Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Роль пептидов лимфатической системы в механизмах измененной реактивности организма при панкреонекрозе

ргб ОД

п дп? ш

На правах рукописи

Жгенти Георгий Рафаэлович

РОЛЬ ПЕПТИДОВ ЛИМФАТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ В МЕХАНИЗМАХ ИЗМЕНЕННОЙ РЕАКТИВНОСТИ ОРГАНИЗМА ПРИ ПАНКРЕОНЕКРОЗЕ

14.00.16 - Патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Иркутск - 2002

Работа выполнена в Читинской государственной медицинской академии МЗ РФ и НИИ восстановительной и реконструктивной хирургии ВосточноСибирского научного центра СО РАМН

Научные консультанты: доктор медицинских наук,

профессор Ю.А. Витковский ,

член-корр. РАМН, доктор медицинских наук,

профессор Е.Г. Григорьев

Официальные оппоненты:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор A.C. Коган доктор медицинских наук, профессор Ю.И. Пивоваров доктор медицинских наук, профессор В.И. Горбачев

Ведущая организация:

Новосибирская государственная медицинская академия МЗРФ

«

2002 г. в

часов не

Защита диссертации состоится заседании диссертационного совета Д 001.&54.01 в ГУ Восточно-СибирскиЁ научный центр СО РАМН по адресу: 664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Восточно-Сибирскт научный центр СО РАМН по адресу: 664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16.

Автореферат разослан« » 2002 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Л.Ф.Шолохов

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АДФ - аденозиндифосфат

AJIT - аланинаминотрансфераза

АПК - альтернативный путь активации комплемента

ACT - аспартатаминотрансфераза

АТ-Ш - антитромбин-Ш

АЧТВ - активированное частичное тромбопластиновое время

БАС — бактерицидная активность сыворотки

ВМБ - веронал-мединаловый буфер

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ДВС - диссеминированное внутрисосудистое свертывание крови

ЗФР - забуференный физиологический раствор

ИАН - индекс активации нейтрофилов

ИРИ - иммунорегуляторный индекс

кД - килодальтон

КПК - классический путь активации комплемента

ЛДГ- лактатдегидрогеназа

ЛКТ - лизосомально-катионный тест

ЛУ- лимфатические узлы

ММ- молекулярная масса

НСТ - тест восстановления нитросинего тетразолия

ПААГ - полиакриламидный гель

ПДФ - продукты деградации фибриногена/фибрина

ПЖ - поджелудочная железа

ПН - панкреонекроз

РОК - розеткообразующие клетки

СРБ - С-реактивный белок

СЦК - средний цитохимический коэффициент

Тк — Т-киллеры

Тс - Т-супрессоры

Тх -Т-хелперы

ЦИК - циркулирующие иммунные комплексы ЦТЛ - цитотоксические лимфоциты ЭГТА - этиленгликоль-тетрауксусная кислота CD - кластер дифференцировочных антигенов Ig - иммуноглобулин

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

В организме существует единая интегральная клеточно-гуморальная система защиты, включающая иммунитет, гемостаз и неспецифическую резистентность организма (Кузник Б.И., Цыбиков H.H., 1989; Витковский Ю.А., 1997). Известно, что нарушения в одной из них приводят к изменению в других. Связующими звеньями единой системы защиты выступают различные гуморальные факторы, среди которых важное место принадлежит полипептидам. К настоящему времени хорошо известны основные полипептиды, которые образуются различными органами и тканями и осуществляют перенос биологической информации между клетками различных популяций (Кузник Б.И. и соавт., 1980 - 2000; Морозов В.Г. и соавт., 1980 -2000; Хавинсон В.Х., 1980 - 2000). Достаточно изучены свойства этих веществ, выделенных из тимуса, печени, кишечника, сумки Фабрициуса, сосудов, тромбоцитов, эритроцитов, головного мозга, почек (Аюшиев О.Д., 1990; Белокриницкая Т.Е., 1990; Витковский Ю.А., 1990; Калашников С.Г., 1988; Кузник Б .И. и соавт., 1984-1990; Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., 1974-1994).

В то же время известно, что щелочные полипептиды активно вовлекаются в модуляцию коагуляционного, сосудисто-тромбоцитарного гемостаза и фибринолиза (Белокриницкая Т.Е., 1990; Витковский Ю.А., 1990; Калашников С.Г., 1988; Кузник Б.И. и соавт., 1984-1990). Кроме того, полипептиды в значительной мере определяют состояние неспецифического звена защиты организма (Кузник Б.И. и соавт., 1984-1996; Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., 1974-1996). Изучение новых механизмов регуляции защитной функции лимфатической системы актуально в плане разработки новых эффективных методов лечения заболеваний, сопровождающихся нарушением трофики, гиперкоагуляцией и ослаблением защитных сил организма.

В этом аспекте остаются практически не исследованными свойства полипептидной фракции лимфатических узлов, лимфы и плазмы крови.

Лимфатическая система выполняет в основном дренажную и элиминационно-деструктивную функцию. Известно, что деструкция чужеродных агентов факторами неспецифической и специфической защиты организма сопровождается локальными или диссеминированными гиперкоагуляционными сдвигами в лимфатических узлах, лимфе и, в конечном счете, в кровотоке. В условиях патологии значимость лимфатической системы в регуляции гемостаза еще более возрастает.

Цель н задачи исследования

Основной целью наших исследований явилось изучение роли полипептидов лимфатической системы в регуляции иммунитета, гемостаза и неспецифической резистентности в патогенезе панкреонекроза.

В связи с этим нами решались следующие задачи:

1. Выделить полипептидный комплекс из плазмы, лимфы и лимфатических узлов разных групп, определить диапазон их молекулярной массы, определить относительное содержание аминокислот и сравнить их биохимическую активность.

2. Изучить в опытах in vitro действие полипептидов лимфы, плазмы и лимфатических узлов на иммунитет, гемостаз и неспецифическую резистентность организма.

3. Выделить и исследовать состав полипептидов лимфы и плазмы у больных панкреонекрозом. Оценить биологическую активность полипептидов лимфы и плазмы больных панкреонекрозом.

4. Установить роль полипептидов плазмы, лимфы и лимфоузлов в патогенезе иммунологических и гемостатических нарушений при панкреонекрозе.

5. Исследовать влияние лимфостимулирующей и сорбционной терапии в комплексном лечении больных панкреонекрозом на клиническое течение, показатели иммунитета, гемостаза и неспецифической резистентности.

6. Разработать практические рекомендации для прогнозирования нарушений иммунитета, гемостаза и неспецифической резистентности при панкреонекрозе.

Научная новизна

Впервые установлено, что полипептидные комплексы лимфы и лимфатических узлов обладают выраженным антипротеазным действием. Полипептиды лимфы и лимфатических узлов тормозят контактную фазу коагуляционного гемостаза. Пептиды лимфы ингибируют формирование протромбиназы по внутреннему и внешнему пути. Антикоагулянтный фактор изучаемых полипептидов сосредоточен в диапазоне молекулярных масс 5-20 кД с пиком активности, соответствующим 15 кД. Полипептиды, выделенные из сыворотки лимфы теряют антикоагулянтный эффект. В составе полипептидного комплекса ЛУ и лимфы содержится антигепариновый фактор, соответствующий молекулярной массе 10-18 кД, который во время свертывания не потребляется. Пептидные фракции ЛУ ингибируют тотальный и Хагеман-зависимый фибринолиз.

Выявлено, что полипептиды лимфатических узлов и лимфы понижают общую гемолитическую активность крови, ингибируя классический и альтернативный пути активации системы комплемента. Свертывание лимфы снижает антикомплементарную активность полипептидов.

Новыми являются данные о том, что полипептиды ЛУ и лимфы стимулируют кислородзависимые и кислороднезависимые процессы

нейтрофилов, а также повышают их фагоцитарную активность. Пептиды, выделенные из лимфатических узлов и лимфы и внесенные в культуру клеток периферической крови, увеличивают экспрессию рецепторов на Т- и В-лимфоцитах здоровых людей и больных панкреонекрозом.

Обнаружено, что применение лимфостимулирующей и сорбционной терапии у пациентов с панкреонекрозом улучшает клиническое течение заболевания, повышает у них содержание лимфоцитов, несущих поверхностные маркеры СОЗ+, С04+, С08+, СО 16+, СБ22+, усиливает фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови, уменьшает признаки ДВС-синдрома.

