Автореферат и диссертация по медицине (14.04.01) на тему:Биотехнологические аспекты вирусной безопасности препаратов иммуноглобулинов: методология, производство, стандартизация.

На правах рукописи

ЗУБКОВА НАТАЛИЯ ВАСИЛЬЕВНА

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ВИРУСНОЙ БЕЗОПАСНОСТИ ПРЕПАРАТОВ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ: МЕТОДОЛОГИЯ, ПРОИЗВОДСТВО, СТАНДАРТИЗАЦИЯ

14.04.01- технология получения лекарств

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук

2 О ДЕК 2012

005047534

Пермь - 2012

005047534

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации и в филиале Федерального государственного унитарного предприятия «НПО «Микроген» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации в городе Нижний Новгород «Нижегородское предприятие по производству бактерийных препаратов «ИмБио»

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Казьянин Александр Викторович

Официальные оппоненты:

Сульдин Александр Владимирович, доктор фармацевтических наук, профессор, ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздравсоцразвития России

Быстрицкий Леонид Дмитриевич, доктор фармацевтических наук, ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России

Устинова Ольга Юрьевна, доктор медицинских наук, ФБУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения», г. Пермь

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Минздравсоцразвития России

Защита диссертации состоится «25» декабря 2012 г. в 13.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.068.01 при ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздравсоцразвития России по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Полевая, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке при ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздравсоцразвития России по адресу: 614070, г. Пермь, ул. Крупской, 46.

Дата размещения объявления о защите диссертации на сайте Министерства образования и науки Российской Федерации www.mon.gov.ru «24»сентября 2012 г., на сайте ПГФА www.pfa.ru «24 » сентября 2012 г.

Автореферат разослан « /У » 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат фармацевтических наук, доцент ■ .у",' / И.А.Липатникова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Плазма крови человека является источником более 100 различных белков и биологически активных соединений, часть которых получают промышленным способом и используют в качестве лечебных препаратов для профилактики и лечения широкого спектра заболеваний [WHO Recommendation for the production, control and regulation of human plasma for fractionation / Fifty-sixth Report, 2007]. Глобальный рыпок лекарственных препаратов из плазмы крови доноров за период с 2000 года увеличился в 2 раза и имеет постоянную тенденцию к росту. При этом производство препаратов иммуноглобулинов обеспечивает более 50% данного сегмента рынка и является движущей силой фракционирования плазмы крови в целом [Pharmexpert. Market Research Center / http://marketpublishers.com/report/ /medicine j>harmaceuticals_biotechnology].

Потребность в препаратах иммуноглобулинов, особенно для внутривенного введения, постоянно растет. В России она удовлетворена только па 5—15%, а обеспеченность страны препаратами из плазмы крови доноров обычно рассматривается с позиций экономического развития и мобилизационной готовности страны [Селиванов Е.А.,2010]. Поэтому усовершенствование технологии производства отечественных препаратов иммуноглобулинов и более полное удовлетворение в них потребности здравоохранения — это государственная проблема национальной безопасности и актуальность ее не вызывает сомнения.

Основным сырьем для получения препаратов иммуноглобулинов является плазма для фракционирования, представляющая собой жидкую часть крови из индивидуальных порций, отделенную от форменных элементов центрифугированием или методом плазмафереза в присутствии антикоагулянта, полученную от здоровых доноров и предназначенную для объединения в производственный пул [Human Plasma for fractionation. (2008:2073) In.European Pharmacopoeia; ФС 42-0091-02 Плазма для фракционирования]. Являясь уникальной биологической субстанцией — живой тканью человеческого организма, плазма крови доноров может содержать различные инфекционные агенты, наиболее опасными из которых признаны бактерии и вирусы. В ходе технологической переработки бактериальное загрязнение легко устраняется, а вирусы, относящиеся к наноструктурам, могут проникать в полупродукты и готовые препараты.

Ухудшение эпидемической ситуации в отношении основных гемотрансмиссивных вирусов, выявление новых инфекционных агентов обострили проблему вирусной безопасности препаратов из плазмы крови доноров [Голосова Т.В., Никитин В.К., 2003; Жибурт Е.Б., 2004; Карякин А.В., 2005; Оприщепко С.А., Захаров ВВ., Русанов В.М., 2008]. Случаи инфицирования пациентов вирусом гепатита С (ВГС) после применения препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения привели к активизации исследований, направленных на разработку новых методологических и технологических подходов к повышению их вирусной безопасности [Edwards С., 1987; Horowitz В. et al„ 1993; Rabenau Н. et. al„ 1996; Biesert L., 1996; Uemura У. et al., 1994; Yap P.L., 1996; Barin F., 2008; Ballow M., 2002; Dichtelmiiller H„ 2009; Burnouf T. et al., 2004, 2007; Groner A., 2008]. В Европе, США и других странах

мира под контролем Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) были разработаны и приняты к исполнению национальные директивы в области безопасности гемотрансфузий и производства препаратов из плазмы крови доноров [Guide to the preparation, use and quality assurance of blood components. Recommendation No. R (95) 15; Guidance on plasma-derived medicinal products / EM A/CHMP/BWP/706271/2010; WHO Expert Committee on biological standardization, 2007; WHO Guidance document on viral inactivation and removal procedure intended to assure the viral safety of blood plasma products /WHO Technical Report, Series № 924, Annex 4, 2004 и др.].

В России нормативная база, регламентирующая работу в этой области, несовершенна и противоречива. Несмотря на то, что на технологическую переработку поступает плазма крови доноров, разрешенная для использования в лечебно-профилактических учреждениях, существует риск получения инфицированных донаций [Карякин A.B., 2005]. При этом производство лечебных препаратов ориентировано главным образом на метод спиртового фракционирования по Кону, а дополнительные стадии ипактивации вирусов не используются или применяются устаревшие технологии. Не разработаны также методы валидации вирусинактивирующих стадий, а главный упор делается на контроль готовых лекарственных форм, хотя диагностические наборы, предназначенные для этой цели, отсутствуют.

Комплексные исследования в этой области позволят повысить безопасность отечественных препаратов иммуноглобулинов, привести их качество в соответствие с рекомендациями ВОЗ и повысить конкурентоспособность на рынке лекарственных средств.

Цель работы — разработка методологической базы и технологических подходов к обеспечению вирусной безопасности препаратов иммуноглобулинов.

Задачи исследования:

1. Определить закономерности выявления серологических и молекулярно-генетических маркеров гемотрансмиссивных вирусов в индивидуальных образцах и пулах плазмы крови доноров и разработать научно-обоснованный алгоритм входного контроля безопасности сырья на предприятиях по фракционированию плазмы крови доноров.

2. На примере стандартного образца содержания РНК ВГС разработать методологию создания стандартных образцов содержания нуклеиновых кислот (НК) гемотрансмиссивных вирусов, необходимых для контроля качества генамплификационных методов исследования.

3. Создать современную вирусбезопасную технологию производства иммуноглобулина G (IgG) человека для внутривенного введения.

4. Разработать методологические основы валидации вирусинактивирующих и вирусэлиминирующих технологий.

5. Разработать рекомендации по контролю вирусной безопасности готовых лекарственных форм препаратов иммуноглобулинов.

Научная новизна работы. Впервые применен комплексный подход к проблеме обеспечения вирусной безопасности препаратов иммуноглобулинов, включающий определение требований к качеству сырья, разработку современных технологий производства, валидацию методов вирусной инактивации и усовершенствование методов контроля готовых препаратов.

Изучено распределение вирусной нагрузки и коэффициентов позитивности (КП) антител в плазме крови доноров, инфицированных ВГС и вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ). Продемонстрировано отсутствие корреляции между активностью антител к ВГС (анти-ВГС) и концентрацией РНК ВГС, активностью антител к ВИЧ (анти-ВИЧ1,2) и концентрацией РНК ВИЧ, а также концентрацией поверхностного антигена ВГВ (HBsAg) и ДНК вируса гепатита В (ВГВ).

Выявлен высокий уровень распространенности парвовируса В19 (В19 V) в популяции доноров и установлена вероятность контаминации этим вирусом производственных пулов плазмы.

Создана вирусбезопасная технология производства препаратов иммуноглобулина G человека, включающая стадию удаления вирусов с помощью гидроксида алюминия и сольвент-детергентную (СД) обработку с использованием три-п-бутилфосфата (ТБФ) и натрия холата. Оптимизированы условия СД-обработки, разработан оригинальный способ очистки от вирусинактивирующих реагентов. Научная новизна исследований подтверждена патентами на изобретение (RU 2192279 и RU 2352358).

Экспериментально подтверждена вирулицидная активность каприлата натрия и разработана перспективная технология производства иммуноглобулина с его использованием.

Впервые для инактивации вирусов применены алкилирующие соединения (карбоплатин, хлорамбуцил). На примере хлорамбуцила продемонстрировано усиление вирулицидного действия при использовании его с реагентами, разрыхляющими оболочку вирусов.

Теоретическая и практическая значимость работы. Разработана универсальная методика аттестации стандартных образцов содержания НК, основанная на параллельном тестировании Международного стандартного образца (МСО) и исследуемого препарата с последующей статистической обработкой данных методом параллельных линий, реализованным в виде программного модуля в среде Microsoft Excel. Разработан и утвержден отраслевой стандартный образец содержания РНК ВГС (ОСО РНК ВГС) 42-28-366 (1) -11(П).

Разработаны методы определения ТБФ и натрия холата в препаратах иммуноглобулинов и обоснованы предельно допустимые нормы их остаточного содержания. Технология СД-обработки унифицирована и рекомендована для внедрения в процесс производства нормальных и специфических иммуноглобулинов для в1гутримышечного и внутривенного введения.

Разработана методология калидации вирусэлиминирующих и вирусинактивирующих технологий, включающая контаминацию объекта исследования вирусами, моделирование технологического процесса с адекватным масштабированием, определение концентрации вирусов по стадиям производства. Установлен уровень редукции ВГС и В19 V при спиртовом фракционировании вируссодержащей плазмы. Подтверждена эффективность СД-обработки в опытах с вирусом гепатита В утят (ВГВУ) и возбудителем вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота (ВВД-БС КРС).

