Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Действие синтетического гексасахарида, соответствующего фрагменту цепи капсульного полисахарида Streptococcus pneumoniae серотипа 14, на активацию врожденного и адаптивного иммунного ответа

На правах рукописи

. '4

АХМАТОВ Элвпи Альтафович

ДЕЙСТВИЕ СИНТЕТИЧЕСКОГО ГЕКСАСАХАРИДА, СООТВЕТСТВУЮЩЕГО ФРАГМЕНТУ ЦЕПИ КАПСУЛЬНОГО ПОЛИСАХАРИДА Streptococcus pneumoniae серотипа 14, НА АКТИВАЦИЮ ВРОЖДЕННОГО И АДАПТИВНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 2 ИЮЛ 2015

005570804

МОСКВА-2015

005570804

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова»

Научный руководитель: доктор медицинских паук, профессор Курбатова Екатерина Алексеевна

Официальные оппоненты:

Калгожнн Олег Витальевич, доктор медицинских наук, профессор кафедры клинической иммунологии и аллергологии Института постдипломного образования Первого государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова.

Нинегин Борис Владимирович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий отделом иммунодиагностики и иммунокоррекции Федерального государственного бюджетного учреждения «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России.

Ведущая организация: Федеральное бюджетное учреждение науки Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора

Защита состоится «15» октября 2015 г. в 12.00 часоз на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 при ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова по адресу: 105064, Москва, Малый Казенный пер., 5А. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова, у."\чу.inslmech.ru

Автореферат разослан « ^ » ^^2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совега

Яковлева Ирина Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Streptococcus pneumoniae является этиологическим фактором тяжелых бактериальных инфекций различной локализации у детей и взрослых [Харит С.М., 2011; Weinberger D.M, et al., 2010]. На основе химической структуры капсулыюго полисахарида (КП) идентифицировано более 90 серотипов пневмококка [Kamerling J.P., 2011], около 20 из которых вызывают до 90% заболеваний [Козлов P.C. и др., 2011]. Показано, что в защите от пневмококковой инфекции основную роль играют антитела к КП и комплемент-опосредованный онсонофагоцитоз [Hyams С. et а!., 2010].

Вакцинопрофилактика пневмококковой инфекции полисахаридными и конъюгированиыми вакцинами, защищающими от 80-90% клинически значимых серотипов пневмококка, привела к снижению заболеваемости во всех возрастных группах населения [Таточенко В.К., 2010; Бслошицкий Г.В. и др., 2014; Hutchison B.G., et al., 1999; Leventer-Roherts M. et al., 2015].

Разработка пневмококковых вакцин третьего поколения на основе синтетических олигосахаридов, соответствующих фрагментам цепи КП S.pneumoniae, является приоритетным направлением современной вакцинологии [Vliegenthart J.F.G., 2006; Safari D., et ai., 2012; Deng S., et al., 2014]. Известная структура углеводных лигаидов позволяет точно определить олигосахаридные зпитопы, необходимые для индукции протективных антител [Anish С., et al., 2014]. Иммунный ответ на олигосахариды типоспецифичен, поэтому конъюгаты белков-носителей с некоторыми олигосахаридами рассматриваются в качестве потенциальных вакцин [Jansen W.T. et al., 2004].

В настоящем исследовании из трех впервые синтезированных в России (ФГБУ ИОХ им. Н.Д. Зелинского РАН) тетра-, гекса- и окта- олигосахаридов для углубленного иммунологического исследования выбран гсксасахарид, соответствующий участку цепи КП S. pneumoniae серотипа 14, клиническая

Сокращения, КП - капсульный полисахарид, БСА - бычий сывороточный альбумин

значимость которого подтверждена в ряде эпидемиологических исследований [Jamal F., et al., 1987; Mcintosh E.D., et al., 2007; Alexandre C., et al., 2010; Lin T.Y. et al., 2010; Jauneikaitea E. et al., 2013]. Гексасахарид является наиболее перспективным для исследования, так как содержит в своем составе помимо тетрасахаридного повторяющегося звена еще два дополнительных моносахарида и в большей степени соответствует химическому строению бактериального КП S. pneumoniae серотипа 14. Это позволило нам моделировать в эксперименте иммунный ответ, сходный с действием пневмококковых вакцин на основе КП, и исследовать его особенности.

Показано, что синтетические аналоги фрагментов цепи КП S. pneumoniae серотипа 14, конъюгированные с белком-носителем, вызывают Т-зависимый ответ, переключение синтеза антител с IgM на IgG, созревание аффинности антител, продукцию специфических IgG-антител к углеводной составляющей конъюгага и формирование иммунологической памяти [Safari D. et al., 2008].

В то же время остается неизученным действие синтетических олигосахаридов, в том числе гексасахарида, на активацию эффекторов системы врожденного иммунитета; отсутствуют данные о протективной активности конъюгированных олигосахаридов в опытах активной защиты животных от заражения и превентивных свойствах олигосахарид-специфических антител; не исследовано их влияние на иммунофенотип мононуклеарных лейкоцитов селезенки мышей. Всё это определило цель и задачи настоящего исследования.

Цель. Изучение действия синтетического гексасахарида, соответствующего фрагменту цепи капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 14, конъюгированного с белком-носителем, на активацию эффекторов врожденного и адаптивного иммунитета.

Задачи исследования

1. Дать оценку антигенной активности гексасахарида в сравнении с тетра-и октасахаридом в ИФА.

2. Определить активность основных факторов системы врожденного иммунитета под влиянием конъюгированного с БСА гексасахарида (экспрессия

TLRs, созревание дендритных клеток, уровень продукции цитокинов in vitro и in vivo, бактерицидная активность сыворотки кропи).

3. Оцепить влияние кснъюгированного гексасахарида на субпонуляаионную структуру лимфоцитов селезенки мышей.

4. Определить особенности формирования гуморального иммунного ответа при иммунизации мышей ксныогированным гексасахаридом (продукция IgG-антител, опсонизирующие и превентивные свойства сыворотки крови).

5. Исследовать протективную активность коныогированного гексасахарида при моделировании у мышей генерализованной инфекции, вызванной S. pneumoniae серотипа 14.

Научная новизна

Гекеасахарид - синтетический аналог фрагмента цепи кансульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 14, конъюгированный с БСА, ингибировал IgG-антитела в антимикробной кроличьей сыворотке и характеризовался равнозначной антигенной акгивностью с кокъюгированными тетра-, октасахаридом и бактериальным капсульным полисахаридом (ингибирование ИФА 71-75%).