Приоритетными являются данные о том, что при панкреонекрозе, сопровождающегося вторичным иммунодефицитом и ДВС-синдромом, изменяется качественный состав полипептидного комплекса, выделенного из лимфы и плазмы больных, а также снижаются их иммунореактивные и гемостатические свойства. Использование лимфостимулирующей и сорбционной терапии в комплексном лечении больных с панкреонекрозом восстанавливает способность полипептидов лимфы и плазмы усиливать экспрессию рецепторов на Т- и В-лимфоцитах, стимулировать фагоцитоз, а также проявлять антипротеазное и антикомплементарное действие.

Положения, выносимые на защиту

1. Лимфа и лимфатические узлы содержат полипептиды, отличающиеся между собой по молекулярной массе, аминокислотному составу и физиологическим свойствам.

2. Полипептидные комплексы лимфы и лимфатических узлов обладают выраженным антипротеазным действием. Полипептиды лимфы, и в меньшей степени ЛУ, тормозят контактную фазу коагуляционного гемостаза. Пептиды лимфы ингибируют формирование протромбиназы по внутреннему и внешнему пути. В составе полипептидного комплекса ЛУ и лимфы содержится антигепариновый фактор. Пептидные фракции ЛУ ингибируют тотальный и Хагеман-зависимый фибринолиз.

3. Полипептиды лимфатических узлов и лимфы понижают общую гемолитическую активность крови, иншбируя классический и альтернативный пути активации системы комплемента. Свертывание лимфы снижает антикомплементарную активность полипептидов. Пептиды ЛУ и лимфы стимулируют кислородзависимые и кислороднезависимые процессы нейтрофилов, а также повышают их фагоцитарную активность. Полипептиды, выделенные из лимфатических узлов и лимфы и внесенные в культуру клеток периферической крови, увеличивают экспрессию рецепторов на Т- и В-лимфоцитах.

4. При развитии панкреонекроза, сопровождающегося вторичным иммунодефицитом и ДВС-синдромом, изменяется качественный состав полипептидного комплекса, выделенного из лимфы и плазмы больных, а также снижаются их иммунореактивные и гемостатические свойства.

Использование лимфостимулирующей и сорбционной терапии в комплексном лечении больных с панкреонекрозом восстанавливает способность полипептидов лимфы и плазмы усиливать экспрессию рецепторов на Т- и В-лимфоцитах, стимулировать фагоцитоз, а также проявлять антипротеазное и антикомплементарное действие.

Практическая ценность работы

Полученные нами данные о роли полипептидов в регуляции иммунитета, гемостаза и неспецифической резистентности организма свидетельствуют об их высоком влиянии на защитные механизмы в норме и при панкреонекрозе. В связи с этим результаты исследований могут быть полезными для более полного расширения сведений о патогенезе заболевания, сопровождающегося нарушениями гемостаза, иммуногенеза, неспецифической резистентности организма, и с учетом этого позволяют более корректно подходить к лечению больных.

Апробация диссертации

Материалы исследований были доложены на международной конференции Экологическая патология и ее фармакокоррекция (Чита, 1991), на межвузовской конференции "Физиология и патология перекисного окисления липидов, гемостаза и иммуногенеза" (Полтава, 1993), международных конгрессах по иммунореабилитации (Сочи, 1994; Анталия, Турция, 1996; Эйлат, Израиль, 1997), на XII Российской научной конференции "Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях" (Челябинск, 1995), на Всероссийской конференции "Экологическая патология: вопросы биохимии, фармакологии, клиники" (Чита, 1995), на II съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 1995), на Всероссийской конференции "Актуальные вопросы службы крови и трансфузиологии" (Санкт-Петербург, 1995), на международной конференции по проблемам гемостазиологии (Санкт-Петербург, 1995), на Всероссийской научной конференции "Экологические интоксикации: биохимия, фармакология, клиника" (Чита, 1996), на I Российском конгрессе "Патофизиология органов и систем. Типовые патологические процессы" (Москва, 1996), на XVII конгрессе международного общества по тромбозу и гемостазу (ГБТН) (Вашингтон, США, 1999), XVIII конгрессе международного общества по тромбозу и гемостазу (18ТН) (Париж, Франция, 2001).

Внедрения в практику

Полученные данные внедрены в учебный процесс кафедр нормальной и патологической физиологии, микробиологии Читинской медицинской академии, на кафедре физиологии человека Читинского педагогического университета.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 251 странице машинописного текста, иллюстрирована 49 таблицами и 37 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав собственных исследований, обсуждения полученных данных, выводов и списка литературы, включающего 257 отечественных и 154 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Под наблюдением находилось 117 больных тяжелой формой панкреонекроза, которые оперированы способом динамической оментопанкреостомии. У больных применяли методы сорбционной терапии: лимфосорбция (43 чел.); гемосорбция (12 чел.); энтеросорбция (48 чел.). Пациенты, не получавшие сорбционные методы лечения составляли контрольную группу (31 чел.).

У наблюдаемых больных применялись гематологические, биохимические, иммунологические, гемостазиологические,

патоморфологические методы исследования. Полученные результаты сравнивались с показателями 120 здоровых доноров обоего пола в возрасте 20 - 40 лет.

Иммунологические тесты. Субпопуляции Т- и B-лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD8+, CD16+ и CD22+) исследовали методом непрямой поверхностной иммунофлуоресценции с использованием моноклональных антител. У части больных для оценки содержания Т- и B-лимфоцитов применяли методы розеткообразования (E-РОК, ЕАК-РОК), а Т-хелперов и Т-супрессоров -теофилиновый тест (Jondal М.,1972; Kerman B.et al., 1976; Bianko С., Patrik R.,1970; Shore A. etal., 1978).

Иммуноглобулины классов A, M, G у больных людей определяли методом ракетного иммуноэлектрофореза (Laurell G.,1966).

Концентрацию ЦИК исследовали методом преципитации с 3,5% и 7% полиэтиленгликолем (Digeon М. et al, 1977).

Кислородзависимые процессы в нейтрофилах периферической крови изучали в тесте восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест), кислороднезависимые - по содержанию лизосомальных катионных белков (ЖТ) (Пигаревский В.Е. и соавт., 1981). Фагоцитарную активность нейтрофилов исследовали с добавлением суточной культуры стафилококка по методу Н.В. Васильева и соавт. (1972).

Исследование системы гемостаза. Агрегацию кровяных пластинок изучали фотометрическим методом (Born G., 1962), в качестве индукторов агрегации использовали АДФ и тромбин.

Для исследования свертывания крови и фибринолиза использовали реактивы и фибринтаймер фирмы Behring (Германия). Коагуляционный гемостаз мы оценивали по следующим тестам: время свертывания крови (Lee

R.J., White P.,1913), время рекальцификации плазмы (Bergerhof H.D., Roka L., 1954), АЧТВ (Larrien M.J., Weillard С., 1957), протромбиновое (Quick A.J., 1943), тромбиновое время (Sirmai Е., 1957), этаноловый тест (Godai H., Helle J., 1963) и протаминсульфатный тест (Lipinski A. et al., 1968). Концентрацию фибриногена определяли коагулометрическим способом и радиальной иммунодиффузии. Содержание AT-III выявляли методом радиальной иммунодиффузии реактивами Behring (Германия).

Фибринолиз оценивали по времени лизиса эуглобулинового сгустка (Kowarzyk H, Buluk К., 1954).

Исследование системы комплемента. Влияние пептидов на общую гемолитическую активность крови оценивали по степени лизиса эритроцитов кролика (альтернативный путь активации системы комплемента) и по гемолизу сенсибилизированных антителами эритроцитов барана (классический путь активации системы комплемента) (Козлов JI.B., Соляков JI.C., 1982; Adrian P.G., 1983; Tanaka S. et al., 1986).

