Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Оценка инфицированности ткани предстательной железы вирусами семейства Herpesviridae и папилломы человека при раке предстательной железы

На правах рукописи

САМСОНОВ Роман Борисович

Оценка инфицированности ткани предстательной железы вирусами семейства Негрезуігісіае и папилломы человека при раке предстательной

железы

14.01.12 - онкология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

11 АПР 2013

Санкт-Петербург

2013

005051645

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский научный центр радиологии и хирургических технологий» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: доктор биологических наук Евтушенко Владимир Иванович

Официальные оппоненты:

Беспалов Владимир Григорьевич, доктор медицинских наук, академик МАНЭБ, научно-исследовательский институт онкологии имени H.H. Петрова, руководитель лаборатории химиопрофилактики рака и онкофармакологии

Дмитриев Александр Валентинович, доктор биологических наук, научно-исследовательский институт экспериментальной медицины, руководитель лаборатории функциональной геномики и протеомики микроорганизмов

Ведущая организация: ГБОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Минздрава России

Защита состоится «28» мая 2013г. в 14 часов

на заседании диссертационного совета Д 208.052.01 Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт онкологии имени H.H. Петрова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 197758, Санкт-Петербург, Песочный, ул. Ленинградская, д.68.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ онкологии им. Н.Н.Петрова» Минздрава России по адресу 197758, Санкт-Петербург, Песочный, ул. Ленинградская, 68

Автореферат разослан «25» марта 2013 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Бахидзе Елена Вилльевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Рак предстательной железы (РПЖ) занимает третье после рака легких и кожи место по частоте заболеваемости и четвертое (после рака легких, опухолей желудка и мочевыводящей системы) по онкологической смертности у мужчин. В частности, в Санкт-Петербурге РПЖ занимает второе место по заболеваемости среди всех злокачественных опухолей у мужчин, а в динамике показателей смертности - первое. В динамике за 10 лет с 2000 по 2010 годы заболеваемость РПЖ растет, и в 2010 году она составила 15,6 на 100 тыс. мужского населения, тогда как в 2000 году это показатель был равен 9,8 (Чиссов В.П., Старинский В.В., Петрова Г.В. 2009). РПЖ является заболеванием сложной этиологии, молекулярно-биологические механизмы происхождения которого еще недостаточно изучены на сегодняшний день. На его возникновение и течение сильно влияют как факторы генетической предрасположенности, так и факторы окружающей среды. Предстательная железа является резервуаром для инфекции различной этиологии, в том числе и вирусной. Несмотря на длительный период с момента формулирования вирусной теории канцерогенеза отечественным ученым Зильбером Л.А. (1968), роль вирусов в этиологии и развитии онкологических заболеваний остается не до конца выясненной.

Многие вирусы, инфицирующие человеческие ткани, обладают онкогенным и онкомодулирующим эффектами. Значительная доля таких вирусов относится к семействам Негре5Ушс1ае и Рароуаутс1ае. В данном контексте изучение инфицированности ткани ПЖ вирусами этих семейств позволит дать оценку их возможному вкладу в процесс канцерогенеза предстательной железы, а также послужить основой для разработки новых прогностических и терапевтических подходов.

В качестве представителей указанных выше вирусных семейств для изучения инфицированности ткани ПЖ были выбраны цитомегаловирус

человека (HCMV), вирус Эппштейна-Барр (EBV), вирус герпеса человека 8-го типа (HHV8) и папилломавирусы (HPV) человека 16-го и 18-го типов.

Папилломавирус человека является наиболее широко изученным патогеном в исследованиях по определению возможной инфекционной природы РПЖ. Это связано с тем, что HPV является главным этиологическим агентом в возникновении рака шейки матки, а также ряда злокачественных новообразований аногенитальной локализации: вульвы, влагалища, ануса и полового члена (Guiliano et al., 2008).

Некоторые вирусы семейства Herpesviridae представляют интерес в качестве возможных инициаторов карциногенеза ПЖ. Одним из них является HCMV. Этот вирус, как и HPV, является инфекционным агентом, передающимся половым путем и, как следствие, может проникать в ткань ПЖ. Показано, что он обладает рядом онкогенных свойств in vitro', усиливает мутагенез, ускоряет прохождение клеток по клеточному циклу, увеличивает клеточную инвазивность (Samanta et al., 2003). В отличие от EBV и HHV8, HCMV ранее не был ассоциирован ни с одним злокачественным новообразованием в человеческом организме, но в последнее время HCMV рассматривается в качестве онкомодулятора, в том числе и процессов малигнизации при РПЖ.

Тот факт, что HHV8 является этиологическим агентом саркомы Капоши, а также факт его обнаружения в ткани ПЖ (Monini et al., 1996) побудили ряд исследователей к изучению возможной роли этого вируса в карциногенезе ПЖ. Однако, экспериментальные данные, которые были получены различными группами исследователей, работавших в этом направлении, имеют противоречивый характер и нуждаются в подтверждении.

