Автореферат и диссертация по медицине (14.00.40) на тему:Диагностическое значение обратно транскриптазной полимеразной цепной реакции в выявлении клеток рака предстательной железы в крови

На правах рукописи

Забежннская Ольга Марковна

ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ОБРАТНО ТРАНСКРИПТАЗНОЙ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В ВЫЯВЛЕНИИ КЛЕТОК РАКА ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ В КРОВИ

14.00.40 - урология 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 3 ОНТ 2200

Москва-2008

003450211

Работа выполнена в ГОУ ВПО Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова РОСЗДРАВА

Научные руководители: доктор медицинских наук,

профессор АСЛАМАЗОВ Эдуард Гургенович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессорТеодорович Олег Валентинович; доктор медицинских наук, профессор Имянитов Евгений Наумович.

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет РОСЗДРАВА».

заседании диссертационного Совета д ZU8.U4U.11 при 1 иу ъпи московской Медицинской Академии им. И.М.Сеченова РОСЗДРАВА по адресу: 119991, г.Москва, ул.Трубецкая, д.8, стр.2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО ММА им.И.М.Сеченова РОСЗДРАВА по адресу: 117998, г.Москва, Нахимовский проспект, д.49.

Автореферат разослан «/V» Ск. 2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета

доктор медицинских наук, профессор Тельпухов Владимир Иванович

член-корр.РАЕН,

лауреат Государственной премии СССР доктор биологических наук, профессор ЗЕЗЕРОВ Евгений Гаврилович

Защита диссертации состоится

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность проблемы. Рак предстательной железы (РПЖ) относится к числу наиболее значимых и распространенных заболеваний нашего времени. Среди причин смерти мужчин от опухолей, РПЖ занимает второе место после рака легких [Лопаткин H.A.,2002]. Настораживающей является выраженная тенденция роста заболеваемости во многих странах, в том числе и России. Одновременно отмечается рост смертности от этой болезни [Бухаркин Б.В., 2003].

Для РПЖ характерно раннее метастазирование, чаще всего гематогенным путем в кости таза и позвоночник. Применяемые методики отбора больных, включающие пальцевое ректальное исследование, определение простатического специфического антигена (ПСА), трансректальное ультразвуковое исследование простаты, пункционную биопсию с гистологическим исследованием и определением степени злокачественности по Глиссону, в большом числе наблюдений не позволяют адекватно оценить стадию заболевания и биологический потенциал рака простаты, характеризующего способность опухоли к метастазированию. Раннее выявление процесса диссеминации её необходимо для правильного выбора лечебной тактики, в том числе при отборе пациентов на радикальное хирургическое лечение, при решении вопроса о назначении адъювантной терапии до и после него. Также это важно для мониторинга состояния больных.

С 1992 года разрабатывается методика применения обратно транскриптазной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) для определения циркулирующих в крови клеток опухоли предстательной железы, основанная на определении мРНК простатического специфического антигена [Moreno J.G., 1999]. В зарубежной литературе предложено называть обнаруженные в крови раковые клетки солидных опухолей гематогенными микрометастазами [Pelkey T.J., 1996] Проведены исследования, подтверждающие возможность использования данной методики как для предоперационной диагностики стадии процесса, так и послеоперационного выявления рецидива [Katz А.Е., 1994]. Имеются данные о применении реакции для первичной диагностики РПЖ [Bostwick D.G., 1998]. Предложено использовать данную методику для изучения возможности гематогенной диссеминации клеток рака простаты после лечебно-диагностических процедур, проводимых на предстательной железе [Cama С., 1997]. В России систематичеких исследований в этом направлении нет. Результаты опубликованных зарубежных исследований противоречивы. Для практического применения методики клиницистами необходимо продолжить исследования в этой области.

Целью настоящего исследования является изучение клинического значения выявления клеток рака простаты в периферической крови с помощью ОТ-ПЦР, специфичной мРНК ПСА, а также исследование возможности гематогенной диссеминации при проведении лечебно-диагностических манипуляций на предстательной железе.

Нами сформулированы следующие задачи исследования: провести экспериментальный анализ и оптимизацию имеющихся методик ПСА-специфичной ОТ-ПЦР периферической крови для использования их при дальнейших клинических исследованиях;

изучить чувствительность и специфичность выбранного метода и взаимосвязь результатов ОТ-ПЦР с традиционными диагностическими и прогностическими критериями при исследовании пациентов без заболеваний простаты, с фоновыми и предраковыми заболеваниями, а также РПЖ;

сопоставить динамику изменения результатов ОТ-ПЦР крови и уровня ПСА на фоне гормонального лечения и без него при динамическом наблюдении больных РПЖ;

провести анализ влияния лечебно-диагностических процедур (биопсии простаты, массажа простаты, радикальной простатэктомии, трансуретральной резекции простаты) на результат ОТ-ПЦР исследуемых пациентов.

Научная новизна. Впервые в России проведено исследование по выявлению циркулирующих в крови клеток рака простаты с помощью ОТ-ПЦР для мРНК ПСА. Проведена оптимизация и анализ чувствительности нескольких методик ОТ-ПЦР с применением четырех групп ПСА-специфичных праймеров. Установлено, что выбранная методика обладает достаточно высокой чувствительностью и специфичностью, является сравнительно недорогостоющей и технически доступной.

На клиническом материале показана высокая чувствительность и специфичность метода, взаимосвязь его результатов с уровенем ПСА, степенью дифференцировки первичной опухоли, её размером, наличием поражения регионарных лимфатических узлов и отдаленных метастазов.

Установлена возможность выявления циркулирующих в крови клеток рака простаты с помощью ОТ-ПЦР у пациентов с отсутствием метастазов по результатам традиционных методов исследования.

При обследовании пациентов с подозрением на рак простаты установлена возможность попадания простатических клеток в кровеносное русло при простатической интраэпителиальной неоплазии высокой степени (ПИН-2).

Впервые продемонстрирована возможность гематогенной диссеминации после массажа простаты, а также после биопсии простаты, радикальной простатэктомии (РПЭ), трансуретральной резекции простаты (ТУР) у пациентов с ПИН-2 и раковой трансформацией.

Практическая ценность работы. Апробирована и оптимизирована высоко чувствительная и специфичная методика выявления клеток рака простаты в крови с помощью ОТ-ПЦР, позволяющая установить процесс гематогенной диссеминации в более ранние сроки по сравнению с традиционными методами диагностики метастазов. Результаты исследования могут использоваться для индивидуальной оценки метастатического потенциала опухоли а также риска развития РПЖ при наличии ПИН-2. Показана возможность временной гематогенной диссеминации после проведения биопсии простаты, ТУР, масажа простаты и радикальной

простатэктомии, что является обоснованием для более строгих показаний при планировании подобных процедур.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Методика выявления циркулирующих в крови клеток рака простаты с помощью ОТ-ПЦР специфичной мРНК ПСА является высоко чувствительной и специфичной, а также коррелирует с традиционными диагностическими и прогностическими критериями РПЖ, что подтверждает ее клиническое значение.

2. У больных раком простаты методика позволяет выявлять процесс метастазирования на раннем этапе и может применяться для ранней диагностики процесса диссеминации рака предстательной железы.

3. У больных с подозрением на рак предстательной железы методика может применяться для оценки риска развития диссеминированного рака простаты.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на X Российском съезде урологов (Москва, 2002); III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002); Научно-практическом симпозиуме «Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении» в рамках Международной конференции «Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины» (Москва, 2002); конференции «Онкологическая урология: от научных исследований к клинической практике (современные возможности диагностики и лечения опухолей предстательной железы, мочевого пузыря и почки» (Москва, 2004); III конференции молодых ученых с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2004); II Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2005); XI съезде Российских урологов (Москва, 2007), а также неоднократно обсуждались на научно-практических конференциях кафедрах урологии и биохимии ММА им. И.М.Сеченова. Апробация работы состоялась на совместном заседании кафедры урологии и кафедры биохимии ММА им. И.М.Сеченова 23 мая 2008 года.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 123 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, практические рекомендации и список цитированной литературы, включающий 190 источников (20 отечественных, 170 зарубежных). Работа иллюстрирована 15 рисунками и 34 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика клеточной линии. При отработке методики, а также в качестве положительного контроля при проведении ОТ-ПЦР использованы перевиваемые клетки РПЖ человека линии LNCaP. Клетки культивировали в

среде RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина при 37° в С02-инкубаторе (5%С02, влажность 95%).