Выделение полипептндной фракции брыжеечных, бронхиальных, печеночных ЛУ, лимфы и крови. Пептидную фракцию ЛУ животных, лимфы и крови получали методом уксусно-кислой экстракции (Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. 1974). Образцы предварительно замораживали. После оттаивания при температуре 4°С ткани измельчали, заливали уксусной кислотой до конечной концентрации 1 моль в присутствии хлористого цинка. Осадок удаляли центрифугированием. К супернатанту приливали ацетон в соотношении 5:1. Смесь выдерживали в течение 12 часов для формирования осадка при температуре 4°С, затем цетрифугировали. Осадок отмывали ацетоном, высушивали. Полученный продукт растворяли в физиологическом растворе и использовали в иммунологических, коагулологических и биохимических тестах

Количественное определение белка. Для количественного определения белка образцы растворяли в 0,1 M трис-HCl буферном растворе рН=8,0 + 4M мочевина. Добавление мочевины диктовалось практически полной нерастворимостью образцов в буферном растворе, при этом растворимость увеличивалась незначительно и нерастворимый осадок удаляли центрифугированием в течение 1 часа при 8000 об/мин. Для анализа использовали надосадочную жидкость. Образцы брали в количестве 10 мг и растворяли в 5 мл 0,1 M трис-HCl + 4M мочевина. Аликвоты надосадочной жидкости использовали для количественного определения белка по методу Бредфорда. Количественное содержание . белка определяли по калибровочной кривой, используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин (Reanal, Венгрия).

Полипептидный состав образцов определяли в блоке полиакриламидного геля (10% акриламида) 12 х 15 х 0,07 см методом SDS электрофореза по Laemmly R.R. (1976). Навески образцов в количестве из расчета 1 мг белка растворяли в 0,5 мл буфера для растворения образцов (0,125 M трис-HCl pH 6,7 + 10% додецилсульфат натрия + 5% 29

меркаптоэтанола). После кипячения в течение 10 минут и охлаждения аликвоты в объеме 50 мкл вносили в «карманы» геля. Электрофорез проводили в течение 5 час при 150 мА. Гель окрашивали кумасси бриллиантовым синим (Reanal, Венгрия) в течение ночи и удаляли избыток окраски вымачиванием в отмывающем растворе при его многократной смене. Образцы распределяли на 2 пластины ПААГ.

После интенсивного перемешивания на магнитной мешалке в течение 2-х часов нерастворимый осадок удаляли центрифугированием, собирали супернатант и осветляли фильтрованием через фильтр Владипор №2 (размер пор 0,2 мкм). Затем каждый образец подвергали ультрафильтрации на ячейке Amicon (США) (объем 10 мл, диаметр фильтра 25 мм) через ультрамембранный фильтр РМ30 (Amicon, США) под давлением азота, пределы пропускания которого - белки ниже 30 кДа. Раствор, прошедший через фильтр, составлял 2-ю фракцию, остаток на фильтре - 1-ю фракцию. Образцы, составляющие 2-ю фракцию упаривали досуха, гидролизовали 6 н. HCl и определяли аминокислотный состав.

Гидролиз образцов проводили в запаянных вакуумированных стеклянных ампулах в течение 24 час при 110°С. После гидролиза образцы упаривали досуха, растворяли в 2 мл 0,2 М Na-ацетатного буфера рН=2,2 и аликвоты по 200 мкл наносили на колонки анализатора AAA 881 (Чехословакия). Анализ проводили в условиях кислотных гидролизатов по методу Moore и Stein (1988). Количественный расчет аминокислот проводили по %моль, которые определяли по калибровочной кривой в стандартной смеси аминокислот.

Гель-хроматография. Молекулярную массу полипептидов из ЛУ и лимфы определяли на колонке (13 х 600 мм) с сефадексом G-75 (фирмы «Pharmacia»), сгандартированной стандартом с известной М.М. Элюрование осуществляли 0,015М веронал-мединаловым буфером, пригатовленном на 0Д5М растворе хлорида натрия (pH 7,4) со скоростью 40мл\час. Объем фракции составлял Змл. В качестве стандартов использовали сывороточный альбумин человека (М.М. 68кД.), ингибитор трипсина из сои (М.М. 21кД.), и цистеин (М.М. 0,121кД.). Содержание белка в элюате определяли спектрофотометрический при длине волны 280 и 260 нм. В дальнейшем фракции тестировались по способности влиять на активность системы комплемента и процесс свертывания крови. Использовали по 0,1 мл из фракции. Контролем служил указанный буфер в объеме 0,1 мл.

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Хроматографический анализ полипептидов проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе «Irica Е» (Япония) методом обращенных фаз на колонке 4 х 250 мм. С сорбентом «Лихросорб РП-18 Т» (Япония). На колонку вносили пептидную фракцию в концентрации 1мг\мл. Элюцию осуществляли линейним градиентом плотности метанола (0-40%) со скоростью 1 мл\мин. При давлении 190 МПа и комнатной температуре в изократическом режиме. Использовали стандартную смесь метанола с водой в соотношении 2:3,

содержащую 0,01% фосфорной кислоты. Детекцию осуществляли на спектрофотометре«1пса Е-785» (Япония) в ультрофиолетовом спектре поглощения при длине волн 210 нм. Анализ хроматограм проводился автоматически с использованием хроматографического процессора «СЬгошаЮсагёег 12». Стандартная обработка хроматограмм велась в режиме регистрации времени выхода пиков, обсчета их площади удельной доли каждого пика. Для сравнительного анализа хроматограмм различных образцов применялся метод внешнего стандарта, где в этом качестве использовали образцы полипептидов с наибольшим содержанием пиков. В таблицах использованы показатели времени удержания пика фракции на сорбенте (мин.) и удельной доли обрабатываемого пика (% площади).

Статистическая обработка материала. Полученные данные обработаны методом вариационной статистики для связанных и несвязанных между собой наблюдений и вычислен показатель достоверности различий (Венчиков А.И., Венчиков В.А., 1974).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Иммунитет, гемостаз и неспецифическая резистентность организма у больных панкреонекрозом

При панкреонекрозе рано выявляются выраженные изменения в системе гемостаза, связанные с энзимемией, массивным поступлением продуктов распада тканей, выраженной активацией симпато-адреиаловой системы и др. Так, сосудисто-тромбоцитарный гемостаз характеризуется высокой агрегационной активностью тромбоцитов. Установлено, что кровяные пластинки реагируют сильнее, чем в крови здоровых доноров, на добавление малых концентраций АДФ, на средние и большие дозы АДФ - максимальной амплитудой и сокращенным временем агрегации. При добавлении в качестве индуктора агрегации коллагена или тромбина кровяные пластинки больных панкреонекрозом демонстрируют высокую амплитуду агрегации.

В коагулограмме больных панкреонекрозом выявлялись сокращенными время свертывания, время рекальцификации, протромбиновое время, АЧТВ, тромбиновое время. У таких больных снижался уровень антитромбина-Ш, укорачивался тотальный эуглобулиновый и Хагеманзависимый фибринолиз. При этом у пациентов нарастали продукты деградации фибриногена/фибрина.

Перечисленные факты позволяют заключить, что у пациентов с панкреонекрозом развивается острый ДВС-синдром.

Как показали наши исследования, у больных с панкреонекрозом выявляются изменения в иммунограмме. Так, у больных резко снижается общее число лимфоцитов, уменьшается численность основных субпопуляций лимфоцитов (С04+, СЭ8+, 'СО 16+, С1322+). На этом фоне развивается дисбаланс основных классов иммуноглобулинов О, М, А.

Исследование клеточных механизмов неспецифической защиты у пациентов с панкреонекрозом свидетельствует, что развитие заболевания сопровождается снижением функциональной активности нейтрофилов периферической крови. Так, у больных снижается показатель фагоцитоза и фагоцитарное число, при этом переваривающая способность клеток существенно уменьшается. Несмотря на высокий лейкоцитоз и значительное увеличение количества нейтрофильных гранулоцитов, клетки в меньшей степени демонстрировали т.н. «кислородный взрыв» (НСТ-тест), свидетельствующий об их активации. При этом существенно снижается содержание лизосомальных катионных белков.

Учитывая острое течение заболевания и снижение функциональных показателей нейтрофилов можно говорить о развитии у больных панкреонекрозом феномена лейкоцитарной депрессии, описанного Ю.А.Витковским (1997). Указанный феномен, по утверждению автора, является показателем тяжести патологического процесса.

Таким образом, панкреонекроз сопровождается грубыми нарушениями защитных систем - иммунитета, гемостаза и неспецифической резистентности организма, составляющих ключевые звенья патогенеза тяжелого заболевания (рис. 1).

Влияние сорбционной терапии на состояние иммунитета, гемостаза и неспецифической резистентности при панкреонекрозе

При панкреонекрозе развивается колоссальная нагрузка на лимфатическую систему организма. В связи с этим в процессе лечения панкреонекроза важное место принадлежит методам сорбционной детоксикации в связи со значительными напряжениями и возможной декомпенсацией дренажной функции организма.

