Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Бруцеллезные вакцинирующие соединения на основе антиген-полимерных комплексов

!J !l II I С T К P G T В 0 3 Д P А В О О X P Л it H H И H И H С Т И Ï У Т И H tí У Ii о л о г и и

pfjj Q0 Не правах рукописи

Длп слуке.бноги шльзоыаш.ч

'¿'¿гЕВНш

Укз Я „vV-

ФЕДОРОВ АвдриЙ И1ШЮШЧ

BpyillwMfiililJK ВАМЦШШИЧИВ О/МШИМ IM (ХЯКФВ

¿штигин - иатчшш кишосеин

Ii.00.OS -- шшергомпш и иимуиодогия Д в-1 о 'р о р е р и т

ДИССГф-ШПИН Пй GOHCKiiHHO yfuliCtl Cl öl[f';HK

клпдвдита Oiiünorrt'HotíiiK наук

Гаоига шлюлнона в Институте иммунологии Министерства здравоохранения Российской Федерация.

ltoyчто руководители: 1. Члеи корресиоадоит ГЛШ(, академик AHÍ ГО, доктор медицинских

нздк, прс „"юссор Р. Ы.Хаитов .1. Доктор химических наук, профессор А. В .{{окрасов

Орициалышо оппоненты: - - доктор медицинских. паук, профессор Г-.И.Атяуллаханов - кандидат анодогтэстх наук Л.Н.Шльничонко

Ведущая организация - Саратовский научно-исследовательский rij¡.. пчючумный институт "Микроб".

Защита диссертации состоится ^¿^¿¿J в /у часов на заседании опециализирослнного Ученого сошта Д (Г/4.("£>.ш при Институте и-оунологпи Минздрава PS (HM7U, '.-'осшза, Каширское воссе 24, корпус 2).

с диссергпшоП мокло.ознакомиться в снолиот«1«? Института i*í'"r/iro.ftox^tir Vi'¡anppA:ii Pf>.

ЛьторЧ'.'рат радослан ^гУ+yS ¡да/г.

, :■[: vr.u, р 0;'..\::-iv.-í0-: ^х v.rsyx .','слгт-

ОБЩАЯ ХАРАКТЕР И С ТИКА. РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Бруцеллез относится к опаснейшим зоо-внтропонознш» заболеваниям и широко распространен со всем мире. Одним из ваююйних моментов в системе протшюбруцеллезшп мероприятий является профилактическая вакцинация людей и животных. Для профилактики бруцеллеза 'используют вакцины, получении« традиционными способами.Существенным недостатком кивих, убитых и хтшчесмч вакцин является: реактогешюсть, сенсибилизируадая активность и способность индуцировать поствакциналыше антитела, которн« трудно дифференцировать от постинфекциошшх.

В последнее время принципы создания вакцин претерпевают коре-шше изменения.В вксперименталъных исследованиях широкое расщюст ранение получают работы по созданию искусственных вакцин. Принцип создагая вакцин нового поколения, сформулировашшй Р.В. Петровым и Р.М.Хаитовим (I976-196& г.г.), несомненно открыл новую перспективу в получении безопасных вакцинных препаратов с заданными свойствами. Тооротические проблемы здесь тесно связаны с требованиями практики, где еще раньше возникла потребность в разработке принципиально новых вакцин против особо опасных инфекций, перэдаыцихсл от кивотш/х к челонеку. Кпк известно, искусственные вакиши представляют собий макромолекулярний комплекс, состоящий из специфической чмсти - вн-тигона и неснецифического носителя - иммуностимулятора. При этом ваююо значение имеет выбор ¡гроте ктиыюго антигена и высокомолекулярного носителя, удовлетворяющего требованиям фармакологи« ни безопасности и ^{фиктивности ярим«-нения.

До сих нор у возоуяи-Юля бруцеллеза точно не установлен антиген, играпдий кличе ьую роль в патогенезе, которнй с yr.eptüiuoemi можно назвать цротоктигашм (Winter k.J. et al, ivö,1; Norfr-'U 1. «t a1.,1901i Tloramel 14. ot «l.,1'.i>V)). Препирати, иолуччнпио на ociiuhh изностш! в настоящее lsj^mh шп irremОруцелл, не нашли шнрткиго

применения в практике. Это связано с низкой протективной активностью и присутствием балластных и токсических веществ, вызывающих побочные явления.

Поэтому получоние новых протективных антигенов, их очистка и повышение иммуногенности путем химического соединения с иммуностимулирующими носителями остается по-прежнему актуальной и современной задачей.

ЦЕЛ!' И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Цель работы - получение искусственных вакцинирующих противобруцеллеаных соединений и их испытание на лабораторных и сельскохозяйственных животных.

Для достижения этой цели поставлены следующие задачи:

1. Разработка метода и условий выделения и очистки антигена бруцелл, обладающего протективними свойствами.