Характеристика исследованных больных. В исследование включены 93 человека, у которых было проведено 156 ОТ-ПЦР периферической крови. Из них 14 человек являлись здоровыми донорами и 79 наблюдались в клинике урологии ММА им. И.М. Сеченова в период с 2000 по 2003 г. Общая характеристика пациентов, включенных в исследование, представлена в табл 1.

Основную группу исследования составили 66 пациентов с подозрением, либо морфологически подтвержденным раком простаты. Из них у 22 больных при морфологическом исследовании биоптатов этого органа на момент первичной ОТ-ПЦР выявлены хронический простатит (ХП), доброкачественная гиперплазия простаты (ДГПЖ) и ПИН-1 и/или ПИН-2 в различных сочетаниях. Эти пациенты составили подгруппу с фоновыми и предраковыми заболеваниями простаты. Возраст больных - от 34 до 80 лет.

Таблица 1

Характеристика обследованных пациентов (п=93)

Группа Количество человек Подгруппы Количество человек

Основная 66 Пациенты с фоновыми и предраковыми заболеваниями простаты 22

Больные раком простаты 44

Контрольная 27 Здоровые доноры 14

Урологические больные без патологии простаты 13

Группу больных раком простаты составили 44 пациента, из них 42 - с морфологически подтвержденным диагнозом, и 2 - с развернутой клинической картиной рака простаты при морфологическом диагнозе ДГПЖ, либо ПИН 1-2. Возраст больных - от 40 до 80 лет. Диагноз рака предстательной железы был поставлен в соответствии с международной системой ТЫМ на основании клинических данных, результатов пальцевого исследования простаты, определения ПСА, рентгено- и остеосцинтиграфии костей скелета для подтверждения наличия очагов метастазирования. Гистологическая оценка степени дифференцировки раковых клеток осуществлялась по трехступенчатой системе (С]-(Зз). ОТ-ПЦР проводили до биопсии простаты, либо не менее, чем через 2 недели после нее.

Контрольную группу составили 27 человек, из них 14 здоровых доноров-мужчин в возрасте до 40 лет и 13 мужчин с различными урологическими заболеваниями без патологии простаты (8 больных варикоцеле в возрасте от 16 до 23 лет и 5 с другими урологическими заболеваниями без поражения предстательной железы в возрасте от 20 до 66 лет).

Для выявления динамики изменения результатов ОТ-ПЦР крови проведены повторные обследования с интервалом не менее, чем через 2 месяца после первичного анализа (максимальный срок - 27 месяцев) у 11 пациентов с подозрением на РПЖ (2 больных с ДГПЖ и ПИН 1-2, одного - с клинической картиной рака простаты при морфологическом диагнозе ПИН 1-2, 8 больных подтвержденным раком простаты). Полученные данные сопоставляли с динамикой уровня ПСА, наличием или отсутствием гормональной терапии и особенностями течения заболевания.

Для анализа влияния лечебно-диагностических процедур на результаты ОТ-ПЦР проведены сравнения ОТ-ПЦР крови, которую брали за 0,5-3 часа до и в течение суток после процедуры, у 34 пациентов (табл.2).

Таблица 2

Характеристика пациентов, включенных в исследование влияния на результаты ОТ-ПЦР лечебно-диагностических вмешательств на предстательной

железе (п=34)

Процедура Количество пациентов Характеристика пациентов

Биопсия простаты 11 Фоновые и предраковые заболевания простаты

11 Больные РПЖ

Массаж простаты 2 Предраковые заболевания простаты

4 Больные РПЖ

РПЭ 4 Больные РПЖ

ТУР 2 Больные РПЖ

Взятие крови и выделение клеточной фракции. В соответствии с данными о локализации простатических клеток во фракции мононуклеарных лимфоцитов крови [Berteau Р., 1998], её выделяли из 8-10 мл венозной цитратной крови методом центрифугирования в градиенте плотности фиколл-содержащего раствора "Limpho separation medium" ("ICN",CIiIA), отбирая интерфазный слой с частью прилегающего сверху и снизу слоя жидкости в объеме 3-4 мл. Подсчет количества клеток проводили в камере Горяева.

Выделение РНК из клеток проводили сразу после их получения по методике P.Chomczynski, N.Sacchi (1987) в соответствии с количеством клеток в условиях постоянного охлаждения.

Контроль препаратов РНК. Качество полученных препаратов РНК оценивали с помощью электрофореза в геле 1,2 % агарозы с бромистым этидием. Количественное определение концентрации РНК проводили спектрофотометрически на основе зависимости: 1 оптическая единица соответствует 40 мкг в 1 мл РНК. Степень очистки препаратов РНК от белка определяли по показателю А260/А280.

Обратная транскрипция (ОТ). Реакцию ОТ проводили с образцами суммарной РНК, выделенной из мононуклеарных клеток крови пациентов, и РНК, выделенной из культуры клеток LNCaP (при отработке методики и затем в качестве положительного контроля).

Результаты оптимизации условий ОТ оценивали с помощью электрофореза после проведения «nestecb-ПЦР с ПСА-праймерами, предложенными А.И.Глуховым и соавт. (МНИИМЭ). Приносим глубокую благодарность профессору А.И.Глухову за оказанную методическую помощь.

Для работы с образцами крови был выбран протокол, рекомендованный MBI Fermentas (Литва). Каждый препарат РНК, выделенный из клеток крови, использовали для проведения трех реакций ОТ: с вносимым объемом РНК 1,5 мкл и 3 мкл - для исключения ложноотрицательных результатов, а также контрольная реакция ОТ без внесения фермента обратной транскрипции М-MulV для исключения возможной контаминации. Параллельно в каждом эксперименте проводилась ОТ с РНК, полученной из клеток LNCaP, для последующего контроля за ходом ПЦР с ПСА-праймерами.

«Nested» - ПЦР с ПСА-праймерами. Нами был выбран метод «nested»-ПЦР, как высоко чувствительный и специфичный [Sourla А.,2001]. Для выбора оптимального варианта анализа мРНК ПСА в работе использовали четыре группы внешних и внутренних праймеров для разных экзонов гена ПСА, предложенные А.И.Глуховым и соавт. (1998), R.S.Israeli и соавт.(1994), S.Jaakkola и соавт. (1995) J-L.Gala и соавт.(1998). Последовательности использованных групп праймеров и выбранный температурный режим при работе с каждым из них опубликованы [Забежинская О.М. и соавт., 2002]. Реакционная смесь ОТ (содержащая кДНК) в объеме 2 мкл использовалась в качестве матрицы при постановке 1-го раунда ПЦР с внешней парой праймеров. Реакционная смесь для первого раунда амплификации объемом 50 мкл содержала 67 мМ трис-HCl (рН 8,8), 16,6 мМ (NH4)2S04, 0,01% твин-20, 1,5 мМ MgCb, четыре дезоксинуклеозидтрифосфата (по 0,16мМ каждого), 2,5 ед.акт. Taq-полимеразы, пару внешних праймеров. При работе с несколькими ПСА-праймерами оптимальная концентрация их в реакционной смеси (по результатам наших экспериментов) была различной и составляла для праймеров А.И Глухова - 20 пкмоль, праймеров R.S.Israeli - 18 пкмоль, праймеров S.Jaakkola -18 пкмоль, праймеров J-L.Gala - 15 пкмоль. Далее 1 мкл смеси ПЦР после 1-го раунда амплификации использовали в качестве матрицы для 2-го раунда ПЦР с внутренней парой праймеров. Реакционная смесь для 2-го раунда ПЦР имела аналогичный состав.

Проведение ПЦР с праймерами к гену Рг-микроглобулина. Для

контроля проведения реакции ОТ в каждом эксперименте полученная кДНК (реакционная смесь ОТ) использовалась для постановки ПЦР с праймерами, комплементарными кДНК ßj-микроглобулина (MIC). Данный ген конститутивно экспрессируется в клетках человека, в том числе и в лейкоцитах. Отрицательный результат ОТ-ПЦР с ПСА-праймерами считался достоверным только при положительном результате ОТ-ПЦР с праймерами на кДНК MIC для исключения ложноотрицательных результатов. Реакционная смесь для постановки ПЦР была сходного состава и содержала по 18 пмоль каждого из специфических MIC-праймеров, предложенных E.Corey и соавт.(1997), длиной 28 нуклеотидов, перекрывающие область 3-х экзонов данного гена. Использовался двутемпературный режим ПЦР: 95° - 4 мин, 69° - 2 мин 40 сек, 1 цикл; 95° - 50 сек, 69° - 2 мин, 33 цикла; 95° - 50 сек, 69° - 1 мин 30 сек, 72° - 8 мин, 1 цикл.