В процессе лечения панкреонекроза мы использовали несколько методов:

А) лимфосорбцию - эксфузия 4-6 л лимфы через наружный дренаж грудного лимфатического протока, очистку ее с помощью угольных сорбентов (СКН , КАУ и др.) и внутривенную реинфузию 3-5 л лимфы/сут. Процедуры продолжали в среднем 4-6 суток.

Б) гемосорбция - сорбционную детоксикацию крови выполняли по замкнутой циркуляционной системе — вено-венозной или вено-артериальной: например, лучевая артерия — подключичная вена. В гемоперфузионный контур включается оксигенатор и теплообменник (аппарат АСО-2). Гемосорбцию осуществляли через массообменник объемом 400 мл, заполненный активированным углем СКН-2М, СКН-ЗМ и т.п. Скорость экстракорпоральной перфузии составляла 100-120 мл/мин, объем перфузии за один сеанс — 2,5-3,0 ОЦК.

Рис.1. Основные звенья патогенеза острого панкреатита.

В) энтеросорбцию - кремнийорганический полиметилсилоксановый сорбент "Энтерогель" - вводили по 15-30 г на 60-120 мл теплой воды через назогастральный зонд или еюностому 3 раза в сутки в течение 10 дней. Последний метод сорбционной детоксикации по нашему опыту прост в применении, не связан с проведением трудоемких инвазивных манипуляций, по лечебной эффективности мало в чем уступает предыдущим.

Проведенные исследования показали, что уже в первые дни болезни возрастает количество лейкоцитов, тогда как общее число лимфоцитов значительно снижается. У таких больных нарастает абсолютное число клеток, несущих кластеры СОЗ+, СБ4+, С08+ и СБ 16+ и С022+.

Одновременно у больных панкреонекрозом наблюдаются выраженные изменения со стороны гуморального иммунитета.

К 5-му дню наблюдения у пациентов, у которых не применялись никакие методы сорбционной терапии усиливались изменения в иммунограмме, при этом соотношение С04+/С08+ резко уменьшался за счет снижения числа Т-хелперов. Содержание иммуноглобулинов существенно снижалось по сравнению со здоровыми людьми.

Использование сорбционной терапии уменьшает сдвиги в иммунограмме. При этом в меньшей степени потребляются Т-хелперы в процессе иммунного ответа.

Наши наблюдения показали, что у больных панкреонекрозом резко снижается содержание лизосомальных катионных белков нейтрофилов, играющих чрезвычайно важную роль в предупреждении инфекционных процессов и уничтожении лиганда во время фагоцитоза. Кроме того, у таких больных падает фагоцитарный индекс. Представленные данные говорят о том, что у таких больных нарушается неспецифическая защита, тесно связанная с функцией клеточного и гуморального иммунитета. Все это является факторами, предрасполагающими к развитию гнойно-воспалительных осложнений и препятствующими репаративным процессам.

При использовании терапии без сорбционных методов каких-либо существенных сдвигов в изучаемых показателях неспецифической резистентности нами не обнаружено: фагоцитарный индекс и содержание катионных белков оставались на низких цифрах, тогда как концентрация СЗ-компонента комплемента продолжала значительно превышать норму.

Если же для лечения больных применялись сорбционные методы лечения, то картина резко менялась. В этих случаях фагоцитарная активность возрастала более чем в 2 раза, увеличивалось содержание катионных белков, а уровень СЗ-компонента комплемента заметно повышался.

Представленные данные говорят о том, что сорбционные методы лечения не только улучшают состояние клеточного и гуморального иммунитета, но и благоприятно действует на неспецифическую резистентность организма.

При использовании стандартной терапии явления хронического ДВС-синдрома лишь слегка уменьшаются. При этом остается сокращенным время

свертывания крови и рекальцификации плазмы, уменьшенным АЧТВ, сниженной концентрация А-Ш, более чем в 2 раза по сравнению с нормой увеличенной концентрация фибриногена и у 65% больных сохраняется положительный этаноловый тест. У таких больных все виды изучаемого нами фибринолиза остаются резко заторможенными. Все это ставит больного в чрезвычайно тяжелое положение, ибо препятствует доставке кислорода и питательных веществ к пораженным участкам ткани, а также удалению токсических продуктов распада из зоны повреждения.

При использовании сорбционной терапии у таких больных время свертывания крови, рекальцификации плазмы, АЧТВ, протромбиновое и тромбиновое время достигают нормы. Практически возвращается к нижней границе нормы уровень АТ-Ш у больных, получавших сорбционную терапию. Вместе с тем, у этой группы больных по сравнению с нормой остается увеличенной концентрация ПДФ, заторможенным фибринолиз и выявляется положительный этаноловый тест.

Таким образом, применение сорбционной терапии позволяет существенно уменьшить проявления гиперкоагуляции.

Характеристика пептидов лимфатической системы и плазмы крови

Методом гельфильтрации установлено, что выделенные из ЛУ вещества пептидной природы сосредотачивались в области белков с молекулярной массой от 3 до 30 кД. Метрдом аналитическолй ВЭЖХ пептиды из брыжеечных, бронхиальных и печеночных ЛУ разделились соответственно на 9, 7 и 11 фракций. Обращает на себя внимание сходство хроматографического профиля пептидных фракций, выделенных да различных ЛУ.

Таким образом, полипептиды, выделенные из брыжеечных, бронхиальных и печеночных ЛУ имеют сходный состав с М.М. до 30 кД., содержат пептиды с гидрофобными фрагментами молекл, включает не менее 711 пептидных фракций и проявляют физиологическую активность в различных фракциях с М.М. от 3 до 20 кД.

Хроматографический профиль элюции пептидов плазмы и сыворотки крови несколько отличается от пептидов лимфы. Пики основного выхода вещества в хроматограммах плазмы смещены на 0,5 минуты. В цитомединах плазмы крови 74-87 % вещества сосредоточено в первом пике, тогда как полипептиды лимфы распределены более равномерно (рис.2,3,4,5).

О <9

z

о tfOH^NMi 9

о

Г) и н о Pi M * 1 Ф

*> - w ®

СО.*«

f

•

¿

л rtrrrr

®

•9

*

• I «Л Л 'í W N Ю W \0 i»

■J)

'I ч а (.fNMfltO^

а о о M T Ф !"> U> N-f) M M

+ (4

<1 ftrtxtt«-**«!*? 4»

б w ç»

о

с

о

M ь

а l. 4, t£> Oj 1 Л}

ttl^-il-H'r

h и » » • • • • » .

r. ci л -« a h t г-

f ♦ ,| _< -. _ .J

Ô

fi

1 S' ш

i 0 £ <t

• С' I b

— г o

г H

D f. (л

о

Рис.2. Хроматограмма цитомединовой фракции цитратной лимфы.

и -югоошг 6

Z >0 ill '5> ff - Œ ®

о Í (û f Г-. <l\ N <5

о « 10 t ft И Я 5

NO И ft 1413 0

О

n -

a. is

♦

s

а V ZZ E

Q t

<3

s

X t-'í» Í î*) 'û m

f.

ее- и Ю IJi fî (Tb < О n

и о о m

+ ¡o а. n и m * Г)

■ m»N r m* N

i -ITC t ^ n

« CI

о

0

я

— M-iiöPN

U.1'/ ......

O v; о V О « CI Т N

О V ** — -ч ». ^

4

ф

о а m J

с о X. 'I

X о а 1-

н - X О

U1 1-

Рис.3. Хроматограмма цитомедияовой фракции цитратной плазмы крови.

и О

X N «> Г» Г ^ Л»

о * СО N N

а СО (Э СЬ ♦ (0 Ф

г © * * (9

■Т а

Й- г*

0. <3

♦

®

О * ггг СЕ

о £

<9

О

I ГЧ ГО тН

1ПЧ) *

1 * ОТ

01 С о ® г > «л о ча Ъ

+ ^ б П « <1 V) N

1 «акимр" П

© Г» 01

9

а

о

г

>- Ъ Л ? *

* & •Ч и" М '-1 Г» ?

гч <"Э С» '•] |. -о

И.Р

1 Л. о 1 Г' Г.

| +

•э

о

1 О ш J

, 9 <1

О 3

о

1 • К

<У <*> * 1Л Ф

Рис.4.

Хроматограмма полипептидной фракции сыворотки лимфы.

н tf ft V I 'J '¿i я

«9Ji-1Tk. О

о ® оо <•' ' 'i о

tnf-íiP О

ÖnM'iWfl-

O У С Z ЕЕ

Í5

O m «-J 'J3 'О ч> О

о -л ю п о in

'О ''J W t ~ il ^ Ifl

O-flftWft® \f>

(M <ji m © o N N.