Вирус Эппштейна-Барр (EBV) - этиологический агент лимфомы Беркитта, был впервые обнаружен Grinstein с соавторами в клетках карциномы простаты. Авторами было показано его наличие в фокусах интраэпителиальной неоплазии ПЖ, что позволяет предполагать его

определённую роль в развитии РПЖ. В связи с этим EBV был также включен в исследование.

Таким образом, результаты данного диссертационного исследования могут внести определенную ясность в во многом противоречивую картину взаимодействия вирусов с тканью ПЖ и их участия в инициации и развитии онкологического процесса и дополнить данные представленные другими исследователями ранее.

Цель исследования:

Целью настоящей работы является изучение инфицированности ткани предстательной железы вирусами семейства Herpesviridae (CMV, EBV, HHV-8) и папилломавирусом (HPV) у больных раком предстательной железы на ранних стадиях развития процесса.

Задачи, решаемые в работе:

1) Оценить инфицированность ткани ПЖ вирусами HCMV, EBV, HHV8 и HPV двумя независимыми методами - ПЦР и in situ гибридизацией.

2) Оценить распределение вирусов в опухолевых и прилегающих условно нормальных клетках предстательной железы.

3) Оценить распределение вирусов в клетках эпителия и стромы предстательной железы.

4) Сравнить инфицированность различными типами вирусов в зависимости от стадии РПЖ.

Научная новизна работы

Впервые на архивных образцах ткани ПЖ было проведено комплексное сравнение данных по инфицированное™ ПЖ четырьмя различными вирусами при помощи двух независимых методов - ПЦР и гибридизации in situ. Было выявлено некоторое отличие данных, полученных двумя этими методами, что свидетельствует о необходимости использования нескольких диагностических методик для получения более точных результатов

исследования. Методом гибридизации in situ было выявлено наличие вирусных ДНК не только в клетках железистого эпителия, но и в стромальных клетках. Апробация работы.

Результаты работы доложены на17 и 19 Международной конференциях «СПИД, рак и общественное здоровье», (г. С.-Петербург, 2008, 2010 ),6 и 7 Российских конференциях по фундаментальной онкологии «Петровские чтения» (Санкт-Петербург, 2010, 2011); 7 съезде онкологов России (Москва, 2009 ); VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2010» (Москва, 2010).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, из них - 6 в реферируемых журналах ВАК. Структура и объём диссертации.

Диссертация изложена на 103 страницах машинопечатного текста и состоит из введения, обзора литературы, глав материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения данных и выводов.

Диссертационное исследование выполнено с использованием оборудования ЦКП «Биотехнологический центр исследования экспрессии генома» ФГБУ РНЦРХТ, при финансовой поддержке Минобрнауки России в рамках государственного контракта № 16.552.11.7021.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика исследуемого материала. Исследование проведено на архивных образцах ткани ПЖ (парафиновые блоки) 30 пациентов в возрасте от 55 до 75 лет с диагнозом РПЖ. Материал был получен в ходе операций радикальной простатэктомии в клинике ФГБУ РНЦРХТ. Все операции выполнялись одним хирургом и по одной методике. Средний возраст пациентов на момент операции составлял 65 лет. Распределение пациентов

по возрасту и гистологически верифицированным стадиям опухоли представлено в таблицах 1 и 2. Гистологически препараты были охарактеризованы на отделении патоморфологии ФГБУ РНЦРХТ. Суспензии клеток, содержащих ДНК HCMV были предоставлены научно-производственной лабораторией по разработке и производству препаратов для диагностики инфекционных заболеваний человека и животных ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора. Суспензии клеток, содержащих ДНК EBV и HHV8 были предоставлены лабораторией вирусного канцерогенеза НИИ канцерогенеза ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН. Выделение ДНК из архивных образцов. Процедуру осуществляли по протоколу, разработанному в ФГУ РНЦРХТ (Евтушенко В.И., Школьник М.И., Андабеков Т.Т. патент № 2351652 от 03 июля 2007г.). Из архивных образцов ткани ПЖ, заключенных в парафин, приготавливали срезы толщиной 20 мкм, помещали срез в пластиковую пробирку с крышкой объема 1,5 мл типа Eppendorf, добавляли 100 мкл 0,5% Tween 20 и прогревали 15 минут при 95 С, далее добавляли 50 мкг фермента протеиназа К (Fermentas) и оставляли на 3 часа при 55°С, после этого добавляли в пробирку 100 мкл 5% Chelex 100, 5 мкл IM Tris (pH 8,5), 5 мкл 0,5М EDTA (pH 8,0), прогревали смесь 15 минут при 100°С, центрифугировали 15 минут при 10500 об/мин, охлаждали 5 минут на льду и удаляли из пробирки парафиновый диск. К жидкости добавляли 100 мкл хлороформа и прогревали 10 минут при 45ПС, центрифугировали 15 минут при 10500 об/мин, переносили надосадочную жидкость в новую пробирку, добавляли к ней 5 мкл 5М NaCl, ЮОмкл 96% этанола и оставляли на ночь при -20°С. Смесь центрифугиировали 20 минут при +4ПС; отбирали жидкую фазу; к осадку добавляли 1 мл 80% С2Н5ОН и центрифугировали 20 минут при +4°С, отбирали жидкую фазу, осадок высушивали и растворяли в 30 мкл Н20. Качество полученной ДНК оценивали методом ПЦР с праймерами к гену "домашнего хозяйства" - бета-актнну.