Электрофорез продуктов амплификации проводили в 1,5% агарозном геле с бромистым этидием. Размер ПЦР-продуктов определяли, используя набор маркеров молекулярной массы ДНК: DNA Marker pBR 322 DNA/BSuRI (Hae 111) («Fermentas», Литва).

Определение чувствительности метода. Чувствительность метода определяли двумя способами. В первом из них препарат РНК из клеток LNCaP, содержащий 0,6 мкг/мкл РНК, разводили повторно 10-кратно до 105 раз и использовали 1,5 мкл каждого разведения для постановки ОТ-ПЦР с каждой группой праймеров. В другом эксперименте готовили серию разведений клеток LNCaP в фосфатно-солевом буфере и добавляли их в пробирки, содержащие по 6х106/мл периферических мононуклеарных клеток, выделенных из крови здоровых доноров описанным выше методом градиентного центрифугирования и подсчитанных в камере Горяева. Далее выделение РНК проводили из полученной смеси клеток LNCaP и мононуклеаров крови. Выделенная РНК использовалась в качестве матрицы для проведения ОТ-ПЦР.

Методы статистической обработки результатов. Для оценки полученных результатов использованы метод Фишера, t-критерий Стьюдента. При отсутствии нормального распределения использовали непараметрический U-тест по методу Манна и Уитни. При анализе средних величин учитывали медиану, 25-ый и 75-ый процентили. Различия считались статистически значимыми при уровне ошибки р<0,05. Расчеты выполнены на персональном компьютере с использованием приложения Microsoft Excel и пакета статистического анализа данных Statistica 5.1 for Windows (StatSoft Inc., USA).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Результаты выбора, оптимизации методики и определения ее чувствительности с использованием клеточной линии рака простаты LNCaP. Проведена оптимизация условий ОТ и «nestecfo-ПЦР с четырьмя группами ПСА-специфичных праймеров и с праймерами, специфичными контрольному гену р2-микроглобулина. Чувствительность методики ОТ-ПЦР

для четырех групп ПСА-специфичных праймеров была одинаковой: продукт ПЦР второго раунда выявлялся при количестве вносимой РНК LNCaP 0,0009 мкг. Наиболее четкая полоса флуоресценции отмечалась при использовании ПСА-специфичных праймеров, предложенных R.S.Israeli и соавт., что позволило выбрать их для последующих анализов мРНК ПСА в крови людей. Отметим, что эти праймеры достаточно широко используются в зарубежных клинических лабораториях и один из них включает последовательности двух соседних экзонов гена ПСА, что исключает возможность амплификации хромосомной ДНК, если она присутствует в образце. Количественный выход мононуклеарных клеток из пробы крови пациентов и количество выделенной из них РНК составляли 15-25x106 мононуклеарных клеток, из которых затем выделяли 10-50 мкг РНК. Показатель степени очистки РНК от белка колебался в пределах 1,7-1,9. Чувствительность метода в эксперименте со смесью клеток LNCaP и периферических мононуклеаров составила 1:106 (одна простатическая клетка среди 10б мононуклеаров). Такая чувствительность является достаточной в соответствии с результатами других исследовательских групп [Corey Е., 1998].

Полученные результаты позволили использовать методику ПСА специфичной ОТ-ПЦР с праймерами, предложенными R.S.Israeii и соавт. (1994), в сочетании с контрольной ПЦР, специфичной мРНК р2-микроглобулина, для выявления микрометастазов рака простаты в периферической крови (рис.1).

I И Ш

550п.н. 48бп.н. 355п.н.

Рис. 1.Результаты ОТ-ПЦР крови у двух больных РПЖ.

Электрофореграмма продуктов ОТ-ПЦР в 1,5% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием: 1 - первый раунд «nestecb-OT-ПЦР с ПСА-праймерами (486 п.н.), 2 - второй раунд «nestedÄ-OT-ПЦР с ПСА-праймерами (355п.н.), 3 -контрольная ОТ-ПЦР с М1С-праймерами (550 п.н.).

I - исследование крови больного диссеминированной формой РПЖ

II - исследование крови больного локализованной формой РПЖ

III - контрольное исследование РНК, выделенной из клеток LNCaP

2.Анализ результатов обследования пациентов контрольной группы. Результат ОТ-ПЦР у здоровых доноров (п=14) был отрицательным. У пациентов с урологическими заболеваниями без иатологии простаты (п=13) ОТ-ПЦР была отрицательной во всех случаях, кроме одного пациента 25 лет с кондиломой крайней плоти. Положительный результат ОТ-ПЦР в этом наблюдении может быть связан с выявлением низкого уровня неспецифической транскрипции гена ПСА клетками крови [Непке XV., 1998]. В связи с крайне молодым возрастом мы не можем объяснить этот результат предположением о недиагносцированном раке простаты. Таким образом специфичность метода, определяемая по проценту отрицательных результатов в контрольной группе, составила 96,3% (26/27).

3. Результаты обследования пациентов основной группы

3.1. Анализ результатов обследования пациентов с фоновыми и предраковыми заболеваниями предстательной железы.

3.1.1. Сравнение результатов ОТ-ПЦР с типом поражения предстательной железы. При анализе пациентов с нераковым поражением простаты ХП и ДГПЖ были отнесены к фоновым заболеваниям, ПИН-2 - к предраковым, а ПИН-1 рассматривался как отдельно, так и в составе подгруппы фоновых заболеваний, т.к. принято связывать ПИН-1 с хроническим воспалением. Полученные результаты представлены в табл.3.

Таблица 3

Результаты ОТ-ПЦР и показатели ПСА у больных фоновыми и предраковыми

заболеваниями простаты (п=22)

Заболевания п Показатели ПСА Частота положительной

простаты СЫ-П1е-(575*, нг/мл ОТ-ПЦР

Фоновые 4 1,2-4,0-23,6 1/4 (25%)

ПИН-1 5 9,0-13,0-24,6 0/5 (0%)

Фоновые и ПИН-1** 9** 3,1-11,0-24,1 1/9 (11,1%)

ПИН-2 13 8,1-10,0-16,2 4/13 (30,8%)

Всего 22 5,9-10,0-16,9 5/22 (22,7%)

* 25-йпроцентиль-медиана-75-й процентиль

** ПИН-1 рассматривался и отдельно, и в составе подгруппы фоновых заболеваний простаты

ОТ-ПЦР была положительной у одного пациента подгруппы с фоновыми заболеваниями (причем у всех пациентов с ПИН-1 результаты ОТ-ПЦР отрицательные) и у 4 пациентов с ПИН-2. Таким образом, выявлена статистически не подтвержденная (р=0,1) тенденция увеличения вероятности положительной ОТ-ПЦР при предраковых заболеваниях простаты по сравнению с фоновыми. Факт выявления простатических клеток в кровеносном русле у данных больных имеет свои объяснения. Во-первых, мы не можем исключить возможность недиагносцированного рака простаты у больных с подозрением на РПЖ. У одного пациента это подозрение подтвердилось при повторной биопсии простаты через 4 месяца. Во-вторых, достаточно высокий процент положительных ОТ-ПЦР у пациентов с ПИН-2 может объясняться

морфологическими особенностями ткани простаты: разрушением базального слоя клеток, усилением ангиогенеза, что может способствовать попаданию простатических клеток в кровяное русло.

3.1.2. Анализ связи результатов ОТ-ПЦР с уровнем ПСА. Положительный результат ОТ-ПЦР выявлен только у пациентов с повышенным уровнем ПСА: 8,1нг/мл и выше. У пациентов со значениями ПСА в пределах «серой зоны» (4-12нг/мл) частота положительной ОТ-ПЦР составила 22,2%, а при более высоких значениях ПСА - 33,3%. Выявленная тенденция к увеличению вероятности положительной ОТ-ПЦР с повышением уровня ПСА статистически не значима (р>0,05).

При сравнении подгруппы пациентов с фоновыми заболеваниями, включая ПИН-1, с подгруппой ПИН-2 отмечены приблизительно одинаковые средние показатели ПСА при наличии различий в частоте положительной ОТ-ПЦР (табл.3).

Таким образом, ОТ-ПЦР может давать дополнительную информацию, по сравнению с определением ПСА, при анализе риска предракового процесса у пациентов с нераковыми заболеваниями простаты. При наличии ПИН-2 положительная ОТ-ПЦР дополнительно указывает на высокий риск развития и выявления значимого рака простаты у данного пациента.