Экспериментально доказана нецелесообразность тестирования иммуноглобулинов на наличие HBsAg по причине иммунной нейтрализации последнего избытком специфических антител. В нормативной документации (НД)

на препараты иммуноглобулинов рекомендовано тест на HBsAg заменить на определение антител к поверхностному антигену ВГВ (анти-НВз), при этом обоснована целесообразность повышения минимально допустимого уровня концентрации последних с 0,5 до 5 Международных единиц (МЕ) на 1 г иммуноглобулина.

Для количественного определения анти-НВэ разработана оригинальная технология изготовления иммуноферментной тест-системы «МикрАт-НВз» с использованием НВзА§, получепного из плазмы крови вирусопосителей (патент Ки 2290642).

Внедрение результатов работы. Разработаны и утверждены приказом №59-ОД от 21.07.2011 ФГБУ «ГИСК им. Л.А. Тарасевича» Минсоцздравразвития России Методические рекомендации «Порядок проведения входного контроля на вирусную безопасность сырья для производства препаратов из плазмы крови доноров». Процедура контроля плазмы для фракционирования, включающая формирование минипулов плазмы и тестирование их методами иммуноферментного анализа (ИФА) и полимеразной цепной реакции (ПЦР) на маркеры ВГВ, ВГС и ВИЧ, внедрена в практику в Нижегородском и Пермском филиалах ФГУП «НПО «Микроген» Минздравсоцразвития России (акт внедрения от 01.12.2011; акт внедрения от 19.08.2011) и утверждена в регламентах производства па лекарственные средства, получаемые из плазмы крови доноров (ПР № 01898718-10-09; ПР № 01898718-27-08; ПР № 01898718-28-11).

Технология СД-обработки иммуноглобулинов внедрена в Нижегородском и Пермском филиалах ФГУП «НПО «Микроген» Минздравсоцразвития России (акт внедрения от 18.08.2010; акт внедрения от 21.05.2010). Утверждена в установленном порядке НД на «Имбиоглобулин» (Иммуноглобулин человека нормальный, раствор для инфузий, 50 мг/мл/ ЛС-000177). Стадия удаления вирусов с помощью гидроксида алюминия и СД-обработка включены в промышленный регламент производства (ПР № 01898718-28-11).

ОСО РНК ВГС 42-28-366 (1)-11(П) используется в учреждениях практического здравоохранения для оценки качества коммерческих диагностических наборов для выявления и количественного определения РНК ВГС (Акты внедрения «Сургутский центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями» от 16.11.2011 №2703, Сургут, Тюменской области; Бюджетное учреждение Чувашской Республики «Республиканский центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями» от 28.08.2012 №01-10/379, Чебоксары; ФГБУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. Н.П.Чумакова» от 03.10.2012 №1132).

Разработаны технические условия, промышленные регламенты и получены регистрационные документы на производство и реализацию следующих диагностических препаратов:

1. Набор реагентов «МикрАт-НВэ» Тест-система иммуноферментная для определения антител к поверхностному антигену к вируса гепатита В / ФСР 2009/05914 от 07.07.2009.

2. Набор реагентов «ИФА-анти-ВГС» Тест-система иммуноферментная для выявления антител к вирусу гепатита С / ФСР 2009/05264 от 24.03.2009.

3. Набор реагентов «СПЕКТР-4» Тест-система иммуноферментная для подтверждения положительных результатов при выявлении антител к вирусу гепатита С / ФСР 2009/05263 от 24.03.2009.

4. Набор реагентов «ИФЛ-НВзА§» Тест-система иммуноферментная для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В / ФСР 2000/05265 от 15.03.2010.

Разработанные диагностические наборы используются в практическом здравоохранении.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Входной контроль вирусной безопасности плазмы для фракционирования обеспечивает снижение риска вирусной контаминации сырья для изготовления лечебных препаратов крови.

2. Аттестованные стандартные образцы содержания НК гемотрансмиссивных вирусов предназначены для стандартизации генамплификационных методов исследования и ратификации требований к вирусной безопасности плазмы для фракционирования.

3. Технология производства препаратов иммуноглобулинов, включающая дополнительные стадии инактивации вирусов (обработка сольвент-детергентом или каприлатом натрия), обеспечивает получение безопасных препаратов, соответствующих по физико-химическим и биологическим показателям качества требованиям отечественных нормативных документов (НД) и Европейской фармакопее.

4. Валидация технологических стадий инактивации и элиминации вирусов подтверждает адекватность технологических режимов и гарантирует безопасность готовых препаратов.

5. Состав и биологические свойства иммуноглобулинов определяют специфику контроля готовых лекарственных форм на маркеры гемотрансмиссивных вирусов.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа соответствует основным направлениям научных исследований ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздравсоцразвития России (номер государственной регистрации темы: 01.9.50.007426) и ФГУП НПО «Микроген» Минздравсоцразвития России.

Апробация работы. Материалы и положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на Международном конгрессе «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней — прогресс и проблемы», С.-Петербург, 2003; на Российской научно-практической конференции с международным участием «Вирусные гепатиты — проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики», Москва 2005, 2007, 2009, на Всероссийской конференции по вакцинологии «Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 2006, 2008, 2010; на VII Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярная диагностика», Москва, 2010; на Всероссийских научно-практических конференциях в Уфе, 2004, Нижнем Новгороде, 2006, Кирове, 2010; на Международном конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития», Москва, 2012.

Личный вклад автора. Все приведенные в диссертации данные были получены под руководством и при личном участии автора на базе Нижегородского филиала ФГУП НПО «Микроген» Минздравсоцразвития России. На базе

Пермского филиала ФГУП НПО «Микроген» Минздравсоцразвития России с участием автора выполнены работы по внедрению генамплификационного тестирования минипулов плазмы для фракционирования и масштабированию технологии производства «Имбиоглобулина». Исследования по валидации вирусинактивирующих технологий выполнены по разработанным автором программам на базе ФГБУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. Н.П.Чумакова» РАМН и ГНУ «Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока» Россельхозакадемии. Методы определения остаточного содержания трибутилфосфата и натрия холата разработаны при личном участии автора на базе НИИ молекулярной медицины Первого Московского государственного медицинского университета им.И.М.Сеченова.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 54 научные работы, в том числе 12 в изданиях, рекомендованных ВАК, получено 3 патента РФ, разработаны и утверждены Методические рекомендации.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 220 страницах машинописного текста и состоит из общей характеристики работы, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и приложений. Работа иллюстрирована 39 таблицами, 29 рисунками. Библиография включает 287 источников, в том числе 71 — отечественный, 216 - зарубежные.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования Для решения поставленных задач был разработан следующий план исследований, затрагивающий все звенья процесса производства (рис. 1).

^- Контроль на вирусные маркеры

Рис. 1. Дизайн исследований.

Основными объектами исследования были индивидуальные образцы плазмы крови доноров, плазма для фракционирования, фракции плазмы: П+Ш (осадок А и осадок А[ после повторного осаждения), II (осадок В), III (осадок Б), а также готовые лекарственные препараты из плазмы крови доноров. Объем исследований указан в табл. 1.

Таблица 1

Объем исследований на маркеры гемотраисмнссивных вирусов

№ п/п Наименование материала Колич ество образ цов Наименование маркеров

серологических молекулярно-генетичеких

1 Плазма крови здоровых доноров, всего 81 594

1.1 - « - 7 4750 алти-ВГС РНК ВГС

1.2 - « - 2 702 HBsAg, анти-HBs, апти-НВс ДНК ВГВ

1.3 - « - 1 ООО анти-В19 ДНКВ19 V

1.4 - « - 260 анти-ВГА -

1.5 - « - 1 ООО - РНК ВГА

1.6 - « - 250 анти-НЬТУ1.2 -

1.7 - « - 1 632 РНК вируса лихорадки Западного Нила (ВЗН)

2 Плазма крови доноров, инфицированных: 382

2.1 вгс 185 анти-ВГС, антиВГС/HGcAg, КП анти-ВГС РНК ВГС, концентрация РНК ВГС, генотипы ВГС

2.2 вгв 125 HBsAg, концентрация HBsAg, апти-НВс ДНК ВГВ, концентрация ДНК ВГВ

2.3 ВИЧ 72 анти-ВИЧ1,2, КП анти-ВИЧ1,2 РНК ВИЧ, концентрация РНК ВИЧ

3 Минипулы плазмы для фракционирования (24+4 донации) 40 274 HBsAg, анти-ВГС, анти-ВИЧ1,2 ДНК ВГВ, РНК ВГС, РНК ВИЧ (п=21 708)

4 Модельные пулы плазмы (24+4 донации): 293

4.1 контаминированные ВГВ 96 HBsAg ДНК ВГВ

4.2 контаминированные ВГС 128 анти-ВГС РНК ВГС

4.3 контаминированные ВИЧ 69 анти-ВИЧ1,2 РНК ВИЧ

5 Производств енные пулы (котловые загрузки) 572 HBsAg, апти-ВГС, анти-ВИЧ1,2 ДНК ВГВ, РНК ВГС, РНК ВИЧ, РНК ВЗН (п=15)

Референс-материалы. Отраслевые стандартные образцы: ОСО HBsAg 42-28-311-ОЗП; ОСО анти-ВГА 42-28-314-00. Международные стандартные образцы: 2-й Международный стандарт антител к HBsAg (анти-HBs), код 07/164; 3-й Международный стандарт РНК ВГС, код 06/100.

Раствор иммуноглобулина получали в Нижегородском филиале ФГУП «НПО «Микроген» Минздравсоцразвития России из плазмы крови здоровых доноров по промышленному регламенту на «Имбиоглобулин». Корректировали рН до 4,5—7,5 и концентрацию белка, добавляли стабилизатор. Раствор стерилизовали, используя мембранные шприцевые насадки Millex.

Готовые лекарственные формы иммуноглобулина (ФСГ14201001316-01; ЛС-000177-171011) получали в Нижегородском филиале ФГУП «НПО «Микроген» Минздравсоцразвития России.