««PjHÇQ'flfl £

«o-

к in r I*I cr» V a, -'ism. r.

4» .M Л л, •>,

Рис.5.

Хроматограмма цнтомединовой фракции рекальцифнцированной плазмы (сыворотки).

CAI . METHOD ÔO

F РА PB

.1OOG0O, .»5 ? . : GÖ0@i«-*-01 .10 oaoe.. ,<•01

N0 . МАМЕ - т Я OR H M к сонс

1 3 .257 10522а M 2 .0265

2 4 1056376 H 23 .3562

s .337 1210337 M 23 1310Э

4 з .365 SCSIS3 П . 10 .8044

? -.7Í-7 lassas* 24 .1363

•а 109311 M г .1090

7 э .if 4 0 336413 M lo .7139

S 16> зээээ , M i .1355

э 10 .31 * 141421 M 2 .7236

10 11 .0-12 134033 ri г .3813

Г 0 Тй L 3 1 S 24 0 1 100

Рис.6. Хроматограмма цнтратной лимфы больных с панкреонекрозом

CAL . HFTHOD ОС'

. \ Г.ООАО- г .IOOÍV 4V« + ÛJ .1 öl

МАЙЕ RT а о; - m: С 'JHC

4 .507 «SG2* . п £3 .0*33

- .ззэ 926.;. M .1254

» .910 2050S1 я Г .3342

7 .775 3 2 S 3 5 С' M 1t .6353

? .эе? 34£S34 12 .4037

3 .397 H 3 .3093

.бЭЭ 2235 i A И 7

TOTAL 27ЭС11 1 100 .0303

Рис. 7 . Хроматограмма интратной плазмы больных с пянкреонекрозом

Рис. 8 • Хроматограмма сыворотки лимфы больных с панкреонекрозом

Рис. 9 . Хроматограмма сыворотки крови больных с панкреонекрозом

Свертывание плазмы крови вызывает аналогичные изменения в составе пептидов. Как после свертывания лимфы, в пуле пептидов рекальцифицированной плазмы исчезал первый пик (8% вещества), выходящийпри разделении пептидов нитратной плазмы на седмой минуте. С 10 до 17% увеличивалась доля вещества в пике, выходящем на тринадцатой минуте. В пептидах лимфы соответствующий пик увеличивалась с 22 до 34%.

Подобно полипептидам, полученных из различных групп лимфоузлов, лимфы и плазмы животных, мы исследовали хроматографический профиль пептидов, выделенных из лимфы и плазмы крови больных панкреонекрозом (рис. 6,7,8,9).

Установлено, что полипептидный пул цельной лимфы содержит не менее 10 различных пиков, из которых наиболее значимые в количественном отношении являются 5 пиков. Пептиды сыворотки лимфы разделялись на 10 пиков, однако основной выход вещества сосредоточен в 3 пиках.

Полипептиды выделенные из плазмы крови содержит в своем составе 7 пиков, с основным выходом вещества в 4 пиках, а сыворотки включает в себе 11, с основным выходом вещества в 3 пиках.

Тонкослойная хроматография в ПААГ

Нами изучен полипептидный спектр методом тонкослойной хроматографии в полиакриламидном геле. Обнаружено, что основные пептидные фракции, выделенные из разных групп лимфатических узлов, лимфы и крови лежат в пределах от 5 до 15 кД. Пептиды брыжеечных лимфатических узлов I порядка содержат максимальное число фракций, причем молекулярная масса большинства фракций находится в диапазоне 2-5 кД. Полипептиды брыжеечных лимфатических узлов II порядка на хроматограмме распределяются в диапазоне от 5 до 15 кД. Хроматограмма пептидов бронхиальных лимфатических узлов отличается небольшим количеством фракций, локализующихся на метке 4 кД и 14 кД. Полипептидный пул печеночных лимфоузлов характеризуется наличием наибольшего числа фракций с усилением хроматографического профиля в районе 3-4 кД и 13-15 кД.

При исследовании полипептидов, выделенных из нативной лимфы грудного лимфатического протока установлено, что основные пики находятся в пределах 7-17 кД, в то время как пептиды сыворотки лимфы расширяют нижнюю границу молекулярной массы до 3 кД. Аналогичная картина наблюдается и для пептидов, выделенных из плазмы и сыворотки крови.

Таким образом, полипептидный спектр различных групп лимфатических узлов, лимфы и крови различается по молекулярной массе.

Гельфильтрация полипептндов лимфы и крови

Нами изучены следующие полипептиды: 1) цельной (нативной) лимфы; 2) сыворотки цельной лимфы; 3) цитратной лимфы; 4) цитратной плазмы; 5) выделенные из сыворотки крови, свернутой 0,025М раствором СаС12; 6) выделенные из сыворотки, полученной предворительным свертыванием плазмы тромбином.

Гельфильтрация на сефадексе 0-75 позволила установить идентичность хроматограмм цитомединов цитратной лимфы и цитратной плазмы (рис. 10,11), а также значительное сходство кривых хроматографического профиля элюируемых пептидов из сыворотки лимфы и крови (рис. 12,13).

Пептиды лимфы и плазмы распределялись в области молекулярных масс до 25 кД. С выходом основного вещества в области молекулярных масс 17-20 кд. Пептиды сыворотки распределялись более равномерно: выявлялись 4 пмка. Причем, увеличивались содержание как низко-, так и высокомолекулярных компонентов.

Антикоагулянтнный фактор пептидов, приводящий к удлинению времени рекальцификации и действующий на контактную фазу свертывания, выявлялся только в пептидах цитратной лимфы и цитратной плазмы. В процессе свертывания плазмы и лимфы фактор полностью потреблялся. Ингибиторы контактной фазы свертывания обнаруживались в диапазоне молекулярных масс от 5 до 20 кД с пиком активности в области 10-18 кД.

Аминокислотный состав полапептидов

В следующей серии исследований мы изучили аминокислотный состав полипептидов.

Как показали наши исследования в процессе свертывания крови и лимфы существенно изменяется аминокислотный состав сыворотки. Так, после солянокислого гидролиза полипептидов, выделенных из сыворотки лимфы происходит увеличение процентного содержания серина, глютаминовой кислоты, пролина, аланина, фенилаланина и, особенно, валина. Одновременно с этим в гидролизатах резко снижается концентрация гистидина, лизина и аргинина.

Гидролизат полипептидов сыворотки крови в отличие от плазмы отличается увеличением содержания положительных аминокислот гистидина, лизина, аргинина, но снижением концентрации валина, серина, пролина.

Сравнительный анализ относительного содержания аминокислот в образцах полипептидов, полученных из сыворотки показывает, что после свертывания крови в пуле пептидов количество лизина, аргинина, гистидина, лейцина, фенилаланина существенно выше, чем после свертывания лимфы. При этом заметно снижается количество серина, глютаминовой кислоты, пролина, глицина, аланина. В составе полипептидов плазмы крови по

(ч) Ю

Ы. СкД)

Рис.10 Характеристика пептидных фракций цитратяой лимфа: I - гальфкльтрадия аа сефадексв-75; И - время рекаяьдифякацяя, тестируемое после внесения соответотаупаай фрайда элюата к плазме здоровых лопоров; Ш - тромбияовое время;

17 - оЗдая гемолитичэокая активность яомпламанта

(клаосичаоквй путь). Выделаны фракции, обладанииа основной биохимической азггивностгс.

ftio.11

петздов /ил/

/мд/

■/мя/

нитратной шизмыг

В - время ракальцификации, тестируемое поела внесения соответствующая фракции элпата к плазма вдоровах доноров: Ш - тромбияовое время;

1У - оооая гемалитичасжая активность комплемента

(ляаосичаекпЯ пум), йщалвян фракции, ойладапдив основной биожимитаскоа активностью.

к> и>

пептидоа /мд/

Ли/

Рио. 12 Характеристика пептидных фракшй сывороига лимфа: I - гвльфвльтрация ва свфадексв-75; Я - время ракалышфихасяя, тестируемое после внеоения ооотввтотБупцзй" фракции элпата к плазма здороагг доноров; Ш - троыбиновов время;

1У - оОщая гемолитическая активность комплемента

Склаооичооквй путь). Выделена фракции, ойладапдаа основной биохимической активностью.