Выделение вирусных ДНК из суспензий клеток. Для выделения вирусных ДНК были использованы суспензии клеток.

Выделение проводили набором AXYPREP BLOOD GENOMIC DNA MINIPREP KIT (Axygen biosciences, США) в соответствии с прилагаемой к набору инструкцией.

Полимеразная цепная реакция. ПЦР проводили в амплификаторе GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, США).

ПЦР использовали для проверки качества ДНК, выделенной из парафиновых блоков, количественного нормирования образцов ДНК, оценки инфицированности ткани ПЖ исследуемыми вирусами, а также для наработки фрагментов вирусных ДНК (используемых в качестве гибридизационных зондов) в количестве достаточном для последующих этапов лигирования и клонирования, с последующим отбором бактериальных клонов, содержащих вставку соответствующей вирусной ДНК, наработки клонированных вирусных фрагментов.

Все реакции проводили с помощью коммерческого набора по протоколу компании «Литех» в объёме 25 мкл. В состав реакционной смеси входили: 2,5 мкл 10х буфера («Литех»®, Москва) для Taq-полимеразы, 1,52,5 мМ MgCl2, 0,2 мМ каждого из четырех дНТФ, 0,1 мкМ каждого праймера, 1 ед. Taq-полимеразы («Литех»®, Москва), 200 нг исследуемой ДНК, dH20 до конечного объема 25 мкл.

В каждой серии проводимых реакций присутствовал положительный и отрицательный контроль для исключения ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Во всех экспериментах использовали свежеприготовленную деионизованную воду с удельным сопротивлением 18 Мом/см, полученную на установке MilliQ (Millipore, США). Праймеры, использованные в работе. Для подбора последовательностей праймеров (за исключением канонических последовательностей М13 и последовательностей праймеров для CMV, приведенных в статье Jenkins С. et

al. (2003)) использовали програмное обеспечение Oligo 5.0 и Vector NTI

8

Advance 10 (Invitrogen). В качестве исходных данных для поиска использовались фрагменты последовательностей ДНК указанных выше вирусов, представленные в базе данных GeneBank (ncbi.nlrn.nih.gov). Электрофорез. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК, выделение фрагментов ДНК из легкоплавкой агарозы проводили в соответствии с методиками, изложенными в руководстве по молекулярному клонированию (Sambrook et al., 1989).

Лигирование фрагментов вирусных ДНК в плазмидный вектор. Клонирование. Лигирование ПЦР-фрагментов вирусных ДНК проводили с использованием набора InstaClone PCR Cloning Kit (Fermentas) в векторе pTZ57R/T для TA-клонирования в соответствии с инструкцией производителя.

Приготовление электрокомпетентных клеток E.coli. Трансформация бактериальных клеток плазмидными конструктами, содержащими вставку вирусной ДНК. Бактериальная трансформация штамма E.coli TOPI OF' проводилась на приборе The Electroporator II (Invitrogen) в кювете со щелью 1 мм в соответствии с инструкцией производителя. Приготовление электрокомпетентных клеток: наращивание, отмывки, консервация и хранение осуществлялось по протоколу компании Invitrogen. Пробирки с электрокомпетентными клетками хранили при -70°С.

Наращивание и выделение плазмид со вставкой. Трансфецированную плазмидой pTZ57R/T культуру бактериальных клеток E.coli TOPI OF' высевали на чашки с твердой питательной средой LB и оставляли расти на ночь при +37°С. Отбор клонов, содержащих необходимую вставку, из общего пула клеток использованных для трансфекции, проводили методом летальной селекции на чашках Петрн с твердой средой LB, содержащей ампицилин в концентрации 100 мкг/мл. Отобранные колонии наращивали в 5 миллилитрах питательной среды LB в течение ночи. Один миллилитр культуры сохраняли в глицерине, из оставшейся культуры выделяли

плазмиду со вставкой. Процедуру проводили с помощью набора "Mini-prep" от Axygene по протоколу компании.

Приготовление гибридизационных ДНК-зондов. Для получения фрагментов вирусных ДНК, используемых в качестве зондов в препаративных количествах, проводили ПЦР на матрице плазмид, содержащих соответствующую вставку, с использованием пар ген-специфических праймеров. Продукты реакций наносили в лунку геля из легкоплавкой агарозы, разделяли электрофорезом и проводили их выделение. Мечение проводили в объеме 20 мкл. В реакцию мечения брали по 200 нг ДНК, 2 мкл 10-кратного реакционного буфера (Stratagene), 4 мкл 6- или 9-мерного статистического праймера (Stratagene), 2 мкл смеси дезоксинуклеотидов, меченных дигоксигенином (Roche), 1 мкл фрагмента Кленова и доводили до конечного объема реакции водой. ДНК смешивали с водой и денатурировали 5 минут при 95°С, центрифугировали и остужали на льду, добавляли остальные компоненты реакции и оставляли на ночь при +37°С. По окончании реакции несвязавшиеся нуклеотиды удаляли из реакционной смеси осаждением этиловым спиртом и проводили проверку эффективности мечения по стандартной методике колориметрической детекции на нейлоновых мембранах (Boehringer-Mannheim).

