Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Разработка вариантов флуоресцентного иммуноанализа с временным разрешением для диагностики бруцеллеза и гепатита В

о я 9'11

Министерство здравоохранения РСФСР

Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского

На правах рукописи

ПОНОМАРЕВА ИРИНА ВЛАДИМИРОВНА

РАЗРАБОТКА ВАРИАНТОВ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ИММУНОАНАЛИЗА С ВРЕМЕННЫМ РАЗРЕШЕНИЕМ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА И ГЕПАТИТА В

(14.00.36 — Аллергология и иммунология)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва — 1991 г.

Работа выполнена в Научно-исследовательском ордена Трудового Красного Знамени институте эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи и ордена Ленина Институте биохимии им. А. Н. Баха АН СССР.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор К. Л. Шаханина; кандидат химических наук А. П. Савицкий.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Е. В. Сидорова; кандидат медицинских наук В. А. Алешкин.

Ведущее учреждение: Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова АМН СССР.

^Защита диссертации состоится 1991 г. в часов на заседании Специализированного совета (К 084.18.01) при Московском научно-исследовательском институте им. Г. Н. Габричевского МЗ РСФСР по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского.

Автореферат разослан 1991

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

О. В. КОТЕЛЬНИКОВА

'i общая характеристика работы

"м'-" '^Актуальность проблемы. Наиболее важньши областях-;! применения иммунологического анализа являются диагностика инфекционных заболеваний, обнаружение возбудителей в объектах внешней среды, контроль донорской крови и препаратов, получаемых из нее ( А.М.Егоров, 1988).

Социально-экономическая значимость инфекционных болезней сегодня все еще велика. До настоящего времени в числе заболеваний, наносящих значительный ущерб экономике я здоровью населения, остается особо опасная инфекция бруцеллез (Е.А.Губн-на и соавт., 1969). По сравнению о 1983 годом заболеваемость лпд^-й бруцеллезом в СССР возросла на 20 % СЮ.М.Федоров и соавт., 1989). Из-за преобладали« первично-хронических, латентных и стертых форм заболевания особую необходимость для диагностики бруцеллеза приобретает использование высокочувствительных и специфичных лабораторных методов и, прежде всего, методов иммуноанализа (М.М.Желудков и соавт., 1986).

Одной из важнейших проблем, стоящих перед медицинской вирусологией во многих странах мира, является гепатит В. В СССР более 100000 человек ежегодно переносят острый гепатит В, насчитывается около 15 млн. так называемых бессимптомных носителей поверхностного антигена вируса гепатита В (НВа Ац), . которые составляют основной резервуар инфекции. Конструирование высокочувствительных иммунодиагностикумов для выявления маркеров гепатита В и внедрение их в медицинскую практику и, в первую очередь, в службу крови, сможет обеспечить снижение частоты поеттрансфуэионного гепатита В и привести к улучшению уровня специфической лабораторной диагностики (В.М.Жданов и соавт., 1966; Д.КДьвов и соавт., 1969).

В конце 1970-х годов Е. 8о1п1, I. НештНа et а1. разработали норый метод иммуноанализа, флуоресцентный иммуно-анализ с временным разрешением (ФИАВР), в котором для проявления реакции антиген-антитело наиболее часто используется лантанидная метка, евроглй (ец). Регистрация долгоживущей флуоресценции метки с временный разрешением позволяет устранить влияние фонового свечения, которое значительно снижает чувствительность традиционных методов флуоресцентного иммуноанализа (ФИА).

К основным преимуществам метода ФИАВР относят высокую чувствигельност!, и специфичность, широкий линейный рабочий диапазон, .экспрессность, пригодность для проведения кассовых исследования, стабильность и безвредность метки ( E.Soinl, 5.Lövgrea, I.Henailä, 19S8). По чувствительности ВДАБР

не уступает или цауе превосходит имуноферментный (И-'А) в ра-диокымунслогический (РИА) анализы (H.Alfthan,1986).

'¿ирь'а ХЛШ-iiallao (Финляндия) с 19с34 года производит флуорометрн с Брекеншл раэресениеи типа " Arcus" и диагностические наеору для диссоциснно-усиченного л&итанидного-флуо-рзсцгктного икмукоанализа ), которые с успехом ис-

пользуются для определения fприсная, лекарств, опухолевых маркеров, вирусных антигенов. Тестг-скстемы ¿11АВР для диагностики бактериальных инфекций ке разработаны.

Рабога вьтолнялясь в соответстьии с оС.цссоюаной научно-технической прагрскмой 0,74.05 "1,1эико-химическая биология" задалийм 22.¡11 "Разработать ишуннь-е окспрссс-метсды анализа (ишуис^ерментяого, имиунохшичесгого, и№уно$1луоресц?нтного и другая)".

Цель исследования: разработать с использованием отечественных реагентов варианты Флуоресцентного иуфюммкоа с ври-квннкм разрешением для определения бруцеллезных антигенов и антител.к ним, а также HBsAg в клиническом материале.

Оснсгнке задачи исследования}

1. Сравнить разные производные пол и .«um i -. о л олг карб он о в ух кислот по эффективности при получении меченных Su »нтител,

2. Определить специфические условия проведения гадлуноана-лиза при использовании лантаиидной >«егки„

3. Разработать вариант ttlABP для определения бруцеллезных: антигенов, апробировать его на клиническом материале.

4. Разработать вариант ¿ИАБР для определения антител к бруцеллезным антигенам в сыворотке кроги человека.