;оэ М

•/ж/

РИ0..13

/ид/

Характераотяла пептидта фраший снворотяи крови:

I - гельфильтрадяя ва овфадвксв-75;

II - время рвкальцификадяи, тестируемое посла

внесения соответствуй»П фракции злгата к плазме здоровых доноров; Ш - троыбиновов время ;

II - оадая гемолитическая амиваооть комплемента

(дяаооичесхиЯ путь). Ввяелеян фрагции, обладание осаоавоИ йиогамггескоа активностью.

сравнению с пептидами лимфы содержание серина, валина, изолейцина, лейцина, тирозина, фенилаланина и гистидина выше, а лизина, аргинина, пролина, глицина - ниже

.Нами исследовано относительное содержание аминокислот в полипептидной фракции брыжеечных, бронхиальных и печеночных лимфатических узлов. Установлено, что пептиды брыжеечных лимфатических узлов по сравнению с другими группами содержат заметно меньше аспарагина, треонина, серина, но существенно больше глицина и лизина. Пептидная фракция печеночных лимфоузлов отличается высоким содержанием глютаминовой кислоты, достигающим 30%, а бронхиальных лимфоузлов -аланина и низким содержанием лизина.

Как показали исследования аминокислотного состава (рис.14), полипептиды лимфы у больных с панкреонекрозом характеризуются высоким содержанием аспарагиновой кислоты, глютаминовой кислоты, глицина и аргинина. Полипептиды плазмы крови включают в своем составе относительно большое количество серина, глицина, лейцина, фенилаланина, аргинина и, особенно, валина. К сожалению, у нас нет возможности сравнить эти данные с пептидами лимфы здоровых людей, однако косвенно о качественном составе аминокислот лимфы можно судить сравнивая с литературными данными (Панченков Р.Т., Ярема И.В., Сильманович H.H., 1986). Пептиды лимфы при панкреонекрозе по аминокислотному составу отличаются от цельной лимфы более высоким содержанием аспарагиновой кислоты, глютаминовой кислоты, лизина и аргинина, и значительно меньшим количеством пролина.

Аминокислотный состав полипептидов плазмы при панкреонекрозе отличаются от аминокислотного состава плазмы здоровых доноров высоким содержанием аспарагиновой кислоты, валина, фенилаланина и низким -тирозина, лизина.

Полученные результаты свидетельствуют, что полипептиды лимфы и крови при панкреонекрозе существенно отличаются по аминокислотному составу.

Влияние полипептидов на защитные системы организма в норме и при

панкреонекрозе

Влияние полипептидов лимфатической системы на экспрессию рецепторов лимфоцитов больных панкреонекрозом в опытах in vitro определяли с помощью спонтанного розеткообразования.

Нами установлено, что все изучаемые полипептиды лимфы в опыте in vitro достоверно увеличивают число Т-активных лимфоцитов (р < 0,05). Однако только пептиды брыжеечных и печеночных ЛУ повышают розеткообразование Т-общих лимфоцитов (р < 0,05). Усиление экспрессии

Рис.14 Процентное содержание аминокислот пептидов лимфы и крови больных НП после

солянокислого гидролиза

♦—Цельная лимфа - ■■ - Плазма крови

рецепторов В-лимфоцитов мы наблюдали в присутствии всех полипептидов, за исключением пептидов бронхиальных ЛУ.

В отдельной серии экспериментов мы исследовали полипептидный пул, выделенный из лимфы и плазмы больных с панкреонекрозом.

Как показали наши исследования развитие панкреонекроза сопровождается снижением иммуностимулирующих свойств полипептидов лимфы. К сожалению, мы не смогли сравнить, по понятным причинам, с пептидами лимфы здоровых людей. Однако этот недостаток восполняет сравнительное исследование пептидов плазмы, которые, как мы установили, повторяют динамику пептидов лимфы. Выявлено, что полипептиды, полученные из плазмы больных панкреонекрозом также теряют свое влияние на экспрессию рецепторов лимфоцитов, в то время, как пептидный пул плазмы здоровых доноров активно стимулировал розеткообразующую функцию клеток. Следовательно, снижение иммуностимулирующих свойств полипептидов лимфы больных связано с изменением состава биологически активных фракций.

Выяснено, что пептиды из брыжеечных, брохнхиальных, печеночных ЛУ и лимфы повышают фагоцитарный показатель на 27-88%, а также фагоцитарный индекс — на 18-62%.

Наименьшую стимулирующую активность проявляли полипептиды, выделенные из бронхиальных ЛУ, наибольшую — Полипептидная фракция ЛУ печени.

Пептиды, выделенные из нативной лимфы были гораздо активнее, чем пептиды цитратной лимфы с удаленными центрифугированием клеточными элементами. Фагоцитарный показатель под действием пептидов цитратной лимфы увеличивался на 24%, тогда как в присутствии пептидов, нативной лимфы фагоцитарную активность начинали проявлять в 2 раза большее количество клеток (стимуляция на 89%).

О фагоцитарной и метаболической функции гранулоцитов позволяет судить тест восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест). В наших исследованиях метаболическую активность нейтрофилов значительно активировали все пептиды лимфатической системы (ЛУ и лимфы). Пептиды, выделенные из ЛУ печени, увеличивали число метаболически активных нейтрофилов в 3,5 раза; пептиды из ЛУ брыжейки - в 2,8 раза; пептиды бронхиальных ЛУ - в 2,2 раза; пептиды цельной лимфы - в 3 раза и пептиды цитратной лимфы - в 0,8 раза. Аналогично изменялся и индекс активации нейтрофилов, пропорциональный площади клеток с диформазановыми отложениями.

При исследовании полипептидов, выделенных из лимфы и плазмы больных панкреонекрозом выявлено, что они существенно активируют фагоцитарные показатели крови, стимулируют поглотительные функции нейтрофилов, однако при этом снижается показатель завершенности фагоцитоза. Одновременно с этим стимулируются кислородзависимые и кислороднезависимые процессы в нейтрофилах.

Влняние пептидов на свертывание крови

Наши исследования были направлены на изучение действия полипептидов лимфатической системы — лимфы и различных ЛУ — на состояние коагуляционного гемостаза и фибринолиза плазмы крови.

Нами исследовались дозозависимые эффекты петидов (1; 0,5; 0,25; 0,05 мг\мл). Установлено, что все исследованные нами полипептиды обладали дозозависимым гипокоагуляционным эффектом в отношении контактной фазы свертывания крови, пептиды лимфы эффективно тормозили и образование протромбиназы.

Щелочные полипептиды из ЛУ удлиняли время рекалыдификации ив меньшей степени каолиновое, кефалиновое, протромбиновое время.

Сокращение тромбинового времени в наших экспериментах обусловлено наличием пептида, обладающего антигепариновой активностью. Об этом свидетельствуют результаты следующей серии опытов. После добавления к цитраткой плазме равного объема раствора гепарина (0,5 ед\мл) время рекальцификации удлинялось в 3,5 раза. Однако в присутствии пептидов лимфы или пептидов из брыжеечных ЛУ гепарин не удлинял времени свертывания, то есть активность гепарина оказалась нейтролизованной антигепариновым фактором (табл. 1)

Исследование влияния пептидов лимфы и плазмы больных с панкреонекрозом на свертывание крови показало, что изучаемые вещества вызывают укорочение времени рекальцификации плазмы, протромбинового, тромбинового времен, АЧТВ. Мы обясняем это явление тем, что при панкреонекрозе в лимфе меняется спектр полипептидных фракций, среди которых уменьшается содержание пептидов, обладающих антикоагулянтным действием. Одновременно на этом фоне усиливается действие антигепаринового фактора, который не потребляется в процессе гемокоагуляции.

Таблица 1.

Влияние пептидов лимфы и брыжеечных лимфатических узлов на

свертыванне гепариннзированной плазмы (М ± т)

Вариант опыта Контроль Пептиды лимфы, 1 мг/мл Пептиды брыжеечных ЛУ, 1 мг/мл

Цитратная плазма + 0,025М СаС12 439 + 10 362 ± 11 р <0,001 173 ±7 р < 0,05

Цитратная плазма с добавлением равного объема гепарина (0,5 ед./мл) + 0,025М СаС12 478+33 378 ±27 р < 0,05 171 ±5 р< 0,001

р - достоверность различий по сравнению с контролем.

