Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммуногенные свойства комплексов и конъюгатов, сконструированных на основе антигенов Yersinia pestis и синтетических полиэлектролитов

[£ШИСХЕРСТ£0 ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РСССНКСЕСЯ ФЕДЕРАЦИЙ

ИНСТИТУТ ïîHHVHo/îonra

Для слгжебного пользования на правах рукописи

КАЛИТА Светлана Адоксандрозиа

ИКНУНОГЕНШЕ СВОЙСТВА КОМПЛЕКСОВ К КОНЪЮГАТОВ. СКОНСТРУИРОВАННЫХ НА ОСНОВЕ АНТИГЕНОВ YersinM pest 13 И СИНТЕТИЧЕСКИХ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТОВ

14. 00.35 - Аллергология и иммунология

Автореферат

иисгс-ртчаии на соискание ученой ст<ч!рим кзплипатя биологиче'-ги* наук

(Глгк1' Ï i Ор г

Работа выполнана в институте кинтнологян жшздрзва РФ

Научный ргкоьодитель: чяен-корреспондент РАИН, профессор

Р. И. Хаитов

уфйянальшхе омояентц: доктор биологических иагк

ДА. Захарова член-корреспспдеит АЕИ РФ, профессор В. И. Зеисков

Ведущее учреждение.: Институт эпидемиологии и кикробиояо-гии ни. Г. Н. Габричевского

Заяыта диссертации состоится _ 1993 г. в

'УУ/-.* часов ва заседании специализированного совета ' Д. ста, 09. 01 при Институте ими экологии Нштэдрава рф по адресу. носква, каширское шоссе, ?л. корп. г

Автореферат разослан "992 г.

Учений -'«крегарь специализированного Совета доктор биолог веских нале

А. В. Колобов

ОКЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫл Актуальность проблемы.

Изучение природных очагов члш, некоторые из которых находятся вблиьл ключевых центров цивилизации, показывает их огромные потенциальные возможности, вместе с тем, в настоящее время отсутствуют средства эффективной зашиты от данн<-1 инфекции. Испрльзу iaa в нашей стране чумная живая вакцина ЕВ Тб, несмотря на определенную эффективност , не способна создать длительного иммунитета (Лешкович ЛИ.. 1975: Нико.*яев Н. И.. 1978). проме того, она имеет ряд существ*, яных недостатков, выражающихся в высокой реактогенности. аутоаллергизирукшеи действии. снижении защитных свойств организма при аражении атипичными штанмани возбудителя члш и другие (Акимович В. В., Панина /LH.. 1965; Белов л.г., Иаторина н.А., 1987; Бунин К.в., Гапочко к.Г., 1970; Самойлова Л. в. и др.. 1970). применяемая за рубежом убитая Форноловая вакцина USP не обладает выраженными преимуществами по сравнению с живой вакциной (Даль-вадянц С.Н., Дробышева Т.К.. 1976. 1977 ). Это определяет актуальность постоянного поиска новых, более эффективных вакди-нируших препаратов для профилактики чумы.

Известно, что наиболее безвредными для макроорганизиа являются вакцины, полученные на основе отдельных антигенов бактерий. так как они содержат меньпе балластных, компонентов, имеют более четко направленный стимул и меньше нарушают естественный иммунологические гомс'остаг организма. Однако, вакцинация очипенкыми антигенами, выделеньыии из чумного микроба, не обеспечивает полноценной заситы экспериментальных животных от чумной инфекции (Басова а Н., фшшнонова Ю. А.. 19бв;Николаев H.H., 19С8; дальвадянц С.Н. и др., 1978; EhrenKranz к. j., Merer X. Р., 1955). при использовании традиционных стимуляторов (адьювант Фрейнда, гидроокись алюминия и др.) имеют место побочные эффекты, :вязанные с действкен алъ-ювантов.

3 последние годы (Петров P.E., Хаитов Р. И., 1977-1979; Кабанов В. А., 1978-1982; Петров Р. В. Хаитов Л И.,. '988) предложен и экспериментально обоснован новый принцип создания высокоиммуногенных искусственных антигенов и вахцинируюаях

комплексов. Принцип основан на том, что присоединение антигена игч антигенной детерминанты к синтетическому -олиэлектролиту (СПЭ), обладающему способностью к многоточечному кооперативному взаим'действию с белками и клеточной поверхностью лимФояи-тов, позволяет получить искусственные антигены, индунирущие сильный иимг-ный ответ к антигенной части комплекса вне за-висиьосп от гекоп. л иимуилзируеиой особи.

В настоящее время предложенный принцип подтвержден Фактами создания искусственной полимер-субьедшшчной вакцины против гриппа (Петров Р. В. и др.. 1989; Некрасов А. в. и др., 19891 и бруделлезно' ис. /сственной вакцины (Кммонал-тев У. И. и др., 1991). Полученные данные дают основание предположить возможность использования у азанного принципа для получения синте-т-ческих вакцин против дру. лж инфетпионных заболеваний, например Yerslni- Pestis,

KbijecTHo, что у чумного микроба в зависимости от метода выделения и условий культивирования может быть определено до 93 антигенов (Вейнблат В.и., 1974). Однако, в патогенезе чумы основьое значение принадлежат лишь некоторым из ник. основная роль отводится капсульному антигену (фракция i по Бейкеру) насован. Н., 19ТО; Лендов с. А^ и др., 19Т2). Известно, что важное зна^ ние имеют и полисахаридсодержапг антигены Шанина Л. Н. и др., 1973; Дальвадянп с. И. и др., 1978!. В этой связи в нас яшей работе в качестве антигенных детеркинак:', необходимых для создания высокоиммуногенн'" противочумных вакцинных препаратов нового типа использовали фракции 1, основной соматический антиген и полисахарид чумного микроба.