Приготовление гистологических срезов. Предварительно охлажденные парафиновые блоки закрепляли в струбцине санного микротома, выставляли требуемую толщину среза и делали по 10 срезов с каждого блока. Срезы снимали с ножа микротома мягкой беличьей кистью и переносили в водяную баню нагретую до +30-35°С и оставляли до полного расправления среза. Расправленные срезы помещали на стекла, обработанные 0,01% раствором поли-Ь-лизина и оставляли сушиться в воздушном термостате при +37°С для удаления остаточной влаги и прочного закрепления гистологического материала на стекле.

In situ гибридизация. Процедуру проводили в соответствии с методикой, изложенной в руководстве по нерадиоактивной in situ гибридизации

10

компании Бёрингер-Маннхейм [Nonradioactive In Situ Hybridization Application Manual,second edition, 1996, Biochemica, Germany, p. 122-125]. Световая микроскопия и фотодокументация гистологических препаратов. Световая микроскопия осуществлялась на микроскопе Leica (Leica Microsystems GmbH) на отделении патоморфологии ФГБУ РНЦРХТ. Фотодокументация гистологических препаратов проводилась в центре коллективного пользования кафедры генетики биолого-почвенного факультета Санкт-Петербургского Государственного Университета. Фотодокументацию и анализ электрофореграмм проводили в проходящем ультафиолетовом свете с длиной волны 312 нм (трансиллюминатор ЕСХ-15.М, Vibler Lourmat) проводили с помощью цифровой системы EDAS 290 и программы ID Image Analysis version 3.5 (Kodak Digital Science). Статистическая обработка данных. Для статистического анализа данной работы было использовано стандартное программное обеспечение, пакет программ Microsoft Office 2003 (AtteStat) и STATISTICA версия 6.0, наряду с методами частотной статистики для проверки случайности или неслучайности обнаруженных различий был использован метод соотношения правдоподобий - фактор Байеса (В), который не зависит от факторов несвязанных с данными и является отношением правдоподобий нулевой гипотезы (о том что различия случайны) и альтернативной гипотезы о неслучайности обнаруженных различий.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ Анализ инфицированности ткани ПЖ методом полимеразной цепной реакции. В качестве объекта исследования были отобраны 30 архивных образцов ткани предстательной железы пациентов в возрасте 55 - 75 лет с диагнозом рак предстательной железы. Образцы были разделены на 3 группы в соответствии со стадией РПЖ, гистологически установленной для каждого пациента: стадия Т2а - 10 образцов, Т2Ь - 12 образцов, Т2с - 8 образцов. Из блоков парафинизированной ткани была выделена ДНК и проведен ее анализ методом ПЦР с праймерами к последовательностям геномов следующих

11

вирусов: HCMV, EBV, HHV8 и HPV 16-го и 18-го типов (последовательности праймеров приведены в таблице 4).

В целом, по результатам ПЦР-анализа последовательности ДНК HCMV были обнаружены у 26 пациентов (87%), EBV - у 16 пациентов (53%), при этом в 15 из 16 случаев была выявлена одновременная инфицированность HCMV и EBV. Лишь один образец ткани был ПЦР-положителен по EBV и ПЦР-отрицателен по HCMV. ДНК вирусов HHV8, HPV 16 и HPV18 ни в одном из 30 образцов обнаружена не была (таблица 5, рисунок 1). Таблица 5. Результаты ПЦР на матрице ДНК, выделенной из парафиновых блоков.

HCMV EBV

1 + +

2 - -

3 + +

4 + +

5 + -

6 + +

7 + -

8 + +

9 + -

10 + +

11 + -

12 + +

13 + -

14 - +

15 + -

HCMV EBV

16 + +

17 + -

18 + -

19 + +

20 + -

21 + +

22 - -

23 + +

24 + +

25 + +

26 - -

27 + +

28 + +

29 + -

30 + -

2 ! ) 4 S I) 6 IS I! S К) 13 ? 9 S.J IS 24 10 21 Я !4 25- » 3.8 24 !8 Ж 29 S2

Рисунок 1. Результаты ПЦР на матрице ДНК, выделенной из парафиновых блоков. А - результаты ПЦР с праймерами к НСМУ, Б - - результаты ПЦР с праймерами к ЕВУ, В - результаты ПЦР с праймерами к гену (3-актина человека. Справа - размер соответствующего вирус-специфического гена в парах нуклеотидов.