3.2. Анализ результатов обследования больных раком простаты. При первичном анализе выявлено 16 наблюдений «положительных» результатов ОТ-ПЦР (36,4%) и 28 «отрицательных» (63,6%). Такое соотношение результатов ОТ-ПЦР соответствует преобладанию локализованных и местнораспространенных опухолей над диссеминированными у обследованных пациентов: количество больных с наличием подтвержденных традиционными методами метастазов составило 11 (25%). Показатели ПСА (С>25-те-С>75) составили: 9,4-22,9-66,5 нг/'мл, что значимо выше соответствующих значений у пациентов с фоновыми и предраковыми заболеваниями (р<0,05).

3.2.1. Взаимосвязь результатов ОТ-ПЦР и результатов выявления отдаленных метастазов традиционными методами у больных раком простаты. При исследовании больных раком простаты в первую очередь был произведен анализ взаимосвязи результатов выявления клеток рака простаты в крови с помощью ОТ-ПЦР с наличием (М+) или отсутствием (Мо) доказанных традиционными методами макрометастазов. Отдельную подгруппу (Мх) составили больные, которым не было проведено исследование на наличие метастазов в полном объеме (табл.4).

Клиническая чувствительность методики ОТ-ПЦР в выявлении циркулирующих в крови клеток рака простаты, оцениваемая по проценту положительных результатов ОТ-ПЦР среди пациентов подгруппы М+, составила 81,8%. Таким образом, чувствительность весьма высока и соответствует таковой у большинства исследователей [Уагкага^ 1., 2003]. Отрицательный результат ОТ-ПЦР у двух больных, имеющих метастазы, выявленные традиционными методами, может быть объяснен несколькими причинами, а именно фиброзированием предстательной железы на поздних

стадиях рака, эффектом Монте-Карло (ошибка образца), связанным с неравномерностью распределения метастатических клеток в кровеносном русле, а также неравномерностью по времени выхода раковых клеток в кровь [Corey Е., 1998; Gewanter R.M., 2003]. У одного из этих пациентов при повторном анализе через 6 месяцев реакция ОТ-ПЦР стала положительной. У второго больного отсутствовали метастазы в регионарных лимфатических узлах (N0), и, видимо, образование отдаленных метастазов было вызвано кратковременным «проскоком» опухолевых клеток в кровь, которое не совпало по сроку с анализом крови с помощью ОТ-ПЦР. Интересно, что у данного больного и после биопсии реакция ОТ-ПЦР была отрицательной, что свидетельствует о низком метастатическом потенциале этой опухоли.

Таблица 4

Результаты ОТ-ПЦР и показатели ПСА у больных (п=44) в зависимости от наличия (М+) или отсутствия (М0) отдаленных метастазов и у пациентов с __невыясненным (Мх) наличием диссеминации_

Подгруппа п Показатели ПСА СЬ-гПс-СЬз.нг/мл Частота положительной ОТ-ПЦР Частота отрицательной ОТ-ПЦР

М+ 11 46,0-80,7-100,0 9/11 (81,8%) 2/11 (18,2%)

Мо 23 2,0-12,3-26,4 3/23 (13,0%) 20/23 (87,0%)

М, 10 9,3-23,4-47,8 4/10 (40%) 6/10 (60%)

Другой возможной причиной ложноотрицательных результатов ПСА-специфичной ОТ-ПЦР является гормональное лечение, которое может подавлять сам процесс диссеминации и снижать выработку простатическими клетками мРНК ПСА, являющейся маркером клеток рака простаты в используемом нами методе. Для оценки значимости последного эффекта мы сравнили клиническую чувствительность метода в зависимости от наличия или отсутствия гормональной терапии у больных РПЖ (табл.5).

Таблица 5

Частота положительной ОТ-ПЦР крови у больных РПЖ, получавших и не

получавших гормональную терапию, с учетом наличия или отсутствия __отдаленных метастазов (п=44)_

Подгруппа Частота положительной ОТ-ПЦР у пациентов, получавших гормональную терапию Частота положительной ОТ-ПЦР у пациентов, не получавших гормональную терапию

Мо 0/10 (0%) 3/13 (23,1%)

М+ 2/2 (100%) 7/9 (77,8%)

мч 1/2 (50%) 3/8 (37,5%)

Всего 3/14 (21,4%) 13/30 (43,3%)

Частота положительной ОТ-ПЦР у больных РПЖ с отдаленными метастазами, разделенных на получавших и не получавших гормональную терапию, составила 100% и 77,8% соответственно. Это объясняется тем, что в

подгруппе М+ очень мало пациентов получали гормональное лечение, поэтому какие-либо закономерности здесь не выявлены. В подгруппе М0 положительные ОТ-ПЦР получены только у больных, не получавших гормональное лечение, что позволяет предположить его влияние на результат ОТ-ПЦР. Однако это отличие статистически незначимо (р>0,05).

В подгруппе больных раком простаты без отдаленных метастазов (М0), состоявшей из 23 человек (табл.4), отрицательная реакция ОТ-ПЦР выявлена у 20 пациентов, т.е. у 87%. Этот показатель (как и высокий процент отрицательных результатов в контрольной группе) характеризует клиническую специфичность метода [ОгаББо ЧЪ., 1998]. Положительные результаты ОТ-ПЦР выявлены у трех пациентов с характеристикой опухоли Т2Т^оС2илиз и повышенным ПСА (>4нг/мл). Можно предположить, что процесс метастазирования у этих больных идет, но достаточно крупный метастатический очаг, который может быть выявлен традиционными методами, еще не сформировался. Вероятность этого подтверждается средне- и низкодифференцированным характером клеток опухоли. Такие больные требуют динамического наблюдения и, возможно, назначения гормональной терапии. Предположение о невыявленных метастазах подтверждается и результатами повторных ОТ-ПЦР. У одного из этих пациентов положительная реакция ОТ-ПЦР сохранялась даже после радикальной простатэктомии, а у второго - после проведения биопсии простаты. Что касается третьего больного, то он обследовался амбулаторно неоднократно в течение года, и реакция ОТ-ПЦР всегда оказывалась положительной, при уровнях ПСА 0,01-9 нг/мл. Возможно, у этого больного существовала повышенная опасность «проскока» опухолевых клеток в кровеносное русло, хотя количество этих клеток было недостаточно для формирования метастазов. Однако это количество циркулирующих клеток удавалось выявить с помощью ОТ-ПЦР. Положительные результаты ОТ-ПЦР в подгруппе М0 характеризуют возможности более раннего выявления метастатического процесса путем установления гематогенной диссеминации, чем при использовании традиционных методов.

Взаимосвязь между результатами ОТ-ПЦР и выявлением метастазов традиционными методами является статистически значимой при сравнении частоты положительных результатов в подгруппах М+ и Мо (р<0,01). Такой же уровень достоверности получен при сравнении средних показателей ПСА между данными подгруппами, причем в подгруппе больных М+ этот показатель был выше более чем в 4 раза.

В подгруппе Мх положительные результаты ОТ-ПЦР выявлены у четырех из 10 пациентов (табл.4), причем у трех из них были крупные (местно-распространенные) средне- и низкодифференцированные опухоли (Т302.з) и повышенный ПСА:>30 нг/мл. Частота положительных ОТ-ПЦР в этой подгруппе была выше, чем в подгруппе М0 (р<0,05), но ниже, чем в подгруппе М+ (р<0,05). Показатели ПСА в подгруппе Мх оказались выше, чем у больных стадии Мо, более чем в 1,5 раза. Таким образом, закономерно предположить

наличие неустановленной диссеминации опухоли у части больных этой подгруппы.

3.2.2.Аналш результатов ОТ-ПЦР в зависимости от наличия или отсутствия метастатического поражения регионарных лимфатических узлов у больных РПЖ. Для оценки клинического значения нового диагностического метода проведен анализ связи результатов ОТ-ПЦР с другими показателями, характеризующими стадию рака простаты по системе ТЫМв, а также уровнем ПСА. Поражение регионарных лимфатических узлов обычно происходит, минуя кровеносные сосуды, но оно подтверждает агрессивный характер течения опухолевого процесса и закономерно может сопровождаться параллельным гематогенным метастазированием. Анализ результатов ОТ-ПЦР крови в подгруппах с наличием или отсутствием (Ы0) поражения регионарных лимфатических узлов показал значимую взаимосвязь этих показателей (р<0,01). Полученные результаты представлены в табл.6.

В подгруппе ОТ-ПЦР была положительной у всех больных, имеющих отдаленные метастазы. Лишь у одного пациента с невыясненным наличием отдаленных метастазов и нормальным значением ПСА ОТ-ПЦР была отрицательной. В то же время, в подгруппе N0 у всех пациентов, кроме одного, отсутствовали документированные отдаленные метастазы. Положительные ОТ-ПЦР среди них выявлены у трех пациентов, описанных выше в подгруппе М0. Достоверно более высокими были также показатели ПСА в подгруппе М+ по сравнению с N0 (р<0,01), а также при сравнении с Ыо(р<0,05).