Цель и задачи ис<. .едования

Целью кастоящего исследования явил :ь изучение иннуноген-ных свойств ком. ;ексов и коньюгатов. полученных на о-лове антигенов чумного микроба (фракции 1. основного соматического антигена - оса, полисахарида - пс) и синтетических полиэлектролитов.

Для достижения этой дели ;ыли поставлены следующие задачи

1, Изучить гуморальный р клеточный иммунный ответ мышея ва Фракцию I, подученную различными методами.

2, Исследовать воздействие фракции 1, полу .¿ннои различными методами на пег ггонеальные макрофаги мышей.

3, зенить иммуногенность комплексов и конъггатов. подученных на основе фракции 1 ы синтетических подиэдектролктов.

изучить ии..уног°кт*е свойства препаратов, сконструкро-

аннкх ча основе двух антигенов чуиного микроба (фракции 1 и олисахаридсодержалшх антигсгов) и синтетических имнуномодуля-

'оров.

5. Проанализировать влияние генотипа мышея на индукцию ммунного ответа к . ракоди 1.

6. Исслеговать возможность Фенотипи-.еской коррекции им-[унного ответа на фракцию 1 с поиошью препаратов данного анти-'ена с синтетическини иммуномодудяторами.

Научная новизна работы

В диссертации впервые установлена зависимость им..уноген-сых свойств фр<ишии 1 от метода е<; получения. Показано, что шнунный ответ на фракцию 1 зависит от генотипа иышей.

Впервые показана принципиальная возможность повеления ин-«унного ответа иышей на фракцию 1 путей ее комплексирования я с^ньюгирования с синтетическими пояизяектролитани. Усгановле-ю, что при введении в данные системы полисахаридсодержаиего штигена (ОСА или ПС) наблюдается усиление иммунного ответа на №акцию 1.

Впервые установлена возможность фенотнпической коррекцйи лмунного ответа на фракции 1 с помолгью комплекса Фракции 1 с :иитетическик полиэлектролитом.

Научно-практическое значение работа

Кастояг-е исследование является частью комплексной программы создания высокоимнувогенных искусственных вакцинирующих препаратов нового типа. Катериалы работы использованы при выполнении государственной программы л. 69. 07 "Исследовать генетические и молекулярные механизма нарушений иммунитета и наследственных болезней и разработать на этой основе методы 1 способы их профилактики, диагностики и лечения" Госкомитета пг науке и технике. Новые научные факта, полученные в диссертационной работе, показывают возможность повыаения икмуногенпых свойств фракции 1 чумного микроба путем ее комплексироваяия и коньюгирования с СПЭ. Выявлена возможность Фенотипической коррекции иммунного ответа на фракцию 1 чумного микроба с помопью комшгкса данного антигена с поли-1 -вин'ШГ-К-4тилпиридиикй бромидом, что дает основание рассматривать ао.гаченный препарат прототип будущих вакцин нового тиаа. Установлено, что наиболее перспективным для получения пысокоиммуногенных противочумных препаратов являете- использование в их составе -шух ан-

- б -

тигенов чумного иикроба - белкового (фракция 1) г полисаха-рио--одержгчего (ОСА или ЯС).

По материг .ан работы получено авторское свидетельство Б 1443599 с ; 15. ов. 66 г. "Способ получения иикункой сыворотки к фракции 1 чумного микроба*.

. "абота т -полнена в соответствии с планом научно-исследо-вательс! :х работ ¿.аоораторш генетического контроля иммунного ответа Института иммунологии нинздрава РФ.

Положения, выносимые на защиту

i, Комплекс фракции 1 чумного иикроба с поли-4-ви-юш-Н-этилпиридиний 61 мидом усиливает клеточный и гуморальк"й иммунный ответ на фракпиь 1 у нш-ч. а также актирует кисло-родзавг^ ;мый метаболизм аеритонеальных макрофагов.'

г. Конъюгарование Фракции 1 с сополимером акриловой кислоты и н-винидпирролидона способствует усилению гуморального и кнеточного иммунного ответа на фракцию 1.

3. Введение в состав препаратов фракции 1 с спэ полиса*--ридсодержатего антигена (ОСА или ПС) повышает их иммуногенные . действа.

4. Имм. нный ответ на фракцию 1 связан с генотипом мышей, кыши линии СБА являются высскоотвечаюшими. мыши линии С57яь/б - ни .(ореагируюшими на фракцию 1. Гибриды (СВЛхСЗ , иы-ш линий ссэти и Л- Ь'п занимают прс-едуточное положение между СВЛ и С57ВЬ/б по стеиени реагирования на фракцию 1.

5. Комплекс фракции 1 с поли-4-винил-Е-этилпиридиний бромидом. введенный мысам ра- тых линий, приводит к Фен\. готической коррекции икмунного ответа на фракш^.' 1 у мшей низкореагирую-вего генотипа - С57ВЬ/б. под лмая его до уровня иммунного ответа у кышей СВЛ. высокоотвечаюших на Ф1 кши> 1.

Публикация результатов исследований и апробация работы

По теме диссертз'ионной работы опубликовано 3 работы, получено авторское свидетельство на "Способ получения иммунной сыворотки". Результаты исследований были доложены и обсуждены г" конференции молодых ученых Института иммунологии (Москва. 1986). на Е-й Всесоюзной конференции "Актуальны«? вопросы теоретической и прикдаI ой иммунологии, механизмы противочумного иии/ните.а (Саратов. 1987), конференции отдела иммунной биотехнология института иннунологии (Москва. 1969). нехлаборатор-ннх конференциях Иьстит-та иммунологии (Москва, 1990. 1991).

- т -

с

Объем работы

диссертапиоянля работа состоит из введег'тя, обзора литературы, : злохения материалов к кетодов гсследования. описания результатов и гас обсуждения, иллюстрирована ^^рисункаии и 3 таблицами, список литературы включает ¿¿^л" публикаций. из них ^ £ зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ : ЛБОТЫ

Материалы и методы исследования

-------------------------------

В экспериментах были использованы инбредные мыши линий СБА, С57ВЬ/б, С-57V, А/Эп и гибриды первого поколения (СВАхС57ВЬ/б>п• санки нассой 16-20 г. полученные из питомника лабораторных животных РАМН "Столбовая' и из научно-исследова- -тельской лаборатории экспериментально-биологических моделей РАИН "Светлые горы".