Впервые на примере разветвленного гексасахарида (3-D-Gal-(l—>-4)-Р-D-Glc-(1—+6)-[B-D-Gal-(l—»-4)]-p-D-GlcNAc-(l—>3)-p-D-Gal-(l—>4)-p-D-Glc продемонстрировано стимулирующее действие синтетических олигосахаридов на ряд показателей врожденного и адаптивного иммунного ответа.

Система врожденного иммунитета. Иммунизация мышей конъюгатом БСА с гексасахаридом увеличивала количество ТЬК2-экспрессирующих клеток в селезенке при отсутствии лиганд-рецепторного взаимодействия с клетками THPl-XBIue™-CD14; стимулировала in vitro появление в среде культивирования зрелых дендритных клеток с фенотипом CDllc+, CD80+, МНС 1Г и цитокинов (IL-ip, IL-6 и TNFa); обеспечивала повьпиеиие содержания в сыворотке крови мышей IL-ip, IL-JO, IFN-v и TNFa; приводила к усилению бактерицидной активности лейкоцитов периферической креви животных.

Гидроксид алюминия, выбранный в качестве адъюванта для

3

конъюгированного гексасахарида, способствовал повышению всех показателей функциональной активности эффекторов врожденного иммунитета мышей, в том числе, TI ,R2-экспонирующих клеток в селезенке; зрелых дендритных клеток с фенотипом CDllc+, CD80+, CD83+, МНС 1Г, продуцирующих цитокины (особенно интенсивно IL-lß); сывороточных цитокинов (IL-1 ß, IL-5, IL-б, IL-10, IL-17, GM-CSF, IFN-y, TNFa); бактерицидной активности лейкоцитов периферической крови животных.

Система адаптивного иммунитета. Впервые показано, что конъюгированный гексасахарид, сорбированный на гидроксиде алюминия, при двукратной иммунизации мышей оказывал стимулирующее влияние на образование преимущественно специфических IgGl-антител с формированием иммунологической памяти.

Впервые установлено, что на фоне высокого уровня IgG-антител к гексасахариду в селезенке мышей сохранялся нормальный уровень CD4+ Т-клеток при снижении числа CD8+ Т-лимфоцитов, что увеличивало иммунорегуляторный индекс (CD4/CD8) с 1,92 до 3,62. Количество В-лимфоцитов (CD5+ и CD19+), NK-клеток и активированных клеток, экспрессирующих молекулы МНС класса II, достоверно превышало соответствующие показатели у интактных животных.

Впервые продемонстрировано, что поствакцинальньге антитела к гексасахариду обладали способностью связывать бактериальный капсульный полисахарид, а иммунная сыворотка мышей стимулировала фагоцитоз инактивированных бактерий S. pneumoniae серотипа 14 нейтрофилами и моноцитами периферической крови интактных животных и защищала мышей от пневмококковой инфекции, вызванной серотипом 14.

Впервые экспериментально доказано, что активная иммунизация мышей ганъюгированным гексасахаридом, сорбированным на гидроксиде алюминия, защищала животных от заражения S. pneumoniae серотипа 14. При этом степень защиты была сопоставима с протективной активностью конъюгированного бактериального капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 14.

4

Практическая значимость

Предложенный в работе дизайн иммунологического исследования функциональной активное™ синтетического гехсасахарида может быть использован для оценки качества других синтетических олигосахаридов пневмококка и разрабатываемых синтетических вакцин.

На основе синтетического гексасахарида может быть разработана высокоспецифичная ИФА тест-система, предназначенная для определения напряженности гуморального иммунного ответа к S. pneumoniae серотипа 14 у привитых пневмококковыми вакцинами, оценки формирования постинфекционного иммунного ответа, мониторинга уровня антител к капсулыюму полисахариду этого серотипа пневмококка в различных популяционных группах населения, а также оценки антигенной активное™ бактериальных капсульных полисахаридов S. pneumoniae серотипа 14 в лабораторных и производственных условиях.

Сыворотки крови. полученные при иммунизации животных конъюгировапным гексасахаридом, могут быть использованы в лабораторных условиях для типирования штаммов S. pneumoniae серотипа 14.

Синтетический гексасахарид. коныогированный с лицензированным белком-носителем, например, с CRM197, можно рассматривать в качестве кандидата для конструирования пневмококковой вакцины против S. pneumoniae серотипа 14, а также для получения лечебных сывороток, иммуноглобулинов и моноклональных антител к данному серотину пневмококка.

Реализация результатов исследования. Материалы диссертации используются в цикле лекций кафедры эпидемиологии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова и кафедры эпидемиологии ГОУ ДПО РМАПО Минздрава России.

Апробация материалов диссертации. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: 16 Международном конгрессе по инфекционным заболеваниям, 2-5 апреля 2014 г. (г. Кейптаун, Южная Африка); 9

Международном симпозиуме по пневмококкам и пневмококковым заболеваниями, 9-13 марта 2014 г. (г. Хидерабад, Индия).

Апробация диссертации состоялась на конференции отдела иммунологии ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова «18» марта 2015 г. Протокол№ 2.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ №11-04-01187-а «Исследование иммунобиологических свойств олигосахаридов, отвечающих фрагментам капсульного полисахарида Streptococcus pneumoniae типа 14, для разработки подходов к синтезу гликоконъюгатной пневмококковой вакцины» (2011-2013 гг.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России, 2 - в материалах международных конференций, 1 - в электронном ресурсе.

Структура и объём работы. Материал диссертации изложен на 135 страницах, проиллюстрирован 13 таблицами, 1 схемой и 9 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав, содержащих результаты собственных исследований, заключения, выводов, алгоритма оценки иммунологической активности синтетических олигосахариидов и списка литературы, содержащего 189 источников (их них —20 отечественных и 169 зарубежных авторов).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Синтетический гексасахарид, конъюгированный с БСА, активирует ключевые эффекторы врожденного иммунитета: повышает уровень TLR2-позитивных клеток селезенки, вызывает созревание дендритных клеток, стимулирует продукцию цитокинов, увеличивает бактерицидную активность сыворотки крови.