2. Определение физико-химических и иммунологических характеристик антигена.

3. Изучение возможности повышения активности бруцеллезного про-тективного антигена с помощью иммуностимулирующих ¡гасителей.

4. Определение протоктишой активности искусственных лротиюбру-целлезннх соединений против разных видов возбудителя бруцеллеза в сравнении с коммерческими вакцинами.

5. Разработка методов контроля специфической активности искусственных протавобруцеллезных соединений.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ. В работе впервые применен мэ-тод получения экстрацеллшярного протектииюго антигена бруцелл и нроводош биологические испытания искусственных вокцтшрущих. про-тквобруцеллеэгапс соединений, полученных конъюгацией антигена с по-лимср!шм носителем - иммуностимулятором.Получена экспериментальная серия искусственной бруцеллезной вакигаш, показана еэ высокая фективность при отсутствии побочных явлений (реактогенности, сен-сибилизиругаей активности и способности вызывать поствакциналыше антитола, выявляемые коммерческими даягаостшсумжлЫ'язрзОотан метод получения эритроцлторного антигешюг диагноетнкума- для обнаружения антител, индуцируемых искусствеиной бруцеллезной вакциной.-, Получен новый штамм - продуцент протекчивного антигена бруцелл.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Проведенные 'исследования указывают на перспективу юснользовпшш протек-тинного- антигенного комплекса ь качестве специфической части искулстиешш иротипоЯру-цчллстяа -соединений, а г качестве носиециакчесгой, имкупостшули

рунцей части - полммерше носители полиоксидоний и градекс в соответствии с этим предложена бруцеллезная искусственная вакцина и разработана "Инструкция по изготовлению и контролю искусственной бруцеллезной вакцины (БИВ)".

Результат» полученшо на лабораторных и сельскохозяйственных животных явились основанием рекомендовать бруцеллезную искусственную вакцину для применения в ветеринарии, а доклинические исслодо-ранмя показывают целесообразность дальнейшего изучения «той вакци-|ш на добровольцах.

АПРОБАЦИЯ PAEOTU. Наториали диссертационной работи доложены р обсувденн на конференции молодых ученых Института иммунологии МЗ РФ (Москва, 1987), научно-производственной конференции "Достижения ветеринарной науки и передового опита - животноводству Нечерноземной зони PCÎCP" (Горький, 4988) и на конференции отдела г.жушюй биотехнологии Института иммунологии U3 РФ VJocnm, 10Э2).

ПУБЛИКАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИСОЩЩШШИ. Основные положения диссертации излокопы в 7 печатных работах.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация состоит из сл<;дукдих разделов: введите, обзор литературы, материалы и методы, розуль-тати исследований, обсуждение полученных результатов, иивозд и практические рекомендации. Работа содержит 21 таблицу. Диссертация написана на русском языке.

Библиографический список литературы вкличшг 218 источников, из которых III отечественных и 107 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ И С С Л К Д О l'i А II И Й

Работу щюводили в лаборатории искуствешшх антигенов Инсти тута иммунологии МО Р!> с 1Уаь но 19У2 год. аксперимонтальную часть работи, связанную с использованием »той культуры оруц'.'лл,выполняли на базе Нижегородского ньучно-исследовательского ветеринарного института Нечерноземной зоны (Ф, Снвн^кнвказского зонального научно-исследовательского ветеринарного института и Ташкентского нау чно-исследовательского института эпидемиологии, мик^ошлигии и шф'кциошшх заболеваний ЫЗ РУз.

И экспериментах использовали морских свинок массой 2Ы.) yiju г.

КрОЛИКОВ М8СС0Й 2-У КГ.МШиЙ ЛИНИИ (ОВА X С57ШУ»>)К1 , Ки|к)В чорно-

пестрой нелюди Ь-7 - летного возрчста и i b - месячных телиг.

Основной материал диссертации посвящен разработке противобру-целлозных искусственных препаратов на основе конъюгации антигенного комплекса с полимерными носителями. В "ачестве носителей для протективного антигенного комплекса бруцелл'использовали синтетический карбоцепной сополимер акриловой кислоты и N-вишшшрролидо-на эквимолыюго состава (NA), производное декстрана - градекс и синтетический водорастворимый модафикат гетероцепного полиамина -полиоксвдошй.

Mmmj лостимулирущив носители и коетыогаты синтезироваш в лаборатории искусственных антигенов Института иммунологии МЗ РФ.

В качестве специфической части искусственных противобруцелле-зных соединений использовали низкомолекулярный антигенный комплекс, выделяемый бруцеллами при культивировании в хидкой питательной среде.Очистку aimiraimoro комплекса от аршосай среда к балластных веществ проводили методом спиртового осакдения и гельхроматографм-ей на колонках с Сефадексом G-75 или на Силохроме C-I20. Хроматог-рафический процесс регистрировали на УФ детекторе Uvioor-d s-2 1KB.