В работе были использованы следующие антигены чумного микроба:

1. Ф1А - антиген выделен из клеточной стенки бактерий переосаждением сульфатом аммония водно-солевого экстракта апе-тон-высушенных кле -ок (ВаКег Е. Е. ег а!.. 1952). Препарат представляет собой белково-полисахаридный комплекс (91. Т/. белка и до зх углеводов) с молекулярной массой х 10^Д. Антиген был любезно предоставлен сотрудником научно-исследовательского противочумного института (г. Ростов-на-Дону) канд. мед. наук л. А. Пустоваловым. л

2. Ф1 - антиген выделен из среды культивирования чунти бактер.»й с последующей гель-Фильтрацией (Сердобгагаев Л. Н.. 1984). Препарат представляет собой практически чистый белок <99.9*> с молекулярной массой г. о х ю®д. Антиген был любезно предоставлен сотрудниками всесоюзного научно-исследовательского противочумного института "кикр^б" (Саратов) докт. мед. наук Т. а. Тараненко и канд. нед. наук л. Н. Сердобинаевш.

тФ1 - тетрамер Ф1 "олучекОпутеи прогревания Ф1 при 95е С в течение 5 ¡ .шут (Сердобинпев л Я., 1964). молекулярная иасса препарата - 6,0 х 1С*Д.

4. нф! - мономер $1 .получен путем прогревания Ф1 при 95 в течение р минут 8 присутствии о, 1 '/.-кого раствора додедилсуль-

- О -

♦a—i натрия (Сердобинаев Л. н., 1984}, Молекулярная нас с а препарата - u х 'о*л

9. с "А - основной соматический антиген выделен из сырой бактериальной кассы экстракцией о. 25 " трихлоруксусной кислотой с послеягшей очисткой в процессе гель-Фильтрации (Дальва-дяая с.г , 1968). .ipenapa\ представляет собой полисахарид, инеший в своей составе неиее IX бедка. Нолекулярная иасса антигена от Т. о к 10*до 9.0 к 10*А ОСА был любезно предоставлен докт. нед. нале Т. И. Таганенко (ВШШЧИ "Микроб").

б. ПС пог. сахарид выделен из бактериальной кассы путей щелочного гидролиза. Нолекулярная касса ПС - 1.41 х 10*я. Антиген был любезно ш .доставлен сотрудником ВНИЯЧИ "Никроб* И. А. Беспаловой. ^

В v гчестве иммуностимуляторов использовали СЯЭ. синтезированный в Институте иммунологии Минздрава рф:

i. КЕ-3 - пояи-4-вшшл-Н-этияпиридииий бромид с молекулярной массой 1.5 х 10еД.

с. ПАК - полиакриловая кислота с молекулярной массой г О X 10*Д.

3. НА - сополимер акриловой кисло'. : (АХ) и н-винилпирро-лидона (Н-В1Д). содержаний 40 t 5* АК. молекулярная масса полимера - 1.0 к Ю5Д.

1. мНА - сополимер АК и Н-ВПД. моди»ициров нный гекса-илн октамь тпендиамином (степень молчФикагош 10-15Х).

5. КО - нолиоксидоний с нолекуляраой кассой 1.0 х 10*Д. Полимеры НЕ-5 и ПАК были получены в лаборатории генетического контроля иниуняог~ ответа (зав, лаб. член-кс респондент РАМЫ. про«, р.и. Хаитов). НА. мНА и *.о синтезированы в лаборатории искусственных антигеног (зав. лаб. докт. хим. наук А.В.Некрасов) .

В качестве искусственных иммуногенов использовалась комплексы и конькгаты антигенов чумного микроба с СПЭ. Комплексы Ф1А с НЕ-3. имешие разные весовые соотношения антигена и полимера (1:ь 1:2. г: 1, соответственно) и комплекс (ПС-ИЕ-3) -ФХА (1:3.6 : Ч. О) пог -чены в лабораторил генетического контроля иммунного ответа канд. хим. наук т. В. Абраиенко. Гоньогаты кФХ. тФ1 и ОСА с НА синтезированы в лаборатории искусственных антигене канд. хим. натк т. 3. Берестопко1.. K-t -и41- НА (£:1); К-г МФ1-ОСА-КА (1:1 1): К-з - тф1-НА (1:1.3): К-. - И -OCA-HA (1:2.б:г.г).

Для выявления антител к Фракции 1 использовали реакшт пассивной гемаггли.инапчи (РПГА) с применением коммерческого чуиного эритроиитарного диагностиктна производства средкеази-

атского научно-иссдедовате~ьског£ противочумного института (Алма-Ата) и метод твердофазного имнунофермен~"1ого анализа (ИФА). Постановку ИФА проводили по стандартной методике (Voller А. et at. 1979) с сенсибилизацией никропланшетов (Flow) Фракцией 1.

Для определения количества антителообразуюших клеток б селезенке .»шей использовали метод локального генолтгаа в ага-розном геле (Jerne Н.К., Hordin A.A.. 1963).

определение серологической активности препаратог Фракции 1 проводили с поиошью РПГА с применением чумного эритроцитар-ного антительного диагностикуна производства Среднеазиатского ваучно-исследсаательского против-.чумного института (Алма-Ата).

Для тестирования т-клеточного иммунного ответа использовали реакцию гиперчувствительности замедленного п.-.а (РГЗТ). оцениваемую в плантарном тесте (Kltaimira К., I960).

Кислородный метаболизм перитонеальных макроФагоп. определяли с помощью метода люминолзависимой кенилгминесцендии (ЛХЛ) при Фагоцитозе опсонизированного свежей сывороткой зимозана (Барсуков A.A. и др., 1983).