Растворы для инактивации. СД-смесь готовили, используя ТБФ, натрия холат (Sigma-Aldrich) и дистиллированную алирогенную воду (воду для инъекций). Указанные компоненты использовали в таких соотношениях, чтобы получить концентрацию ТБФ и натрия холата в смеси, необходимую для создания вирусинактивирующей дозы в растворе при разбавлении в 10 раз. Аналогично готовили раствор натрия каприлата (200 ммоль). Раствор гидроксида алюминия, содержащий 1,0-1,5 г А12Оз вЮО г суспензии, готовили в соответствии с промышленным регламентом производства.

Вируссодержащие материалы. Для моделирования вирусной контаминации in vitro использовали плазму крови доноров-носителей ВГВ, ВГС и ВИЧ.

Для экспериментального моделирования ВГВУ in vivo использовали пул плазмы крови уток, инфицированных штаммом «Уфа-04». Титр вируса, выраженный в инфицирующих дозах, вызывающих развитие болезни у 50% зараженных экспериментальных животных (ID50), определяли по методу Рида и Менча [Reed L., Muench Н, 1938]. Для опытов использовали концентрацию ВГВУ не менее 5,5 logioID5o,

Для модельных опытов с ВВД-БС КРС использовали цитопагогенный штамм ВК-1. Концентрация тест-вирусной суспензии составляла не менее 6,5 logio тканевых цитопатогенных доз для 50% зараженных клеток (ТЦД5о/мл).

Методы

Серологические маркеры (HBsAg, антитела к ядерному антигену вируса гепатита В (анти-НВс), ядерный антиген вируса гепатита С (HCcAg), анти-ВГС, анти-ВИЧ1,2, антитела к вирусу гепатита А (анти-ВГА) в плазме крови выявляли методом ИФА с использованием наборов реагентов производства Нижегородского филиала ФГУП «НПО «Микроген», ООО «Диагностические системы», (Н.Новгород); ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск); «Био Рад» (Франция). Концентрацию антител к парвовирусу В19 (анти-В19) определяли с использованием количественных наборов «RIDASCREEN Parvovirus IgG» и «RIDASCREEN Parvovirus IgM» (R-Biopharm AG, Германия). Антитела к антигенам Т-лифотропного вируса 1 и 2 типов (анти-НТЬУ1,2) определяли с использованием диагностических наборов «ИммуноКомб II HLTV I&II» (ЗАО «Биоград», С.-Петербург). Концентрацию HBsAg определяли в серии кратных

разведений с использованием соответствующих референс-материалов с помощью метода параллельных линий в программе Microsoft Excel.

Активность антител (анти-ВГС, анти-ВИЧ1,2) в положительных образцах определяли по КП, как отношение значения оптической плотности образца (ОПобр.) к критическому значению оптической плотности (ОПкрит). Для проб, имеющих значение ОП более 2,0, готовили серию 10-кратных разведений, определяя КП с учетом фактора разведения.

Молекулярно-генетические маркеры вирусов (РНК ВГС, ДНК ВГВ, РНК ВИЧ, ДНК В19 V) вьивляли в ПЦР с использованием диагностических наборов ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора (Москва), ЗАО «Вектор Бест» (Новосибирск), ООО «ДНК-технологии" (Москва).

Физико-химические свойства. Повреждения структуры IgG оценивали по изменению молекулярного состава, определяемого методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Белковый состав изучали методом иммуноэлектрофореза (ИЭФ) с использованием диагностического набора «Поли-ИЭФ» (Филиал ФГУП «НПО «Микроген», Нижний Новгород).

Содержание иммуноглобулинов класса A (IgA) и класса M (IgM) определяли с использованием диагностических наборов производства «Seramun Diagnostica GmbH» (Германия) и в реакции иммунодиффузии по Манчини.

Содержание подклассов IgG определяли методом ИФА с использованием диагностических наборов «11одклассы-1§С-ИФА-Бест» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск).

Осмомолярность раствора иммуноглобулина определяли криоскопическим методом с использованием осмометра МТ-4 (НПП «Буревестник», С.-Петербург). Определение проводили по ГФ XII, ч,1, с.78.)

Биологические свойства. Изменения функциональной активности IgG в области Fc-фрагментов оценивали по изменению антикомплементарной активности [МУ 3.3.2.1063-01], в области Fab-фрагментов — по активности специфических антител. Содержание противокоревых антител определяли в реакции пассивной гемагтлютинации с эритроцитарным диагностикумом (НИИЭМ им.Л.Пастера, С.-Петербург). Содержание антиальфастафилолизина определяли в реакции нейтрализации с использованием токсина стафилококкового (ГУ НИИЭМ им. Н.И.Гамалеи, Москва) [ФСП 42-0504-4266-04]. Содержание анти-HBs определяли методом ИФА с коммерческими диагностикумами «MONOLISA ANTI HBS» (БиоРад, Франция) и «МикрАт-HBs» (филиал ФГУП «НПО «Микроген», Нижний Новгород).

Остаточное содержание ТБФ и натрия холата определяли методом газовой хроматографии на газовом хроматографе Agilent Technologies 6890N с использованием капиллярной колонки НР-5, 0,32, 0,25 мкм, 30 м. Разработка методов определения выполнена совместно со специалистами НИИ молекулярной медицины Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова.

Модельное фракционирование осуществляли по модифицированному методу Кона—Онклея в лабораторных условиях с использованием центрифуги «Optima L-90К» («Beckman Coulter», США). Полная технологическая схема производства препаратов иммуноглобулинов представлена на рис.2.

Модельный пул «лалии для фракционирование

Этанол 8%, I (-3)аС, рН 6,8-7,2

Цснтрнфугат А8, Этанол 26%, 1(-10)°С,рН 7,0-7,2

Центрифугат А (фракция У) (дм производства альбумина)

Цс?нтрнф5тагЛ1

(технологический отход)

Центрифугат Б Этанол 264» (-ЮуС, рН 7,0-7,4

Центрифугат В26 (технологический отход)

Расгвор для получения лекарственного препарата «Альбумин»

Осадок А8 (фибриноген)

Осадок А (фракция П+Ш) Этанол 2641 (-10)°С5 рН 7,0-7,2

Осадок А1 (фракция П+Ш дополнительно очищенная) Этанол 17%, I (-6)°С, рН 5,4

Осадок Б (фракция ПГ) 1§А, церулоплазмин и др белки)

Осадок В (фракция О) (очищенная фракция 120)

Удаление высокомолекулярных и денатурированных белков

Обработка гидроокисью алюминия А1 (ОП)э

Удаление силсй ■'у.ть графи ль грация

+

Внрусинактнвирующав обработка 5

♦ 0

Очиитка от реагентов

*

Стабилизация, стерилизующая фильтрация

Гитовый лекарственный препарат иммуноглобулина С * 9

Рис. 2. Технологическая схема получения человека для внутривенного введения (1,2,3?4,5,6,7,8,9 — точки отбора проб).

Моделирование технологического процесса. В растворы иммуноглобулина добавляли вируссодержащий материал в соотношении 1/10-1/20. Затем опытные пробы обрабатывали с целью удаления или инактивации вирусов, задавая параметры процесса: концентрацию белка, наличие или отсутствие стабилизатора, рН, температуру, продолжительность процесса. Затем отбирали пробы и тестировали на остаточную инфекционность.

Для выполнения опытов использовали оборудование и материалы, позволяющие максимально приблизить изучаемый процесс к условиям производства. Отрицательный (К-) и положительный (К+) контроли обрабатывали аналогично, но К- без добавления вируса, а К+ без добавления вирусинактивирующих агентов.

Уровень вирусной редукции оценивали по изменению концентрации вирусов на стадиях технологического процесса. Для расчета использовали специальную шкалу логарифмического уменьшения вирусной нагрузки в начале и конце процесса [Virus Validation Studies: the design contribution and interpretation of studies validating the inactivation and removal of viruses / CPMP/BWP/268/95]:

(V, x TO

R=l0g,e (V^TJ ,

где R - фактор редукции; Vi - объем исходного материала, мл; V2 - объем материала после обработки, мл; 7/ - концентрация (титр) вируса в исходном материале; концентрация (титр) вируса в материале после обработки.

Статистическую обработку данных проводили с использованием компьютерных программ Microsoft Office Excel и STATISTICA 6.0. Описание количественных признаков по выборке проводилось с помощью среднего значения и его 95% доверительного интервала (confidence interval, CI). Для оценки статистической значимости различий между сравниваемыми группами использовали непараметрический критерий Манна-Уитни. Статистически значимыми считались различия при р<0,05. Для оценки корреляции между показателями в образцах плазмы рассчитывали коэффициент ранговой корреляции Спирмена (rs) [Гланц С., 1998].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Распространенность и закономерности распределения маркеров ВГС, ВИЧ и ВГВ у доноров

Изучение распространенности гемотрансмиссивных вирусов в популяции доноров и определение закономерностей выявления серологических и молекулярно-генетических маркеров у инфицированных лиц необходимы для разработки обоснованного с научной и экономической точки зрения методологического подхода к организации контроля вирусной безопасности плазмы крови доноров, как объекта для трансфузий, так и сырья для получения лечебных препаратов.

Гетерогенность популяции ВГС, длительный серонегативный период создают трудности при выявлении этой инфекции у доноров, особенно при обследовании методом ИФА. Использование наборов реагентов, разработанных на основе синтетических пептидов и рекомбинантных белков, часто приводит к появлению противоречивых результатов при скрининге донорской плазмы. В связи с этим проведено комплексное исследование образцов плазмы крови методами ИФА и ПЦР и изучена корреляция между активностью анти-ВГС, генотипами вируса и концентрацией РНК ВГС у доноров-вирусоносителей.

Всего исследовано 74 750 образцов донорской плазмы. Выявлено 185 донаций, содержащих маркеры ВГС. Дополнительное тестирование этих образцов с использованием иммуноферментных тест-систем трех производителей, включая набор «Монолиза ВГС Аг-Ат Ультра» для одновременного выявления HCcAg и анти-ВГС, показало, что 158 образцов (85,4% от количества инфицированных) были положительными во всех тестах, при этом в 128 образцах РНК ВГС выявлена, в 30 - не выявлена. В 26 образцах (14,1% от количества инфицированных) обнаружены дискордантные (несовпадающие у разных

производителей иммуноферментных тест-систем) результаты. Характерно, что в этих образцах были выявлены низкие КП антител (менее 3), а в 2 образцах была обнаружена РНК ВГС в концентрации 1,0 х103 и 2,1х107. Наконец, была выявлена одна серонегативная плазма (0,5%), отрицательная при исследовании с использованием всех тест-системам, но имеющая концентрацию вирусного генома 2,3x107 МЕ/мл. Это свидетельствует, что плазма была получена от донора, находящегося в периоде «серологического окна». Несмотря на высокую концентрацию РНК, что должно сопровождаться наличием в плазме НСсА§, результат исследования этого образца с помощью тест-системы «Монолиза ВГС Аг-Ат Ультра», предназначенной для одновременного выявления антител и антигена, также был отрицательным.