Наличие полисахаридов в полученных фракциях определяли методом Дюбуа (1956), белков - методом Лоури (1951). Количество первичных аминогрупп устанавливали с помощью трин/тробензолсульфоновой кислоты (Snyder S.L. et'al.,1975).

Для определения протективных свойств полученных конъюгатов м антигенного протективного комплекса использовали метод эк юримен-тального заражения иммунизированных животных вирулентным штаммом бруцелл. Для заражения применяли разные виды бруцелл (Br.abortus, Br.molitonsls, Br.ovis). Через 30-4D дней после заражения животных убивали и проводили бактериологическое исследование лимфатических ■ узлов и паренхиматозных органов.

Культуры бруцелл выращивали на мясопептошюм печеночном бульоне и эритрит агаре. Микроорганизмы, полученные в ходе бактериологического исследования, дифференцировали и идентифицировали на соответствие заражающей культуре. Обнаружение культуры бруцелл, хотя бы в одном из объектов исследования,расц чивали как прорыв иммуни тета п животное считали заразившимся. Но результатам бактериологического исследования определяли индекс инфицировзниости патентное отношение объектов, из которых выделены оруцеллы, .к общему числу исследованных объектов), а также процент иммунных юлютных.

Работу с KimuMii культурами бруцелл проводили в соответотши с родимомустановленным для работы с ижр\шрг-'Л!;;,ц* нте;.>ой грушм.

- о -

Серологические исследования сыворотки крови эксперименталышх иивотпых,иммунизировании! разними противооруцеллозними препаратами, исследовали со стандартшми ллнпюстикумами и роакшш агглютинации по Райту (Ра), роакшш пассивной гемагглютинации (РИГА).

СенсиСшшзирушую способность препаратов определяли по ко»юй аллергичоскоя пробе Бюрне.

Результата опытов статистически обрабатывали с целью определения достоверности получаемых датой.

I. ПОЛУЧЕНИЕ M БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЗКСТРА1ИШШ1Р1Ю1'0 АНТИГЕННОГО КОМПЛЕКСА, ВЦДЕЛЕШЮГО ИЗ БРУЦЕЛЛ

Проблема создания искусственных. вакцин тесно связана с поисками протективных антигенои, их очисткой и повышением иммушгешо-сти. При конструировании искусственных вакцин особо важен правильная выбор антигена, так как от этого зависит но только эфЕоктив-ность препарата, но и проявление попочиих свойств. Исход;! на патогенеза бруцеллеза,Оила разработана методика получения экстрацелл»-ляргюго антигенного комплекса (УЛКБ). Первоначально, в качество продуцента а АКБ, использовали вирулентный штамм fir.abortui, г>4. ЭкстрацеллюлярныА антигенная комплекс, полученный из этого штамма в дозе 0,4 мг, предтранял 07,6* морских свинок от зарезавши вирулентным штаммом в дозе 10 11Д100.

В дальнейшем, из-за трудностей, связанных с использованием вирулентного штамма, илКБ получали из вакцинных слаоовпрулент.'шх штаммов Br.abortua 19, Ur.molitenais ilow-i. Однако выход антигена при этом снизился в У-5 раз.Используя метод последовательного пассирования и клонирования, из вакцинного штата Вг. Hbortus ^^ù удалось выделить клон клеток, имепций низку»! вирулентность,ш> П]>о'• дуцирупциП экстряцеллшярннй антиготшП комплекс и количествах, црибликамщися к вирулентному штамму. атот штамм, названный lu M, использовали для получения î.huthmx ь.-ртий

Сравнительное изучение активности экордцеллшмршх антигенных комплексов, виделекичх из'разных штдампв оруиплл, поводили на морских свинках, которым вводили ннутригд.-мачмо но 0,-1 мг антигена и -«роз да месяца парахчли шрулын ним итаммем и дозе 1U ИЛ,,Н,. Из розультатоп очкторко»»•»•»-.•кого иге. «.'„уигшия м-м-ски* свинок сл»я?«т, чк- радниця и;.*)'«чктиияой ектилч-л-'ю ж***

ВЕКШШЦ КЗ штгаэда Br.ttbortU» !•> И Мт?Г«И01), МЦРЛ'гМ.ЫХ ц.1 И"И1!Ш

!ш; и вирулентного штаммов, незначительна. ЭАКБ, такко как и живая вакцина,индуцировала поствакциналыше антитела, мешаодие выявлению инфицированных. животных (таблица I).