При разделении пациентов на группы в зависимости от стадии заболевания, наблюдалась следующая картина инфицированности: в группе образцов от пациентов с РПЖ стадии Т2а у 5-и пациентов был обнаружен только HCMV, у 3-х - совместно HCMV и EBV и 2 оказались ПЦР-отрицательными по всем 5-и типам вирусов. Инфицированность HCMV и EBV в этой группе составила 80% и 30%, соответственно.

В группе образцов от пациентов с РПЖ стадии Т2Ь у 5-и пациентов был обнаружен только HCMV, у 5-и - совместно HCMV и EBV, у 1-го - только EBV, и 1 был отрицателен по всем 5-и типам вирусов. Инфицированность HCMV составила 83,3%, инфицированность EBV - 50%.

В группе образцов от пациентов с РПЖ стадии Т2с у 7-и из 8-и пациентов наблюдалась совместная инфицированность вирусами HCMV и EBV, и один пациент был инфицирован только HCMV. Таким образом, в этой группе инфицированность HCMV составила 100% и 87,5% для EBV.

ДНК вирусов HHV8, HPV 16 и HPV 18 не была обнаружена ни в одном из 30 исследованных образцов.

Таблица 6. Результаты детекции вирусных ДНК методом ПЦР в препаратах ткани ПЖ больных РПЖ, находящихся на разных стадиях заболевания.

T2a T2b Т2с

Кол-во % Кол-во % Кол-во %

HCMV 8 80 10 83,3 8 100

EBV 3 30 6 50 7 87,5

HCMV+EBV 3 30 5 41,6 7 87,5

Использование критерия Фримана-Холтона для анализа данных, приведенных в таблице 6, позволило выявить статистически достоверные различия в инфицированности только для EBV (Р=0,04), т.е. более поздние стадии заболевания характеризуются большим количеством пациентов, инфицированных EBV. Для HCMV различия оказались недостоверны (Р=0,52). По представленным в таблице 6 данным был рассчитан фактор Байеса, для HCMV В0|=2,43, для EBV В0|=0,44, т.е. для HCMV нулевая

гипотеза является в 2,43 вероятнее альтернативной, а для EBV вероятность альтернативной гипотезы по сравнению с нулевой больше в 2,3 раза. Различия в совместной инфицированности оказались статистически убедительными, несмотря на небольшие объемы выборок (Р=0,042, В0|=0,35). Таким образом, для HCMV мы имеем умеренно убедительные доказательства случайности различий, а для EBV - умеренно убедительные доказательства их неслучайности, и можем предположить роль совместной инфекции в прогрессии РПЖ.

Анализ инфицированности ткани ПЖ методом гибридизации in situ. Для той же выборки больных, с целью получения дополнительной информации по наличию и распределению вирусов в клетках, был проведён анализ инфицированности методом гибридизации in situ. Особенности морфологии РПЖ не позволяют достоверно отделить опухолевую ткань от нормальной, поэтому использование полимеразной цепной реакции позволяет судить только о наличии или отсутствии вируса в органе в целом. Использование метода in situ гибридизации позволяет установить локализацию сигналов в ткани по критериям "железистый эпителий/стромальные клетки", "опухолевые/ нормальные клетки", а также сравнить уровень интенсивности сигнала в разных образцах. В качестве гибридизационных зондов использовали меченные дигоксигенином ПЦР-амплифицированные фрагменты ДНК исследуемых вирусов. В случае HPV использовался комбинированный зонд из смеси меченых фрагментов HPV 16-го и 18-го типов, поэтому в данном разделе описания результатов работы они указываются как HPV. Секвенирование используемых в исследовании ПЦР-амплифицированных фрагментов вирусных ДНК (проводилось на оборудовании ЦКП «Таксон», работающем на базе Зоологического института РАН) показало 100% гомологию их последовательностей с соответствующими вирусными геномами, представленными в GeneBank.

В целом, по результатам гибридизации in situ HCMV был обнаружен у 23

пациентов (77%), EBV - у 16 (54%), HHV8 - у 15 (50%), HPV - у 7 (23%).

14

Вирусы оказались представлены у разных пациентов в различных сочетаниях. Так, наличие всех 4-х типов вирусов одновременно было выявлено лишь у 3-х из 30-и пациентов, при этом РПЖ для них был стадирован как Т2с. Одновременная инфицированность 3-я вирусами была выявлена у 11-и пациентов, при этом вирусы встречались в следующих сочетаниях: HCMV, HHV8, HPV - 3 пациента, HCMV, EBV, HHV8 - 7 пациентов, EBV, HHV8, HPV - 1. Одновременная инфицированность 2-я вирусами была выявлена у 6-и пациентов: HCMV, EBV — 5 пациентов, HCMV, HHV-8 - 1 пациент. У 4-х пациентов был выявлен только HCMV. В образцах ткани 6-и пациентов ДНК ни одного из исследуемых вирусов обнаружена не была.

Таблица 7. Сопоставление данных, полученных по результатам ПЦР и in situ гибридизации.

Метод Инфицированность,%

HCMV EBV HHV8 HPV

ПЦР 87 53 0 0

Гибридизация 77 54 50 23

Как следует из таблицы 7, результаты исследования инфицированности значительно различаются в зависимости от примененного метода детекции. Проведение гибридизации позволило выявить большее разнообразие вирусов, чем при постановке ПЦР (этим методом HHV8 и HPV выявлены не были).