5. Разработать варианты 'Й1АВР ддк обнаружения HBsAg с использование)/, препаратов меченных Ей антител к стрептавиди-на.

6. Оценить пригодность данных вариантов ФИАВР для диагностики вирусного гепатита В и исследования донорской крови и препаратов,получаемых из нее.

Провести сравнительное изучение вариантов МАВР и И1А по эффективности определения НВеДв , бруцеллезных антигенов и антител к ним в сыворотке крови лодей.

Научная новизна исследования. Впервые разработана тест-система диссоционно-усиленного ланталидного флуоресцентного иммуноанализа для определения бруцеллезного антигена.

Для синтеза коньвгатов антител с Ей предложено использовать диангидрид диэтилентриамин- Н,Н»,Н',И"1,К*1 - пентаук-сусной кислоты. Определены условия получения коньюгатов с высокий удельным содержанием метки. Теоретически и экспериментально обоснованы общие принципы оптимизации ФИАВР при использовании меченных лантанидаыи реагентов. С целью повышения чувствительности разработаны новые способы проведения ФИАВР. . (авторские свидетельства №№ 1617381, 1642400).

Показано, что &1АВР при определении НВвАе , бруцеллезных антигенов и антител к ним имеет высокую чувствительность, специфичность, точность и воспроизводимость результатов, широкий линейный рабочий диапазон. Установлено,что 'МАВР значительно превосходит ИФА по чувствительности ( в 5-10 раз ) и ширине рабочего диапазона ( на I - 2 порядка ),

[¡оказана высокая эффективность использования в ФИАВР меченного 2ц стрептавидина в качестве универсального индикаторного реагента.

Практическая значимость работы. С использованием отечественных реагентов разработаны варианты ФИАВР для диагностики бруцеллеза и гепатита В. Разработанные методы получения коньюгатов с Ей и общие принципы проведения анализа могут применяться при создании различных диагностических тест-систем ФИАВР.

На модели бруцеллеза показана принципиальная возможность использования ФИАВР для диагностики бактериальных инфекций.

Установлено, что при определении бактериальных и вирусных антигенов, а также специфических антител ФИАВР по эффективности значительно превосходит распространенный в клинической практике ИФА. ФИАВР пригоден для определения как растворимых, так и корпускулярных бактериальных антигенов. С помощью ФИАВР бактериальные антигены могут быть обнаружены в клиническом материале, а также в пробах, содержащих гетерологичные микроорганизмы.

I¡on;.3s,!íü иг-шпиктнсность ncfißBbSoiüHHn ФЯАЬР, ocooeim. о.;,;: о сущ; икнсг о экспрссс-снглио«, дяя обнаружен:« 12-0% nr¡ скрянннгс донорской крови и крепгратоБ, получат« ио на,-

Сл^оуцлена нормйтивио-технологкческап документации ь -зхст-систску диссоционно-ускленного лонтьнадного фяуорсст-^" ного кдоукоанализд для опргделеикя бруцеллезного антиген.'.. которая утсорждена Ученым Советом ШШ им. Ц.Ф.Гсмалеи ASH СССР (протокол к' 3 от 14 декабря 1990 годе),.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы ли доложены на расширенной научноII конференции отдела бактериальных инфекций ¡йЫЭМ им.Н.¿.Романеи АНН СССР 13 июля 1989 г„

Материалы диссертации обсуждались на:

I. Всесоюзном симпозиуме "Вакцины, диагностические средства и новая биотехнология", г.Пущкно, 1988 г.

. 2. Всесоюзном семинаре "Икмунофлуоресцентный микроанализ для медицины", г.Минск, IS33 г.

3. Всесоюзной конференций "Современные направления создания медицинских дкагностикумсв", г.Моск»&, 1988 г.

4. Конкурсе молодых ученых НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи АМН СССР, 1989 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Структура к объем диссертации. Диссертация изложена на 152 страницах машнописи и состоит из введения, обзора литературы, • 5 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Материалы иллюстрироваиы 9 таблицами, 22 рисунками. Библиографический указатель диссертации содержит 207 источников литературы (70 отечественных и 137 иностранных).

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Материалы и методы исследования. Антигены, В исследовании использовало 9 штаммов бруцелл 3 видов ( Вг. abortus, Вт. melitensis, Br. suis) , 12 штаммов гетерологичных грамотри-цательных микроорганизмов 6 родов и полученные из них препараты растворимых антигенов: антигенов Буавена и липополисаха-рмдных антигенов. Использовали также препарат очищенного ШаЛ& полученный из плазмы крови доноров-носителей по модифициро-

ванной методике В.П.Карелина и соавт. (1573), коммерческий препарат очищенного НВа Ag ( Atibot , США) и препарат инсулина свиньи, полученный в институте гормональных препаратов и кровезаменителей МЗ СССР (Москва).

Антитела. В исследовании были использованы коммерческие иммунные сыворотки Предприятия ШИЭИ им.Н.Ф.Гамалеи АМН СССР ц мышиные моноклональные антитела (МКАТ): козья сыворотка против возбудителя бруцеллеза, кроличьи сывороаки против НВа Ag , Ig G человека и ig G мыши; ЫКАТ ЖАК 22 против общей а -детерминанты НВа Ag , полученные в Институте вирусологии им. Д.И.Ивановского АМН СССР (Москва) и МКАТ 10 Е.2А, против инсулина свиньи, полученные п Институте биохимии им.А.Н.Баха АН СССР (Москва).