Концентрация РНК ВГС в положительных образцах колебалась от 5x102 до 7,5х107 МЕ/мл. Распределение концентраций РНК ВГС по частоте встречаемости, в том числе по двум основным генотипам, представлено на рис. 3,а.

В РНК ВГС-позитивных образцах активность специфических антител находилась в диапазоне от 2 до 19 235 КП и была достоверно выше, чем в РНК ВГС- негативных донациях, активность антител у которых находилась в пределах от 1 до 5078 КП (р<0,001). Выявлено также статистически значимое различие (р<0,001) активности антител у доноров, инфицированных генотипом 1в (12< КП <19355) по сравнению с таковой у доноров, инфицированных генотипом За (2< КП <8655). При этом между активностью анти-ВГС и концентрацией вирусного генома в РНК ВГС-позитивных донациях корреляции не выявлено (рис. 3,6).

а — распределение концентраций РНК б — связь между концентрацией РНК ВГС ВГС доноров-вирусоносителей по частоте и КП анти-ВГС (п=128) встречаемости (п=128)

Рис. 3. Особенности распределения маркеров ВГС у инфицированных доноров.

Полученные данные подтверждают, что для реципиентов плазмы и ее препаратов серьезную опасность представляют сероконверсионные донации и образцы с низкими КП анти-ВГС, которые при обследовании доноров могут давать ложноотрицательные результаты. Такая плазма может поступать в лечебные

учреждения и на предприятия фракционирования как соответствующая требованиям безопасности. По результатам наших исследований частота выявления донаций, полученных в период «серологического окна», составляет 1 случай на 74 750 исследованных единиц плазмы. Частота встречаемости образцов с низким уровнем КП анти-ВГС, которые часто определяются как серонегативные, составляет 0,035% от общего числа обследованных доноров, при этом в 1 случае из 37375 такая плазма содержит РНК ВГС.

С целью изучения закономерностей выявления маркеров ВИЧ у доноров нами было исследовано 72 образца плазмы крови, полученных от ВИЧ-инфицированных лиц. Показано, что 95,8% анти-ВИЧ-позитивных образцов содержали РНК ВИЧ, при этом в 4 образцах (5,6% от общего количества исследованных образцов) копцеитрация РНК ВИЧ составляла менее 1000 копий/мл, в 5 образцах (6,9%) образцах - от 1000 до 5000 копий/мл, в 5 (6,9%) образцах — от 5000 до 10000 копий/мл и в 55 (76,4%) образцах — более 10000 копий/мл (1 копия -1,75 ME). Корреляции между активностью анти-ВИЧ1,2 и концентрацией РНК ВИЧ не выявлено.

Следует отметить, что активность специфических антител у ВИЧ-инфицированных была достоверно выше, чем у ВГС-инфицированных доноров (р<0,001): 409 < КИш^вичи 5 943 750 и 2 < КП11П11.ШС <19235. Однако из-за отсутствия количественных стандартов показатель КП апти-ВИЧ1,2 и анти-ВГС, представленный в наших исследованиях, относителен и складывается главным образом из уровня иммунного ответа, специфической активности диагностических наборов, а также способности эффективно выявлять вирусный маркер при разбавлении («dilution sensitivity»), что особенно важно при контроле плазмы для фракционирования [ЕМЕА Workshop on the Plasma Master File//CPMP/ /BWP/1737/02],

На следующем этапе работы были изучены особенности распределения маркеров ВГВ у допоров: аити-НВс, апти-HBs, HBsAg и ДНК ВГВ, а также корреляция между концентрацией ДНК ВГВ и HBsAg у доноров-вирусоносителей. Для этого исследовали 2702 образца плазмы крови здоровых доноров и 125 образцов, отбракованных на станциях переливания крови по HBsAg и анти-НВс.

В первой группе выявлено 92 (3,4%) образца, содержащих анти-НВс, но не содержащих анти-HBs. При исследовании этих же образцов методом ПЦР, в том числе с дополнительным ультрацентрифугированием, обеспечивающим предел обнаружения ДНК ВГВ на уровне 50 копий/мл (1,7 копий ~ 1 ME), вирусный геном не был выявлен.

Результаты исследований на HBsAg, анти-НВс, ДНК ВГВ образцов второй группы разделили на несколько категорий. Для удобства статистической обработки концентрацию HBsAg и ДНК ВГВ представили в логарифмическом масштабе (табл.2).

Таблица 2

Распределение серологических и молекулярно-генетических маркеров ВГВ у

№ п/п Категория п Концентрация HBsAg Оояю нг/мл) Концентрация ДНК ВГВ копий/мл) Анти -НВс (+),п Анти-НВс (-),п

М+т диапазон М+т диапазон

1 НВзАё (-) ДНК ВГВ (-) 16 - - - - 10 6

2 HBsAg (+) ДНК ВГВ (-) 13 0,75+1,26 От-1.04 до 4,13 - - 11 2

3 HBsAg (+) ДНК ВГВ (+/-) 12 1,83+0,89 От-1,70 до 3,75 - Предел детекции 12 0

4 НВбА8 (+) ДНК ВГВ (+) 24 2,97+0,42 От 0,64 до 4,45 - Предел детекции 24 0

5 НВ5Аё (+) ДНК ВГВ (++) 60 3,59+0,20 От 1,39 до 5,04 3,89+0,19 От 2.47 до 8,44 60 0

Примечание. HBsAg (+) -результат положительный (предел детекции 0,05 нг/мл);

ДНК ВГВ (+/-) — результат положительный только при дополнительном концентрировании НК

(предел детекции 50 копий/мл или 1,7к^ю копий/мл);

ДНК ВГВ (+) — результат положительный в качественном тесте (предел детекции 100 копий/мл или 2,0 1о£ю копий/мл);

ДНК ВГВ (++) - результат положительный в количественном тесте (предел детекции более 300 копий/мл (2,5 кфо копий/мл).

Установлено, что в 36 из 96 ДНК ВГВ-позитивных образцов уровень вирусной нагрузки был низкий, при этом концентрация HBsAg в этих образцах составляла от 4,3 нг/мл до 30 мкг/мл. Особенности распределения HBsAg и ДНК ВГВ у доноров-носителей представлены на рис.4,а и 4,6.

а— связь между концентрацией HBsAg и б— распределение вирусной нагрузки у ДНК ВГВ (п=96) доноров-вирусоносителей (п=60)

Рис.4. Графическая иллюстрация особенностей распределения маркеров ВГВ у инфицированных доноров

Результаты генамплификационного тестирования HBsAg-позитивных образцов показали, что в образцах с низкой концентрацией антигена, составляющей менее 100 нг/мл (п=19), при стандартной процедуре тестирования ДНК ВГВ была выявлена только в 6 (31,5%) случаях, из них в 2 с концентрацией около 1000 копий/мл. При дополнительном концентрировании НК (31 000 g, 2 ч) эффективность выявления ДНК ВГВ в образцах этой группы составила 57,9 %. В 2 образцах с высокой концентраций HBsAg, составляющей более 100 000 нг/мл, концентрация ДНК ВГВ не превышала 5000 копий/мл.

Таким образом, относительно высокая эффективность выявления HBsAg и низкая - ДНК ВГВ у инфицированных доноров свидетельствует о недостаточной чувствительности стандартной процедуры исследования методом ПЦР, особенно если тест выполняется в формате минипулов. Такой скрининг может быть направлен только на выявление классических форм острого гепатита В в период «серологического окна» или ранней сероконверсии, когда нарастание концентрации HBsAg и ДНК ВГВ происходит в линейной прогрессии.

В целом полученные в ходе исследования данные были использованы в дальнейшей работе для оценки остаточного риска вирусной контаминации производственных пулов плазмы и разработки обоснованного с научной и экономической точки зрения алгоритма контроля сырья для производства препаратов крови.

Выявление маркеров «неактуальных» гемотрансмиссивных вирусов в плазме

крови доноров

Вирусы без липидной оболочки, к которым относятся вирус гепатита А (ВГА) (семейство Picornaviridae) и парвовирус В19 (семейство Parvoviridaé) — предмет особой обеспокоенности производителей препаратов крови. Эти вирусы чрезвычайно устойчивы к химическим и физическим факторам инактивации [Guidance on plasma-derived medicinal products / EMA/CHMP/BWP/706271/2010; WHO Guidance document on viral inactivation and removal procedure intended to assure the viral safety of blood plasma products / WHO Technical Report, Series № 924, Annex 4, 2004]. Требует также внимания изучение распространенности на территории РФ некоторых экзотических вирусов, включая Т-лимфотропный вирус 1-го и 2-го типов (семейство Retroviridae) и вирус лихорадки Западного Нила (семейство Flaviviridae). Учитывая, что обследование доноров на эти вирусы не является обязательным, уровень вирусной нагрузки в производственных пулах может зависеть только от распространенности их в популяции доноров, а риск заражения — от степени патогенности и устойчивости к вирусинактивирующим и вирусэлиминирующим процедурам.

Распространенность маркеров этих вирусов в популяции доноров Приволжского федерального округа представлена в табл. 3. Показано, что парвовирус В19 является наиболее распространенным контаминантом плазмы для фракционирования: виремия обнаружена в 1 % донаций, из них в 0,3% концентрация вирусного генома превышала установленный для доноров уровень ипфекциошюсти, равный 1,0x104 ГЭ/мл [Brown К.Е. et al., 2001; Blümel J.et.al., 2010]. Наличие вируснейтрализующих антител класса IgG во всех ДНК -позитивных образцах, безусловно, является положительным фактором. Средний уровень анти-В19 в ДНК-позитивных донациях составил 107,3 ME/мл (CI 95%

55,7^ 158,9 МЕ/мл), и был достоверно выше, чем в ДНК-негативных образцах, а именно 27,5 МЕ/мл (С1 95% 19,6-35,4 МЕ/мл).