2. Гексасахарид, конъюгированный с БСА, после двукратной иммунизации мышей в присутствии гидроксида алюминия повышает количество В-лимфоцитов и естественных клеток-киллеров в селезенке мышей, приводит к продукции опсонизирующих IgG-антител, формированию иммунологической памяти и защищает животных от заражения S. pneumoniae серотипа 14.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Синтетические олигосахариды. соответствующие фрагментам цепи КП S. pneumoniae серотипа 14 (Рис. 1), синтезированы в лаборатории химии гликокопъюгатов ФГБУ «Институт органической химии им. Н.Д. Зелииского» РАН под руководством члена-корреспондента РАН, д.х.н., профессора Н.Э.Нифантьева [Сухова Е.В. и др., 2014].

Полученные олигосахариды конъюгировали с БСА скваратным методом. В соответствии с данными MALDI-TOF анализа тетрасахарид содержал 11 олигосахаридных остатков, ковалентно связанных с белком; гексасахарид — 15; октасахарид - 9. Содержание углеводов в препаратах составляло 10, 19 и 16% соответственно. Все олигосахариды содержали галактозный заместитель в боковой цепи и галактозный остаток на невосстанавливаемом конце.

Тетрасахарид

он

Гексасахарид

H<?i-0H NHAC ОН »-ОН

ОН (

ö Gal-Gk-(Gal-)GIcNAc-Ga!-G!c

hoSSH OH

Окгасахарид

HC

HO-

Hl

Sjh но'1™ 04

но^он

Gal-GIc-(Gai-)GlcNAc-Gai-Gic(Gal-)QlcNAc

Рис. 1. Олигосахарндпые синтетические аналоги фрагментов пеги капсульного полисахарида 5. pneumoniae серотипа 14.

Синтетический капсулышй полисахарид S. pneumoniae серотипа 14 получен методом поликонденсации [Нифантьев Н.Э. и др.. 1987; Kochetkov N.K. et al, 1987J.

Бактериальный капсульный полисахарид 5. pneumoniae серотипа 14 получен в лаборатории нммунохимической диагностики ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова под руководством д.м.н., профессора Н.Е. Ястребовой и к.м.п. Н.П. Ванеевой [Ванеева Н.П. и др., 2012].

Также в работе использовали пневмококковые вакцины, содержащие в своем составе КП S. pneumoniae серотипа 14: полисахаридную - Пневмо-23 (фирма "Sanofi-Pasteur", Франция), не содержащую адъюванта, и конъюгированную - Превенар-13 (фирма "Pfizer", США), сорбированную на фосфате алюминия, в качестве белка-носителя в которой использован рекомбинантный дифтерийный анатоксин (CRM197).

Лабораторные животные. Мыши линий СВА самки и BALB/c самцы массой 14-16 г, полученные из питомника НЦ биомедицинских технологий, филиал «Андреевка».

Антимикробные мышиные сыворотки к S. pneumoniae серотипов 6В, 10А, 14, 19А, 19F и 23F получали при иммунизации мышей возрастающими дозами живых микробных клеток [Курбатова Е.А. и др., 2013]. Сыворотку кроликов получали при многократном введении животным инактивированных микробных клеток S. pneumoniae серотипа 14 (лаборатория нммунохимической диагностики ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова).

Титры IgG-антител к олигосахаридам и КП S. pneumoniae типа 14 определяли с помощью твердофазного ИФА, в том числе с использованием биотинилированных конъюгатов исследуемых олигосахаридов, сорбированных на стрептавидиновых плашках "Pierce", (фирма 'Thermo Scientific", США).

Экспрессию TLRs определяли двумя методами. В первом случае оценивали лиганд-рецепторное взаимодействие гексасахарида с клетками моноцитарной клеточной линии THPl-XBlue™-CD14 (фирма "Invivogen", США), экспрессирующей различные патоген-распознающие рецепторы (ФГБУ

«ФНИЦЭМ им. К.Ф. Гамалеи» Минздрава России, заведующий лабораторией микробиологии, д.б.н. Д.Ю. Логунов). Во втором случае уровни экспрессии TLR2 и TLR4 определяли на моионуклеариых лейкоцитах селезенки иммунизированных мышей методом проточной цитофлуорометрии.

Фенотип дендритных клеток, мононуклсарных лейкоцитов селезенки мышей, продукцию цитокинов. опсонофагоцитарную и бэктерииилпущ активность сыворотки мышей определяли методом проточной цитофлуорометрии.

Протективная активность. Мышей иммунизировали конъюгированным гексасахаридом (с гидроксидом алюминия и без адъюванта) двукратно внутрибрюшинно в разовой дозе 10 мкг в расчете на углевод с интервалом 14 суток и заражали через две недели S. pneumoniae ееротипа 14. В качестве контроля использовали интактных животных, которых заражали той же дозой микробной культуры. Учитывали количество выживших мышей в опыте и контроле.

Превентивные свойства сыворотки. Мышам однократно внутрибрюшинно вводили иммунную сыворотку (25 мкл), полученную от мышей, иммунизированных коныогатом БСА с гексасахаридом (разовая доза 10 мкг/мышь по углеводу), сорбированным на гидроксиде алюминия. В качестве группы сравнения использовали мышей, которым вводили нативную сыворотку от неиммунизированных мышей. Для контроля заражающей дозы использовали интактных животных, оценивая количество выживших мышей во всех группах.

Методы статистической обработки. При нормальном распределении показателей использовали однофакторный дисперсионный анализ ANOVA для независимых выборок с апостериорным анализом Tukey. При отсутствии нормального распределения применяли метод Манна-Уитни для независимых выборок и метод %2. Статистически достоверными считали различия при р<0,05. Программное обеспечение STATISTICA 8.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ

1. Сравнительная характеристика антигенной активности синтетических олигосахарндов

Антигенную активность конъюгированных тетра-, гекса- и октасахарида

оценивали методом ингибирования ИФА при сорбции на планшете конъюгата БСА с гексасахаридом. Специфическая активность гексасахарида подтверждена по отсутствию положительных реакций с антимикробными сыворотками к другим серотипам пневмококка ( 6В, 10А, 19Р. 19А и 23Р).

Установлено отсутствие различий в антигенной активности между конъюгированньгми тетра-, гекса- и октасахаридом, а также КИ (бактериальным и синтетическим). Все препараты связывали специфические ^С}-антитела в антимикробной кроличьей сыворотке (ингибирование ИФА 71-80%). Эти показатели существенно отличались от отрицательного (р<0,05) и положительного контролен (БСА) (р<0,05) (Рис. 2).