В настоящее время учеными разных стран ведутся исследования в направлении получения протектшзного бруцеллезного антигена не вызывающего сенсибилизации организма и образования антител.выявляемых стандартными диагностикумами. Ввиду того, что противобруцел-лезные антитела в основном вырабатываются на высокомолокулярные структуры клеточной стенки бруцелл, полученный экстрацеллюлярный антигенный комплекс разделили по молекулярной массе, используя

• Таблица I

Свойства экстрацеллхшярного антигенного комплекса, выделенного из разных штаммов бруцелл

реакция агглютинации Мин

ЭАКБ из штамма

% иммунных мор.св.

индекс инфиц. М+ш

7 день

15,О+Г.9 18,3+3,1 21,0+2,6 _ 17,6+3,9

15 день

21,572,7 23,3+3,1 24,5+4,1 21,0+3,5

30 дет,

20,0+8.6 25,5+10,6 22,2+3,6 "0,0+3,6

208+24,4

ШТ.54 шг. 19 kit.row-i тт.19-М

87,5

66.7

77.8 90.0

1,8+1,8 9,5+5,3 4,7+10.1 4,3+13,5

живая вакцина из штамма

Dr.abortus 19 100,0 О

контроль заражения 0 92,9+3,2

68,0 +19,3 152+22,1

метод гельфильтрации на Сефадексе а-75 и Силохроме С-120. В результате чего получили две фракции антигенного комплекса." высокомолекулярную и низкомолекуллрную.

Высокомолекулярная фракция предохраняла от заражения 10 ИЯ100-28,Ь% животных, а низкомолекулярная - 85,5%. причем, последняя не вызывала аллергических реакций и гюявллшя антител, улавливаемых коммерческими диагностикумами.Таким образом, удаг.осв выделить низ-комолскулярную фракцию, обладающую выражешшмк прпективными свойствами и в тоже врпмя не шзывавдую еенсиоилппащш организма ■ и синтез противобруцеллезных антител.

В последующей работе использовали югакомолокулярнув антигенную фракцию (в дальнейшем названную цротекткышм антигешш комплексом

-ПА), содержащую полисахарида и пептиды. Молокулярння масса протективного антигенного комплекса менее 10 кД.

2. ПР0ТЕКТ1ШЛЯ АКТИВНОСТЬ ПР0ТИВ0БРУ1ЩЛК31Й)Х СОКИИНЙШИ, ПОЛУЧЕННЫХ К0НШГЛШШ1 АНТИГЕННОГО КОМПЛЕКСА С иолшегиш ММУНОС'ПШУЛИРУЩШ НОСИТЕЛЕМ

Следующим этапом работи явилось изучеши возможности повышения протективной активности ПА с помощью иммушстнмулиругщих носителей. Стимуляции иммунного ответа па низкомолекулярныо соединения путем связыва!шп с високомолекулярннми носителями широко применяется в иммунологии.Наиболее интенсивное развитие исследований в этом направлении связано с работами, проводимыми под руководством Р.В.Петрова и Р.М.Хаитова. Основываясь на принципе использования полимерного иммуностимулирующего носителя" и качестве иоспнцифичвской части искусственной вакцины, нами получены и испытаны соединения на основе сополимера амиловой кислоты и л-виыилпирролидопа (na), градекса (Град) и полиоксидош)я (ПО).

Первоначально, в качестве модельного иммуностимулируьил'о носителя, использовали сополимер акриловой кислота и N-ьинилнирроли-дона эквнмольного состава с молекулярным весом 100 кД.Соотношение полимора и антигена в коныи'гатах составляло 3:1 (по весу). Протек-тивную активность 1фоверяли на морских свинках, иммунизированных копгюгатом ПА:na в дозе 0,2 мг, которым вводили двадцатикратную заражающую дозу вирулентного штамма Br. abortuc 54. В [результате бактериологических испытаний установлено, что конъюгат защищал от заражения ЬОЯ животных, в то время как сам антигенный комплекс по предохранял животных от инфицирования. Следовательно, метод конъюгации позволил повысить протективную активность антигенного комплекса бруцелл и может успешно использоваться для получения бруцел ■ лезной искусственной вакцины.

В качестве следующего кандидата носпещфтчесгсой части искусственного противооруцеллеаного соединения апробировали иммуностимулирующий носитель градекс. 1"радекс представляет собой химический модифшеат природного полисахарида.получаемого путем взаимодействии окисленного декстрана с грамицидином С.