Таблица 6

Результаты ОТ-ПЦР крови и ПСА у больных РПЖ в зависимости от наличия (Ы+) или отсутствия (N0) метастазов в регионарные лимфатические узлы и у

пациентов с неустановленным их состоянием (Nx) (п=44)

Подгруппа n Показатели ПСА Q25-me-Q75,кг/мл Частота отдаленных метастазов (М+) Частота положительной ОТ-ПЦР

N+ 9 46,0-80,7-100,0 8/9 (88,9%) 8/9 (88,9%)

No 20 3,0-12,2-26,1 1/20 (5%) 3/20 (15%)

15 14,3-30,9-91,2 2/15 (13,3%) 5/15 (33,3%)

3.2.3. Взаимосвязь результатов ОТ-ПЦР со степенью дифференцировки клеток рака простаты. Показана взаимосвязь между результатами ОТ-ПЦР и степенью дифференцировки опухоли: микрометастазы не выявлены у больных с высокодифференцированным раком простаты, а при наличии низкодифференцированных опухолей частота выявления раковых клеток в крови с помощью ОТ-ПЦР несколько выше, чем при средней степени дифференцировки (табл.7).

Сходная тенденция наблюдается при сопоставлении доли пациентов с установленными метастазами (М+), которые отсутствовали в подгруппе с высокой степенью дифференцировки. В то же время процент больных с М+ при

средней и низкой степени дифференцировки отличался незначительно, что свидетельствует в пользу возможности более раннего выявления метастатического процесса с помощью ОТ-ПЦР крови. Однако значимость различий в частоте положительного результата ОТ-ПЦР между подгруппами С2 и вз была недостаточной (р=0,1). Достоверным оказалось отличие по данному показателю между подгруппами 61 и 02, а также в] и вз (в обоих случаях р<0,01). Также достоверным было отличие по средним показателям ПСА в указанных подгруппах, демонстрирующее повышение уровня ПСА при снижении степени дифференцировки опухоли (р<0,05).

Таблица 7

Результаты ОТ-ПЦР крови и ПСА у больных с высоко-, средне- и низкодифференцированным (вь в;, в3,) раком простаты (п=44)_

Подгруппа п Показатели ПСА <325-тс-С>75,т/мл Частота отдаленных метастазов (М+) Частота положительной ОТ-ПЦР

О, 14 0,2-10,9-14,6 0/14 (0%) 0/14 (0%)

02 17 25,8-30,9-80,7 7/17 (41,2%) 8/17 (47,1%)

бг-з 03 8 36,2-75,6-100,0 4/8 (50%) 6/8 (75%)

5 4,0-9,3-20,0 1/5 (20%) 2/5 (40%)

Пациенты с неустановле/шой степенью дифференцировки рака простаты включены в подгруппу Ох.

3.2.4.Взаимосвязь результатов ОТ-ПЦР с размером первичной опухоли (Т). Показано статистически значимое (р<0,01) повышение частоты положительных результатов ОТ-ПЦР по мере увеличения размера опухоли (табл.8). Это закономерно отражает большую вероятность метастазирования при разрастании и местном распространении опухоли за пределы капсулы предстательной железы. В подгруппе частота выявления микрометастазов в крови и макрометастазов почти одинакова, в то время как на более ранних этапах развития опухоли (подгруппа Ти) макрометастазы во многих наблюдениях еще не определяются, а гематогенное микрометастазирование установлено. В исследуемых подгруппах показана корреляция между величиной первичной опухоли и повышением уровня ПСА (р<0,01).

Таблица 8

Сравнение результатов ОТ-ПЦР крови и показателей ПСА у больных РПЖ в

зависимости от размера первичной опухоли (п=44)

Подгруппа П Показатели ПСА СЬ-Шс-СЬ.нг/мл Частота отдаленных метастазов (М+) Частота положительной ОТ-ПЦР

Ть: 23 1,4 -9,8-20,0 0/23 (0%) 4/23 (17,4%)

Тз-4 21 30,9-60,0-100,0 11/21 (52,4%) 12/21 (57,1%)

3.2.6. Анализ взаимосвязи результатов ОТ-ПЦР крови и уровня общего ПСА. Проводилось сравнение результатов ОТ-ПЦР со значением общего ПСА (табл.9). Больные РПЖ были разделены на 4 подгруппы в соответствии со значением ПСА: норма (0-4нг/мл), «серая зона» (>4-12нг/мл), патогномоничный для РПЖ показатель (>12-100нг/мл), патогномоничный для диссеминированного РПЖ показатель (>100нг/мл). Выявлена тенденция к увеличению частоты положительной ОТ-ПЦР при увеличении уровня ПСА. Однако достоверно отличается только частота положительной ОТ-ПЦР в подгруппе с нормальным уровнем ПСА от остальных подгрупп (р<0,01).

Внутри подгруппы со значением ПСА>12-100нг/мл, можно отметить увеличение частоты положительной ОТ-ПЦР до 63,6% при повышении ПСА более 28нг/мл, тогда как при значениях ПСА меньше 28нг/мл этот показатель составил 27,3%. Но это различие недостоверно (р=0,1). Если же разделить всех больных раком простаты с повышенным уровнем ПСА на две подгруппы: до 28нг/мл включительно и более, то частота положительной ОТ-ПЦР составит 25 и 63,2% соответственно. Эти различия статистически значимы (р<0,05). Таким образом, существует корреляция между результатом ОТ-ПЦР и нормальным, либо повышенным уровнем ПСА. Большинством зарубежных исследователей отмечается более выраженное повышение этого показателя в случаях диссеминированной опухоли. При анализе результатов обследования пациентов с повышенным ПСА статистически значимо повышение риска гематогенной диссеминации при значениях ПСА выше 28нг/мл.

Таблица 9

Результаты ОТ-ПЦР крови у больных раком предстательной железы при

различных уровнях ПСА (п=44)

Подгруппа ПСАнг/мл п Частота отдаленных метастазов (М+) Частота положительной ОТ-ПЦР

I 0-4 9 0/9 (0%) 0/9 (0%)

II >4-12 5 0/5 (0%) 1/5 (20%)

III >12-100 22 6/22 (28%) 10/22 (45,5%)

IV >100 8 5/8 (62,5%) 5/8 (62,5%)

Интересно, что количество положительных ОТ-ПЦР у пациентов четвертой подгруппы соответствовало количеству пациентов с установленными традиционными методами отдаленными метастазами (М+) - 5/8. При этом в четырех наблюдениях были выявлены и раковые клетки в крови, и отдаленные метастазы, а соответственно в двух наблюдениях - либо одно, либо другое. В третьей подгруппе частота выявления раковых клеток в крови (10/22) превышала частоту выявления отдаленных макрометастазов (6/22), причем у 5 из 6 больных с М+ ОТ-ПЦР была положительной. Во второй подгруппе отсутствовали пациенты с установленными отдаленными метастазами при наличии одной положительной ОТ-ПЦР. Эти данные подтверждают

возможность более ранней диагностики процесса диссеминации опухоли с помощью ОТ-ПЦР исследования крови.

3.3. Анализ основных клинико-лабораторных показателей пациентов с отрицательным и положительным результатом ОТ-ПЦР крови.

Для комплексной оценки связи различных факторов с циркуляцией простатических клеток, определяемой ОТ-ПЦР, целесообразно сравнить диагностические и прогностические критерии у двух подгрупп больных РПЖ -с положительной и отрицательной реакцией ОТ-ПЦР. Средние показатели ПСА при положительной ОТ-ПЦР были значимо выше, чем при отрицательной (р<0,01). Следует отметать, что процент пациентов со значением ПСА более 100 нг/мл, являющегося патогномоничным для диссеминированной формы рака простаты, был выше в подгруппе с положительной ОТ-ПЦР по сравнению с подгруппой, имеющей отрицательный результат, но не так значительно как можно было бы ожидать: 31,3% и 10,7% (р>0,05). В то же время доля пациентов с уровнем ПСА более 28 нг/мл была значимо выше (р<0,05), составив 75% в подгруппе больных РПЖ с положительной ОТ-ПЦР крови и 25% - при отрицательной (рис.2). Эти результаты подтверждают, что уровень ПСА более 28 нг/мл является прогностически неблагоприятным в отношении риска гематогенной диссеминации.