0,9

процент ингибирования IgG-AT кгексасахариду

?т 75% 74% 8096 71% * $ $ * £

II, ■ J.

ФСБВД Тмгоа-БСА Гекса-БСА Окг*-БСА ыапКК 6а£П SCAK(+) Препараты для ивгвбироваая антимикробной сыворотки

На твердой фазе сорбировав гексасахарвд. ковьюгнрованвын с БСА

Риа 2. Антигенная активность конъюгированных олигосахарндов. Примечание. Реакция ингибирования ИФА с использованием антимикробной кроличьей сыворотки к Ж pneumoniae серотипа 14. ОП - оптическая плотность исходной сыворотки; ФСБ - фосфатно-солевой буфер К(-); БСА - К(+); синтКП - сшггетический КП, бакКП -бактериальный КП. Концентрация всех препаратов 10 мкг/лунка. На твердой фазе сорбирован конъюгат БСА с гексасахаридом, 0,2. мкг/лунка. Данные представлены как M±3D. * - достоверность различий с К(-) и К(+). Тест Манна-Уитни.

Тетра-, гекса- и октасахарид, сорбированные на твердой фазе в составе биотинилироЕанных кокъюгатов, одинаково хорошо выявляли IgGl-антитела (Log ш - 3,4; 3.4 и 3,7 соответственно) в сыворотке крови мышей, иммунизированных KIT S. pneumoniae серотипа 14 в составе коммерческой вакцины (Рис. ЗА). При этом титр IgGl-гексасахарид-специфических антител в сыворотке крови мышей, иммунизированных исследуемым гликоконъюгатом, был в 9 раз выше, чем у мышей, иммунизированных конъюгированным KIT.

Поствакцинальные гексасахарид-специфические антитела обладали способностью связывать бактериальный КП, что доказано в тесте ингибирования ИФА по снижению оптической плотности (ОП) сыворотки иммунизированных мышей на 76,5: 81,2 и 83,6% при добавлении к ней 0,25; 0,5 и 1 мкг бактериального КП в расчете на лунку соответственно (Рис. ЗБ).

4 Я - сыворотка к КП jj

ЕЗ - СШШМШ к* ГЙКСЯ М ХЯП1 ! :IV

Рис. 3. Титр антител к олигосахаридам в иммунных сыворотках мышей (А); ингибирование гексахарид-специфических антител (Б). Примечание. Иммунные сыворотки получены на 14 сутки после двукратной иммунизации мышей КП, сорбированным на фосфате алюминия (1/2 человеческой дозы вакцины Превенар-13) и конъюгированным с БСА гексасахаридо.м, сорбированным на гидроксиде алюминия (разовая иммунизирующая доза 10 мкг по углеводу па мышь). Для ингибирования ИФА использовали бактериальный КП. Титр антител представлен в Достоверность различии в сопряженных группах и с К(-), * - р<0,05. Тест МшшаУитни.

Полученные данные показали, что конъюгированный гексасахарид

характеризуется антигенной активностью и специфичностью, что послужило

основанием для проведения дальнейших исследований по оценке его действия

на активацию эффекторов врожденного к адаптивного иммунного ответа.

Тетра- Гекса- Окта-

К(-) 0,25 0,5 1 SIKT

Биотянячированные йяигосахариды. сорбированные на стрептав!шшювой плашке

Инщбнруюшая концентрация КП

2. Активация врожденного иммунитета

Иммунный ответ начинается с активации рецепторного аппарата клеток системы врожденного иммунитета, что в последующем определяет направленность, интенсивность и длительность адаптивного иммунного ответа.

2.1. Активация экспрессии Толл-подобных рецепторов

В первом случае оценку способности гексасахарида активировать Толл-подобные рецепторы (Toil-like receptors - TLRs) проводили in vitro с использованием моноцигарной клеточной линии THPl-XBlue-CD14, экспрессирующей различные патоген-распознающие рецепторы, включая TLRs. Во втором - определяли содержание TLR2- и ТЬК4-иозитивных клеток в селезенке иммунизированных мышей методом проточной цитофлуорометрии.

Синтетический гексасахарид (лигаид) вызывал повышение уровня экспрессии TLRs на клетках THPl-XBlue-CD14 по сравнению с контролем (К-) (р=0,049535), но значительно слабее по сравнению с положительными контролями (К+) (Рис. 4). То есть, специфического лиганд-рецепторного взаимодействия выявлено не было.

THPl-XBlue-CD14

Кокъюгированный Лкганц БСА K(_j ЛПС CBLB502 СП-® DAP

гексасахарид гексасахарида

К(+)

Рис. 4. Лиганд-рецелторное взаимодействие гексасахарида с патогенраспознающими рецепторами клеточной линии ТНР 1-ХВ1ие-С1) 14. Примечание. Конъюгированный гексасахарид и лиганд гексасахрида, а также БСА использовали в концентрации 100 мкг/мл. (К+) - в концентрации 1 мкг/мл. К (-) - ФСБ. Данные представлены как М±5Б. Достоверность различий в сопряженных группах, * -р<0,05. Тест Манна-Уитни.

На 7 сутки после однократной и двукратной внутрибрюшинной иммунизации мышей несорбированным конъюгатом гексасахарида с БСА {далее, гликоконъгагат) и сорбированным на гидроксиде алюминия {далее, гл и ко ко нъю гат+АЬ) отмечали повышение содержания ТЫ12-позитивных клеток в селезенке мышей по сравнению с контролем (р<0,05) (табл. 1). Количество ТЫ14-экспрсссирующих клеток при этом не изменялось.

Таблица 1. Содержание ТЬЯ-экспрессирующих клеток в селезенке мышей

Препарат для иммунизации Количество ТЪЯ-экспрессирующих клеток на 7 сутки после иммунизации, %

однократно двукратно

ГЬЯ2 ТЬЯ4 ТЫ12 ТЬЯ4

Гликоконъюгат 20,6±2,2* 4,3±0,4 13,3±1,2* 3,8±0,2

Гликоконъюгат + АЬ 26,7±3,0* 4,1±0,5 25,9±2,2*)+* 4,4±0,4

АЬ 20,2±2,1* 9,7±0,6 50±4,4*'** 8,1±0,5

Контроль (интактные) 3,6±0,3 4,7±0,3 4,9±0,4 7,3±0,5

Примечание. Данные представлены как М±80, Достоверность различий: * - с контролем; ** - между однократным и двукратным введениями, р <0,05. Тест Манна-Уитни.