Конгюгаты МЛ с градексом имели молекулярную массу от 60 до 1U0 кЦ. Онтималыюо соотношение специфической чести коыгюгата к носителю составляло - К) (по косу). Конъюгат НА с градаксом

по-г-чали как в подпой среда, так и в органическом растворителе (ДНСО).Активность коныогатов, полученных в водной среде, на 50-60% выше, чем полученных в органическом растворителе, Сравнивали свойства коммерческих вакцин и коныогата, получешюго в водной среде. В эксперименте использовали живую вакцину из штамма Dr.abortus 19, убитую адъювант- вакцину "Abortor" из гатамма Br. abortus 45/20 и слабоагглютиногенную кивую вакцину из штамма Br. abortus 82. Морским свинкам вводили вакцины из штаммов 19 и 82 однократно в дозе I млн. микробных меток, вакцину из штамма 45/20 и коггьюгат - двухкратно с интервалом в 30 дней в дозах 0,1 мл и 0,25 мг соответственно. Через девяносто дней после последней иммунизации морских свинок заражали 10 ИД100- Коммерческие вакцины предохраняли от инфицирования 72,7-86,7% животных, конъюгат при этих же условиях заражения защищал - 87,7% (таблица 2).

Таблица 2

Сравнительная активность коньюгата с коммерчески,« вакцинами в опыте на морских свшнсах

вакцшннй к-во серолог. проба выде.^но индекс %

препарат жив. реакции Бюрне культур 1Шф. Ынп иммунных

ПА¡Град 8 отр. отр. I 1,8 Т 1.8 87,5

45/20 12 пол. пол. , 15 17,8 ; 9,4 75,0

82 II пол. пол. 10 13,0 + 7,8 72,7

шт. 19 15 пол. ■ пол. 8 7,6 + Ь,2 86.7

контроль 8 - 52 92,8 + 3,8 0

Как следует из таблицы 2, конъюгат ШЫ'рад, в отличие от коммерческих вакцин, по обладает сеисибилизирунгей активностью и но стимулирует образование поствакшшзльных антител, выявляемых стандартам диагностикумамя, что очень важно при профилактики бруцеллеза.

Далт.нейгсоо изучение свойств конъвгата 1Шгрэдекс проводили на сельскохозяйственных животных. определяли онткм.'ш иуи иммунизирующую дозу препарата для телят и коров. №ли«гат вводили ънутршы-юочнэ, двухкратно, с кт-ервол"м .30 дней. Лгх»я к-пгшмтя, используемого при тфьичиой иммунизации, состядеял» от иоямП дозы. Всего вакцинировали и- голов коров и столько же теляг. Ь контроль -

ную группу входило 2 кивотшх, по четыре* из кавдой возрастной категории. Через сорок дней после вакцинации проводили коптильное заражение животных конъшктивалытм методом в дозе 5 млн.микробных клеток. Спустя 00 дней животных убивали и проводили бактериологическое исследование подчелюстных, околоушных, заглоточных, с[>едос-тешшх, мезенториалышх.предлопаточных. паховых и надглмяших лимфатических узлов, а также почет и селезень... Бг.ктериологическоп исследование показало, что полученное искусственно'; ирютивобруцнл-лезное соединение при двухкратном введении в оптимальной депо 714 мг (по ЛД) создает невосприимчивость к зарданип бруцеллезом у 75 - ¡(ХУЛ, телят и коров.В сыворотке крови кммуиизировптиа корон и телят нэ обнаружили антитела, выявляемые стандартными днагнсстику-мами в реакциях агглютинации по Райту, пассивной гомягглютипяции, связывания комплемента.

Использование дашюго препарата позволяет про>1идяктировять бруцеллезную ипфжцип а нэ затрудняет при этом выявлении пинцированных кивотшх среди вакцинированных, что является пяхннм преимуществом перед всеми используемыми в настоящее время вакцинными препаратами и позволяет предположить, что копт югат низкомолекулярного антигенного комплекса бруцелл с грапексом в дальнейшем нейдет сирокоэ пр.тиспонио в ветеринарной практике.

Следунцим иммуностимулятором, испытапным в составе искусственного противобруцвллезног-о вакшишрушего кгмплекса, был полиок-сидоний.НолиоксидониЯ синтотичйский полимер, деструктнруется в организме, продукты деструкции безвредна и полностью выводятся, в отличии от на. ЛолпсксидспиЯ разрешен Флрмкомитето« для иримоно/тя на лила и хитотаых.Наличие функциональных групп позволил использовать полаонсадемяй в качестве носителя .г».»уносткмуляторя щи создании гр'-'целлйгшоЯ искусственной вэкшшы (Г>И.Ь), Изучали способность к'лп вгатоь с полисксидоштем предохранять хпвотш.х от заражения ром«^« ьидами Сруцелл. Оптимальная доза кстлгата для морских свин г, и кролж.и - и,:; мг по ПЛ. Ксотыгат ПЛ с подиоксклопнем зашил от заражения вирулентным штом^ся Вг. аЬогЧиз ',4 в дозе 20 ¡1%,*, морск../. свинок, конт'зт НА с градексм 1гри тех >:е

условиях зарс>жл-ил ир'гохрпиог! - %, а капкгат НА с сопо-

м:рк.п;>:»!'{1 кв'-лоты и н-тшпирролядспа только ьо '?>•

Р,>лз-;Р гчт^р'"-, п;ч'Л.."таиляст пр»>1«ляктккл бруцодлезз.шзнпод-МОГО ор/чкдлчю» П'.ДЗ МШ?КН51г, к-ггорно на^одее часто обуславливай- бруцеллез у людей. Из результатов заражения вакшягирорвшш

кроликов вирулентным штаммом Br.melitensls видно, что коныогат ПА с полиоксадонием так не, как и кивая вакцина из штамма ia, защищал КХМ кивотных (таблица 3).