Иммуноглобулнновув фракции из иммунных сывороток выделяли сульфаТно-риваноловьгм методом, ig g фракция из кроличьих сывороток получати по методу ионообменной хроматографии на колонке с ДЭАЭ -целлюлозой в 0,0175 M фосфатном буфере, рН 6,3,

Чистые антитела против hBs ^получали методом аффинной хроматографии по модифицированной методике С.В.Зубова (1986).

МКАТ ЖАК 22 были выделены из асцитной нидкости трехкратным высаливанием сернокислым аммонием при 33 % насыщении.

МКАТ 10 Е.2А. после высаливания были очищены по методу ионообменной хроматографии на жидкостном хроматографе высокого давления " datera " (США) на колонке ЕВ 5 КЗ .

Чистоту выделенных фракций иммуноглобулинов определяли методом иммуноэлектрофореза в геле.

Активность и специфичность антибактериальных сывороток, а также выделенных из них фракций иммуноглобулинов оценивали в непрямой реакции иммунофлуоресценции ( нРМФ) и в неконкурентном ИМ антител с мечеными антивицовыми антителами.

Активность чистых антител против НВа Ag определяли в реакции двойной иммунодиффузии в геле по Оухтерлони.

Синтез конъюгатов для ФИАВР. Для синтеза коньюгатов специфических антител с Eu использовали коммерческий препарат Eu * -и* - ( л -изогноцианатофенил) - диэаплентриамин - i/, В2,N3, И 3 - тетраацетат (ИЩ - ДТТА-Eu ) ( ЬКВ - Callao ) и диангидрид диэтилентриаминпентауксусной кислоты (ДА ДИ1А),

синтезированный по методу Я.с.ЕсЬоЗлап et al. (1975) в МГУ.

Конъкгаг антител с хелйтои ИТЦ-ДТТА-eu синтезировали по методу I. Нсша11а ot al. (1984).

Синтез конъягатов антител с Eu на основа ДА. ДТПА проводили по модификации кет ода O.S. Fallí efe al. (1983) с использованием хлорида Eu „ Eu ci3 х CHgO (Eluia ), или оксида Eu , Eu 203 ( slfpi.a )f Стспе„ь вдетоты более 99,9 %. Oï избытка метки нонъюгаты очицали на колонке с сефадексом a -БО (aediua ) (1ЪАХклс1а ).

Дг.п биотинклирования чистых антител против HBaAg использовали " Eaaofria" - реагент ( Eneo Eloohoa , США). Ьйоти-гшировмнг выполняли согласно метоцичсскш рекомендациям фирш.

Печенный Bu стрептавидин был приготовлен в Института биохимии км.А.Н.Ьаха Ali СССР по модификации методе R.&ador et el. (1967) с использованием ДА £TiiA в 100-кратноц молярной избытке. Удельное содержание Eu в хонъпгатс составляло 12 ионов на молекулу стрептовидина.

Методики проведения &1АВР. Использовали разборные по-листиролъные микроплаяиеты ( Eflab Оу , Финляндия). При определении бруцеллезных антигенсб и НВа Ag ФИАВР выполняли по методу двухстадийного езндвич-иммуноаналиэа. Реакцию осуществляли в объеме 0,1 мл. При определении HBság также использовали методы одностадийного езндвич-аналиэа и сэндвич-анализа с системой биотин-стрептавидин. Для определения специфических антител к бруцеллезному антигену применил» метод неконкурентного твердофазного ишуноенализа с мечеными енгй-ви.довыми антителами. Оптимальные условия проведения калдого варианта ФИАВР огределяли в предварительных модельных экспериментах. Флуоресценция Eu измеряли в усиливающем растворе ( ъКВ- tJallao ) на флуорокетре с временным разрешением" iroua 1230".

Исследуемый клинический материал. Разработанные варианты ФИАВР для определения бруцеллезных антигенов и антител к ним апробировали на клиническом материале, который включал: ейворотки крови от больных с клиническим диагнозом острого или хронического бруцеллеза, от здоровых доноров, от больных острыми респираторными вирусными инфекциями (ОРВИ) н килечными инфекциями (еяльмонеллезом, дизентерией), от доноров,

вакцинированных живой тулярешШной вакциной ( титр в ИХА-I : 25600 ).

Для апробации и изучения специфичности 511АВР п.л определении ИВв Ав использовали сыворотки крови: от больных вирусным гепатитом В, положительные на НВо Аб по данном реакции преципитации в геле; от здоровых доноров, отрицательные на НВвАе в РПГА; от больных гепатитом А, ОРВИ.

Контрольные методы. Результаты, полученные при апробации разработанных вариантов «И1АВР в экспериментальных условиях и на клиническом материале, сравнивали с. результатами аналогичных вариантов Н4А. В Ф11АБР и ИЛ использовали идентичные т-мунореагенты. ИФА выполняли по общепринятым методикам с ис-пс.1Ьзование|д конъюгатов специфических антител с пероксидазоИ хрона Предприятия Ш-ИЭМ им. Н.З.Гамалеи. В качестве субстратов применяли Н202 и о-фенилендиамин или Н^О^ и 2,2-азино--да-1,3-этилбензилтиазолинсульфонат( АБТС)(ВоеЬг1пгег , >2РГ). Результаты 1Ш. учитывали на вертикальном фотометре ^чíult;iБ}mnи, ( По» ЬаЪога^^ев, Великобритания) или фотометре фирмы ВупаЬеск (США) . В И*А с системой Оиотин-стрелтавидин для определения 1Шз Ай использовали меченный пероксидазой хрена стрептавидин, получении*! в Института биоорганической химии АН СССР (Москва).