Образцы ткани ПЖ в исследуемой группе были инфицированы как частично - в ткани детектировались единичные сигналы, группы сигналов, так и тотально - соответствующие гибридизационные сигналы детектировались по всей площади образца(рис. № 2-5). Количественная представленность гибридизационных сигналов определялась визуально в условных единицах: "-" - отсутствие сигналов, "+" - очень мало, "++" - мало, "+++" - средне, " I I I Г' - много, "+++++" - очень много сигналов.

Рисунок 2. Гибридизация in situ гистологических срезов ткани простаты. Увеличение 100Х. А - зонд HCMV, Б -положительный контроль, В -отрицательный контроль. Стрелками показан гибридизационный сигнал.

/ /

/

/

Рисунок 3. Гибридизация in situ гистологических срезов ткани простаты. Увеличение 100Х. А - зонд EBV, Б -положительный контроль, В — отрицательный контроль. Стрелками показан гибридизационный сигнал.

Рисунок 4. Гибридизация in situ гистологических срезов ткани простаты. Увеличение 100Х. А - зонд HHV8, Б -положительный контроль, В -отрицательный контроль. Стрелками показан гибридизационный сигнал.

:::

11111 :::iVS!': х : xxl^x i Й-: К: ЙЩ'Хх х- v ' : : ■ ■■■■!*

mm-fßs A ¡J Щ ■■П ^МШШШММШШШШШИШ^шшшЩЯШёШМШ в

Рисунок 5. Гибридизация in situ гистологических срезов ткани простаты. Увеличение 100Х. А - зонд HPV, Б -положительный контроль, В отрицательный контроль. Стрелками показан гибридизационный сигнал.

Для всех вирусов гибридизационные сигналы выявлены как в железистом эпителии, так и в стромальных клетках, при этом инфицированными

оказались не только опухолевые клетки, но и клетки прилегающей условно нормальной ткани. Также стоит отметить, что в случае с НСМУ ни в одном из исследованных образцов гигантских клеток, характерных для стадии активного воспроизводства вируса обнаружено не было.

В группе образцов от пациентов с РПЖ стадии Т2а у 5-и пациентов был обнаружен НСМУ, а ЕВУ у 2-х, остальные пять образцов оказались отрицательными по всем четырем типам вирусов. Инфицированность НСМУ и ЕВУ в этой группе составила 50% и 20%, соответственно. Интенсивность гибридизационных сигналов варьировала от "-" до "+++" (Таблица 8).

Таблица 8. Количественная представленность вирусов, обнаруженных у пациентов группы Т2а. Э - железистый эпителий, С - строма.

№ пациента НСМУ EBV

э С э с

5 + + ++ ++

8 + +++ -

13 ++ -н- -

23 +++ + + -

29 ++ - -

Для тканей ПЖ пациентов группы Т2а по результатам гибридизации in situ, как и по результатам ПЦР, характерно одновременное наличие максимум двух типов вирусов - НСМУ и ЕВУ.

В группе образцов от пациентов с РПЖ стадии T2b НСМУ был обнаружен у 10-и пациентов, ЕВУ - у 8-и, HHV8 - у 7-и, HPV - у 3-х, один образец был отрицателен по всем типам вирусов. Инфицированность НСМУ составила 83,3%, ЕВУ - 66,7%, HHV8 - 58,3%, HPV - 25%. Интенсивность гибридизационных сигналов варьировала от "-" до "Mill" (Таблица 9).

Таблица 9. Количественная представленность вирусов, обнаруженных у пациентов группы Т2Ь. Э - железистый эпителий, С - строма.

№ пациента HCMV EBV HHV8 HPV

э с Э С Э С э с

1 ++ + + - - -

4 ++ - +++ - - -

9 + + - + + + -

11 ++ +++ - - +++++ - +++++

12 +++++ 1 1 1 1 + - - -

14 - + - + + + -

18 1 1 1 м - +++++ +++ +++ - -

21 - -

22 + + + + ++ ++ -

25 1 1 1 1 1 - ++ + + - -

30 ++ ++ + - + + -

В группе образцов от пациентов с РПЖ стадии Т2с HCMV и HHV8 были

выявлены в 8-и образцах, EBV и HPV в 6-и и 4-х образцах, соответственно. Таким образом, в этой группе инфицированность HCMV и HHV8 составила 100%, EBV - 75%, HPV - 50%. Интенсивность гибридизационных сигналов варьировала от "-" до "+++++" (Таблица 10).

Таблица 10. Количественная представленность вирусов, обнаруженных у

пациентов группы Т2с. Э - железистый эпителий, С - строма.