Выявление лизосом перитонеальных макрофагов проводили с помощь» акридинового оранжевого в люминесцентном микроскопе ЛШАН PI (фрейдлин и. с., 1976).

каждый эксперимент повторяли з-tä ра?. Полученные результаты обработаны статистически по обаепринятым нетодам. Достоверность разности средних оценивали по критерию стьюдента и разницу считали достоверной, если уровень значимости не превысил 0,05 к.

РЕЗУЛЬТАТЫ Ч ОБСУЖДЕНИЕ 1. Сравнительный иммунологический анализ фракции 1,

полученной различными методами.

Известно, что основным антигеном, участвуюиим в Формировании иммунитета к чуие, является капсулышй антиген (Вейнбла-з. и., 1971! Николаев н. и., 1968: веппег г. е., Тогпаьепе т. в. ,1974). в настоящее время для получения капсульного' антигена .умного микроба испол£ -уют дв<* основных четода. Первый из них основан н<г-получении фракции 1 ,.з клеточной стенки бактерий - Ф1А (ВаКег Е. Е. е! а1., 1952^ второй - на выделении из-среды культивирования ниадроорганизмов - Ф1 (Вейнпат В. И., 1974). Кр^ме того, для Ф1 описана способность диссоциировать

при определенны" условиях до тетрамера и мономера (Сех „обинпе Л. Н. I 196'. >. Нами было проведено сравнительное изучение эту антигенных препаратов. о

. в предвтчггельиых исследованиях были подобраны оптимал! ные ими' -изирушие д^зы капс/льного антигена и способ его вв< дения мышам. Было установлено, что для работы целесообрал использование фракции 1 в дозах 10 и 50 нкг/мпь. показан* что подкожная инъекция фракции 1 является более эффективной 1 сравнению с нта-.£ршинкым и внутривенным вве/"»нием антиген, что полностью согласуется с данными литературы (Самойлова Л. 1 и др.. 1979; Сорокина т.Б. и др.. 1962; Лебединский В. А. и да 19М).

1.1. Определение серологической активности препарат фракции 1.

Для выявления серологической активности фракции 1. пол ченноь различными кетодаии. использовали РОГА с, чумным зрито цитаркым антительным диагностикумок. Было установлено, что с . алогическая -чтивност* Ф1А. полученной из клеточной стен бактерий и представлявшей собой белково-пс гисахаридный ком деке, была идентична серологической активности Ф1. выделен» из к льтуральной жидкости и являшейся чистым белком, мови> во своей серологической активности н-> уступая Ф1А и Ф1. У т« раиера Ф1 отсутствовала способность агглютинировать антителг фракции 1. Очевидно, потеря способности взаимодействовать специфическими антителами связана у тетрамера с ус...> виями < получения и обусловлена потерей им I. обходимых детерминант процессе его самосборки из не эмеров.

Таким образом, проведенные исследи ания выявили одила( вую серологичес: ю активность Ф1А и Ф1. однако, поскг тьку I тоды их получения различны, было предположено, что набор а пифических детерминант у них может быть неодинаков. Это пр< положение било изучен^ с помощью ИФА. В эксперименте исполь: валась сыворотка крови мывес иммунизированных Ф1А в дозе икг/нышь с интервалом в 21 сутки и взятая на 10-е сутки по! '-»следней иммунизации. Сенсибилизацию микропланшетов провод: антигенами Ф1А и Ф1. становлено. что активное > сиворот подученной от кышей, иннунизированны. Ф1А с антигеном Ф1А э чт^льно выше, чек с Ф1. что подтверждает сделанные ра предположения.

- 11 -

<.г. гунорзльный иммунный ^твет на «раклю 1. подученную различными метос ни.

Для тестирования гуморального иммунного <. гвета, мышей ■ибрилов fi иммунизировали подкожно Ф1А. Ф1. тФ1 и мФ1 в дозе >о мкг/мишь. так к ж. по предварительным даш.*м, первичный от-1ет на Фрак- да 1 отсутствует, то мышеи реиммунизировали череп :1 сутки после первичной иммунизации соответствующими антиге-[аки в той же дозе и на Т. 11. 14 и 21 сутки оде мвали титр штител в ррга. Наксимальный иммунный ответ наблюдали на 11-е :утки после реимклшзадии. Установлено, что титр анттг ул к Ф1А ¡олее. чем в в раз превышает титр антител к Ф1 и его тетраме->у. Гуморальный иммунный ответ к Ф1 и тФ1 находился тактически ta одной уровне во все исследованные сроки. Титр антител к №1 [ишь незначительно превышал фоновые значения антител.

Таким образом, проведение- экспег'тменты ,выуиМ1ЛИ более шзкую. по сравнению с ф1а. способность «1 и ее диссоциатов индуцировать втори^чый гуморальный иммунный ответ.

1.3. т-клеточный иммунный ответ на фракцию 1. полученную различными методами.

Для изучения т-клеточного иммунного ответа на фракцию 1. зодученную раличными методами, мышей гибридов (СВА х C5TBL/6) Г1 подкожно иммунизировали Ф1А. Ф1. тф1 и нФ1 з дозе 50 даумышь и на б, 10,13 и ai-e сутки оп-еделяли РГЗТ. Накси-кальные значения РГЗТ Получены на 10-е сутки, наиболее выраженный икнуннь"Ч ответ наблюдался при введении мышам Ф1А. в то время как гФФект от введения животным Ф1 был в 2 раза ниже. V мышей, иммунизированных мФ1, реакция гиперчувствительности находилась практически на уровне контроля. Иммунизация животных тФ1 не приводит г к Формирогчнию т-клеточного иммунного ответа. Параллельно с валики экспериментами, да ные антигенные препараты были изучены в тесте зашиты мышей от экспериментальной чумы саратовской внипчи "Кикроб". В результате проведение.: экспериментов установлено, что тетранер. не способный индуцировать т-клето^ный иммунный ответ, не зашишал кшей от чумной инфекции. Наиболее выраженными протективныки свойствами обладала Ф1А.