Статистическая обработка результатов исследований проводилась по И.А.Ашмарину, А'.А.Воробьеву (1962) и П.Ф.Рокицкому (1967).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

При разработке ишуноанализов с использованием ланта-нидной метки необходимо обеспечить: во-первых, прочное связывание ионов лантанида с антителом или антйгеном; во-вторых, сенсибилизацию флуоресценции ионов лантанида.

Обычно присоединение лантанидов к белку осуществляется за счет образования комплексов с бифункциональными хзлатиру-вдими соединения!.«!, коваленгно связанными 0 ним. В методе беычл для синтеза конъюгатов широко применяются производные полиамшояоликарбоновыл кислот (ПАПК) , этилевдиаминтетра-уксусной (ЭДТА) и диэтилентриаминпонтауксусной СДТПА) , содержащие подходящую функциональную группу для ковалеитного связывания с белком. ПАШ' образуют с ионами лантанидов хорошо

раотвордаше п стабильные комплексы.

Однако ггрямо-з количественное определение специфически евязашшх меченых реагентов иа твердой фазе невозможно, так как дзктанвды в комплексах с ПАПК имеют очень низкй квак-товиа выход флуоресцощта. Измерение коллчества мзгки проводится в уеиляваваз« растворе после диссоциации иоков лан-танида мз конъпгата в обмэм при низком значении рН раствора Е образования нового кокиекса с сенсибх-шззтором фдуорзс-докцил р-дккегоком. В усиливающего раствора ( ысв-ИаИао) в качестве сенсибилизатора ^орэсцэщаи используется р- нафтоилтрЕфторацото.ч, который образует о ионами Ей вксокс-. эффективные флуоресцентные кошиюхси.

Подучоттэ кояьстагов анг.гтал с Ей с использованием [гроизвощна ДАЦК, Для оантоза конызгагов ашятзл с Ей использовали прсззЕОДШо ДТПД: хала т ЙТЦ-ДГТА-Еи я ДА ДТГГА.

Таблица.

Условия синтеза кокгюгатоз кроллчьвх антител против НВо Ае, мыки и зцо человека с хелатом ИТЦ--ДТТА-ЗЗи Я .ВЫХОД К01ШЗГ8Щ1И.

Антитела

Буферный раствор

1^6 кролика

против НВаАь" р(! в, о

0,Ш ЕЕР, рй 8,3

Хео кролика ПрОТИВ 1ез ШЛИ

1еа кролика 0,1М КЕБ?, Етютив 1еО рН 3,3 человека

Кончат- Молярное рацпя саотцо-раствор шекво антител балок/ по йапх^з катка

О,Ж КББР,

л 0 ..

I.3

•5

II,5

1:200 1:30

1:50

Тошора- Удель-турно- поз зт>еьган- содоргл-

Н9Й рэ- Ей

кгл конь- в коггь-

гаг-сшл

16-18 ч.

с

16-18 ч. 3

6,9

4°С

16-18 ч. 10,7

ПрямечайЕв: КЕЕР- карбонатко-бикарбокатны! буферный раствор,

ББР- бшсарбонатгнй буферный рас-хвор.

Выход конъюгации зависит от молярного соотношения белок/метка, концентрации белка в растворе антител, рН буфера,

тешературно-вршенного рожиш конъюгации. Спгишлыше условия для синтеза конъюгатов создастся при концентрации белка 5-10 иг/ил и рН буферного раствора вше 9,0. Для д( <:т1шзтщ высокого удельного содержания Ей в кон'ьюгате при использовании раствора антител с концентрацией белка около I «г/мл з буфере с рН ниже 9,0 требуется бол-эа высовдй расход котки.

Хотя данниН маркер обладает высокой. эффективностью, он является дорогим и малодоступным реагентом Его синтез представляет собой сложную многостадийную процедуру, в которой , предусматривается использование токсичного тиофосгона ( В'шйЪвгз et а1., 1977).

Изучали эффективность использование для синтеза конъю-гатов антител о Ей ДА ДТПА, которий является более дошовым и доступным реагентом но сравнения с халатом ЛТЦ-ДТТА-Е,а и легко синтезируется.

С использованием ДА ДТПА а 500-;,-ратном молярном избытка в ЕБР снитезировали 2 вида ковъютатов кроличьих антител против

шпш (КАЧ): конызгаг антитело-хзлагзруодий агент, на содержащий Еи(1Ш,1-ДША) и конъстат антител о Ви <КА!.1-ДТПА-Еи). Удельное содержание Ей на молекулу да в коггазгате составило 3.

Конъюгат козьих бруцеллззных антител синтезировали при молярном соотношении белок/ДА ДТПА 1:1200. Коиъагат содержал около 20 ионов Ей на молекулу да. По дакни,! неконкурентного Шк антител с аиишздовыа конъкгатом специфическая активность антител после конъюгации практически но изменилась.

Таким'образом, при использовании ДА Д1ПА могут бить получены конъюгатн антител с высоким удельинм содержанием Ей без значительного снижения их шя.1унолсг:гческой активности.

Ощщбзонпо. специфических для ля;ггапялвой мотки условий проведения яюягаоаиалпза. Известно, что методика ш?2А чувствительна к загрязнению снотеш лзнгашшаыи изхшо. В процесса гшеубацин свободные кону лантаиидоа из раствора конхюгзта, ес-следуешх образцов ит загрязненных буферов штут несаоцыфн-чески сорбироваться на твердой фазе или захватываться Са-свя-зываицимп центрами та&обилизованных белков. Зто приводит к повышении уровня фона, уменьшению соотношения сигнал/фон и снижению чувствительности определения.