ПСА >28 Т 3-4 М+ вЗ

нг/мл

! О Пациенты с отрицательной ОТ-ПЦР_■ Пациенты с положительной ОТ-ПЦР I

Рис.2. Процент пациентов с прогностически неблагоприятными показателями (ПСА>28нг/мл,Тз4,Ы+,М+,Оз,) среди больных РПЖ с положительной и отрицательной ОТ-ПЦР.

В целом, как видно на рис.2, для группы больных РПЖ с положительной ОТ-ПЦР характерной была значительно большая (по сравнению с группой больных с отрицательной ОТ-ПЦР) частота таких прогностически

неблагоприятных показателей как: ПСА>28 нг/мл; наличие крупных опухолей (Т3-4), опухолей с метастазами в регионарные лимфатические узлы (М+), с отдаленными метастазами (М,), а также опухолей с низкой степенью дифференцировки (вз). При этом чаще всего (в 75% наблюдений) отмечали сочетание положительных результатов ОТ-ПЦР с наличием крупной первичной опухоли, прорастающей капсулу предстательной железы (Т3-4) и значением ПСА более 28 нг/мл (рис.2). В группе пациентов с сочетанием положительной ОТ-ПЦР и уровня ПСА>28нг/мл больные РПЖ стадии Тм составили 92%. Такой результат является вполне закономерным. Наличие крупной местнораспространенной опухоли простаты характеризует агрессивное течение ракового процесса, что приводит к выбросу раковых клеток через прорастаемые сосуды в кровеносное русло, где они определяются методом ОТ-ПЦР по наличию специфичной для них мРНК ПСА. В то же время клетки рака простаты продолжают синтезировать белок ПСА, причем в связи с большими размерами опухоли количество его возрастает. ПСА выделяется в кровеносное русло, где и определяется существующими методиками.

4.Анализ влияния лечебно-диагностических манипуляций на предстательной железе на результат ОТ-ПЦР. Следует отметить, что у всех пациентов с положительной ОТ-ПЦР до манипуляций на простате (9 человек), такой же результат был получен и через сутки после нее, что указывает на хорошую воспроизводимость методики.

Что касается пациентов с начальной отрицательной ОТ-ПЦР, то после проведения биопсии простаты в группе больных фоновыми и предраковыми заболеваниями, ОТ-ПЦР стала положительной в 4 из 9 (44,4%) наблюдений (три пациента с ПИН 1-2 и один - ПИН-1). Циркуляция простатических клеток в крови у подобных пациентов описана и другими авторами [Нага М, 2001]. Можно предположить, что особенно при ПИН-2 из-за нарушения клеточных контактов вследствие дисплазии проведение биопсии простаты может вести к попаданию простатических клеток в кровеносное русло и детекции этих клеток методом ОТ-ПЦР. Взаимосвязи полученных результатов с уровнем ПСА не установлено.

В группе больных РПЖ первичный отрицательный результат ОТ-ПЦР после биопсии изменился на положительный у четырех из семи пациентов (57,2%). Такой высокий процент больных РПЖ, у которых биопсия вызвала появление гематогенных микрометастазов описан в литературе [Ко^зШепв М., 1999]. При повторной ОТ-ПЦР крови у одного из этих четырех пациентов результат снова стал отрицательным вследствие элиминации из кровеносного русла циркулирующих опухолевых клеток. Взаимосвязи полученных результатов с уровнем ПСА, степенью дифференцировки, размером опухоли не установлено.

После РПЭ конверсия с отрицательного на положительный результат ОТ-ПЦР отмечена у одного из четырех обследованных пациентов, после ТУР простаты - у обоих обследованных больных. Риск диссеминации опухолевых клеток при проведении трансуретральной резекции простаты отмечен и

зарубежными авторами [Heung Y.M., 2000]. При повторном исследовании крови у одного из описанных пациентов через 11 месяцев после ТУР, результат ОТ-ПЦР вновь стал отрицательным.

После массажа простаты конверсия отрицательного результата ОТ-ПЦР на положительный наблюдалась у одного из трех больных РПЖ, с клинической картиной рака простаты при морфологическом диагнозе ДГПЖ. Он погиб через 2,5 года при наличии симптомов рака простаты.

Таким образом, впервые показана возможность диссеминации простатических клеток в кровеносное русло после проведения массажа простаты, подтверждена возможность такого эффекта после проведения биопсии простаты, радикальной простатэктомии, трансуретральной резекции простаты, у пациентов с предраковыми заболеваниями простаты (ПИН-2) и РПЖ. В соответствии с нашими наблюдениями и данными других исследователей [Price D.K., 1998] эта диссеминация является временной, ее клиническое значение остается неясным и требует дальнейших исследований с длительным сроком наблюдения больных. Возможность такой диссеминации следует учитывать клиницистам и исследователям при анализе результатов выявления гематогенных микрометастазов.

5.Анализ мониторинга больных с подозрением, либо подтвержденным раком простаты с помощью ОТ-ПЦР. Перспективными для анализа риска гематогенного метастазирования являются повторные исследования крови с применением ОТ-ПЦР при длительном мониторинге. Из обследованных таким образом 11 пациентов трое больных РПЖ имели отдаленные метастазы (М+). В этой подгруппе у двух больных при мониторинге положительная реакция ОТ-ПЦР сменилась на отрицательную, а у одного отрицательная реакция стала положительной. Это свидетельствует о том, что уже сформировавшиеся вследствие диссеминации отдаленные метастазы не всегда сопровождаются повторной циркуляцией опухолевых клеток в крови.

Поэтому наибольший интерес представляют повторные ОТ-ПЦР исследования в подгруппе из трех больных с локализованным и местнораспространенным РПЖ, т.е. отсутствием макрометастазов. У одного больного высокодифференцированным локализованным раком простаты (TiNqMoGO ОТ-ПЦР дважды была отрицательной на протяжении 2 месяцев наблюдения при уровнях ПСА в пределах «серой зоны» (9,2-9,8 г/мл). Отрицательный результат ОТ-ПЦР сохранился и после РПЭ. Учитывая высокодифференцированный характер опухоли, можно сделать вывод, что рак простаты у данного пациента характеризуется крайне низким метастатическим потенциалом, подтвержденным стабильным отсутствием в крови микрометастазов. У другого пациента с РПЖ (T2N0M0G2) ОТ-ПЦР была положительной четырежды на протяжении 13 месяцев при показателях ПСА 5,22; 1,14; 0,01; 9,0 нг/мл. Стабильное наличие клеток рака простаты в крови указывает на высокий риск диссеминации опухоли, подтверждаемый колебаниями ПСА и средней степенью дифференцировки. Известно, что этот больной на данный момент не имеет признаков активации опухолевого

процесса, видимо за счет адекватного действия системы имунной защиты, либо несостоятельности механизмов, ответственных за адгезию и дальнейший рост метастатических клеток во вторичных очагах. Однако этот пациент требует тщательного наблюдения. Представленные пациенты не получали гормональную терапию.

Третий пациент с местнораспространенным низкодифференцированным раком простаты (Т]К0МоОз), получал гормональное лечение на протяжении всего исследования 14,5 месяцев. Результаты ОТ-ПЦР были отрицательными дважды в течении одного месяца при уровне ПСА более 100нг/мл, являющегося патогномоничным для диссеминированных форм. После ТУР ОТ-ПЦР была положительной. Через 11 месяцев при снижении ПСА до 78,7нг/мл ОТ-ПЦР вновь стала отрицательной и сохранялась такой при повторном исследовании, проведенном в течение месяца. Через 2,5 месяца ОТ-ПЦР стала положительной на фоне подъема ПСА почти до первоначальных цифр, что свидетельствует о развитии резистентности к препарату. Через год у больного были выявлены метастазы в кости таза и в регионарные лимфатические узлы. Больной умер на фоне развившейся гормонрезистентной формы рака простаты. Это наблюдение подтверждает возможность более раннего по сравнению с традиционными методами выявления диссеминации рака простаты с помощью ОТ-ПЦР крови.

В подгруппе с клинически невыясненным наличием отдаленных метастазов (4 человека) при мониторинге результат ОТ-ПЦР оставался стабильным, и только после биопсии у двух из них отрицательная реакция сменилась на положительную. Мониторинг проведен также у больного с ДГПЖ, ПИН 1-2. Результаты ОТ-ПЦР был положительными трижды при значениях ПСА от 13,8 до 10,2 нг/мл.