Кроме того, коиъигат ПА с полиоксидоняем испытивали и в качество профилактического средства при инфекционном шшдщщмиге баранов. Этиологическим агенток этцмдимита является вгиаеПа ovia, находящаяся в стабильной R-форме. Для профилактики этого заболевания у сельскохозяйственных кивотних применяют вакцины, изготовленные из Б- и R- форм бруцелл, однако возникающие посгвакцшшльше антитола мешают выявлению бруцеллеза, вызываемого другими видами бруцелл.

Таблица 3

Протективная активность конгвгатов с полиоксвдоиием

препарат доза по штамм для выделено индекс инфи- % иммун-

НА /мг/ заражения культур цирован Mi in ных

Б1Ш 0.2 Br.abortus 3 5,9 7 12,5 83,3

БИВ 0.06 Br.abortua 37 58,7 7 13.4 44,4

[IA 0.2 Br.abortua 24 68,6 7 9,2 0

контроль - Br.atiortuo 40 95.2 7 3,2 0

Blffi 0,2 Br.melltena 1b 0 0 100

вакцина из шт.19 Br.moLlteas la 0 0 100

контроль - Br.melitensls 39 92.8 7 3.7 0

Bilí) 0.2 Br.ovle 6 8,5 7 3.6 70

НА 0,2 Br.ovio 7 16,7 7 15.9 33,3

KOUTpUlIb - Вг.оу1з 12 20.5 7 П.7 0

Для установления возможности профилактировать инфекционный энидздимиг, морских свинок - самцов ишунизировели ШЗ и заражали вирулентным штаммом Br.ovla в дозе 250 тис. микробных клеток, lían видно из таблицы 3,бруцеллезная искусственная вакцина пред ¡хранила от зараксния 40% кивотних. Так как искусственная вакцина ib- mj?h вает образование протиьобруцеллезшя анппч.-:;, улавливаемых стандартными диагностику«,чш, то исиользовани ее дл.ч иро1илакпши эпмдидимита в неблагополучных по бруцоллозу районах М'.исет Лмть весьма перспективно.

Длительность иммунитета, вызываемого бруцеллезной иасуоствешгй вакшпюй, изучали на морских сеют.чйх. С этой цель» юта тных о лис к ■ ратно иммунизировали бруцеллезной искусственной вакциной в дозе 0,2 мг (по НА) и через шесть месяцев подвергали заражению виру л<-н тшм штаммом в дозе 10 ИД100 с последутим бчктериол^гическим исследованием. Заражению противостояло иммунизированных морских свинок, такой гш иммуштет наблюдалои и при применении коммерческих вакцин.

Таким образом, проведенные исследования показали, что активность полученных противооруцеллезных соединений не уступает коммерческим вакцинам, и в то же время искусственные иротивобруцел-лезные соединения лимены недостатков, присущих этим вакцинам.

В лаборатории лекарственно-диагностических форм изучали соответствие бруцеллезной искусственной вакцины, представляющей собой конъюгат протективного антигенного комплекса бруцелл с полиоксидо-нием, требованиям Комитета по медицинским иммунобиологическим препаратам. На основании проведенных исследований сделано закличет'.«, что бруцеллезная искусственная. вакцина хорош переносится животнн-¡.и в большом . диапазоне доз, агшрогениа. не вызывает реакции на месте введения, хорошо очищена от токсических прямосей, не сказывает патологического воздействия на органы кроветворения.центральную нервную систему, ш влияет на фунхции шчеш! » печек, то есть отвечает требованиям, предъявляемым к вякшшам Комитетом по медицинским иммунобиологическим препаратам.

■3. КОНТРОЛЬ ПРОТЕКТИВНУХ И Ш'ИГШШ СВОЙСТВ- ИоКУССТВЕНШХ ПРОТИВОБРУЦЕЛЛЕЗИИ СОЕДИНЕНИИ

При изготовлении бактераалышх и вирусных вакцин особое внимание уделяется контроля прзтектиьноя и ангягеняей активности препаратов. Протективная активность до сих пор является основным критерием оценки бруцеллезных вакцин, так как яитигениля активность, выявляемая стандартными даап}СС'Ггку«--м1. ие коррелирует с протек-тирной активностью. при одеже протекгешых свойств бруцеллезных вакшш в оснсвнсм используется метод эксперкмсятадьиого зяргжения яивотных сируденткш атак»:?* с последукешы оактсриолс плески« исследованием. В последнее вромя все ¡гире стали применяться методы о:1р»-;'.елла«я протектишюй антиьности протигобруцеллезми ир'Пврзтев уетах, ь частности, методика с использованием цихд>1юсфчна