2.2. Созревание дендритных клеток и продукция цитокииов Известно, что зрелые дендритные клетки участвуют в представлении антигена Т-лимфоцитам. Прибавление гликоконъюгата в культуру незрелых ДК, генерированных из костного мозга мышей, снижало количество недифференцированных клеток (СБ34+). При этом увеличивалось содержание клеток с молекулами адгезии СШ 1с\ костимуляции С080+ и антигенного представления МНС класса 1Г (р<0,05), однако их количество было ниже положительного контроля (ТМга) (р<0,05) (табл. 2). Добавление гликоконъюгата в среду культивирования ДК увеличивало в ней концентрации 1Ь-1р, 1Ь-6, ЮТа по сравнению с контролем (среда с незрелыми ДК, без индуктора созревания).

Гликоконъюгат+АЬ обладал сходными свойствами, однако, по сравнению с гликоконъюгатом без адъюванта, вызывал более значительное снижение уровня СВ34+ и стимулировал повышение числа клеток с поверхностными молекулами СВ11с+, С080+ и СП83+ (р<0,05). В присутствии адъюванта

13

продукция цитокинов усиливалась, но была ниже положительного контроля (ТМРа) за исключением И.-1р.

Таблица 2. Иммунофенотип дендритных клеток и продукция цитокинов

Индуктор Поверхнос :тные молекулы, % Цитокины, пг/мл

созрева- CD34 CDllc C.D80 CD83 МНС IL-ip 1L-6 GM- TNFa

ния ДК II CSF

Без 38,6± 4,8± Н,3± 3,1± 6,5± 23,2± 216± 159± 24,8±

индук- 2,9 0,4 1,3 0,2 0,6 1,5 24,9 14,5 2,7

тора, (К-)

Глико- 12,4± 41± 28,6± 4,7± 13,0± 33,5± 312± 57,2± 39,4±

конъюгат 1,1* 3,1*'** 2,1* 0,5 0,5* 4,2* 28,8* 5,5# 3,3*

Глико- 1,3± 32,0± 38,0± 8,4± 13,8± 84,7± 388± 152± 58,5±

конъюгат 0,2*'** 2,7* 2,9*'** 0,8*'** 1,4* 6,4*'** 31,3** 11,2 5,8*'**

+ AL

AL 41,1± 9,5± 54,8± 22,0± 20,3± 50,3± 226± 97,3± 24,6±

3,6 0,8 5,2* 1,8* 3,4* 4,1* 18,3 11,2 2,6

TNFa 10,7± 39,5± 75,2± 42,8+ 52,3± 42,0± 345± 125± 132±

(К+) 0,6* 2,4* 5,3* 3,3* 4,1* 4 •?* 9a" 27* 9,5 9,7*

Примечание. 9 сутки кз'льтивирования ДК. Данные представлены как M±SD.

* - достоверность различий с незрелыми ДК (без индуктора созревания), (К-); ** - между гликоконъюгатом и гликоконъюгатом+AL; # - снижение по сравнению с К (-), р<0,05. Тест Манна-Уитни.

Таким образом, под действием гликоконыогата, в том числе гликоконъюгата+AL, формировалась популяция зрелых ДК (CDllc+, CD80+, CD83+ и MHCII+), в среде культивирования которых присутствовали IL-ip, IL-6 и TNFa.

2.3. Продукция цитокинов in vivo

Для оценки продукции цитокинов in vivo мышам однократно внутрибрюшишю вводили гликоконъюгат и гликоконъюгат+AL в дозе 10 мкг по углеводу в расчете на мышь и исследовали концентрацию цитокинов в сыворотке крови в течение 24 часов после введения препарата (Рис. 5). Гликоконъюгат вызывал повышение уровней lL-ip, IL-10, TNFa (р<0,05), кратковременно повышались концентрации IL-4, IL-5 и IL-17 (р<0,05), а через 4 ч после введения препарата увеличивалась продукция GM-CSF (р<0,05) и IFN-y (р<0,05), при отсутствии изменения уровня IL-6. Гликоконыогат+АЬ вызывал продукцию более широкого спектра цитокинов (IL-ip, IL-5, IL-6,1L-10, II.-17,

ОМ-СЭР, 1РМ-у, ТКРа) и в большей концентрации, особенно 1Ь-5, 1Ь-б, 11.-10, 1Ь-17, ОМ-СЭР, 'ШРа. Выработка П-'К'-у увеличивалась через 8 ч и резко возрастала через 24 ч наблюдения.

Гликоконъгогат — Гликоконъюгат+АЬ

Время после иммунизации, ч

Рис, 5. Концентрация цитокинов в сыворотке крови мышей. Примечание. Данные представлены как М±50, * р<0,05; ** р<0,01. Тест Манна-Уитни.

2.4. Бактерицидная активность лейкоцитов периферической крови Гликоконъюгат повышал бактерицидную активность лейкоцитов периферической крови иммунизированных мышей в отношении

гетерологичного возбудителя (S. aureus), причем в большей степени в присутствии эдъгаванта (табл. 3).

Таблица 3. Бактерицидная активность лейкоцитов периферической крови

Препарат для иммунизации мышей % убитых микробных клеток S. aureus после первого введения препарата на срок

4ч 24 ч

время инкубации время инкубации

1 ч 3 ч 1 ч 3 ч

Гликоконьюгат 37,3±0,9 41,9±1,5 37,0±1,6 49,6±2,2*

Гликоконъюгат+AL 42,9±2,б* 53,5±1,6*>** 64,3±1.9*)+* 72,1±1,9*)**

AL 33,3±2,6 40,7±3,1 32,1+1,6 41,0±2.0

Контроль 35,1±1,7 39,0±2,3 37,7±1,9 38,3±2,6

Примечание. Данные представлены как М±80; * - достоверность различий с контролем; ** - между гликоконъюгатом и гликоконъюгатом+АЬ, р<0,05. Тест Манна-Уитни.

Таким образом, иммунизация гексасахаридом, конъюгированиым с БСА, приводила к модификации иммунного процесса уже на первых этапах активации врожденного иммунитета, что проявлялось в повышении экспрессии TLR2; созревании дендритных клеток; продукции цитокинов, увеличении бактерицидной активности сыворотки крови. Сорбция гликоконъюгата на гидроксиде алюминия усиливала функциональную активность эффекторов врожденного иммунитета.