Таблица 3

Распространенность маркеров «неактуальных» гемотрансмиссивных вирусов у доноров

Вирус Характеристика вируса (диаметр, оболочка, структура НК) Исследуемый маркер Частота выявлния У доноров, % Диапазон концентраций

ВГА Диаметр 28—30 нм, без оболочки, эбИМА Анти-ВГА 61,0 0,025 - 60,0 МЕ/мл

РНК ВГА 0,0 -

В19 V Диаметр 18—26 пм, без оболочки, збЕЖА АнтиВ19ЯяО 30,4 19,6-158,9 МЕ/мл

АнтиВ 19ЯgM 0,1 -

ДНКВ19 V 1,0 103 - 106 ГЭ/мл

Т-лимфо-тропный вирус 1,2 Диаметр 50-90 нм, липидная оболочка, диплоид, 2ззТША Анти-НТЬУ1.2 0,5

ВЗН Диаметр 40-50нм, липидная оболочка, збКЫА РНК ВЗН Не выявлен

Однако при пулировании плазмы происходит изменение соотношений уровня антител и концентрации вирусного генома. Поэтому вирусная безопасность плазмы крови доноров в отношении парвовируса В19 — это актуальная проблема, которую трансфузиологам и производителям препаратов крови необходимо будет решить в ближайшее время. Следует также обратить внимание на выявление у доноров антител к Т-лимфотропному вирусу 1-го и 2-го типов. В связи с этим специалистам Службы крови необходимо проявлять настороженность в отношении этой инфекции, а производителям препаратов крови оценивать уровень безопасности лечебных препаратов с учетом полученных данных.

Относительно ВГА результаты наших исследований показали, что у доноров обнаружен высокий уровень иммунитета против этого вируса. Анти-ВГА выше защитного уровня были выявлены у 61% обследованных доноров в диапазоне концентраций от 25 мМе/мл до 60 МЕ/мл. У 28% лиц уровень антител не превышал 10 МЕ/мл, в 25 % он составлял 11-20 МЕ/мл, в 23% - 21-30 МЕ/мл, в 13% - 3140 МЕ/мл, в 11% — 41—60 МЕ/мл. Несмотря на то, что Приволжский федеральный округ не является благополучным по гепатиту А, вирусоносителей мы не выявили, в том числе и среди допоров с высоким титром антител.

Методологические подходы к повышению вирусной безопасности плазмы для фракционирования

Первый этап безопасности плазмы для фракционирования обеспечивается при заготовке ее от доноров и включает отбор доноров, карантинизацию и исследование на маркеры вирусных инфекций в учреждениях Службы крови. Обязательными тестами при заготовке плазмы крови от доноров являются определение HBsAg, антител к ВГС, антител и антигена р24 к ВИЧ [ГОСТ Р 522492009].

Обследование доноров на РНК ВГС, РНК ВИЧ и ДНК ВГВ методом ПЦР, несмотря на утверждение приказа Минздравсоцразвития №261 от 6.06.2008, внедрено пе повсеместно по причине отсутствия необходимого оборудования и относительно высокой стоимости анализов. Как следствие, часть плазмы крови доноров, разрешенной к применению в РФ, не исследовано методом ПЦР. Недостаточно эффективно также контролируется качество исследований методом ИФА. Это повышает риск поступления па переработку донаций, полученных в период «серологического окна», а также с ложноотрицательными результатами серологических тестов.

Поэтому организация производственного процесса, предполагающего пулирование плазмы от большого числа доноров, требует разработки специальных методологических подходов к организации контроля вирусной безопасности плазмы для фракционирования. Наиболее распространенным является алгоритм контроля, когда методом ИФА исследуют индивидуальные донации, а методом ПЦР— минипулы плазмы. Однако такая форма контроля трудоемка и экономически не обоснована. Оптимальным для контроля сырья на предприятиях является тестирование минииулов плазмы методами ИФА и ПЦР.

Размер минипула, подлежащий входному контролю, обычно определяют производители, исходя из технологических особенностей производства. Однако пулирование может снижать эффективность выявления вирусных маркеров в пулах плазмы. Поэтому в модельных опытах было изучено влияние размера минипула и чувствительности используемых диагностических наборов на эффективность выявления инфицированных образцов. Исследования выполнены для минипулов 24+4 донации. Для формирования модельных пулов было использовано 293 образца, положительных по ВГВ, ВГС или ВИЧ, имеющих случайное распределение серологических и молекулярно-генетических маркеров: 128 образцов с А77анти-вгс от 2 до 19 235 и концентрацией РНК ВГС от 5 * 102 до 7,5 х 10 МЕ/мл, 69 образцов с А77анга_Вич1,2 от 751 до 943 750 и концентрацией РНК ВИЧ от 5,7 х Ю2 до 4 х Ю7 копий/мл; 96 образцов с концентрацией HBsAg от 4,4 нг/мл до 110 мкг/мл и ДНК ВГВ от 50 копий/мл до 2,8 х Ю8 копий/мл.

Модельные минипулы готовили в лабораторных условиях путем смешивания в равных объемах 19—27 отрицательных образцов и 1 образца, положительного по ВГВ, ВГС или ВИЧ. Модельные пулы исследовали методами ИФА и ПЦР.

Эффективность выявления соответствующих маркеров оценивали как долю положительных результатов от общего количества исследованных пулов. Результаты представлены в табл. 4.

Таблица 4

Эффективность выявления маркеров ВГВ, ВГС и ВИЧ в модельных минипулах плазмы

Вирусные Количе Результат исследования методами

маркеры ство ИФА ПЦР в режиме реального

модель- времени

ных аналитичес- эффектив- аналитичес- эффектив-

пулов кая ность вы- кая чувстви- ность

чувствитель явления, тельность выявления,

ность % %

Анти-ВГС/ 128 100% на 91,4 150-200 96,4

РНК ВГС контрольной панели МЕ/мл

- « - - « - - - 100 МЕ/мл 98,3

- « - - « - - - 10 МЕ/мл* 100,0

Анти- 69 100% на 100,0 200 МЕ/мл 93,4

ВИЧ1,2/ контрольной

РНК ВИЧ панели

- « - - « - - - 20 МЕ/мл* 99,2

НВэА^ 96 0,05 нг/мл 93,8 100 копий/мл 60,4

ДНК ВГВ

- « - - « - - - 15 копий/мл* 84,9

* Дополнительное концентрирование НК

Установлено, что исследование минипулов плазмы методом ИФА на анти-ВИЧ1,2 позволяло эффективно выявлять инфицированные донации. При исследовании минипулов, коптамипировапных анти-ВГС-позитивными

образцами, эффективность обнаружения антител в них составила 91,4%, при этом в модельных пулах, контаминированных положительными образцами с низкими КП (КПанги.Вгс< 24), только 14,2—21,4%. Полученные результаты были закономерными и связаны с различиями в характере распределения КП антител при гепатите С и ВИЧ-инфекции.

При исследовании модельных пулов, контаминированных ВГВ-позитивными образцами, в б из 96 исследованных проб НВзА§ не был выявлен, при этом исходная концентрация антигена в образцах, используемых для коптаминации, варьировала от 4,4 до 57 нг/мл. Учитывая полученные данные, мы предположили, что, кроме фактора разбавления, причиной снижения эффективности выявления НВзА§ в пулах плазмы было присутствие анти-НВэ, которые нейтрализовали НВзАй, исключая его из реакционной смеси.

Эффективность выявления вирусного генома в пулах плазмы методом ПЦР нами была оценена для разных уровней аналитической чувствительности метода. Выявлена зависимость между эффективностью скрининга, чувствительностью диагностических наборов и размером минипула.

Полученные данные были использованы для определения остаточного риска контаминации производственных пулов плазмы. Расчеты выполнены с учетом

следующих факторов: 1) особенностей распределения вирусных маркеров у инфицированных доноров; 2) вероятности поступления на предприятие серопозитивных вируссодержащих образцов; 3) вероятности получения донаций в период «серологического окна» (по данным собственных исследований и данным литературы [Б^атег Б.Ь. е1 а\., 2011; (ЖегаеЫ II, 2005]); 4) аналитической чувствительности используемых тестов. Результаты представлены в табл. 5.

Таблица 5

Остаточный риск контаминации производственных пулов (1000 донаций)

ВГВ, ВГС и ВИЧ

Вирус Вероятность поступления инфицированных донаций*, 1 In Частота контаминации производственных пулов (1/п/) в случае, если

входной контроль не проводить входной контроль в формате минипулов 24+4 донации

ИФА ИФА/ПЦР

ВГВ 1/29 916 1/39 1/242 1/303-1/709

ВГС 1/11 987 1/19 1/47 1/1656 и менее

ВИЧ 1/1 000 000 и менее 1/597 1/2308 1/4616 и менее

* С учетом донаций, полученных в период «серологического окна»

Экспериментально подтверждено, что в случае формирования производственных пулов только на основании результатов серологического обследования доноров, выполненного на этапе заготовки плазмы крови, риск контаминации их вирусами гепатитов будет высоким. При этом анти-ВГС в таких пулах выявляться не будут, а концентрация РНК ВГС может достигать 106 ME/мл и более Входной контроль методом ИФА снижает риск. Наиболее эффективным ИФА-тестирование минипулов оказалось для выявления ВИЧ-серопозитивных донаций, наименее эффективным — для ВГС-серопозитивных донаций. Характерно, что дополнительное ПЦР-тестирование минипулов на РНК ВГС снижало риск контаминации производственных пулов в 35 раз и более, а аналогичный контроль на ДНК ВГВ — только в 1,2—2,9 раза.