№ пациента HCMV EBV HHV8 HPV

э С э с э с э с

3 +++ - ++ - +++++ 1 1 1 1 1 -

6 + + - + +++++ +++++ -

10 +++ +++ - +++++ 1 1 1 1 1 -

19 1 1 1 1 1 +++++ - + - + -

20 +++++ +++ + 11 1 1 + +++ + - +

24 + + + - + + -

27 ++ ++ + + + - 1 1 1 1 -

29 +++++ + +

На стадиях Т2Ь и Т2с в ткани ПЖ все 4 типа рассматриваемых в

исследовании вирусов были представлены в различных сочетаниях: Т2Ь: HCMV - 1 пациент, HCMV+EBV - 3, EBV+HHV8+HPV - 1, HCMV+HHV8+HPV - 2, HCMV+EBV+HHV8 - 4. Т2с: HCMV+HHV8 - 1 пациент, HCMV+HHV8+HPV - 1, HCMV+EBV+HHV8 - 3, HCMV+EBV+HHV8+HPV - 3. Необходимо отметить, что на стадии Т2с у всех 8-и пациентов наблюдалось одновременное присутствие HCMV и HHV8. Результаты детекции вирусных ДНК методом гибридизации in situ представлены в таблице 11.

Таблица 11. Результаты детекции вирусных ДНК методом in situ гибридизации в препаратах ткани ПЖ больных РПЖ, находящихся на разных стадиях заболевания.

T2a T2b Т2с

Кол-во % Кол-во % Кол-во %

HCMV 5 50 10 83,3 8 100

EBV 2 20 8 66,7 6 75

HHV8 0 0 7 58,3 8 100

HPV 0 0 3 25 4 50

Анализ данных, представленных в таблице 11, с использованием критерия Фримана-Холтона показал статистически достоверные различия в инфицированности для всех типов вирусов. Расчет фактора Байеса также подтвердил результаты, полученные методом частотной статистики (Таблица 12).

Таблица 12. Значения фактора Байеса и Р-значения: определение статистических различий в представленности вирусов на разных стадиях

РПЖ.

Тип вируса Р-значеиие Значение Вщ

HCMV 0,04 0,34

EBV 0,04 0,31

HHV8 0,003 0,0003

HPV 0,03 0,32

Из таблицы 11 видно, что для всех типов вирусов альтернативная гипотеза имеет большую силу: для HCMV альтернативная гипотеза в 2,9 раза сильнее нулевой, для EBV - в 3,22, для HPV - в 3,12 раза, а в случае HHV8 альтернативная гипотеза в 3300 раз сильнее нулевой.

Использование критерия знаков для общей совокупности исследованных образцов (вне зависимости от стадии заболевания) не выявило статистически достоверных различий в распределении "эпителий-строма" для всех рассмотренных в исследовании вирусов. Р-значение и фактор Байеса (указан в скобках) рассчитанные для данного критерия для HCMV были равны 0,98 (2,03), для EBV - 0,99 (1,37), для HHV8 - 0,98 (3,4) и для HPV - 0,89 (2,61).

Значение внутритканевой сегрегации вирусов не удалось подтвердить статистически и по результатам дисперсионного анализа (Р=0,6).

Для оценки вклада эпителиальной или стромальной локализации каждого из исследуемых вирусов в стадийность заболевания в зависимости от количества обнаруженного в эпителии/строме вируса были использованы критерий Манна-Уитни и метод дисперсионного анализа двухфакторных неравномерных комплексов. Использование критерия Манна-Уитни показало, что только для HHV8 количественные различия в эпителиальной локализации на стадиях Т2Ь-Т2с являются достоверными (Р=0,006, B0i—0,16). Результаты дисперсионного анализа продемонстрировали, что количество типов вирусов, обнаруживаемых в ткани ПЖ, и количественная представленность каждого вируса зависит от стадийности заболевания (Р=0,002 и Р=0,004, соответственно). С другой стороны, статистически достоверно и то, что стадия заболевания определяется количеством вирусов и количеством каждого вируса (Р=0,003 и Р=0,002, соответственно). Таким образом, можно утверждать, что более поздние стадии заболевания характеризуются большим типовым разнообразием вирусов и их количеством, выявляемым в ткани.

Сопоставление данных in situ гибридизации с показателем пятилетней безрецидивной выживаемости. В клинической практике для больных, которым была выполнена радикальная простатэктомия по поводу локализованного РПЖ, и живущих до настоящего времени, для оценки эффективности проведенного лечения применяют такой показатель, как пятилетняя безрецидивная выживаемость. В общей группе исследованных в работе пациентов, рецидив основного заболевания был обнаружен у 5-и пациентов из 30. Для 2 -х пациентов на момент проведения операции была установлена стадия Т2Ь и для 3-х — Т2с. По результатам ПЦР все они были положительны по HCMV, по результатам гибридизации in situ у 4-х пациентов (T2b - 1, Т2с - 3) были одновременно выявлены HCMV, EBV и HHV8, причем количество вирусов находилось в диапазоне от "+++" до

21

"Mill", еще у одного пациента (Т2Ь) был обнаружен только HCMV в количестве "+++++".

Выводы.