(Ыилышченко В.И., 1909.). Используя этот метод, мы п качестве заражающего штампа стали применять слабовирулентный вакциной штамм br. abortiia i .. иа. Контроль протективной активности искусственных нротиьобруцчллезшх соединений проводили следущим образом. Мишей ьнутришвючно иммунизировали изучаемым препаратом в дозо 0,01 иг (но ILA) и через 10-12 дней виутрибршшно шюкулировали культуру Br.abortu-j 1 9~ва в дозе 3-4 млрд. микробных клеток, а через сутки вводили ьнутрибрмишаю циоофосфан из расчета 200 мг/кг. За мышами

Таблица 4

Сравнение методик определения протективной активности искусственных протмвооруцеллезных соединений

емый

препарат

эксперимент яа морских свинках эксперимент на шл ах

кол. кив. доза по IR /иг/ инд.инф.1 % M + m. 1 HMWyii. кол. бив. доза по IIA /мг/ 51 иммун.

Ь,1В s 0.2 8.6 + 8,5 80 10 0,01 90

иагррад 5 0.2 11,4 + 11.4 80 10 0,01 80

ru 5 0,2 25.7 + 15.9 60 10 0,01 50

k0¡1t¡ ...1, 7 - 88.6 + 7.0 0 10 0

вели ньошдание в течение 10 дней, регистрируя их гибель. На основании ризницы в гибели контрольных не ш.слунизированшх мншеП и опытных, определяли нритективную активность препарата.

Этот способ сравнивали с классическим методом определения протстиишй активности на морских свинках. Ь^зультпти, получешше на Ы'.'рсних спилках, коррелировали с результатами, полученными на ¡».ша (таблица 4).

Методика определения защитных свойств антигенов и искусствен-них протииобруцеллезных соединений им мышах сокращает сроки исследовании до Z'i дней и позволяет исключить использование и работе 1>ирул»>игшя шп.ммпв бруиьлл, я кршо того эк.чнчмит материальные 3fi'jï:a'itj ne проведение бакт"риологичооких исследований.

И<»уо ï f;»KH>j>.* iiff*гы1 •бруцеляешшо сч<>дш(инин .получм-мао конг-

Wf«»«'/:0 П; ■ j-i'î'iiTli fti- ШПЙГСШЮГО KOMJUieKUi ")уЦ0ЛЛ С ИММУНОСТИМУ -¡нслтьллми, ¡¡о шяшпюг ыЗраоов-'шпн е'ютчкщщальиих ннтйт««, ыпъляыш ст'итаркшми ля.чт.спт/и-лт. Дли »имкмлниин ант»! uHimB актиииостй искусетьеших нр<п еомдинений

отработали условия получения эритроцитарново антигенного диагно-стикума. Разработанный метод получения эритроцитарного диапюсти-кума отличается от известных тем, что сенсибилизацию Фирмалкнизн-рованшх эритроцитов антигенным протекгиыы* комплексом бруцелл проводили в две стадии.Первую стадию вели и буфере при рц ь,0-6,0, а вторую при рН 7,5-8,0. Полученные сенсибилизирован!«« эритроцита использовали в РПГА для выявления внгител к п, активному антигенному комплексу, являющемуся спещфпеской частью искусственных противобруцеллезнш. соединения.

С помощью полученного эритроцитарного антигенного диагности-кума в РПГА исследовали сыворотки крови от тавотных,иммунизированных разными противооруцеллезными конъпгатамч. Установление, что через 15 дней после первичной иммунизации, средний титр антител к ПА составлял 1:160, о после второго введения - 1:640. При исследовании этих сывороток в РПГА стандартным эритроцитарпш дааглос-тикумом снещфгческке бруцеллезные антитела но выявляли. Исследование динамики антителооораэования на введение искусстветшх иро-тавобруцеллезных соединений проводили на морских свинках а кроликах. Полученные результаты показали, что максимальный титр антител регистрировался на 15 день, а к 6 месяцам снижался до 1:201:80.

ВЫВОДЫ

I. Впервые выделен экстряцеллтяряый протективт/й комплекс бруцелл. Доказана возможность использования данного антигенного комплек.а в качество спещфгюского компонента для получения искусственной бруцеллезной вакцины. Установлена ведущая роль этого антигена при ээдите организма от возбудителя бруцеллеза.

¿. Получены искусственные протитюбруцеллезныэ соединения на основе связывания антигенсго комплекса бруцелл с иммуностимулирующими носителям) (грчдексом, сополимером акриловой кис ноты и н-вшишпфролидона, полиексидонкем), в том числе экспериментальны') серии бруцеллезной взкцмш« предстэвлягцей собой конъпгят гасоко-молекулярного иммуностимулирующего носителя - полиокспдения с про-тективнкм антигенным комплексом бруцелл.