Возможность повышения чувствительности анализа за счет предупреждения носпоцлфичоской сорбции ионов лантанидов изучали на иодельиоЯ с г,стека неконкурентного ФИЛЕР для определена антител (!.КАТ 102.2А.) к инсулину свиньи с использованием конъюгагов Ш-ДШ-Eu и Ш-ЬТЦ-ДГТА-Еи .

Известно, что для связывания свободных ионов ланганида в буфер для разведения коныогатов добавляют ПЛПК, ЭДТА или ДТПА. Экспериментально устаношюно, что для оЗоих конъагатов оптимальная концентрация ILUIK составила КГ4!,!. При использования ПАДК в этой концентрации соотношение сигнал/фон улучшалось в 2 раза.

Для наенщошш Са-связ1шавцих центров белков в буфер для разведения конъагатов добавляли хлорид Са, СаС12> в экспериментально подобранно,! оппг-дльной концентрации Ю-3:.!. При этом соотношение сигнал/фон улучшалось до сравнению с результатами контрольных опытов в 1,5 раза.

С целью повышения чувствительности анализа парад нанесенном специфического коньигата проводили предварительную обра-ботху твердой фазы бу^ернпы растваро!,;, содержащим ГШК и пони в концентрациях соответственно 5Х1СГ3- и бхЮ-3-

- Ю-4!.!, при 20°С в течение 20-40 икнут. При проведении предварительной обработки соотношение сигнал/фон улучшалось в 1,5 раза но сравнении с результатами контрольных опытов, выполненных в аналогичных условиях, но баз ноэ. ^

Для достижения более высокой ■чувствительности в методику QME? при определении IBsAg, бруцеллезных антигенов к антител it ни>,î был включен этап предварительной обработки твердой фази.

Разработка..юдл^икд.щц?. СПАВ?, с Еведедясм^.д уокъягет в ходе анализа'. Ка удельное содержание Еа в конгкгате влеяюг условия хранения коныогата и условия проведения анализа <р!1 буфера, присутствие в нем иеионннх Детергентов, свободных хе-латируюцих агентов и ионов тягелнх металлов, и др.)«

С целью повышения чувствительности определений за счет достижения максимально возможного удельного содержания ланта-нида в конъшгате предложен способ проведения анализа, предусматривающий выполнение иммунологической реакции с хокъкгатом ан-тнтело-хелатирующий агент, не содержащим Ей,- и введение ионов б конъюгат на дополнительной стадии анализа перед пеполь-

зованием усиливающего раствора.

Для введения ионов Ей в коньюгаг в лунки добавляли 75-.100 i.U ацетатный буфер, рН 4,5-5,25 , содержа ций КиС1, в концентрации 2,2x10 - 6,6хЮ~7М, и инкубировали при 20°С в течение 30 минут. Затем лунки обрабатывали буферным раствором, содержащим 10~5Ы ДТПА и СаС12 в течение 5 минут. 11а заключительном этапа анализа в души; вносили усиливающий раствор для измерения флуоресцешцш Ей .

Сравнительное изучение разработанных вариантов ФНАВР п 1ЙА по эффективности при определен;.;! антител к инсулину свиньи (см. рис. I) показало, что по чувствительности ФИАВР превосходил ЙФЛ в 11,5 , 7,4 и 4,4 раза в зависимости от использованного конхюгата. Наиболее чувствительным был вариант'Ф11ЛВР о введением Ей в.конхкгат в ходе анализа. При использовании конъюгата с Ей, синтезированного на основе ДА ДТПЛ, была получена более высокая чувствительность, чем при использовании конъпгата с хечпатом ИТЦ-ДТТЛ-Еи . По сравнения о ИМ ФИАБР имел более широкий динамический диапазон, более высокие соотношения сигнал/фон, а, следовательно, и более высокую достоверность определения.

1

13(3/П) ; 2,5. 2,0. 1,5 Г,О 0,5

О

-0,5 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 XgO (М)

х-Ю

Рис. I. Чувствительность определения МКАТ I0E.2A. к инсулину свиньи з ФИАНР и ИФА: I- Ш-ДТПА+EuOl, (б,6хГ0~7Ы) в 75 Ш ацетатном буфере, рН 5; 2- КАМ-ДТПА-Ей;''3- Ш-ИТЦ-ДТТА-Bttj 4- КАМ- пероксидаза хрена + АБТС.

ПРИМЕЧАНИЕ: S/У - соотношение сигнал/фон •

- 14 - .....

/

разработка ФИАНР для определения бруцеллеза актугенов. . Основную роль в заражения лвдой бруцеллезом играют Br. abortus 8 Ee.Eeliieasia, Br.suis. В антигенном составе бруцелл различают как специфические, так к деспацифичвскЕе общие антигены, наличием последках обусловлены перекрестные серологические_ реакции мзвду бруцольаыи разных видов. Б вирулентной s-форме бруцеллы содераат в клеточной стенке липополасахарада (ЛПС) , которые имеют высокую биологическую активность и выраженные антигенша свойства (П.Л. Варшплова, 1972; Е.С. Болозеров, 1985) .