1) Показан высокий процент инфицированности ткани ПЖ у больных РПЖ вирусами семейства Herpesviridae и папилломавирусом: инфицированность цитомегаловирусом (HCMV) составила до 87%, вирусом Эппштейна-Барр (EBV) - 54%, вирусом герпеса 8-го типа (HHV8) - до 50%, папилломавирусом (HPV) - до 23%.

2) Сравнение двух независимых методов исследования - полимеразной цепной реакции и гибридизации in situ показало, что при использовании архивного материала гибридизация in situ позволяет выявить большее типовое разнообразие вирусов в ткани и получить более полную информацию об инфицированности ткани ПЖ.

3) В ткани ПЖ все исследованные вирусы были обнаружены как в опухолевом, так и нормальном эпителии, а также в стромальных клетках, при этом только для HHV8 было показано достоверное увеличение количества вируса в эпителии при переходе от Т2Ь к Т2с (¿?=0,006).

4) При переходе от стадии Т2а к стадии Т2с наблюдается как увеличение разнообразия вирусной инфекции, так и увеличение процента инфицированности (phcmv=0,04, pvm =0,04, punvs =0,003, /;Mpv=0,03).

5) Больные, имевшие в анамнезе рецидив РПЖ, по результатам обоих методов исследования были HCMV-положительны, по результатам гибридизации in situ у 4-х из 5-и пациентов с установленным фактом рецидива были одновременно выявлены HCMV, EBV и HHV8.

22

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1. Клочкова Т.Г., Самсонов Р.Б.. Евтушенко В.И. Изучение функциональной активности цитомегаловируса человека в клетках предстательной железы у больных раком и доброкачественной гиперплазией простаты. - Материалы 17-й международной конференции "СПИД, рак и общественное здоровье" Русский журнал "СПИД, рак и общественное здоровье". Том 12. №2(25). 2008.стр.23

2. Клочкова Т.Г., Андабеков Т.Т., Самсонов Р.Б.. Карелин М.И., Школьник М.И., Семёнов A.B., Виноградская Г.Р.,Евтушенко В.И. Анализ инфицированное™ предстательной железы цитомегаловирусом у больных раком и доброкачественной гиперплазией простаты. Медицинский академический журнал , 2008, т.8, N4, с.64 -70

3. Андабеков Т.Т., Клочкова Т.Г., Самсонов Р.Б.. Евтушенко В.И. Влияние цитомегаловирусной инфекции на эффективность лечения рака предстательной железы. Материалы VII съезда онкологов России, Москва, 29-30 октября 2009 г., т. 2, с. 88

4. Андабеков Т.Т., Клочкова Т.Г., Урбанский А.И., Самсонов Р.Б., Школьник М.И., Евтушенко В.И., Карелин М.И. Более низкая степень дифференцировки рака предстательной железы может быть связана с цитомегаловирусной инфекцией ткани простаты. - Вопросы онкологии, 2009, т.55, N2, с. 183 - 186

5. Клочкова Т.Г., Самсонов Р.Б.. Евтушенко В.И. Инфицированность ткани предстательной железы вирусами семейства Herpesviridae и HPV у больных раком предстательной железы - Материалы 19-й международной конференции "СПИД, рак и общественное здоровье" Русский журнал "СПИД, рак и общественное здоровье". Том 14. №1(29). 2010.стр.22

6. Р.Б. Самсонов. Т.Г. Клочкова, Т.Т. Андабеков, М.И. Школьник, М.И. Карелин, В.И. Евтушенко. Цитомегаловирусная инфекция ткани

предстательной железы у больных раком и доброкачественной

23

гиперплазией предстательной железы - Тезисы 6-й Российской конференции по фундаментальной онкологии. Вопросы онкологии, 2010, т.56, №2, с.39.

7. Самсонов Р.Б., Клочкова Т.Г., Евтушенко В.И. Диагностика вирусных инфекций при раке предстательной железы в ткани простаты. Сборник трудов VII всероссийской научно-практической конференции с международным участием. Том IV. Молекулярная диагностика-2010. 24-26 ноября 2010г.

8. Клочкова Т.Г., Самсонов Р.Б., Евтушенко В.И. Анализ полиморфизма G1358A в гене RNASEL и инфицированности ткани простаты цитомегаловирусом у больных раком и доброкачественной гиперплазией предстательной железы - Медицинская генетика, 2011, № 10, с. 11-12.

9. Клочкова Т.Г., Самсонов Р.Б., Евтушенко В.И. Высокая степень инфицированности цитомегаловирусом человека ткани предстательной железы у больных раком простаты. - Справочник врача общей практики, 2012, №9, с. 31-38

10. Самсонов Р.Б., Клочкова Т.Г., Евтушенко В.И. Поиск корреляции вирусной инфекции и стадийности рака предстательной железы. -Перспективы науки

11. Самсонов Р.Б., Клочкова Т.Г., Евтушенко В.И. Инфицировапность ткани предстательной железы вирусами семейства Herpesviridae и HPV у больных раком простаты. - Вопросы онкологии - в печати

Подписано в печать 22.03.2013. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 10481Ь.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в типографии Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.:(812)550-40-14 Тел./факс: (812) 297-57-76