К сожалению, сегодня нет четкого представления о том, какой риск является допустимым. В Европе и других развитых странах мира разработаны руководящие документы, определяющие требования к генамплификационному тестированию плазмы для фракционирования, согласно которым в минипуле должно быть обнаружено по крайней мере 10 000 ME/мл РНК ВИЧ и 5000 МЕ/мл РНК ВГС (при р<0,05) [Руководство для изготовления, применения и обеспечения качества компонентов крови : рекомендации № R (95) 15. Совет Европы, 2006; Paul-Ehrlich-Institut / http://www.pei.de; WHO Guidance document on viral inactivation and removal procedure intended to assure the viral safety of blood plasma products /WHO Technical Report, Series № 924, Annex 4, 2004].

С учетом рекомендаций ВОЗ, а также на основании полученных аналитических данных нами был разработан алгоритм входного контроля сырья для производства препаратов крови методами ИФА и ПЦР в формате минипулов, включающих 24+4 донации (рис.5).

Плазма для фракционирования

(индивидуальные донации, полученные от здоровых доноров, обследованных на вирусные маркеры)

Минипулирование

Минипулы плазмы (24±4 донации)

Контроль минипулов

Методом ИФА Методом ПЦР*

- HBsAg -РНКВГС

-анти-ВГС -РНК ВИЧ

-анти-ВИЧ1,2 -ДНКВГВ '-*-'

Идентификация и исключение положительных образцов _+_

Производственные пулы плазмы

+

Контроль производственных пулов (HBsAg, анти-ВГС, анти-ВИЧ1,2, РНК ВГС, РНК ВИЧ, ДНК ВГВ должны отсутствовать)

Мультиплексные диагностические наборы (предел обнаружения РНКВГС <100МЕ/.ш, РНК ВИЧ<менее 400 МЕ/мп, ДНК ВГВ<50 МЕ/мл).

Рис.5. Алгоритм контроля вирусной безопасности плазмы для фракционирования (на примере Нижегородского филиала ФГУП «НПО «Микроген» Минздравсоцразвития России).

Эффективность процедуры контроля подтверждена экспериментально. С момента ее внедрения на предприятии исследовано 572 производственных пула плазмы на анти-ВГС, анти-ВИЧ1,2, НВбА& а также РНК ВГС, РНК ВИЧ и ДНК ВГВ. Положительных результатов не выявлено, что соответствует требованиям Национального стандарта Российской Федерации ГОСТ Р 52249-2009.

В то же время полученные данные свидетельствуют, что при первичном обследовании доноров с целью признания пригодности плазмы крови для использования в лечебно-профилактических учреждениях, а также, если технологический процесс не включает эффективных стадий элиминации и инактивации вирусов, специфика контроля должна быть следующей:

• ИФА-скрининг проводить только в формате индивидуальных донаций.

• ПЦР-тестирование минипулов выполнять только при минимальном размере пула, вплоть до проведения исследований в формате индивидуальных донаций.

Несмотря на высокую стоимость исследований, такой алгоритм контроля оправдан, поскольку необходимо учитывать тяжелые медико-социальные последствия инфицирования пациентов гемотрансмиссивными вирусами.

Практическим результатом работы стали разработка и утверждение Методических рекомендаций «Порядок проведения входного контроля на вирусную безопасность сырья для производства лечебных препаратов из плазмы крови доноров». Это первый отечественный нормативный документ, регламентирующий процедуру контроля сырья на предприятиях по производству препаратов крови. В документе определены обязательные тесты на вирусные маркеры, разработаны процедура мипипулировапия, позволяющая идентифицировать каждую инфицированную донацию, установлены требования к максимальному размеру минипулов и критерии обеспечения качества исследований.

Методические рекомендации гармонизированы с требованиями Европейской фармакопеи, ГОСТ Р 52249-2009, Технического регламента «О требованиях безопасности крови, ее продуктов, кровезамещающих растворов и технических средств, используемых в трансфузионно-инфузионной терапии», утвержденного постановлением Правительства РФ №29 от 26.01.10, а также с рекомендациями ВОЗ и Европейского агентства по оценке медицинских продуктов.

Стандартизация генамплификационных методов исследования

ОСО РНК ВГС предназначен для стандартизации и контроля качеств генамплификационных методов исследования. Препарат получен путем разведени РНК ВГС-позитивной плазмы крови вирусоносителя (генотип За) плазмой кров здоровых доноров. Препарат разливали в дозе 0,5 мл с последующе лиофилизацией. При контроле точности розлива весовым методом коэффициен вариации составил 3,2 %. Остаточная влажность препарата была 2 %.

Аттестацию ОСО относительно МСО осуществляли следующим образом: готовили сершо пятикратных разведений испытуемого и референс-препарата каждое разведение готовили независимо друг от друга и тестировали в трех повторах методом ПЦР с определением концентрации РНК ВГС в соответствии с инструкцией по применению диагностического набора.

Полученные аналитические данные для МСО и ОСО подвергали совместной статистической обработке с помощью метода параллельных линий. Графики зависимости логарифма измеренного значения концентрации от логарифма дозы (титра) тестировали на линейность и параллельность, используя метод дисперсионного анализа. Затем определяли концентрацию РНК ВГС в ОСО на основе известной концентрации МСО, а также границы доверительного интервала (CI 95%) (табл. 6). Расчеты выполняли в программном модуле Microsoft Excel, разработанном в соответствии с требованиями Европейской фармакопеи [Statistical analysis of results of biological assays and test (01/2008:50300) In.European Pharmacopoeia],

Таблица б

Концентрация РНК ВГС в ОСО, рассчитанная относительно МСО методом параллельных линий (по четырем циклам исследований)

Цикл/титр Концентрация РНК ВГС, 1о§ю МЕ/мл (Хсред + э) (измеренные значения) Концентрация РНК ВГС, loglo МЕ/мл

Разведение ОСО Разведение МСО в ОСО относительно МСО С1 95%

1:1 1:5 1:25 1:1 1:5 1:25

I 5,71±0,05 5,07±0,05 4,33±0,18 5,12±0,02 4,35±0,05 3,83±0,03 5,81 5,69-5,95

5,68±0,04 5,05±0,03 4,3б±0,09 5,81 5,73-5,89

II 5,59±0,07 5,11 ±0,05 4,36±0,09 4,94±0,08 4,31 ±0,03 3,79±0,02 5,94 5,83-6,07

5,74±0,09 5,07±0,05 4,33±0,18 5,94 5,79-6,11

III 5,73±0,05 4,98±0,12 4,52±0,09 5,15±0,01 4,37±0,04 3,74±0,01 5,87 5,77-5,98

5,75±0,01 5,02±0,06 4,39±0,08 5,83 5,76-5,89

IV 5,97±0,06 5,37±0,05 4,53±0,26 5,37±0,01 4,74±0,10 3,86±0,04 5,81 5,64-5,99

Общее 5,74±0,12 5,10±0,13 4,4±0,14 5,14±0,17 4,44±0,19 3,81±0,05 5,86 5,79-5,92

Графики зависимости концентраций МСО и ОСО от логарифма дозы (титра) представлены на рис.6. В данном случае при построении графиков использованы результаты измерений по всем циклам. Подобные графики строились также при обработке данных каждого цикла измерений.

Рис.6.Графики зависимости концентрации РНК ВГС от титра в МСО и ОСО.

Срнквгс (logio МЕ/мл) - измеренное значение концентрации РНК ВГС, (logm МЕ/мл)

Разработанный препарат зарегистрирован в Реестре отраслевых стандартов (ОСО 42-28-366(1 )-11П). Аттестованная характеристика содержания РНК ВГС в ОСО составила ,2x105 МЕ/мл или 3,6x105 МЕ/флакон, что эквивалентно 5,86 logm МЕ/мл или 5,56 log10 МЕ/флакон соответственно. Наличие линейности и параллельности графиков для МСО и ОСО свидетельствует, что исследуемые объекты имеют одинаковую природу, содержат одно и то же активное вещество.

Методологический подход может быть рекомендован для аттестации стандартных образцов второго уровня, включая контрольные или стандартные образцы предприятия, необходимые для ежедневного мониторинга качества исследований. В Европейской фармакопее рекомендовано при исследовании производственных пулов тестировать контрольный образец с концентрацией РНК ВГС 100 МЕ/мл [Human Plasma for fractionation. (2008:2073) In.European Pharmacopoeia].

Выполненные исследования направлены главным образом на повышение качества плазмы для фракционирования. Однако гарантировать безопасность готовых препаратов можно только в том случае, если при их изготовлении используются методы, позволяющие эффективно удалять и инактивировать вирусы.

Разработка вирусбезопасной технологии производства препаратов иммуноглобулинов

Новое поколение препаратов иммуноглобулина в для внутривенного введения на российском фармацевтическом рынке представлено, в основном, зарубежными производителями. Из отечественных препаратов применяется только «Имбиоглобулин», разработанный в Нижегородском филиале ФГУП «НПО «Микроген» Минздравсоцразвития России под руководством проф. В.В. Анастасиева (2000). Этот препарат представляет собой высокоочищенный концентрат молекул близких по структуре и свойствам к иммуноглобулинам, циркулирующим в крови. Удаление и инактивация вирусов при производстве «Имбиоглобулина» осуществляется главным образом в процессе спиртового фракционирования и при обработке гидроксидом алюминия. Однако эти приемы не гарантируют полную безопасность продукта, в связи с этим технологический процесс был усовершенствован и дополнен сольвент-детергентной стадией инактивации вирусов.

Оптимизацию условий вирусинактивирующей обработки осуществляли на основании изучения изменений физико-химических и биологических свойств ¡^'О и вирулицидной активности используемых реагентов в диапазоне концентраций от 0,015% до 0,6% ТБФ и от 0,01% до 0,4% натрия холата. В результате был разработан следующий вариант СД-обработки: раствор с концентрацией белка 4,5-6,5%, рН 6,5-7,5, стабилизированный глицином до концентрации 1%, обрабатывали стерильной СД- смесью в конечной концентрации 0,3% и 0,2% соответственно. Смесь выдерживали в течение 6 ч при температуре от 30°С до 37°С. При сравнении физико-химических и биологических показателей качества СД-обработанного препарата с иммуноглобулином, не подвергнутым вирусинактивирующей обработке, достоверных различий не обнаружено.