3. Активация адаптивного иммунитета

3.1. Иммунофенотип лимфоцитов

На 7-е сутки после однократной иммунизации мышей гликоконъгатом увеличивалось количество Т-лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности молекулы CD3+, CD4+ и CD8+ (р<0,05 относительно контроля и гликоконъюгата+AL), и В-клеток с фенотипом CD19+ и CD5+ (р<0,05 относительно контроля) (табл. 4). Иммунизация гликоконъюгатом+AL не оказывала влияние на количество CD4+ и CD8+ Т-клеггок, но стимулировала повышение числа В-лимфоцитов (CD19+, CD5+) и Т-клеток, экспрессирующих рецептор к IL-2 (CD25+), а также активированных лимфоцитов, экспонирующих молекулы МКС класса II (р<0,05. относительно контроля и гликоконъюгата).

На 7-е сутки после второй иммунизации мышей гликоконъюгатом наблюдалось снижение числа CD3+ и CD4+ Т-лимфоцитов (р<0,05), тогда как

16

Таблица 4. Иммунофенотип лимфоцитов мышей

Препарат для иммунизации Количество клеток, экспрессирующих поверхностные молекулы, %±80

С045/ СОЗ СЭЗ/ С04 СИЗ/ С08 СЭ19 СЭ5 Тч!К у5Т С154/ СБ25 Тгеё СБ45/ мнсн

7 суток после первой иммунизации

Гликоконъюгаг 52,0± 27,0± 25,3± 24,5± 16,7± 13,3± 2,0± 3,5± 1.2± 28,4±

4,5* 2,3*'** 2 6*)** 2,7* 1,7* 1,1 0,3# 0,3 0,2 2,4

Г ли ко ко нъ ю гат+А Ь 51,б± 20,8± 11,4± 33,0± 28,3± 13,4± 2,4± 9,4± 2,3± 33,1±

4,4* 1,8 0,3 41*)** 2;7 *)** 1,4 0,3# 0,5 *>** 0,4 ^ 0*)**

АЬ 32± 10,9± 7,0± 25,2± 30,6± 13,1± 3,3± 1,2± 2,2± 37,5±

3,7 1,3# 0,5# 2,6* 3,3* 1,7 0,4 0,2 0,3 2,9*

Контроль 40,6± 21,3± 16,0± 10,7± 2,2± 13,8± 6,2± 1,6± 1,3± 28,5±

(неиммупизированные) 3,7 2,7 1,5 0,7 0,2 0,4 5,0 0,3 0,2 3,1

7 суток после второй иммунизации

Гликоконъюгат 23,9± 14,4± 7,5± 11,6± 10,8± 38,0± 2,5± 10,8± 3.2± 47,9±

2,2# 1,1# 0,4# 0,9* 1,0* 3,5* 0,2# 1,0* 0,3 4,8*

Гликокошлогат+АЬ 37,8± 24,2± 7,2± 14,2± 13,9± 41,7± 3,2± 13,9± 3,0± 58,9±

3,5 2,5 0,5# 1,5* 1,2*'** 5,3* 0,3# 1,2* 0,2 ^ 7*)**

АЬ 22,9± 18,3± 5,3± 5,4± 9,8± 52,0± 5,9± 9,8± 2,8± 50,7±

2,4# 1,4 0,3# 0,5 0,7* 4,2* 0,5 0,7* 0,2 4,7*

Контроль 32,4± 20,6± 11,7±0, 6,8± 1,5± 13,9± 4,1± 1,5± 2,4± 35,2±

(неиммунизированныс) 3,2 2,0 7 0,2 0,3 1Д 0,3 0,3 0,3 3,3

Примечание. Данные представлены как М±ЯП. Достоверность различий: * - по сравнению с контролем; ** - между гликокопыогатом и гликоконъюгатом+АЬ; # - снижение показателя по сравнению с контролем, р<0,05. Тест Манна-Уитни.

иммунизация гликоконъюгатом+AL не оказывала влияния на количество Т-клеток. Иммунизация мышей обоими гликоконъюгатами способствовала снижению численности Т-клегок с поверхностной молекулой CD8+ и у5Т-клеток (р<0,05). Прибавление к гликоконъюгату соли алюминия способствовало увеличению соотношения CD4/CD8 (для гликокоиъюгата -1,92; для гликокоиъюгата + AL - 3,36) из-за уменьшения числа СйвТ-клеток. Повторное введение животным каждого из гликоконъюгатов приводило к сохранению на более высоком уровне числа В-клеток (CD19+, CD5+), способствовало увеличению количества NK-клеток и активированных клеток, экспонирующих МНС класса II (р<0,05).

3.2. Продукция антител Для определения продукции IgG-антител к гексасахариду мышей иммунизировали гликоконъюгатом и гликоконъюгатом+AL (Рис. 6). На 7 и 14 сутки после однократной иммунизации не наблюдали образования специфических IgG-антител (Рис. 6А). Через 7 суток (день 21) после второй иммунизации гликоконъюгатом+AL уровень IgG-антител увеличивался (р=0,000177) и продолжал нарастать к 14 суткам (день 28 от начала вакцинации), тогда как гликоконъюгат без адъюванта не вызывал продукции антнтел. Это подтвердилось при определении IgGl-антител в индивидуальных сыворотках мышей (Рис. 6Б). Уровень IgG-антител после иммунизации гликоконыогатом+AL оставался высоким до 61 суток (47 дней после второй иммунизации) по сравнению с исходным показателем (р=0,000205). К 92 суткам уровень IgG-антител снижался, но оставался выше первоначальных значений (р=0,011659). На фоне низкого уровня IgG-антител, на 92 день после иммунизации была проведена ревакцинация гликонъюгатом + AL в той же дозе (Pua 6А). Через 24 часа (день 93) IgG-антитела оставались на исходном уровне, но к 4-м суткам (день 96) их титр увеличивался (р=0,012195) и продолжал нарастать до 7-х суток (день 99) (р=0,01148). Такое достаточно быстрое IgG-антителообразование может свидетельствовать о формировании иммунологической памяти к гексасахариду.