27

В результате исследований было выявлено резкое торможение Хагеман-зависимого фибринолиза в присутствии полипептидов в дозах 1 и 0,5 мг\мл. цитомединов лимфы, которые замедляли лизис фибринового сгустка в дозировке 0,125 мг\мл. Действие пептидов в данном случае аналогично механизму влияния на контактную фазу свертывающего каскада и связано со снижением ферментативной активности фактора Хагемана и калликрейна, о чем говорит резкое замедление времени рекальцификации.

Пептидный пул полипептидов лимфы и плазмы больных сокращают время лизиса эуглобулинового сгустка, указывая на наличие факторов, активирующих фибринолиз и отсутствие факторов, ингибирующих лизис фибринового сгустка.

Влияние полипептидов на систему комплемента

Выделенные нами пептиды из брыжеечных, бронхиальных и печеночных ЛУ не изменяли активацию комплемента по альтернативному пути (АПК) и неоднозначно влияли на классический путь активации системы комплемента (КПК). Пептиды брыжеечных ЛУ активировали, тогда как пептиды из бронхиальных ЛУ ингибировали КПК. Суммарная цитомединовая фракция печени не изменяла КПК, тем не менее при разделении пептидов методом гельфильтрации выявлялся слабый активирующий эффект. Интересно, что при аналогичном разделении цитомединов бронхиальных ЛУ обнаружены как фракция, предотвращающая активацию КПК, так и фракция, оказывающая противоположное действие. Активирующая КПК фракция имела большую молекулярную массу, чем ингибирующая: 15-25 и 5-15 кД соответственно.

Выяснено, что пептиды, выделенные из цитратной плазмы, дозазависимо ингибируют как классический, так и альтернативный путь активации комплемента (соответственно на 62% и 40%). Пептиды, полученные из сыворотки лимфы, тормозят классический и не влияют на альтернативный путь активации комплемента. В процессе свертывания лимфы частично снижается уровень антикомплементарных факторов, действующи на КПК и исчезают антикомплементарные факторы, воздействовавщие на АПК. Отсюда можно предположить, что в пептидной фракции лимфы содержатся как специфические факторы, воздействующие лишь на КПК, так и неспецифические ингибиторы комплемента, параллельно участвующие в регуляции свертывающего каскада и потребляющиеся в процессе свертывания.

При панкреонекрозе только полипептиды плазмы сохраняли свою активность относительно классического пути активации системы комплемента, повышая гемолитическую активность крови. Полипептидная фракция лимфы больных панкреонекрозом не оказывала своего влияния на систему комплемента.

На основании полученных данных можно схематически представить взаимосвязь лимфатической системы и единой интегральной клеточно-гуморальной системы защиты организма следующим образом (рис 15).

Лимфатическая система получает афферентную информацию от всех органов и систем посредством гуморальных факторов, составляющих метаболиты клеток. Эфферентная функция лимфатической системы сводится к продукции гуморальных факторов, поступающих в кровоток и являющихся сигналами для всех органов и систем многоклеточного организма. Такими сигналами могут быть цитокины, иммуноглобулины, различные пептидные молекулы и другие. Если цитокины и иммуноглобулины являются универсальными молекулами, способными вызывать биологические эффекты в любом органе, то среди полипептидов имеются молекулы как общего, так и местного значения. В последнее время именно органным полипептидным факторам отводят ведущую роль в третичной дифференцировке лимфоцитов, в результате которой они приобретают органотропную информацию и становятся способными к хоммингу. Одновременно с этим полипептиды лимфатической системы содержат фракции, оказывающие влияние на неспецифическую резистентность организма (фагоцитоз, система комплемента, лизоцим и.т.д), а также на систему гемостаза.

В связи с вышесказанным можно утверждать, что усиление дренажной функции лимфатической системы способствует более эффективной работе единой интегральной клеточно-гуморальной защитной системы организма в условиях патологического процесса.

ВЫВОДЫ

1. Выделен полипептидный комплекс из лимфы и лимфатических узлов, отличающийся между собой по молекулярной массе, аминокислотному составу и физиологическим свойствам. Молекулярная масса полученных полипептидов лимфы, лимфатических узлов и плазмы находится в пределах 1-30 кДа.

2. Пептиды лимфы и плазмы сходны по хроматографическому профилю элюции и разделяются на 8 фракций. Пептиды сыворотки лимфы и крови отличаются от пептидов лимфы и плазмы большей степенью гидрофобности и меньшим содержанием низкомолекулярных соединений. Полипептиды ЛУ сходны по составу, разделяются методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на 7-11 фракций, различающихся по молекулярной массе и степени гидрофобности. Наибольшей гидрофобностью обладают полипептиды брыжеечных ЛУ.

3. Полипептидные комплексы лимфы и лимфатических узлов обладают выраженным антипротеазным действием. Полипептиды лимфы, и в меньшей степени ЛУ, тормозят контактную фазу коагуляционного

гемостаза. Пептиды лимфы ингибируют формирование протромбиназы по внутреннему и внешнему пути. Антикоагулянтный фактор изучаемых полипептидов сосредоточен в диапазоне молекулярных масс 5-20 кД с пиком активности, соответствующим 15 кД. Полипептиды, выделенные из сыворотки лимфы теряют антикоагулянтный эффект. В составе полипептидного комплекса ЛУ и лимфы содержится антигепариновый фактор, соответствующий молекулярной массе 10-18 кД. В процессе свертывания лимфы антигепариновое действие пептидов сохраняется. Пептидные фракции ЛУ ингибируют тотальный и Хагеман-зависимый фибринолиз.

4. Полипептиды лимфатических узлов и лимфы понижают общую гемолитическую активность крови, ингибируя классический и альтернативный пути активации системы комплемента. Свертывание лимфы снижает антикомплементарную активность полипептидов.

5. Полипептиды ЛУ и лимфы стимулируют кислородзависимые и кислороднезависимые процессы нейтрофилов, а также повышают их фагоцитарную активность. Пептиды, выделенные из лимфатических узлов и лимфы и внесенные в культуру клеток периферической крови, увеличивают экспрессию рецепторов на Т- и В-лимфоцитах здоровых людей и больных со вторичными иммунодефицитами. Полипептиды ЛУ регулируют процесс хомминга клеток.

6. У больных панкреонекрозом на фоне вторичного клеточно-гуморального иммунодефицита и ДВС-синдрома изменяется качественный состав полипептидного комплекса, выделенного из лимфы и плазмы больных, а также снижаются их иммунореактивные и гемостатические свойства.

7. Применение лимфостимулирующей и сорбционной терапии у пациентов с панкреонекрозом улучшает клиническое течение заболевания, повышает у них содержание лимфоцитов, несущих поверхностные маркеры СБЗ+, СБ4+, СВ8+, СО 16+, С022, усиливает фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови, уменьшает признаки ДВС-синдрома.

8. Лимфатическая система, являясь важным связующим звеном между тканевой жидкостью, кровью и органами, участвует в регуляции гомеостаза организма через единую интегральную клеточно-гуморальную систему защиты, включающую иммунитет, гемостаз и неспецифическую резистентность организма.

Рис. 15 Участие пептидов лимфы и лимфатических узлов в регуляции гомеостаза.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При ианкреонекрозе патогенетически оправданным методом лечения являются лимфостимулирующая и сорбционная терапия. Контролем над эффективностью применяемого лечения служат показатели клеточного и гуморального иммунитета (содержание субпопуляций лимфоцитов, концентрация иммуноглобулинов), показатели системы гемостаза, а также неспецифической резистентности организма (комплемент, фагоцитоз). Повышение количества иммуноцитов, устранение гиперкоагуляции, ликвидация феномена лейкоцитарной депрессии являются критериями благоприятного течения заболевания.

2. В качестве дополнительного теста может служить исследование антикоагулянтного антигепаринового действия полипептидов лимфы и крови. В случае снижения антикоагулянтного и увеличения антигепаринового эффекта полипептидов лимфы и плазмы можно судить об усугублении внутрисосудистого свертывания крови.

3. Потеря стимулирующего действия полипептидов лимфы и крови на Т- и В-лимфоцитах в краткосрочной культуре клеток свидетельствует о глубоких нарушениях в иммунитете больных панкреонекрозом.

4. Угнетение фагоцитарной, секреторной и медиаторной функции нейтрофилов периферической крови у больных панкреонекрозом указывает на развитие феномена лейкоцитарной депрессии. Это явление свидетельствует о тяжести патологического процесса.

5. При панкреонекрозе полипептиды лимфы и плазмы крови имеют идентичные иммунокорригирующие и гемостатические свойства, чтс позволяет при невозможности исследования лимфы, изучить полипептидь плазмы крови.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гемолитическая активность комплемента лимфы Н Система комплементг - Москва, 1988. - С. 80-81.