3. Изготовлен эритроцитарный антигешшй диагностикум, .позво-лиший контролировать антигенную активность бруцеллезно!-. искусственной вакцины. Модифицирован и оптимизирован метод экспресс контроля п(ютект1Ш1ШХ свойств искусственных противооруцеллезных препаратов.

4. Изучены оощабиологические и специфические свойства противооруцеллезных соединений на лабораторных кивотшх и крупном рогатом скоте в сравнении с коммерческими вакцинами из штаммов 19, 82, 45/20. Показано, что синтезированные противоОруцеллезше соединения эд^-ктишо защищают юшотшх от заражения вирулентными штаммами Оруцелл (Dr.abortus .lir.malitenale.Br.ovis) в дозе 10-20 ИД10у (бруцеллезная искусственная вакцина, в отличии от известных в настоящие время бруцеллезных вакцин, не вызывает синтеза "специфических бруцеллезных" антител, аллергических реакций, а также патомор-Фологическш изменений при многократном применении.

Ь. безопасность применения и высокая протективная эффективность, доказанная на лабораторных и сельскохозяйственных ишвотных, позволяит рекомендовать искусственную бруцеллезную вакцину для применения ь ветеринарии. Результаты доклинических исследований препарата указывают па перспективу использования его в медицинской практике.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработана бруцеллезная искусственная вакцина и экспериментально доказана ее м1фектиьность и безопасность использования.

' Результаты проведенных исследований нашли отражение: о "Методика лабораторного получения протективного антигена Оруцелл", утвержденной Ученым советом Научно-исследовательского ветеринарного института Нечерноземной зоны 21.1уоуг., протокол N 4, а такки в "Инструкции по изготовлению и контролю искусствен-' ной бруцеллезной вакцины U-.HU)".утвержденной Ученым советом Мнсти тута иммунологии МЗ РФ 1У.0УЛУУ0 г., протокол N е.

- 15 -

СПИСОК ОПУБЛИКОВАНШ РЖОТ

1. Игнатов П.Е., Федоров А.И. Способ получения бруцеллезного антигена // Авторское свидетельство СССР я ísse25tí 1981.

2. Петров Р.В., Хаитов P.M., Игнатов U.E., Некрасов А. В., Фчдороп А.И..Свиридов Б.Л., Гсрямюв Л.А.. Сочнвв ".Ü., Григорьева l'Ai. Способ получешм вокшиш против бруцеллеза // Авторское спиде-ТОЛЬСТВО СССР N I5I8961 1985.

3. Петров Р.В., Хаитов P.M., Игнатов П. Е.. Некрасов A.B.. Фелорти

A.И., Свиридов Б.Д., Горякнов Д.А., Сочнев U.U.,Григорьева !'.И. Изучение имнуногенной активности искусственных бруцеллезных

. антигенов // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммупооиоло-ГИИ., 1988., -М 3, -С.39-43.

4. Григорьева Г. П., Игнатов П. Е., Федоров А. И., Харченко А. А., Малышева Л. А. Сравнительная иммуногошюсть бруцеллезной искусственной вакцшш в условиях эксперимента // Достижения потери-парной науки а передового . опита животноводству ШчорноытШ ->ош РСФСР:Тезиси докладов научно-производственной конференции, -Горыотй, 1988., -С.10-12.

5. Григорьева Г.И. .Игнатов П.Е.,Федоров А.И..Хпрчеико A.A., Сочит

B.В..Малдззва Л.А., Некрасов A.B. Изучение иммуногешпмх свойств бруцеллезной искусственной вакцшш в условиях эксперимента // Актуальные вопроси профилактики бруцеллеза и организации медицинской помощи больным: Тезиса докладов Эсесогстсй конкуренции, (Новосибирск. Z4-25 октября -m., 1989., '-C.lä!

6. Иымомоляев У. !!., Джалилов К. Д., Игнатов П. Е., '1едоров А. И., Ния.ова Т. А. К изучению иммунологической безвредности бруцеллезной искусственной вакцины в эксперименте // Материала о съезда гигионистсв, эпидемиологов, микробиологов, паразитологов и инфекционистов Казахстана., -Алма-Ата., 1УЭ1.. -т. G. "Иммунология -С". 33-£5.

7. Федоров-д. И., Лжалилов К. д., ¡'ммомолиев У. Н. Способ полуюта я врит{хн!Втарного диягностакума для выявления противо'руцеллезннх

." :„ нитнтел .'/ розеште о выдаче Авторского свидетельства но заявке

' . N от 30.01 ,í'¿ с приоритетом от 3.01.Ol.