IgG

□ - глнкоконъюгат ■ - гликокоиьюгат+AL

О 7 14

1-я 2-я

иммунизация

21

28

61

I . I I »

92 93

it

ревакцинация

95

99 189

CYTKH

ex «ООО

К

В

, 10000

IgGl

g €000 I

глнкоконыогат+AL глнкоконъюгат

Рис. 6. Титр IgG-аитител к гексасахаридному участку цепи капсульного полисахарида.

Примечание. Мышей иммунизировали двукратно внутрибрюшинно гликоконъюгатом в разовой дозе 10 мкг по углеводу на мышь в присутствии гидроксида алюминия или без адьюванта в дни 0 и 14 с проведением ревакцинации в день 92 той же дозой гликоконъюгата, сорбированного на гидроксиде алюминия. В качестве покрывающего лунки антигена в ИФА использовали КП S. pneumoniae серотипа 14. (А) IgG-антитела. Данные представлены как М±т. (Б). Индивидуальные титры IgGl -антител через 14 дней после второй иммунизации. Данные представлены индивидуальными титрами и Me±SD. ANOVA с апостериорным анализом Tukey, *- р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001.

Титр IgG-антител оставался выше, чем до ревакцинации (р=0,031494) в течение 97 дней (день 189). В сыворотке крови мышей преобладали антитела IgGl субизотипа (1:11200).

3.3. Протективная активность

Для исследования протективной активности гликоконъюгата и гликоконъюгата+AL мышей иммунизировали двукратно внутрибрюшинно и через две недели заражали летальной дозой S. pneumoniae серотипа 14 (табл. 5). В качестве референс-препаратов использовали пневмококковые вакцины: полисахаридную Пневмо-23 (без адъюванта) и конъюгированнуто - Превенар-13 (с фосфатом алюминия). Контроль заражающей дозы культуры S. pneumoniae серотипа 14 проводили на интактных мышах.

Таблица 5. Протективная активность гликоконъюгата при заражении S. pneumoniae серотипа 14 _________

Препарат для иммунизации Разовая иммунизирующая доза по углеводу, мкг Титр"1 IgG-антител на 11-14 сутки после иммунизации в ИФА Число выживших мышей из числа взятых в опыт на 10 сутки после заражения

выжило/ всего %±т

I ликоконъюгат 10 150±28.7 0/10 0+8,5

Гликоконъюгат+AL 10 4800±923* 8/8*** 100±0

10» 800±0* 7/8*** 87,5±11,7

5 2400±461* 7/8*** 87,5±11,7

2,5 2400±461* 6/7** 87,5+11,7

1,25 2400±461* 5/6* 83,3±15,2

0,6 800±0* 6/7** и85,7±13,2

КП- CRMi97 (Превенар-13) 1,0 1600±0* 4/4** 100±0

КП (Пневмо-23) 5 400±0 2/10 20±12,6

Контроль (интактные) - 150±28,7 0/8 0±0

Примечание. '> - вторая иммунизация гликоконьюгатом, несорбирозшшым на гидроксиде алюминия. В качестве покрывающего лунки антигена в ИФА использовали КП. Данные представлении как %±т. Достоверность различий по сравнению с контролем, * - р<0,05; ** -р<0,01; *** - р<0,001. Различия в уровне антител определяли методом Манна-Уиган, а в выживаемости мышей - методом с поправкой Йейтса.

Установлено, что гликоконъюгат, не вызывавший образования

антител, не обладал протективной активностью, тогда как гликоконъюгат+АЬ

защищал от заражения 100% мышей (р=0,001). При проведении второй

иммунизации той же дозой, но без адъюванта, уровень защиты снижался до

20

87,7%. Наименьшая из иммунизирующих доз (0,6 мкг) защищала 85,7% мышей. КП серотипа 14, входящий в состав вакцины Превенар-13, защищал от заражения 100% мышей, а неконъюгированный полисахарид, входящий в состав Пневмо-23, оказался неэффективным для защиты животных.

3.4.Превентивные свойства сыворотки крови иммунизированных мышей

Для оценки превентивной активности иммунной сыворотки мышам за 2 часа до заражения S. pneumoniae серотипа 14 вводили иммунную сыворотку с титром антител к гексасахариду 1:6400. Для сравнения брали мышей, которым вводили сыворотку от интактных животных (табл. б). Установлено, что только иммунная сыворотка, полученная от мышей после их двукратной иммунизации гликоконъюгатом+AL (разовая доза 10 мкг по углеводу), защищала 75% животных при заражении летальной дозой S.pneumoniae серотипа 14.

Таблица 6. Превентивные свойства сывороток мышей при заражении Б.рпеитотае серотипа 14_

Сыворотка Заражаю Разовая Титр"' IgG- Выжило/ Выжило,

после щая доза. доза антител к всего %±ш

иммунизации микр. кле- сыво- гексасахариду на 9

препаратом ток ротки, в тестируемой сутки

мкл сыворотке

Гликокопъюгат 0,5x109 12,5 6400±0 6/8* 75±15,3

+ AL

Нативная 0,5x109 12,5 <200 3/8 37,5±17,1

сыворотка

Контроль 0,5х109 - <200 0/8 0

S.pneumoniae 0.25x109 - <200 6/8 75±15,3

серотипа 14 0,125х109 - <200 8/8 100±8,5

Примечание. Достоверность различий по сравнению с контролем, * - р<0,01. Различия в выживаемости мышей определяли методом у2 с поправкой Йейтса.

3.5.0псочизирующая активность иммунной сыворотки мышей Для изучения опсонофагоцитарной активности к образцам периферической крови интактных мышей прибавляли: убитые нагреванием бактериальные клетки Б.рпеитотае серотипа 14; бактериальные клетки с добавлением нативной сыворотки мышей; бактериальные клетки с добавлением иммунной сыворотки к гексасахариду (табл. 7).

Таблица 7. Опсоннзирующая активность сыворотки крови мышей

Фагоцитирующие клетки периферической крови интактных мышей % клеток интактных мышей, поглотивших убитые нагреванием бактерии S. pneumoniae серотипа 14

без сыворотки натиЕная иммунная

Нейтрофилы 65,6±1,4 77,6±2,6 83,5±1,9*

Моноциты 72,5±2,2 78,0±2,3 89,8±2,6*

Примечание. Иммунную сыворотку получали на 14 сутки после двукратной иммунизации гликоконъюгатом+АЬ (разовая доза 10 мкг по углеводу). Данные представлены как M±SD. Достоверность различий по сравнению с контролем (без сыворотки), * - р<0,05. Тест Макна-Уитни.