1.4. Влияние препаратов фрак^та 1 на активность Ферментов лизогом перитонвольных макрофагов.

известно, что процесс переработки антигенов связан с дн-зосомана макр >агов (фрейдлин и. С.о 1976-1987! BandeKar J. ВГ. and Devdat P. H., 1987), ^ состояние мембран которых пределяет

- и -

функциональную активность не только лизосон. но и в-ей клетки в шлон. " ктивацию лиэо-онального аппарата нак~оФагов нохяо охарактериэоват , в частности, по включению Флуоресцирующего вешества акридинового оранжевого в лизосомы (фрейдлин и. с.. 1976).

. яыло из: ено влияние Ф1А и <И на активность Фернентов ли-зосок m, итонеальнь-i макрофагов мшей (СВА х C57BL/6)F1. Установлено, что исследуемые антигенные препараты активируют vep-иенты лизосом, активация зависит от дозы фракт-t 1: иктенсив-ность свечения лизосом повышалась с увеличением дозы вносимого в культураль >ую с^еду антигена (1-юо икг/мл с^ды). Наряду с этим было показано, что при добавлении в культуру Ф1А в дозе 100 мкг активность лизосомальных Ферментов по сравнению с ич-тактными макрофагами была выше, r-ji в случае Ф1. при использовании ^л'тигеков в меньших дозах (I и 10 ккг/кл) эти отличи* были менее выражены, возможно . способность Ф1А более интенсивно воздействовать на ли-'осомальнкй аппарат микрофагов О сравнении с Ф1),в какой-то мере, зависит от наличия в е< составе полисахаридного компонента. Согласно данным литера' " ры, доказана лизосомотропность полисахаридов. Считается, чт * .л активизир ornee дег твие н? функшш накрофагов может быт связано с ¿...тивавдей лизосомного аппарата С -рнова 3. А. и др. 197в).

Тахх* образом, анализ препаратов Фракции 1. различаюиихс по способу получения, проведенный к: первом этапе работы пока зал, что антигеном, обладающим наиболее выраженными имиуноген нынн свойствами, а также способностью активировать лизосональ ный аппарат макрофагов, вляется фракция 1, получс .ная по ме году Бейке^ч из неточной стенки ба^/ерий - Ф1А.

г. Кзгчение иммуногеннык свойств к лплексов и конъюгатог

Фракции 1 с синтетическими пояиэлектролитами.

В предваритедьн: к экспериментах была поставлена зада» отобрать синтетические иммун.лодуляторы-косите^л, обладают не только способностью стимулировать гуморальный иммунный о: ,ет, но и акт!шировать Функцию макрофагов, как одного 1 основных звеньев защити при чумной инФекккк. с 9.омо_ыэ мето; локального гемолиза в агарозном гель и метода ЛХ/1 были и:;уче! следуювь.<г СПЗ - НЕ-3. ПАК, НА. мНА и ПО. В результате про я денных исследован^ были рысранн два полиэлектрояита - НЕ-3 ЕА. которые в далыгчтем использовались для получения ком

ммсов и коньюга^ов.;

2. 1. ЙМИЛ1 генные свойства комплексов Ф1А - НЕ-3

Достаточно высокие, как было установлено, иммуностимулирующие свойства не-3. а также его способность комплексиро-заться с белками (Кабанов В.А. и др., 1977, 197В), легли в >снову получения комплекса не-з с фракцией 1 чумного микроба. Для выяснения оптимального соотношения 4>1А и НЕ-3 в конплексе Зшш исследованы препараты с различным содержанием в них антигена и лолиэлектролита. Выявлено, что наиболее иммуногеннын явдягтся соотношение Ф1А и НЕ-3 равное 2:1, с которым и быт; про^-^лжена работа.

Для изучения иммуногенных свойств комплекса $1А - ИЕ-3, мыаей гибридов (СБА х С57ВЬ/0)П иннунизировали по описанной выше схеме. В результате проведенных исследог-ний было установлено, что комплекс Ф1А - ИЕ-3 индуцирует как первичный, так и вторичный клеточный иммунный ответ к Ф1А (рис. I). Иаксч.аль-ные значе ия индекса РГЗТ, полученные на 13-е сутки после первичной и 10-е сутки после вторичной иммунизации в 2-3 раза превышали максимум РГЗТ после иммунизации мышей чистым антнгенон и приближались к значениям индекса реакции животных, примнро-ванных Ф1А в на-}. Установлено, что полученный комплекс также усиливает и пролонгирует гуморальный иммунный ответ к «НА.

Сделано предположение, что весьма важным для получения высокоактивного искусственного вакцинирующего препарата долхн<. являться сохранение иммуномодулируюаих свойств СПЭ, входяпего в его состав. В связи с этим изучено влияние комплекса Ф1А -ИЕ-3 на неспецифическую Фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов, позволяющее оценить иммуномодулиртпие свойства лоякнёра. входяшрго в состав комплекса. Мышей гибридов (СВА х с„7ВЬ/б)П иммунизировали внутрибршинно НЕ-3 и комплексом Я А

- НЕ-3 в дозах Ю к 100 юоуиызь по полимеру. ИакроФаги выделяли из срсиной полости мкшей на 2-е н 21-е сутки после иммунизации и определяли уровень лхл при Фагоцитозе зинозана.

Установлено, что иммунизация мшей КЕ-3 и комплексом Ф1А

- КЕ-З приводит на 2-е сутки к стимуляции неспецифической Фагоцитарной активности макрофагов. При этом инъекция мышан чистого полимера (100 мкг/ншь) вызывает несколько болыкий хе-ииленкнесцентщ л от1>ет Фагопитов. чем введение полимера, находящегося в составе комплекса с антигеном. Полученные данные сзкдотельс .в/к-г о гон, что кнмуномоду/лфуюяая активность Ке'} после его конплексировання с Ф1А сохраняется.