Для очистки иммуноглобулина от реагентов использовали оригинальный способ очистки (патент 1Ш '2352358), включающий экстракцию сольвента и детергента растительным маслом с температурой затвердевания не ниже 8°С, например, маслом какао, специально обработанным с целью удаления вредных примесей. Стерильное масло какао добавляли в обработанный растворителем и детергентом иммуноглобулин до концентрации 5-10%. Смесь выдерживали при температуре 37—45°С, постоянно перемешивая. Затем раствор охлаждали до 8°С и инкубировали в течение 10-15 ч для затвердевания масла. В конце инкубации температуру раствора понижали до 1,5-2,5°С, что создавало благоприятные условия для удаления масла. Окончательную очистку от вирусинактивирующих реагентов осуществляли с помощью ультрафильтрации с одновременным снижением рН до 4,4^4,8. При апробации технологии в условиях производства часть серий препарата получали без стадии масляной экстракции, используя только ультрафильтрацию с увеличенной кратностью отмывки. Преимуществом варианта технологии без использования масла какао было упрощение технологического процесса. Контроль качества очистки от реагентов оценивали методом газовой хроматографии.

Остаточное количество реагентов устанавливали на основании полученных аналитических данных, требований Европейской фармакопеи, сведений о токсичности реагентов и опыта зарубежных производителей: для ТБФ - не более 2 мкг/мл, для холата натрия - не более 100 мкг/мл.

Изучена стабильность физико-химических и биологических свойств СД-обработанного иммуноглобулина при хранении. Состав и свойства иммуноглобулина оставались стабильными в течение 2,5 года. Отсутствовала фрагментация препарата, не отмечено статистически значимого изменения содержания мономерной и димерной форм. Комплексная проверка серий препаратов по тестам, принятым Российским Фармакопейным Комитетом, позволила установить, что они полностью соответствовали требованиям, предъявляемым к иммуноглобулинам для внутривенного введения.

Разработанный вариант СД-обработки может быть использован в технологии производства препаратов иммуноглобулинов как для внутривенного, так и для внутримышечного введения. Технология легко встраивается на разных стадиях технологического процесса, не требует дорогостоящего оборудования.

Однако механизм действия СД-реагентов ограничивает область применения этой технологии и не решает проблему безопасности препаратов в отношении вирусов без липидной оболочки. Поэтому были предприняты попытки поиска новых химических соединений с другим механизмом действия. Критерии выбора были следующими: вещества не должны денатурировать белки и вызывать канцерогенного или тератогенного эффектов, должны быть изучены с точки зрения фармакологических свойств и применяться в фармацевтической промышленности (табл. 7).

Таблица 7

Характеристика химических веществ, используемых для инактивации вирусов

Наименование соединения Группа Использование в технологии лекарств

Каприлат натрия Производное жирной кислоты, детергент При производстве альбумина

Бензалкониум хлорид Смесь алкилбензилдиметиламмония хлорида (С6до С]«), ПАВ Консервант в готовых лекарственных формах

Карбоплатин Комплексное соединение платины, алкилирующее вещество Лекарственный препарат. Цитостатик

Хлорамбуцил Производное бис-Р-хлорэтиламина, алкилирующее вещество Лекарственный препарат. Цитостатик

Механизм действия каприлата натрия и бензалкониума хлорида заключается в связывании мембранных белков и разрушении липидной оболочки вирусов. Мишенью же нуклеофильных соединений, к которым относятся карбоплатин и хлорамбуцил, является геном вируса, и это делает эти вещества особенно перспективными для разработки новых технологий с расширенным спектром действия.

В модельных опытах in vitro и in vivo, а также на основании изучения физико-химических свойств IgG были определены дозы, обеспечивающие вирулицидный эффект, и оптимальные условия обработки. Результаты представлены в табл. 8.

Установлено, что при использовании разных концентраций хлорамбуцила в водном растворе уровень редукции ВГС был невысоким. По-видимому, это связано

с низкой растворимостью хлорамбуцила в воде. Предварительное растворение хлорамбуцила в димексиде или в ТБФ обеспечивало повышение уровня редукции.

Таблица 8

Вирусинактивирующие дозы и условия обработки каприлатом натрия,

бензалкониумом хлоридом, карбоплатином и хлорамбуцилом

Вещество/ изученный диапазон концентраций Оптимальная концентрация в растворе IgG Оптимальные условия обработки Уровень редукции

белок мг/мл рН t,°C время, ч ВГС, logioPHK ВГС ВГВУ, logio Ю50

Каприлат натрия/от 5 до 80 мМоль 10-40 ммоль (1,66-6,64 мг/мл) 20-70 4,05,0 1837 1 >3 >5

Бензалкониум хлорид/от 0,2 до 0,4 % 0,4% 4 мг/мл) 20+1 6,57,5 37 1 >3 >5

Карбоплатин/ от 2,5 до 30 мг/мл 10-30 мг/мл 10+1 4,0 37 24 >2 -

Хлорамбуцил/ от 2,5 до 10 мг/мл 2,5-10,0 мг/мл 10+1 4,05,0 37 24 <0,5 -

Хлорамбуцил+диме ксид 1мг/10мгна 1мл 1 мг/мл+ 10 мг/мл 10±1 4,05,0 37 24 >3,5

Хлорамбуцил+ТБФ 1мг/10 мг на 1 мл 1 мг/мл+ 10 мг/мл 10+1 4,05,0 37 24 >3,5 -

В целом сочетание хлорамбуцила с растворителями, особенно с ТБФ, который, как известно, широко используется в составе СД-смесей, а также самостоятельно для вирусинактивирующей обработки, является наиболее интересным технологическим решением. Воздействуя одновременно на оболочку и геном вируса, такая смесь может обеспечить более эффективную вирусную инактивацию по сравнению с СД-обработкой. Детальное изучение эффективности этой технологии на модельных вирусах и оптимизация условий обработки должны стать предметом отдельного исследования.

Вирулицидный эффект бензалкониума хлорида был обнаружен только при концентрации последнего 4 мг/мл. Однако в этой дозе он вызывал агрегацию IgG. Содержание полимеров после вирусинактивирующей обработки увеличивалось до 15%. С целью уменьшения денатурации IgG был разработан вариант обработки при пониженной концентрации белка (20 мг/мл и менее) в присутствии стабилизатора глицина. В этих условиях содержание мономерной фракции IgG до и после обработки составило 90,4+5,9 и 91,1+4,8 % соответственно (изменения статистически незначимы при р<0,05).

Наилучшие результаты были получены в опытах с каприлатом натрия. В модельных опытах in vitro с использованием плазмы, содержащей РНК ВГС, и in vivo на модели ВГВУ выявлена высокая вирулицидная активность каприлата в

концентрации более 1 Оммоль. Выбраны оптимальные условия обработки раствора иммуноглобулина, позволяющие обеспечивать стабильный вирулицидный эффект и сохранять физико-химические и биологические свойства препарата: концентрация каприлата натрия 20 ммоль, рН раствора от 4,0 до 5,0, температура от 18 до 29° С. Изготовлено 12 лабораторных и 4 экспериментально-производственных серий препарата. Подтверждено соответствие полученных препаратов требованиям НД. Проводится наблюдение за их качеством в процессе хранения.

Результатом выполненной работы стала разработка технологических схем производства препаратов дополненных сольвент-детергентной или

каприлатной стадией инативации вирусов (рис.7). В качестве объекта сравненш использована классическая технология с применением пепсина.

Рис.7. Схема получения иммуноглобулина человека для внутривенного введения

Физико-химические и биологические свойства препаратов, полученных с использованием указанных технологических схем производства, представлены в табл. 9.

Таблица 9

Сравнительная характеристика качества препаратов иммуноглобулина О человека для внутривенного введения

Иммуноглобулин для в/в введения ФСП 4201001316-01 Имбиоглобулин СД ФСП ЛС-000177-171011 Имбиоглобулин К 'эксп. произ. серии)

Норма по НД Фактические п=20 Норма по НД Фактические п=17 Фактические п=4

Прозрачность, ОП ОП менее 0,05 0,021±0,006 ОП менее 0,05 0,017±0,004 0,003±0,002

Молекулярные параметры (%): полимеры (не более)/мономеры-димеры (не менее)/фрагменты (не более) 0/80,0/20,0 0,08±0,12 91,8±2,2 8,1±1,9 1,0/90,0/5,0 0,7±0,2 98,2±4,1 1,1±0,5 0,0±0,0 95,1±0,2 4,9±0,1

Фракционный состав: - дуги преципитации в ИЭФ ие более 2 1 -2 дуги че более 2 1 дуга 1 дуга

Специфическая активность: - антиальфастафилолизин (титр МЕ/мл) - антитела к вирусу кори (титр МЕ/мл) - антитела к HBsAg (МЕ/г) - антитела к ВГА (анти-ВГА) (Ме/мл) ие менее 2 не менее 25 не нормируется ие нормируется 3,29±0,26 25,0±0,0 38,7±1,9 че менее 2 не менее 25 че менее 0,5 не нормируется 3,7±0,24 25,0±0,0 38,6±3,9 62,2±26,3 4,0±0,0 25,0±0,0 44,5±9,9 77,8±35,4

Антикомплементарная активность: - единица СН50 на 1 мг не более 1 единицы 0,17±0,05 че более 1 единицы 0,26±0,16 0,47±1,05

Осмоляльность (ммоль/кг Н2О) ие нормируется - не менее 240 286,0±25,1 275,2±26,2

Содержание 1дА, мг/мл че нормируется 0,34±0,05 че нормируется менее 0,1 менее 0,1

Содержание 1йМ, мг/мл ие нормируется не нормируется 0,15±0,11 менее 0,05

Распределение подклассов 1цС (%) (^01 /1з02/1Э3/^С4) не нормируется 50,7±1,4 38,5±1,3 7,4±0,2 3,4±0,2 че нормируется 48,4±1,2 41,1±1,6 7,1 ±0,3 3,3±0,2 50,0±3,1 41,3±1,8 5,7±0,8 3,0±0,5

Трибутилфосфат (мкг/мл) отсутствует - менее 2,0 От 0 до 0,9 -

Натрия холат (мкг/мл) отсутствует - менее 100,0 От 0 до 39,6 -

Пирогенность Апирогенен Апирогенен Апирогенен Апирогенен Апирогенен

Токсичность Нетоксичен Нетоксичен Нетоксичен Нетоксичен Нетоксичен

Как видно из данной таблицы, препараты иммуноглобулинов нового поколения, инактивированные СД-методом или каприлатом натрия, соответствовали требованиям нормативных документов, а по ряду показателей, например, по содержанию мономеров IgG и примесей IgA, превосходили качество иммуноглобулина, полученного по классической технологии с использованием пепсина.