Появление положительного результата ОТ-ПЦР на фоне гормонального лечения указывает на возможность мониторинга процесса гематогенной диссеминации с помощью ОТ-ПЦР на фоне данного вида лечения. Взаимосвязь между динамикой ОТ-ПЦР крови и динамикой ПСА в большинстве наблюдений не выявлена. Следовательно, мониторинг с помощью ОТ-ПЦР несет дополнительную информацию о течении и метастатическом потенциале опухоли. Реальное прогностическое значение данного показателя при различных стадиях РПЖ может быть выявлено при соответствующем динамическом наблюдении большого контингента больных.

ВЫВОДЫ

1. Выбранная и оптимизированная методика ПСА-специфичной ОТ-ПЦР крови обладает высокой чувствительностью в опытах со смесью культуры клеток РПЖ и мононуклеаров крови (1:106).

2. У пациентов без патологии простаты отрицательные результаты ОТ-ПЦР отмечены в 96,3% наблюдений, чго свидетельствует о высокой специфичности метода.

3. В группе пациентов с фоновыми и предраковыми заболеваниями простаты положительные результаты ОТ-ПЦР выявлены в 23% наблюдений у

больных с уровнем ПСА 8 нг/мл и выше. Это свидетельствует о возможности попадания простатических клеток в кровеносное русло уже при развитии диспластических изменений (ПИН-2).

4. Установлена корреляция положительных результатов ОТ-ПЦР у больных раком простаты с другими диагностическими критериями (в особенности с уровнем ПСА более 28 нг/мл и размером первичной опухоли Тм), что указывает на возможность применения ОТ-ПЦР для установления гематогенной диссеминации ракового процесса.

5. В ряде наблюдений у больных РПЖ положительные результаты ОТ-ПЦР предшествовали клиническому выявлению отдаленных метастазов.

6. Массаж предстательной железы, РПЭ, ТУР и биопсия простаты могут стимулировать диссеминацию простатических клеток в кровеносное русло у пациентов с предраковыми заболеваниями простаты и РПЖ. Наибольшая частота такой диссеминации отмечена при биопсии простаты и ТУР у больных РПЖ. Повторные ОТ-ПЦР указывают на временный характер такой диссеминации.

7. Повторные ОТ-ПЦР крови позволяют мониторировать процесс гематогенной диссеминации у больных с предраковыми заболеваниями и РПЖ, в том числе на фоне гормонального лечения. Взаимосвязь между динамикой ОТ-ПЦР и динамикой ПСА в большинстве наблюдений не выявлена.

8. Не все попавшие в кровь раковые клетки выживают и формируют метастатический очаг, однако их наличие в крови (положительная ОТ-ПЦР) указывает на высокий метастатический потенциал опухоли. Для выявления прогностического значения этого показателя показаны повторные исследования с длительным сроком наблюдения больных.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Описанная методика ПСА-специфичной ОТ-ПЦР рекомендована для исследования процесса гематогенной диссеминации рака простаты.

2. При фоновых и предраковых заболеваниях простаты у больных с ПСА более 8 нг/мл рекомендуется проведение ОТ-ПЦР крови для оценки риска развития РПЖ и диссеминации простатических клеток.

3. У больных РПЖ с невыясненным наличием отдаленных метастазов, а также больных без отдаленных метастазов с опухолью стадии Т3ц рекомендуется проведение ОТ-ПЦР для раннего выявления диссеминации и риска формирования отдаленных метастазов, особенно при уровне ПСА более 28 нг/мл.

4. После хирургических вмешательств на предстательной железе рекомендуется ОТ-ПЦР исследование крови для своевременного выявления гематогенной диссеминации клеток рака простаты.

5. При динамическом наблюдении больных РПЖ, в том числе на фоне применения гормональной терапии, рекомендуется проводить повторные ОТ-ПЦР для контроля за процессом диссеминации.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Аляев IO Г, Асламазов Э Г, Зезеров Е Г, Забежинская О М Обратно транскриптазная полимеразная цепная реакция в диагностике метастазов рака предстательной железы // X Российский съезд урологов (Москва, 1-3 октября 2002) -Москва,2002 -С383-384

2 Забежинская О М, Асламазов Э Г, Зезеров Е Г, Северин Е С. Выявление микрометастазов рака предстательной железы с помощью обратно транскриптазной полимеразной цепной реакции // III Съезд биохимического общества - Санкт-Петербург, 2002.-С. 157

3 Забежинская О М, Асламазов Э Г., Зезеров Е Г Диагностика микрометастазов рака предстательной железы с помощью обратно транскриптазной полимеразной цепной реакции // Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении Научно-практический симпозиум в рамках Международной конференции «Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины».-Москва, 2002 -С 152-155

4 Забежинская О М, Асламазов Э Г, Глухов А И, Аляев Ю Г, Зезеров Е Г., Белушкина Н Н, Северин Е С Выявление микрометастазов рака предстательной железы с помощью совмещенных реакций обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии - №3 - 2002. - С 28-32

5 Аляев Ю Г , Асламазов Э Г, Северин Е.С., Зезеров Е Г., Забежинская О М. Обратно транскриптазная полимеразная цепная реакция в диагностике микрометастазов при раке предстательной железы// Андрология и генитальная хирургия. -№3-4 -2003 -С.10-18

6 Забежинская О М., Асламазов Э Г, Зезеров Е.Г Обратно транскриптазная полимеразная цепная реакция в оценке возможности гематогенной диссеминации опухолевых клеток при биопсии простаты // Актуальные вопросы онкоурологии. Заболевания предстательной железы. Здравоохранение Башкортостана. Специальный выпуск №3,2003 - С.90-92

7. Асламазов ЭГ, Забежинская О.М, Зезеров ЕГ., Северин ЕС Диагностика микрометастазов рака предстательной железы (РПЖ) методом обратно транскриптазной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) // Онкологическая урология от научных исследований к клинической практике (современные возможности диагностики и лечения опухолей предстательной железы, мочевого пузыря и почки) конференция -Москва, 2004. -С 50-51

8 Забежинская О М Исследование влияния врачебных манипуляций на предстательной железе на развитие гематогенной диссеминации рака простаты // Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины III конференция молодых ученых с международным участием - Москва, 2004 - С 327-328

9 Зезеров Е Г, Северин Е С, Аляев Ю Г., Коваленко Н А, Асламазов Э Г., Винаров А 3, Лесничук С А, Спиричев В Б, Безруков Е.А., Барашков Г К., Бутнару Д В, Курынин Р.В, Забежинская О М, Бекетова Н А, Поляковский К А Некоторые молекулярно-биологические маркеры рака предстательной железы (РПЖ) и простатической интраэпителиальной неоплазии (ПИН) // Молекулярная медицина и биобезопасность' II Международная конференция. - Москва, 2005 - С. 138-139

10. Зезеров Е Г., Коваленко Н А, Забежинская О М, Лесничук С А, Курынин Р.В., Асламазов ЭГ, Винаров A3., Безруков ЕА, Поляковский К А, Бутнару ДВ., Спиричев В Б, Бекетова Н А, Переверзева О.Г., Попова О.Н, Барашков Г.К., Зайцева Л И, Глухов А И,Белушкина Н Н Аляев Ю Г. Изучение клинической ценности определения активности теломеразы, ДНК-плоидности, содержания в крови витаминов, микроэлементов и мРНК-продуцирующих клеток для диагностики простатической интраэпителиальной неоплазии, рака предстательной железы и его микрометастазов // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - №3. - 2005 - С.44-54.

11 Аляев Ю Г, Асламазов Э Г, Северин Е С, Зезеров Е Г, Забежинская О М Возможна ли диссеминация раковых клеток при манипуляциях на пораженной раком предстательной железе? // Материалы XI съезда урологов России (Москва, 6-8 ноября 2007) -Москва,2007 -С92-94

12 Аляев Ю Г, Асламазов Э Г., Северин Е С., Зезеров Е.Г, Забежинская О М Выявление гематогенных микрометастазов рака простаты с помощью обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции, специфичной мРНК ПСА // Материалы XI съезда урологов России (Москва, 6-8 ноября 2007) - Москва, 2007 - С.94-95

Подписано в печать Об 09.2008 г

Печать трафаретная

Заказ № 904 Тираж: 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (499) 788-78-56 www autoreferat ru

Актуальность проблемы. Рак предстательной железы (РПЖ) относится к числу наиболее значимых и распространенных заболеваний нашего времени. Среди причин смерти мужчин от опухолей, РПЖ занимает второе место после рака легких [18]. Настораживающей является выраженная тенденция роста заболеваемости во многих странах, в том числе и России. Одновременно отмечается рост смертнос ти от этой болезни [1].