-

о

Рис. 1 Динамика перычного и вторичного Т-клеточного иммунного ответа на V 3 •о ■а" -♦1А в НАф! * " ;'»МШекС Ф1А - МЁ-3. Доза по «1А - 30 икг.

о

- 15 -

2. г. иммуь-гекные свойства комплекса ПС- нк-э - Ф1А,

В настоящее время стало очевидный, что полноценной залиты организма от ¿акой сложной инфекции. как чума с помощь» одного антигена получить ве возможно, в этой связи представлялось целесообразным выяснить может ли введение в состав комплекса Ф1А - НЕ-З еше одного антигена повысить мнмуногенные свойства такой системы.

Как известно, клеточный иммунитет при чуне имеет превалирующее значение (Коробкова Е. И. 1955: Задумина С.КХ и др.. 19?б. 1967: Пионтковский С. А. ндр.. 1980: Т.Уопв. Б. Е1Ьег^. 1977). В связи с этим был изучен т-клеточный инмунный ответ к ♦Ь. при подко.лой иммунизации мышей гибридов (СВА х С57ВЬ/б1П комплексом ПС - МЕ-3 - Ф1А. Реакцию гиперчувствительиости учитывали на пике вторичного имнуннвого ответа (10-е сутки). Как видно из рис. г введение в состав двойного комплекса Ф1А -НЕ-З полисахариднсо антигена чумного микроба заметно усеивает т-клеточный иммунный ответ к Ф1А. хотя способность полиса-харидных антигенов усиливать иммунологическое действие других антигенов чумного микроба известна (Панина АН. и др.. 1973. Дальвадянц С.н.. Дробышева Т.Н. > 1976 1977), важно,что наблюдаемый эффект характерен именно для системы, в состав которой входит синте-ический полиэлектролит, использование для иммунизации животных только смеси Ф1А и ПС не дает подобного результата (рис. 2). такин образом, введение полимерного носителя г систему позволяет повысить инмуногенность комплекса и получить иммунный ответ практически аналогичный иммунному ответу на Ф1А. введенную в НАФ.

В научно-исследовательском противочумном институте (г. Ростов-на-Дону) комплексы «1А - НЕ-З и ПС - НЕ-З - Ф1А были изучены в тесте зажиты мышей от экспериментальной чумы. Показано, что данные препараты обладают высокими протективными свойствами.

2. 3. Изучение иммуногенных свойств коньюгатов Ф1 и ОСА с сополимером ЛИ и Н-ВПД.

Согласно дакшм литературы, понимо комплексирования, для повышения иммуногенных свойств бактериальных и вирусных антигенов используют конъюгирование их с синтетическими полиэлектролитами (Хаитов Р. И. и др.. 1981-1953; Петров Р. В. и др., 1984-1936). в предварительных исследованиях были иучены ими» • ногенныс свойства' конъсгатов Фракции 1 чумного микроба с различными полимерами и в разных соотношениях. Дг работы бш..; отобраны наиболее перспективные препараты в которых в качест-

Индекс РГЗТ,

"20 -

10

1*1

нн

Л

11

I 2

4 5

Рис.2. Вторичный т-клето* гай имнунный ответ на Ф1А (10-е сутки) после введения мышам: Ф1А (1), смеси Ф1А+ПС (2). комплекса Ф1А - НЕ-з (3), комплекса ПС - НЕ-3 - Ф1А (4). Ф1А в НАФ (5). Темный столбик - интактны кыши. Доза по Ф1А. - 50 ккг/иышь.

ве полимерного носителя бь- использован сополимер АК и Н-впд (НА), ¿ля изуен гуморальный и Т-клеточный иммунный ответ на Ф1 при введении иышам коньюгатов К-1. К-2, К-з и К-4, отличающихся иехду собой по составу и Форме антигена (мононер и тет-ранер).

Июлей гибридов (СВА х С5ТВЬ/6Ж1 иммунизировали подкожно ♦1. Ф1 в НАФ в дозе 10 нкг/ныиь и конъюгат^ии с той же дозой антигена. На 7.10. и-е сутки ьосде реиммунизадии определяли титр антител и ""-клеточный иммунный ответ.

Анг..:из иммунного ответа показал, что все изученные конь-югать1 крс'.е к-3, обладают способностью индудировать образова • че антител и вызывать Р1ЗТ на антигенную часть конъюгата (рис. 3). Сравнение препаратов, полученных на основе мон.-пера (К-1 и К-2) с препаратани. синтез-рованнылл н. основе тетраме-^а (К-З и К-4) выявило более высокую иимун*геннуг активность пе вой паРы коньюгатов. что, очевидно, связано с особенностями структуры антигенной час :и препарата. Наряду с этин установ

Ьщокс ГГЗТ, %

О

20

18

16

14 12

1918 6

4 2

А

а)

1 2 3 4' 5 5

Тчтр антител,

Ж

А

6)

Я

Рис. 3. Кндукяия вторичного иммунного отзета па Ф! конъ-г"атанн антигенов чумного микроба с НА.

а) т-клеточиыя иммунный ответ (10-е сутки).

б) гуморальный иммунный ответ (7-е сутки). г

1 - контроль (интактные ныши); г - Ф1; 3 - Ф1 в НАФ; 4 - К-1; 5 - К-2; 6 - К-3; 7 - -'-4. Доза ПJ Ф1 - 10 мкг.

но. что коньюгатн, содержащие только один антиген (Ф1). менее имиуногенны, чем те. которые имели в своем составе два антиге на (Ф1 и ОСА). Параллельно с нашими исследованиями во ВНИПЧ 'Никроб" (г. Саратов)были проведены опыты по оценке протектив них свойств полученных конъюгатов. наиболее хорошим защитны эффекте обладали препараты, содержащие в своем составе ОСА.