При определении бруцеллезных антигенов ФИЛЕР выполняли по методу двухстадийкого еэндаич-ишуноакдлкза. Оптимальные концентрата' антител дуй адоорбции на полистирол и конгпгата составляли соответственно 5 шг/ьш и 4 ыкг/мл. Эффективность анализа оценивали по чувствительности и специфичности, ширине линейном динамического диапазона, степени корреляции результатов ФИЛЕР и ИФА при исследовании клинического материала.

Чувствительность определения растворимого лилополисаха-рядкого антигена Зг. aborsus99 в нормальной сыворотке кровк человека соответствовала 0,1 кг/мд. Б пределах диапазона концентраций от 0,6 нг/ьи до 250 нг/мл была установлена линейная зависимость ф^оресцонткого сигнала от концентрации антигена в пробе- (см. рдс. 2 ). Анализ имел хорокув точность и воспроизводимость результатов. Коэффициенты вариации црл повторных определениях б еналязе кслобалиеь от 2,2* до 5,9д , а мезду анализами- от 2,о% до 7,6$,

1кЗ ■ (НМЛ. )

5 .

4 f

I

f

о

I

3 1бО(нг/мл )

Рис. 2. ¡калибровочная кривая для определения ЛПС

Вг, аЬог1л1а99 в сыворотке крови человека методом ФИАЕР.

Чувствительность tfliABP при определении корпускулярного антигена Br. abortus 99 составляла 7,5xI0,:i вдкробчня клеток в I т буфер. Линейная зависимость флуоресцентного сигнала от содержания микробных клеток в пробе наблвдзлась при концентрациях антигена от ЗхЮ^м.кл./мл до 5х106м.кл./мл (см. ряс. 3 ).

S2I5AI3P апробировали на 9 ыташах Br. abortus, Br. meliten-eia.Br.auie. Клетки микроорганизмов внлвлялгсь в концентрациях 7,5х1о\.кл./пл или 1,5x10 м.кл./мл. Использование калибровочной кривой, построенной для Вг.аЪог'us 99, позволяло определять клотап других штаммов с ошибкой не более 251.

lG3f / (нмл.) '

5 '

4

7 IgO (м.кл./ыл )

Piro. 0. Калибровочная ?српвая для опродолеихт ?пнгрэ-

органпзкоз шгаша Br.abortus 99 кетодом 0ИАЕ?.

Пря определении рзетворккыз: и корпускуллрьюс бруцеллезных ашагаюв ФШШ? превосходил USA по чувствительности соответственно в 10 раз я 5,7 раза, а по ширине линейного диьамичаского диапазона ез 1-2 порядка.

Специфичное гь ФИАМ- подтверждали риаишей торможения избытком спзцЕф-лчэсклх антител.

Известно о оутчествовагаи перекрестных оорологичеоких реакций меяду (Зручеллами в яругзгт граыотртзцатольными микроорганизмами, среда которых Jr.tularer.aie, choleras, E.coli, отдельные представители рода Salnonolla . раиболээ выраженные перекрестные реакции наблюдаютзя между бруцеллами и x.entero-colitica 09- Они обусловлены общими антигенными детерминантами ЛПС бруцелл л кврсиний.

Для изучения специфичности ФИАВР использовали раствори-

■4,5 5

мыв и корпускулярные антигены 12 штаммов гетерологичных микроорганизмов S родов. Растворимые антигены гетерологичных микроорганизмов, в том числе обладающий иммунологическим сходством с антигеном бруцелл тулярэмийный антиген, не выявлялись даке в концентрации 1000 нг/мл. ЛПС ï. enterocolitica 09 определялся в концентрациях, превышаодх чувствительность гомологичной системы более, чем в 50 раз. При исследовании проб, содержащих гетерологичные микроорганизмы в концентрациях от 10^ м.кл./мл до М^м.кл./мл, были получены отрицательные результаты. Исключение составили клетки Y. enterocolitica os, которые определялись в концентрациях свыше 5х10®м.кл./вд. По мнению ряда авторов, использование з иммуноанализе МКАТ, направленных к определенным эпитопам ЛПС бруцелл, позволит решить проблему дифференциальной диагностики бруцеллеза и иерсиниоза без ее усложнения.

Установлено, что с помощью ФИАВР возбудители бруцеллеза могут бить обнаружены в смеси с гетерологичными микроорганизмами (10'м.кл./мл E.coli OUI) практически без снижения чувствительности определения.

Особый интерес представляло изучение пригодности ФИАВР для выявления бруцеллезных.антигенов в клиническом материале. Всего было исследовано 160 сывороток крови от больных острым ■ и хроническим бруцеллезом. Исследование проводили методаш ФИАВР и ИФА одновременно, чтобы избежать расхождения результатов, обусловленного деградацией ЖЮ в присутствии специфических антител с течением времени (J.H.Limet, 1987 ). Широкий динамический диапазон ФИАВР позволял исследовать образцы без дополнительного разведения.

Число положительных образцов составило по данным ФИАВР 34 (21%), по данным ИМ- 31 (19,45? ). Совпадение пололштель-ных результатов ФИАВР и ИФА било установлено в 91,2$. Более высокий процент выявления бруцеллезного антигена методом ФИАВР ' объясняется тем,что ФИАВР по чувствительности значительно превосходит ИФА.-Между результатами ФИАВР и ИФА была установлена хорошая корреляция (г= 0,94 , р<0,01 ). При исследовании 140. сывороток крови контрольной группы во всех случаях результаты ФИАВР и ИФА били отрицательными.

Разработка ФИАВР для определения антител к бруцеллезным антигенам в сыворотке кропи человека,. Для определения бруцеллезных антител разрабатывали неконкурентный твордофаз-

ны2 вариант 4ИАВР с использованием конъюгата анпшидовнх ?нтлтел.