Нейтрофилы и моноциты в присутствии иммунной сыворотки захватывали больше бактерий, взаимодействовавших с антителами к гексасахариду (р=0,004), по сравнению с клетками, к которым не добавляли сыворотку или обрабатывали нативной сывороткой (р=0,006 и р=0,004 соответственно).

Исследование показало, гексасахарид - синтетический аналог фрагмента цепи кансулыюго полисахарида S. pneumoniae серотипа 14, конъюгированный с БСА, стимулирует активность ключевых эффекторов системы врожденного иммунитета, в присутствии адъюванта вызывает образование опсонизирующих IgG-антител и защищает мышей от заражения.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что гексасахарид обладает сопоставимой по величине антигенной активностью с тетра- и октасахаридом в составе конъюгатов с БСА, ингибируя специфические IgG-антитела в антимикробной кроличьей сыворотке соответственно на 75, 71, 74%; в сыворотке к бактериальному КП поствакцинальные антитела к тетра-, гекса- и октасахариду выявляются в титрах 3,4; 3,4 и 3,7 (в Logic).

2. Установлено, что антитела к гексасахариду способны связывать бактериальный КП, ингибируя активность иммунной сыворотки соответственно ка 76,5; 81,2 и 83,6%, при конценграциях КП 0,25; 0,5 и 1 мкг.

3. Продемонстрировано, что конъюгированный гексасахарид активирует экспрессию TLR2, вызывает созревание дендритных клеток (CDllc+, CD80+ и МНС IP), продуцирующих цитокины IL-lß, 1L-6 и TNFn; повышает концентрацию в сыворотке крови мышей IL-lß, IL-10, IFN-y и TNFa;

увеличивает бактерицидную активность лейкоцитов крови иммунизированных гликоконъюгатом мышей.

4. Показано, что добавление гидроксида алюминия к конъюгироваццому гексасахариду увеличивает численность ТЫ12-позитивных клеток селезенки мышей и зрелых дендритных клеток; повышает продукцию цитокинов дендритными клетками; расширяет спектр и увеличивает концентрацию сывороточных цитокинов (IL-Iß, IL-5, 1L-6, IL-10, IL-17, GM-CSF, IFN-y, TNFa); усиливает бактерицидную активность лейкоцитов крови иммунизированных мышей.

5. Выявлено, что образование IgG-антител к гексасахариду происходит только после двукратного введения мышам гликоконъюгата (оптимальная доза 10 мкг по углеводу), сорбированного на гидроксиде алюминия; гликоконъюгат без адъюванта не вызывает специфического антителообразовапия.

6. Установлено, что ревакцинация, проведенная через 47 дней после второй иммунизации, вызывает быстрое (на 4 сутки) образование анамнестических IgG-антител к гексасахариду, которые сохраняются в сыворотке крови животных до 92 дней.

7. Показано, что введение животным конъюгированного гексасахарида, сорбированного на гидроксиде алюминия, увеличивает соотношение CD4/CD8 лимфоцитов, вследствие снижения числа С08+Т-клеток, стимулирует преимущественно B-лимфоциты, увеличивает пул естественных клеток-киллеров, а также экспрессию МНС класса II на лимфоцитах.

8. Установлено, что сыворотка крови мышей, иммунизированных гликоконъюгатом, сорбированным на гидроксиде алюминия, обладает превентивными свойствами и повышает фагоцитоз убитых нагреванием бактерий пневмококка S.pneumoniae серотипа 14 нейтрофилами и моноцитами периферической крови интактных мышей.

9. Впервые продемонстрировано, что конъюгат БСЛ с гексасахаридом, сорбированный на гидроксиде алюминия, обладает выраженной протективной активностью и защищает мышей от заражения S.pneumoniae серотипа 14.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Synthetic hexasaccaride — related to the fragment of the chain of capsular polysaccharide Streptococcus pneumoniae type 14 and dendritic cells maturation / E.A. Akhmatov, E.A. Kurbatova, D.S. Vorobiov, E.V. Sukhova, D.V. Yashunsky, Y.E. Tsvetkov and N.E, Nifantiev // Pneumonia. Special issue. 9th International Symposium on Pneumococci and Pneumococcal Diseases. - India. Hyderabad. -2014. -Vol.3.-P. 102.

2. Immunogenic activity of a synthetic hexasaccharide fragment of the capsular polysaccharide of Streptococcus pneumoniae type 14 / E.A. Akhmatov, E.A. Kurbatova, D.S. Vorobiov, E.V. Sukhova, D.V. Yashunsky, Y.E. Tsvetkov and N.E. Nifantiev // Pneumonia. Special issue. 9th International Symposium on Pneumococci and Pneumococcal Diseases. - India. Hyderabad. - 2014. -Vol. 3. - P. 103.

3. Synthetic hexasaccharide of the capsular polysaccharide of S. pneumoniae type 14 induces cytokines / E.A. Akhmatov E.A., E.A. Kurbatova, N.K. Akhmatova, E.V. Sukhova, D.V. Yashunsky, Y.E. Tsvetkov, N.E. Nifantiev /7 16th International Congress on Infectious diseases. Cape Town. South Africa. - 2014. -Abstract No 63.022. http://www.xcdsystem.com/icid2014/63.022.html.

4. Действие гидрокевда алюминия на систему врожденного иммунитета и иммуногенность бактериальных и синтетических антигенов Streptococcus pneumoniae / E.A. Курбатова, Э.А. Ахматов, Н.К. Ахматова, Д.С. Воробьев, Н.Б. Егорова, А.П. Батуро, Э.Е. Романенко, Е.В. Сухова, Д.В. Яшунский, Ю. Е. Цветков, Н.Э. Нифантьев // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. - 2014. - № 6. - С. 59 - 66.

5. Протективная активность гликоконъюгата на основе синтетического гексасахарида - родственного фрагменту цепи капсульного полисахарида Streptococcus pneumoniae серотипа 14 / E.A. Курбатова, Д.С. Воробьев, Э.А. Ахматов, Н.К. Ахматова, Н.Б. Егорова, Ю.Е. Цветков, Е.В. Сухова, Д.В. Яшунский, Н.Э. Нифантьев // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2014. - Т. 157. - № 5. - С. 630-633.

Подписано в печать:

20.06.2015

Заказ № 10793 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Объем: 1,5усл.п.л. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 wwi-v.autoreferat.ru