4. При постановке диагноза «урогенитальный трихомоноз» у мужчин необходимо применение комплекса методов лабораторной диагностики, включающего посев материала из уретры, микроскопию фиксированного окрашенного мазка отделяемого из уретры, ИФА сыворотки крови и ПЦР отделяемого из уретры, что позволяет повысить эффективность выявления инфекции. При этом культуральное исследование является ведущим в диагностике урогенитального трихомоноза у мужчин.

Культуральный метод при диагностике урогенитального трихомоноза у женщин предпочтительнее использовать в качестве арбитражного при отрицательном результате микроскопии нативного препарата и положительном результате микроскопии ФОМ отделяемого из уретры, влагалища и цервикального канала при количестве лейкоцитов в отделяемом из цервикального канала более 20 в п/зр.

5. При лечении трихомоноза для достижения наилучшего эффекта рекомендуется одновременное использование двух этиотропных препаратов ни-фурателя и орнидазола в соответствующих разовых и курсовых дозах.

6. Высокий процент рецидивов при проведении специфической терапии как острого, так и хронического трихомоноза обуславливает необходимость комплексной терапии, включая физиотерапевтическое, иммунотропное и местное лечение. При терапии хронического трихомоноза перед назначением этиотропного лечения целесообразно применение Бестима по следующей схеме: по 0,1 мг ежедневно внутримышечно всего 5 инъекций.

321