Известно, что бактериальный аитпгон, который используется для сенсибилизации полистирола, определяет чувствительность л специфичность анализа. Для проведения ОИАВР на поверхность лунок мпкропланшвтов мы адсорбировали ЛЛО Вг. аЪогиш 99»

Для уменьшения неспецифической сорбции компонентов пробу после иммобилизации антигэна твердую фазу обрабатывали бычьим сывороточным альбумином ( БСА ), который добавляли такне в буфер для разведения образцов. Анализ проводили в кинетическом ратама с сокращением времени инкубации до I часа.

Оптимальные концентрации антигена для иммобилизации на полистирол и кокъэгэта составляли соответственно 10 и 1,2'5 мкг/ыл.

Исследовали 90 сывороток крови большие острым и хроническим бруцеллезом и 50 сывороток доноров. Из-за отсутствия стандарта для проведения количественного определения бруцеллезных антител их содержание выражали посредством титров сыво-, роток. При последовательном разведении сывороток крови выявили линейный характер зависимости (флуоресцентного снгнала от содер-лакия бруцеллезных антител в пробе.-Донорские сыворотки не давали положительных результатов в развэденш 1:6400. Положительные реакции в меньших разведениях носили несйецифический характер, при этом эффект торможения реакции избытком бруцеллезного антигена (2 мкг/гля) на был выражен. Анализ икел хорошую воспроизводимость и точность определения. Коэффициенты • вариации в анализе находились в пределах от 2,9$ до 5,8%.

Результаты ФИАЗР сравнили с результатами ИФА. Средняя геометрическая титров положительных сывороток в ФИАВР(1:51200) была в 64 раза выше, чем в ИФА (1:800) . Специфические антитела были выявлены методом ФИАВР в 88 (97,8,3) сыворотках больных, а методом ИМ- в 84 (93,3£ ). Совпадение поло.чштельных результатов анализов отмечалось 95,5$. Результаты ФИАВР и ИФА хорошо коррелировали (г= 0,90 , р< 0,01) . Специфичность ФИАВР была подтверждена реакцией торможения гомологичным антигеном.

При исследовании 110 сывороток контрольной группы большинство из них в разведении 1:6400 были отрицательными. Только сыворотки доноров, вакцинированных живой туляремий:1ой вакциной ( титр в И-М I: 25600 ) , били слабо положительными

в ФИАВР (титр 1:6400- 1:12800), что, ло-видшпф, обусловлено иммунологическим сходством возбудителей бруцеллеза и туляремии и высокой чувствительностью ФИАВР.

Результаты исследования 200 сывороток крови позволили считать титр 1:6400 диагностическим, lia модели бруцеллеза была показана перспективность использования ФИАВР в серологической диагностике инфекционных заболеваний, для которых характерно низкое содержание защитных антител в сыворотке крови болышх.

разработка вариантов ФИАВР для определения HBsAr . Тесты на HBeAg занимают центральное место в диагностике гепатита В. Методы выявления HBsAg широко используются ддя тестирования донорской крови с целью профилактики постгрансфузаонного гепатита В, в связи с этим высокие требования предъявляются к чувствительности и специфичности данных методов.

НВаАв представляет собой высокомолекулярный липопротеид. Ои входит в состав интактного вириона, а также вирусных частиц размером 22 нм, циркулирующих в крови больных и вирусоносителей.

При разработке ФИАВР использовали МКАТ ЖАК 22 к груиио-специфичеокой а-детерминанте HBeAg и конъюгаты аффинных кроличьих антител против HBsAg о хелатом ИТЦ-ДТТА-Еи или биотипом.

Оптимальные концентрации МКАТ ЖАК 22 и конъюгата в двух-стадййном варианте ФИАВР составили соответственно 10 и 2,5 мкг/мл. На проведение анализа при использовании заранее сенсибилизированных микроплашштов требовалось 3-4 часа. В двух-стадийном ФИАВР была получена высокая чувствительность при определении очищенного HBaAg (Attot ) в нормальной сыворотке крови человека > (0,12 нг/мл) . Анализ имел широкий линейный динамический диапазон (от 4 нг/мл до 1000 нг/мл) (см. рис. 4).

В одностадийном анализе исследуемый образец и специфический конъюгат вносили в лунку одновременно. Бремя анализа 'составляло 2-2,5 часа. Чувствительность определения достигала 0,25 нг/мл. Одностадийный ФИАВР характеризовался экспрессность» и высокой чувствительностью.

■i IС '"т r

3-1 T i 2~ " 5 tigC (»г/мл>

Рис. 4. Калибровочная кривая для определения НВв Ag в сыворотке крови человека методом ФИАВР.

Следующий этап работы состоял в разработке ФИАВР с системой биотин-стрептавидин. В анализе были получены характеристики, подобные приведенным выше для других вариантовЛувствительность анализа составила 0,25 нг/мл, а линейный динамический диапазон- от 4 до 1000 нг/мл. ФИАВР превзошел аналогичный вариант ИФА, по чувствительности в 8 раз, а по ширине динамического диапазона на 1-2 порлдпа. Таким образом, установлена высокая эффективность использования меченного Ей сгрептавидина в ФИАВР в качестве универсального индикаторного реагента.