Для РПЖ характерно раннее метастаз11ровапие, чаще всего гематогенным путем в кости таза и позвоночник. Применяемые методики отбора больных, включающие пальцевое ректальное исследование, определение простатического специфического антигена (ПСА), трансректальное ультразвуковое исследование простаты, пункционную биопсию с гистологическим исследованием и определением степени злокачественности по Глиссону, в большом числе наблюдений не позволяют адекватно оценить стадию заболевания и биологический потенциал рака простаты, характеризующего способность опухоли к метастазированию. Раннее выявление процесса диссемынации её необходимо для правильного выбора лечебной тактики, в том числе при отборе пациентов на радикальное хирургическое лечение, при решении вопроса о назначении адъювантной терашш до и после него. Также это важно для мониторинга состояния больных.

С 1992 года разрабатывается методика применения обратно траискриптазной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) для определения циркулирующих в крови клеток опухоли предстательной железы, основанная на определении мРНК простатического специфического антигена [118]. В зарубежной литературе предложено называть обнаруженные в крови раковые клетки солидных опухолей гематогенными микрометасгазами [133]. Проведены исследования, подтверждающие возможность использования её как для предоперационной диагностики стадии процесса, так и послеоперационного выявления рецидива [98]. Имеются данные о применении реакции для первичной диагностики РПЖ [37]. Предложено использовать данную методику для изучения возможности гематогенной диссеминации клеток рака простаты после лечебно-диагностических процедур, проводимых на предстательной железе [39]. В России систематические исследования в этой области не проводились. Результаты опубликованных зарубежных исследований противоречивы. Для практического применения данной методики клиницистами необходимо продолжить исследования в этой области.

Целью настоящего исследования является изучение клинического значения выявления клеток рака простаты в периферической крови с помощью ОТ-ПЦР, специфичной мРНК ПСА, а также исследование возможности гематогенной диссеминацни при проведении лечебно-диагностических манипуляций на предстательной железе. Нами сформулированы следующие задачи исследования: провести экспериментальный анализ и оптимизацию имеющихся методик ПСА-специфичной ОТ-ПЦР периферической крови для использования их при дальнейших клинических исследованиях; изучить чувствительность и специфичность выбранного метода и взаимосвязь результатов ОТ-ПЦР с традиционными диагностическими и прогностическими критериями при исследовании пациентов без заболеваний простаты, с фоновыми и предраковыми заболеваниями, а также РПЖ; сопоставить динамику изменения результатов ОТ-ПЦР крови и уровня ПСА на фоне гормонального лечения и без него при динамическом наблюдении больных РПЖ; провести анализ влияния лечебно-диагностических процедур (биопсии простаты, массажа простаты, радикальной простатэктомии, трансуретральной резекции простаты) па результат ОТ-ПЦР исследуемых пациентов.

Научная новизна. Впервые в России проведено исследование по выявлению циркулирующих в крови клеток рака простаты с помощью ОТ-ПЦР для мРНК ПСА. Проведена оптимизация и анализ чувствительности нескольких методик ОТ-ПЦР с применением четырех групп ПСА-специфичных праймеров. Установлено, что выбранная методика обладает достаточно высокой чувствительностью и специфичностью, является сравнительно недорогостоющей и технически доступной.

На клиническом материале показана высокая чувствительность и специфичность метода, взаимосвязь его результатов с уровепем ПСА, степенью дифференцировки первичной опухоли, её размером, наличием поражения регионарных лимфатических узлов и отдаленных метастазов.

Установлена возможность выявления циркулирующих в крови клеток рака простаты с помощью ОТ-ПЦР у пациентов с отсутствием метастазов по результатам традиционных методов исследования.

При обследовании пациентов с подозрением на рак простаты установлена возможность попадания простатических клеток в кровеносное русло при простатической интраэпителиалыюй неоплазии высокой степени (ПИН-2).

Впервые продемонстрирована возможность гематогенной диссеминации после массажа простаты, а также после биопсии простаты, радикальной простатэктомии (РПЭ), трансуретральной резекции простаты (ТУР) у пациентов с ПИН-2 и раковой трансформацией.

Практическая ценность работы. Апробирована и оптимизирована высоко чувствительная и специфичная методика выявления циркулирующих в крови клеток рака простаты с помощью ОТ-ПЦР, позволяющая установить процесс гематогенной диссеминации в более ранние сроки по сравнению с традиционными методами диагностики метастазов. Результаты исследования могут использоваться для индивидуальной оценки метастатического потенциала опухоли а также риска развития РПЖ при наличии ПИН-2. Показана возможность временной гематогенной диссеминации после проведения биопсии простаты, ТУР, масажа простаты и радикальной простатэктомии, что является обоснованием для более строгих показаний при планировании подобных процедур.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на X Российском съезде урологов (Москва, 2002); III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002); Научно-практическом симпозиуме «Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении» в рамках Международной конференции «Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины» (Москва, 2002); конференции «Онкологическая урология: от научных исследований к клинической практике (современные возможности диагностики и лечения опухолей предстательной железы, мочевого пузыря и почки» (Москва, 2004); III конференции молодых ученых с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2004); II Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2005); XI съезде Российских урологов (Москва, 2007), а также неоднократно обсуждались на научно-практических конференциях кафедры биохимии и урологии ММА им. И.М.Сеченова. Апробация работы состоялась на совместном заседании кафедры биохимии ММА им. И.М.Сеченова и кафедры урологии ММА им. И.М.Сеченова ().

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ.

выводы

1 .Выбранная и оптимизированная методика ПСА-специфичной ОТ-ПЦР крови обладает высокой чувствительностью в опытах со смесью культуры клеток РПЖ и мононуклеаров крови (1:106).

2. У пациентов без патологии простаты отрицательные результаты ОТ-ПЦР отмечены в 96,3% наблюдений, что свидетельствует о высокой специфичности метода.

3. В группе пациентов с фоновыми и предраковыми заболеваниями простаты положительные результаты ОТ-ПЦР выявлены в 23% наблюдений у больных с уровнем ПСА 8 нг/мл и выше. Это свидетельствует о возможности попадания простатических клеток в кровеносное русло уже при развитии диспластических изменений (ПИН-2).

4. Установлена корреляция положительных результатов ОТ-ПЦР у больных раком простаты с другими диагностическими критериями (в особенности с уровнем ПСА более 28 нг/мл и размером первичной опухоли Т3^), что указывает на возможность применения ОТ-ПЦР для установления гематогенной диссеминации ракового процесса.

5. В ряде наблюдений у больных РПЖ положительные результаты ОТ-ПЦР предшествовали клиническому выявлению отдаленных метастазов.

6. Массаж предстательной железы, РПЭ, ТУР и биопсия простаты могут стимулировать диссеминацию простатических клеток в кровеносное русло у пациентов с предраковыми заболеваниями простаты и РПЖ. Наибольшая частота такой диссеминации отмечена при биопсии простаты и ТУР у больных РПЖ. Повторные ОТ-ПЦР указывают на временный характер такой диссеминации.

7. Повторные ОТ-ПЦР крови позволяют мониторировать процесс гематогенной диссеминации у больных с предраковыми заболеваниями и РПЖ, в том числе на фоне гормонального лечения. Взаимосвязь между динамикой ОТ-ПЦР и динамикой ПСА в большинстве наблюдений не выявлена.

8. Не все попавшие в кровь раковые клетки выживают и формируют метастатический очаг, однако их наличие в крови (положительная ОТ-ПЦР) указывает на высокий метастатический потенциал опухоли. Для выявления прогностического значения этого показателя показаны повторные исследования с длительным сроком наблюдения больных.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Описанная методика ПСА-специфичиой ОТ-ПЦР рекомендована для исследования процесса гематогенного микрометастазирования рака простаты.

2. При фоновых и предраковых заболеваниях простаты у больных с ПСА более 8 нг/мл рекомендуется проведение ОТ-ПЦР крови для оценки риска развития РПЖ и диссеминации простатических клеток.

3. У больных РПЖ с невыясненным наличием отдаленных метастазов, а также больных без отдаленных метастазов с опухолью стадии Тз4 рекомендуется проведение ОТ-ПЦР для раннего выявления диссеминации и риска формирования отдаленных метастазов, особенно при уровне ПСА более 28 нг/мл.

4. В связи с риском временной гематогенной диссеминации простатических клеток вследствие проведения биопсии простаты рекомендуется проводить это вмешательство по строгим показаниям.

5. После хирургических вмешательств на предстательной железе рекомендуется ОТ-ПЦР исследование крови для своевременного выявления гематогенной диссеминации клеток рака простаты.

6. При динамическом наблюдении больных РПЖ, в том числе на фоне применения гормональной терапии, рекомендуется проводить повторные ОТ-ПЦР для контроля за процессом диссеминации.