Таким образом, результаты данного раздела работы показы вают. что конъюгаты низкоколекулярных фрагментов *1 с НА новы лают иммунный ответ на Ф1. Введение в их состав подисахарйдсо держащего антигена позволяет усилить подученный эффект.

Проведенные исследования иннуногенкых свойств комплексо и конъюгатов Фракции 1 и полисахаридсодержаших а тигенов синтетическими полиэлектролитами показали принципиальную воз нежность использования предложенного Р. В. Петровым. Р. М. Хаито вым и соавторами подхода для создания искусственных высокоим "уногенкых препаратов. Наиболее перспективными при- этом по-видимому, следует считать препараты в состав которых вхо дят, по крайней мере, два антигена чумного микроба.

3. Генетический контроль и Феиотипическая коррекция

иммунного ответа на ф1а чумного микроба.

3.1. Влияние генотипа чывей на иммунный ответ к Ф1А.

и-честно. что в развитии имнунного ответа на различи* антигены первостепенную роль играет генотип организи (Вепасегга£ В., 1980).--Установлен Факт существования индивиду-иов с генетически обусловенной низкой реактивность» по отноше ни» к конкретным антигенам (Петров Р. В., Хаитов Р. н., 1976) Нами была изучена зависшость выражекност иммунного ответа я Ф1А чумного микроба .т генотипа лыщей,

Ныоей линий СВА. С57ВЬ/б. СС57У. а/бп и (сва x С5ТВ* 'б)Г иммунизировали подкожно Ф1А в дозе 30 мкг/мышь. Через £1 сто животных ^еиммуннзировали антигеном в тог. же дозе. На б, к 13 ь 21-е сутки после им. /низании определяли т-клеточньй ю мунный ответ с помощью РГЗТ и те же сроки после первичной вторичной иммунизации титр антител к Ф1А : помощью рпга. выяе лекэ. что антитела у всех лиеий мышей поя ляются в заметне количест:;» лишь на 21-е сутки после примирования и досткга» максимума на 7-е сутки после реиммунизации. Наксинал1 нь Т-клет'Чныи иммунный ответ наблюдали на 13-е с>.ки после пе!

«

вичной инмунизаг и,; Было установлено, что высокоотвечашей на ♦ 1А линией являются ныти СВА- низкореаги^таей - С57В1У6. Мши линия А/Бп . СЛ5ТУ и гибриды (СВА х С57ВЬ/б)П занимали промежуточное положение по силе иммунного ответа. Из полученных данны*' следует, что генетические различия проявляются как на уровне клеточного, так и на уровне гуморального имнунного ответа. У мышей линии СВА индекс РГЗТ был в 3,2 раза выше индекса реакция мышей линии С57ВЬ/б. Ори гуморальном иммунном ответе эти различия были еще более выражены: титр антител у мышей СВА в 16 раз превосходил тктр антител у мышей С57БЬ/б.

В настояяее время инеются работа, касающиеся норФолог!?-чес.лх изменений, происходящих у мышей разных линий после вакцинации их живой чумной вакцины (Назарова л.с. и др.. 1983) и механизмов естественной резистентности различных линий мышей при заражении их у.резиз (Уаке А.. 1980). .о данным авторов этих исследований мыши линии С57ВЬ, б являются наиболее чувствительными к чумной инфекции. Полученные нами данные свидетельствуют о наиболее слабом иммунном отчете на Фракцию 1 чумного микроба также у мышей линии С57ВЬ/6, таким о"?азон. результаты наших экспериментов и данные литературы свидетельствуют о генетической обусловленности иммунных процессов. Происходящих <з иммунизированном фракцией 1 чумного микроба или вакцинированном чумной живой вакциной организме.

3. 2. Фенотипическая коррекция генетического контроля иммунного ответа на Ф1А у мышей разных линий с помощью комплекса Ф1А - НЕ-3.

Создание синтетической вакцины против чумы предполагает получение препарата, способного обеспечивать фенотипическую коррекцию геяетг-еского контроля иммунного ответа на антигены, входящие в ее состав.

Хак описано выше, высота имнунного ответа на Фракцию 1 чумного микроба генетически детерминирована. Ныши линии СВА являются высокоотвечаюпнни на данный антиген. С57ВЬ/б - низко-реагируюЕкми. гибриды И занимают промежуточное положение. Учитывая, что ведущую роль в противочумной защите животных играет Т-клеточный иммунитет, нали была изучена возможность фе-нотипической коррекции генетического контроля т-клеточного иммунного ответа на. Ф1А у мышей линии С37ВЬ/С и гибридов К1.

Иьшей линий СВА, С57ВЬ/б и И иммунизировали подкожно ф; \ и комплексом Ф1А - мз-з в дозе зо мкг/ккшь по антигену. На пике первичного клеточного иммунного ответа (13-е с—пси) опредг • ляли РГЗТ. Результата исследований представлены на рис.4.

¡Iдокс РГЗГ,

* 22

контроль ч .жактмлз . :ггт-) .

"ЯЛ 5G 13КГ

Рис. 4. фенотшшческая коррекция комплексом Ф1А - К&-3 Т-> клеточного иммунного ответа на Ф1А у мышей разных flKHiui. 13-е сутки после первичной иммунизации.

в данных экспериментах, как и ранее, фракция '1, введенная мышам линии C5TBL/Q и гибридом iCBA к C37BL/6)Ft. "ндуцировала спабо выраженную РГЭТ. Имнуг зация мыше" комплексом FIA - НЕ-3 пря-водила°к возрастанию у мышей C57BL/6 с 4.4 до 10, о*, гибрилов PI - с 3,8 до 11.ах. то есть, у данных линий мышей иммунный ответ повьшп ich до уровня иммунного отве-1 мышей линии СБА. имиуниллрованных только ант теном (14,8 ♦ 1.2*). Полученные результаты согласуются с данными гчтературы о возможности кор-рекг !и иммунного ответа на другие антигены " помощью синтетические подизлектролитов (Нахкитдинов А. К. и др. 1980; Насыров А. А. б 1984; Хаитов P.M. и др.. 1982; Корякине. A., Ii85).