С помощью ФИАВР на НВв Ag исследовали 150 сывороток крови больных и доноров. Во всех положительных по результатам предварительных исследований образцах, методами ФИАВР и ИФА был обнаружен НВз Ад . В 2 образцах донорской сывдроткн, отрицательных в РИГА и ИМ, только с помощью ФИАБР был выявлен HBs Ag . Специфический характер взаимодействия был подтвержден реакцией нейтрализации антигена избытком специфических антител. В ФИАВР не было получено ложноположительных результатов. Совпадение положительных результатов ФИАВР и ИФА наблюдалось в 96,2$. Результаты ФИАВР и ИФА хорошо коррелировали ( г= 0,91 , р< 0,01).

При исследовании 40 препаратов коревого гаммаглобулина в 5 из них методами ФИАВР'и ИФА был обнаружен НВв Ag .

В результате экспериментальных исследований показано, что ФИАВР являе(тся более эффективным методом, чем ИФА, для

скрининга донорской крови и препаратов, получаемых из нее.

ЩВОДЦ,

I. Установлена высокая эффективность использования ДА ДТПА для синтеза конъюгатов антител с Ей . С помощью ДА ДТПА получены конъюгаты антител с высоким удельным содержанием метки при сохранении их ж.плунологической активности.

- 2. Показано, что обработка твердой фазы буфером, содержащим полиаминополикарбоновую кислоту и ионы Са , и их использование при разведении конъюгатов повышают чувствительность ФИАВР в 1,5-2 раза. Авторское свидетельство й 1642400.

3. Впервые разработана модификация ФИАВР с введением Ей в коншгат антител с ДА ДТПА в ходе анализа. Изучена зависимость чувствительности от концентрации Ей в растворе, рН и молярности буфера. Показано, что данный вариант анализа по чувствительности превосходит ИФА в 11,5 раза, а традиционный вариант ФИАВР-в 2 раза. Авторское свидетельство Л 1617381.

4. Впервые с использованием отечественных реагентов разработан вариант ФИАВР для определения бруцеллезных антигенов. Установлено, что ФИАВР имеет высокую специфичность и чувствительность при определении как растворимых, так л корпускулярных бруцеллезных антигенов (0,1 нг/мл и 7,5х10^м.кл./ш) и превосходит по чувствительности ИФА соответственно в 10 и

6,7 раза. ШАЕР характеризуется широким динамическим'диапазоном (1:104). Показана пригодность ФИАЛР для обнаружения бруцеллезных антигенов в пробах, содержащих гетерологичные микроорганизмы, и в клиническом материале.

5. Разработан вариант ФИАВР для определения бруцеллезных антител в сыворотке крови человека. При исследовании сывороток крови больных бруцеллезом установлено, что анализ имеет высокую чувствитёльность и специфичность, широкий динамический диапазон. Средняя геометрическая титров положительных сывороток в ФИАВР в 64 раза выше, чем в ИФА.

6. Разработано несколько вариантов ФИАВР для определения НВаАе : двух- и -одно- стадийные сэндвич-анализы, сэндвич-анализ с системой биотин-стрептавидин. Показана их высокая чувствительность (0,12-0,25 нг/мл, что в 8-16 раз выше чувствительности 1ОД), специфичность, широкий динамический диапазон. Установлена высокая эффективность использования в ФИАВР мечен-

ного Eu стредтавидина в качество универсального индикаторного реагента. Продемонстрирована перспективность применения ФЯАВР, особенно одностадийного экспресс-анализа, для скрининга донорской крови и препаратов, получаемых нз ша.

Список работ. опубликованных по томе диссертации.

1. Пономарева И.З., Савицкий А.П., Шаханина К.Л. Потение кокъюгатов антител с производными поликарбоновых кислот и ионами еврокля для флуоресцентного ищуноанализа с временным разрешением,// Тез. докл. Всосоюз. кенф. "Современные направ-' лекия создания медицинских диагностику!,юв".- Ы., 1988. - С. 60.

2. Флюоресцентный Емыуноакализ с временным разреиениом. Использование различных производных шшшарбоновнх та слот для получения г.онъпгатсв антител, с европием/ И.В. Пономарева, А.П. Савицкий, К.Л. Шаханина, A.A. Ееголев // Ищунология. -1989. - й 4. - С. 73-78.

3. Пойодярзва И.В., Шахашта К.Д., Келудков М.М. Использование лантанидаого флуоресцентного вммуноаналиэа для выявления специфических актягел пря бруцеллезе у людей // Тез. докл. Всесовз. конф. "Актуальные вопросы .профилактики бруцеллеза и организации медицинской помощи больным." - iL, 1989. - С. III- 112.

4. Шаханина К.Л., Савицкий А.П., Пономарева PI.В. Использование флюоресцентного шмуноаналкза с временны;.', разрешением в медицине// Иммунология. - 1990. - й I. - С. 4-9.

5. Пономарева И.В., Шахакнна К.К., Желудков М.М. Использование флюоресцентного иммуноаналпза с временным разрешением для диагностики бактериальных и вирусных инфекций // Тез. докл. Республиканской конференции "Новые метода диагностики СВДД, других вирусных и бактериальных инфекций в практике инфекционной и противоэпидемической службы", Алушта, 1990. -

С. 98-99.

6. Способ проведения иммунсанализа /А.П. Савицкий, И.З. Пономарева, К.Л. Шаханина, A.A. Щеголев //Авторское свидетельство № I6I738I. - 1990.

7. Способ проведения иммуноакализа / А.П. Савицкий, И.В. Пономарева, К.Л. Шаханина, В.А. Архипова // Авторское свидетельство № 1642400. - 199I.