2. Влияние полипептидов лимфы на свертываемость крови гемолитическую активность комплемента // Цитомедины. - Чита, 1988. С 36-37.

3. Некоторые практические аспекты катетеризации грудног лимфатического протока // Актуальные вопросы хирургии, анестезиологи и реаниматологии детского возраста. - Днепропетровск. - 1989. - С. 93-93.

4. Полипептиды (цитомедины) системы крови и комплемент // Поиск новых лекарственных средств и их исследование в клинике - Чита, 1990. - С. 168170. (Соавт. Ложкина А.Н., Колдаев P.A., Аюшиев O.A.).

5. Влияние полнпептидов из лимфы на некоторые показатели свертывания крови и гемолитической активности комплемента // Материалы 53-ей Всесоюзной конференции. - Тбилиси, 1990. - С. 39-40.

6. Влияние полипептидов лимфы на гемостаз и неспецифическую резистентность организма // Материалы 1-ой Всесоюзной научной конференции «Актуальные проблемы лимфологии». - Волгоград, 1991. С.45-47.

7. Изменение некоторых показателей гемокоагуляции и неспецифической резистентности при экспериментальном плеврите и их коррекция путем дренирования грудного лимфатического протока // Материалы 54-ой Всесоюзной научной конференции. - Тбилиси, 1991. - С. 45-47.

8. Влияние полипептидных фракций лимфатических узлов и лимфы на свертывание крови и фибринолиз // Физиология и патология перекисного окисления липидов, гемостаза и иммуногенеза. - Полтава, 1993. - С. 65-65.

9. Тканеспецифичность лимфоцитов. Роль лимфатических узлов // Всероссийская конференция «новое в лимфологии клиника, теория, эксперимент» - Москва, 1993. - С. 56-57. (Соавт. Витковский Ю.А., Папава K.M.).

10. Гепарин блокирует торможение плазмина пептидами лимфы // Успехи физиологических наук. - 1994. - Вып. 25. - № 1. - С. 136-137.

11. Immunocorrection by lymphaden peptides // International Journal of Immunorehabilitation. - Sochi, 1994. - P. 394-394.

12. Запуск первичного иммунного ответа в слизистой кишечника тормозит вторичный ответ на парентеральное введение антигена // Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях. Тезисы докладов XII Российской научной конференции. - Челябинск, - 1995. - С. 41-41. (Соавт. Ложкина А.Н., Резников Ю.П., Лутцева М.А.).

13. Коагулологические свойства пептидной фракции плазмы и лимфы // Актуальные вопросы службы гематологии и трансфузиологии. - Санкт-Петербург, - 1995. С. 72-74 (Соавт. Ложкина А.Н., Колдаев P.A.).

14. Регуляция пептидами лимфатической системы фагоцитоза и комплементарной активности крови И Проблемы сорбционной детоксикации внутренней среды организма. - Новосибирск. - 1995. - С. 108-112. (Соавт. Ложкина А.Н., Витковский Ю.А., Колдаев P.A.).

15. Хроматограф ический анализ пептидов лимфатической системы // Экологическая паталогия: вопросы биохимии, фармакологии, клиники. (Тезисы докладов Всероссийской научной конференции). - Чита, - 1995. С. 95-95. (Соавт. Резников Ю.П., Колдаев P.A.).

16. Launching of immune response in intestine mucous inhibits the secondary response after parenteral introduction of antigen // International Journal of Immunorehabilitation. - 1996. - № 2. - P. 124-124.

17. Влияние иммунизации на флуктуации некоторых показателей крови // Экологическая патология: вопросы биохимии, фармакологии, клиники. (Тезисы докладов Всероссийской научной конференции). - Чита, - 1995. С. 111-112. (Соавт. Ложкина А.Н., Пономарев Т.А., Бегалиева З.Р., Тулабеков Б.).

18. Иммуномодуляторы первичного иммунного ответа лимфы тормозят вторичный ответ на парентеральное введение антигена II Экологическая патология: вопросы биохимии, фармакологии, клиники. (Тезисы докладов Всероссийской научной конференции). - Чита, - 1995. С. 96-96. (Соавт. Ложкина А.Н., Резников Ю.П.).

19. Влияние патогенного стафилококка на гемостаз // Патофизиология органов и систем. Типовые патологические процессы. - Москва, - 1996. -С. 100-100. (Соавт. Черепанова Т.А., Ложкина А.Н.).

20. Влияние полипептидов лимфатической системы на гемостаз, регенерацию и факторы неспецифической защиты организма // Патофизиология органов и систем. Типовые патологические процессы. - Москва, - 1996. -С. 283-284. (Соавт. Кузник Б.И., Ложкина А.Н., Колдаев Р.А.).

21. Влияние полипептидов лимфы и лимфатических узлов на коагуляционный гемостаз // Цитомедины. - Вып. 2. - Чита, 1996. - С. 15-16. (Соавт. Ложкина А.Н.).

22. Influence of polypeptide fraction of lymphatic nodes on some factors of nonspecific resistance. // International Journal on Immunorehabilitation. - May, 1997. - № 4. - P. 726 (Соавт. Элизбарян Я.И., Папава K.M.).

23. Antiheparin effect of lymph peptides. // International Journal on Immunorehabilitation. - May, 1997. - Ns 4. - P. 734 (Соавт. Элизбарян Я.И., Папава K.M.).

24. Adaptive properties of thromboplastin. // International Journal on Immunorehabilitation. - May, 1998. - № 8. - P. 157 (Соавт. Дулянинова А.Ю., Шойбонов Б.Б., Ложкина А.Н., Лутцева М.А., Черепанова Т.А.).

25. Influence of lymph and lymphadenic peptides on immunity and haemostasis // Thrombosis and Haemostasis. - 1999. - Suppl. - P. 1360.

26. Современные принципы лечения панкреонекроза // Забайкальский медицинский вестник. - Чита, - 1999. №1-4 -С. 14-15. (Соавт. Коновалов Е.П.).

27. Влияние внутрисосудистого лазерного облучения крови на иммунитет и неспецифическую резистентность больных панкреонекрозом // Забайкальский медицинский вестник. - Чита, - 1999. - № 1-4 - С. 16-18.

28. Панкреонекроз // Чита: Поиск, 2000. - 240 с. (Соавт. Коновалов Е.П., Терлецкий В.Н., Доманский Б.В.).

29. Влияние пептидов лимфы и лимфатических узлов на фагоцитарные реакции нейтрофилов // Мат. Международной конф. по хирургии. - Минск. -2001. С. 34-35.

30. Хирургическое лечение больных некротическим панкреатитом // Мат. Международной конф. по хирургии. - Минск. - 2001. С. 36-37.

31. Cationic peptides of plasma and lymph possess anticoagulant and antiheparin properties // Thrombosis and Haemostasis. - 2001. - Suppl. 1. - P. 3154 (Coautor: Zhghenti Ts.).

32. Антикоагулянтное и антифибринолитическое действие полипептидов лимфатической системы // Цитомедины, цитокины и антигены главного комплекса гистосовместимости (HLA). - Чита - 2001. - С. 18-19. (Соавт. Жгенти Ц.Р., Ложкина А.Н.).

33. Антигепариновый эффект основных полипептидов лимфы и крови. // Цитомедины, цитокины и антигены главного комплекса гистосовместимости (HLA). - Чита - 2001. - С. 20-21 (Соавт. Жгенти Ц.Р., Ложкина А.Н.).

34. Гемостатические свойства щелочных полипептидов лимфы и плазмы у больных панкреонекрозом // Цитомедины, цитокины и антигены главного комплекса гистосовместимости (HLA). - Чита - 2001. - С. 22-23 (Соавт. Жгенти Ц.Р.).

35. Биохимическая характеристика иммунореактивных пептидов лимфы и лимфоузлов. - Чита, ЧГМА - 2002 . - с. 13.- Деп. ВИНИТИ № 64В-2002.

36. Влияние пептидов лимфы и лимфоузлов на иммунитет и неспецифическую резистентность организма в эксперименте. - Чита, ЧГМА - 2002. - 13 с. - Деп. ВИНИТИ № 66В-2002.

37. Влияние пептидов лимфы и лимфоузлов на свертывание крови и фибринолиз в эксперименте. - Чита, ЧГМА. - 2002. - 14 с. - Деп ВИНИТИ № 67В-2002.