Такгм образом, подученные данные о выраженн: х иммуноген-

ных свойствах комплекса Ф1А с НЕ-з. его способность активировать функцию накроФагов и с :ушествлять лэнотипическую коррекют иммунного ответа на антигенную часть комплекса, дают основание предполагать, что сконструированные подобным образом препараты буду обладать определенными вакцинирующими свойствами. Наиболее перспективными являются системы, имеющие в своем составе два антигена чумного микроба. Результаты исследований, проведенных нами совместно с Всесоюзным Саратовским научно-исследовательским противочумным институтом "Микроб* и Ростовскин-на-Дону научно-исследовательским противочумным институтом подтверждают сделанные предположения. Вместе с тем, учитывая, что чума является сложной инфекцией, необходимо продолжение работ по созданию искусственных вакцинирующих препаратов против ""мы в 2-х основных направлениях: П выбор адекватных модельных систем; 2) создание оптимального композиционного состава, вклсчаюшего несколько антигенных детернияг т.

Выводы

1. иммуногешше свойства Yersinia резиз зависят от способа ее получения, фракция 1, выделенная из клеточной стенки чумного i -кроба по методу Бейкера обладает более выраженной шмуногенностью.

2. Комплексированне <МА с сютетяческим пояизлектролитм - поди-'1-виннл-н-этшшяркдияий бромидом приводи¿ к значительному усилению Т-клеточпого и гуморального иммунного ответа па

3. Комплекс Ф1А С. поли-а-вияил-Н-зтилпид-идиний сро.пг.мои стимулирует неспецифическую Фагоцитарную активность перитоне-альных макрофагса. оцененную в тесте люминолзависиной хемил»-минесцендии.

Введение в состав комплекса с пола-4-эинил-П-этилпири-динй бромидом двух антигенов чумного микроба позволяет получить препарат, обладающий более княуногенными свойствами, чем комплекс данного полизяектрошта с 51А,

5. ИммУногенаость конъктатов с сополимером АК и Н-ВЛД зависит от ¿орки яходяоего э их состав антигена. Хонъюгат, син-тезировашшл на основе мономера <И существенно повышает т-клеточкий и гуморальный иммунный ответ на Ф1. Использование в составе коньюгатд тетранерз ,не вызывает усиления иммуног' ных свойств данного антигена.

6. Введение в состав конъюгата Ф1 с con- -.им«том АК -й-вед основного соматического ■'нтигедаа чучного микроба приво-

- 22 -

дит к значительному усилению их имкуногеиных свойств.

7. Имиуногенные свойства Фракции 1 зависят от генотип; иииунизирует особи. Нши линии СБА являются выокоотвечаюшимг иыши линии с57вь/б - низкореагируюшими на фракцию 1. Гибриш ;сва х с57вь/б)п, иыши линий сс57у и А/Бп занннают промежу точное положение нежду сва и с57в1./6 по си..е иммунного ответ! на фрак I.

в. введение комплекса Ф1А с поли- 4-винил-к-этилпиридш: т бромидом мышам разных линий оппозитноотвечаюшии на Ф1А приво дит к нивелированию иеждинейных различий в иммунном ответе т. е. к Фенотипической коррекции 1г-генного контроля иммунног ч,твета.

9. Показана приникли чьная возможность использования но вого подхода для повышения иммуногенных свойств чумных антиге нов путем их конплексирования и коньюгирования с синтетически ми полиэлекдролитами. Полученные препараты являются осново для создания синтетических вакцин против чумы.

Список работ, опублик.аанных по тене диссертации.

1. Калита С. А. (в соавторств. с хаитовым Р. и., Муста Фае вым И. и.. Алексеевой Н. С., Пустоваловым В. Л.. Наумовым А. В. Абраменко Т. В., Сердобинцевым Л. Н.. Костиной г. И.. Васильева Г. И.). Способ получения иммунной сыворотки к Фракции' 1 чумног микроба. - Авторское свидетельство N 1445399. выдаг юе Госкс иитетом СССР по к-лам изоб; чтений и открытий 15, ое. 68 г.

2. Калитг С, А, (в соавторстве с Алексеевой Н. ю., Нустафг евым Н. и.. Абраменкс^ т. В.. Пустоваловым В. л., Сердобинцевь Л. Н.. Хаитовым Р. П.. Тараненко т. К.). Иммунный ответ мыше различных генотипов на фракцию 1 чумного ::икроба и его Фено-п пическая коррекция //Лг"ораторная диагностика и генетика вирз лентности возбудителей особо опасных инфекций. Саратов, 199< - С 155-160.

3. Калита С. А. (в соавторстве с Петровым р. в., Горьковс А. В., хаитовым Р. И., Некрасовым А. В., Наумовым А. В.. Алексе* вой '{. кх , Воронцовым е. д. . Павловой Л. п.. Тараненко Т. Н., Се! добинцевым1 Л. Н., ДУбичевым А. н.. Берестепкой Т. 3.. Оуковсю Т. а , Костиной Г. И., Тихомировой Е. И., Андреевой П.! Искусственные вакцинирующие пре1.1Раты на основе капсульно1 антигена и синтетических полизлектролитов //Сборник трудов Н ГЛ» им. ф. Гамалеи. - Москва. 1990. - С. 191-196.

4. Калита С. А. (в соавто рстве с мустаФаев».-м и. И., саь.л' вой и. В.. Алексеевой Н. Ю.). Водорастворимые тройные полимерн'

- -

шчсскиз комплексы калсудьного антигена чумного тш-оба и •жнуяогенныэ свойства. (В печати).

УЧАСТОК мм О* И ТЕЛЬНОЙ 'ТЕХНИКИ ОНЦ РАМН ПОЛЯ. * Л ЕЧАТ И /5Ь.%г*К . б' ТИРАЖ /'-«'экз