Усовершенствованная технология производства по уровню безопасности соответствует критериям ВОЗ, опа включает 3 дополнительные стадии вирусинактивирующей обработки: адсорбцию гидроксидом алюминия, инкубацию при кислом значении рН и обработку СД-методом или каприлатом натрия.

Следует отметить, что СД- и каприлатный методы инактивации вирусов нами использованы в разных технологических схемах. С целью совмещения этих методов в одной технологической схеме обработку каприлатом натрия мы проводили на стадии спиртового фракционирования, а сольвент-детергентом, как указано в технологической схеме. Это обеспечивало не только высокий уровень вирусной безопасности получаемого продукта, но и дополнительную очистку IgG от балластных белков. Исследования в этом направлении планируется продолжить.

На следующем этапе необходимо было подтвердить эффективность разработанных технологических схем производства и их способность обеспечить надежный уровень безопасности препаратов.

Валидация технологических стадий элиминации и инактивации вирусов

В настоящей работе был валидирован технологический процесс производства «Имбиоглобулина», включающий стадию спиртового фракционирования и дополнительные технологические приемы удаления и инактивации вирусов, а именно неспецифическую сорбцию вирусов гидроксидом алюминия и СД-обработку.

Известно, что в процессе спиртового фракционирования плазмы крови происходит перераспределение вирусов по фракциям, но данные об уровнях редукции противоречивы [Mitra G. et al., 1988; Kempf С. et al., 2007; Yei S. et al., 1992; Piszkiewicz D. et al., 1985; Wells M.A.et.al., 1986]. Чтобы оценить этот процесс для наиболее опасного контаминанта, каким является ВГС, нами было выполнено модельное фракционирование контаминированной плазмы крови (рис.1, см. «Методы») и изучена динамика концентрации РНК ВГС по стадиям технологического процесса. Уровень редукции рассчитывали с учетом изменения объемов продукта в ходе фракционирования, определяя общую вирусную нагрузку на каждой стадии процесса.

Показано, что па стадии получения осадка А (фракция П+Ш) уровень редукции РНК ВГС был невысоким и составил 0,95+0,21 logmME/мл (точки отбора проб 1 и 2, см. «Методы», рис.2). Последующие стадии осаждения (точки отбора 3, 4, 5, см. «Методы», рис.2) приводили к перераспределению вирусов по стадиям процесса и в итоге к снижению концентрации РНК ВГС в осадке В (точка отбора 9, см. «Методы», рис.Х) более чем в 103 раз. Суммарный уровень вирусной редукции ВГС при получении очищенной фракции IgG составил по результатам наших исследований 4,11+0,18 logi0 МЕ/мл. Аналогичные исследования,

выполненные с плазмой крови, содержащей ДНК В19 V, показали, что многостадийный процесс производства иммуноглобулина обеспечивал снижение концентрации парвовируса В19 более чем в 103 раз 5,69 ± 0,23 logio МЕ/мл..

Дополнительная обработка раствора IgG гелем гидроксида алюминия в дозе 20 мл на 1 л раствора приводила к снижению концентрации РНК ВГС в 102 раз, а при увеличении дозы геля до 150 мл - в 103 раз.

Таким образом, определение вирусного клиренса с помощью ПЦР является доступным и недорогим методом для оценки эффективности удаления вирусов, но, используя его, невозможно адекватно оценить эффективность инактивирующих технологий. Для этого необходимы методы, позволяющие оценивать I жизнеспособность вирусов. Поэтому эффективность СД-обработки определяли в опытах in vivo, моделируя ВГВУ-инфекцию на утятах, и в опытах in vitro на культуре клеток с возбудителем вирусной диареи (модель ВГС).

Моделирование технологического процесса СД-обработки выполняли, как указано в разделе «Методы». Результаты с ВГВУ оценивали двумя способами: вначале в модельных опытах in vitro путем определения концентрации ДНК ВГВУ непосредственно в растворе иммуноглобулина до и после СД-обработки, затем в опытах in vivo путем введения этих же растворов восприимчивым к инфекции утятам. Для каждой концентрации реагентов было использовано по три группы животных из 10 особей.

Как и следовало ожидать, в опытах in vitro не было выявлено статистически значимого снижения концентрации ДНК в обработанных растворах иммуноглобулина, в то время как в опытах in vivo наблюдался выраженный вирулицидный эффект. Как показано на рис. 8, в группах утят, которым вводили контаминированный ВГВУ раствор иммуноглобулина, обработанный СД-смесью в конечной концентрации 0,15% ТБФ и 0,1% натрия холата и выше (продолжительность инкубации 6 ч), не регистрировались случаи инфекции. Отмеченная в группах убыль утят по сравнению с исходным количеством (8—9 против 10) связана с естественным падежом их в период наблюдения.

Рис.8. Выявление ДНК ВГВУ в группах утят через 3 недели после внутрибрюшинного введения СД-обработанного содержащего до обработки 5 ^10 Ш50 ВГВУ (по три группы в каждом опыте)

Полученные результаты подтвердили высокую эффективность стадии СД-обработки иммуноглобулина в отношении ВГВУ при концентрации ТБФ более 0,15% и натрия холата более 0,1% при температуре от 29 до 37°С °С и длительности инкубации 6 ч. Уровень редукции ВГВУ в этих условиях составил более 5 log ID50. Отсутствие снижения концентрации ДНК ВГВУ в опытах in vitro связано с механизмом действия СД-смеси, которая, разрушая липидную оболочку вирусов, высвобождает ДНК и фрагменты, не обладающие инфекционными свойствами.

При выполнении исследований с ВВД-БС КРС вначале оценивали цитотоксичность СД-смеси. Для этого СД-смесь, разбавленную в питательной среде Игла MEM до конечных концентраций от 0,03% до 0,6% ТБФ и от 0,02% до 0,4% натрия холата, добавляли в лунки планшета с монослоем клеток коронарных сосудов теленка и культивировали при 36+1 °С в С02-инкубаторе в течение 3 сут. Затем анализировали морфологию и целостность монослоя клеток. В результате ! было установлено отсутствие токсичности СД-смесей во всех исследованных концентрациях.

Уровень вирусной редукции при СД-обработке определяли при : концентрации ТБФ от 0,03% до 0,6%, натрия холата от 0,02% до 0,4%, инкубации смеси в течение 6 ч при температуре от 29 до 37°С. Результаты наших исследований продемонстрировали, что даже при минимальной концентрации реагентов уровень редукции ВВД-БС КРС составил от 5,25+0,12 до 5,33+0,18 logio ТЦЦ50/МЛ. Этого достаточно, чтобы признать стадию СД-обработки эффективной [WHO Technical Report, Series N924, 2004]. С увеличением концентрации ТБФ и натрия холата эффективность инактивации повышалась и по данным наших исследований составила более 6 logio ТЦД50/МЛ. При этом условия обработки в исследованном диапазоне, включая концентрацию белка, plí, температуру инкубации, практически не влияли на результат.

Кинетику инактивации ВГВУ изучали для двух вариантов концентраций реагентов: 0,15% /0,3% ТБФ, 0,1% /0,2% натрия холата, а ВВД-БС КРС только для концентрации ТБФ 0,3%, а натрия холата 0,15%. Определяли долю инфицированных ВГВУ (%) особей в группах, получивших СД-обработанные препараты, или концентрацию ВВД-БС КРС в растворах иммуноглобулина, инкубированных с СД-смесью в течение 1, 3 и 6 ч Результаты исследований представлены на рис. 9 а, б.

» 71 | 51

а- инфицированность ДНК ВГВУ (% в группе утят) через 3 нед после внутрибрюшинного введения инактивированного иммуноглобулина

б- динамика редукции ВВД-БС КРС при СД- обработке раствора иммуноглобулина (0,3%ТБФ/0,2% натрия холат)

Рис.9. Кинетика инактивации ВГВУ и ВВД-БС КРС при СД-обработке иммуноглобулина

Таким образом, экспериментально подтверждена эффективность СД-обработки 1§С при следующих условиях: концентрация ТБФ 0,3%, натрия холата 0,2%, температура инкубации от 29 до 37 °С, концентрация белка в растворе от 4,5% до 5,5 %, рН от 6,5 до 7,5. Требуемый уровень редукции (более 4 1оёю) был достигнут в течение 3 ч инкубации. По истечении этого времени препарат считают вирусинактивированным и в соответствии с рекомендациями ВОЗ перемещают в так называемую «безопасную зону», свободную от вирусов. Дальнейшая инкубация раствора с СД-смесыо усиливала эффект и гарантировала дополнительную безопасность полученных препаратов, по крайней мере, в отношении ВГВ и ВГС.

Валидационные исследования с адекватным моделированием технологического процесса впервые были выполнены в РФ. Подтверждена эффективность технологии производства для внутривенного введения и

определен суммарный уровень вирусной редукции, который составил более 11 порядков, что существенно выше, чем возможный уровень вирусной нагрузки в производственном пуле (табл. 10).

Таблица 10

Уровень редукции патогенных и модельных гемотрансмиссивных вирусов при

Шаги снижения вирусной нагрузки ВГС ВГВУ ВВД-БС КРС

Спиртовое фракционирование >4,0 - -

Обработка гидроокисью алюминия >2,0 - -

СД-обработка - >5,0 >6,0

Суммарный уровень редукции > 11,0

J

Первый отечественный опыт по валидации нового технологического процесса с использованием разных типов патогенных и модельных гемотрансмиссивных вирусов и способов их детекции, может быть полезен при разработке соответствующих нормативных документов, необходимых для повышения вирусной безопасности препаратов из плазмы крови доноров. Разработка и внедрение в РФ обязательных требований к подтверждению эффективности вирусной инактивации, гармонизированных с международными директивами, позволят повысить уровень вирусной безопасности отечественных препаратов из плазмы крови человека.

Контроль вирусной безопасности готовых лекарственных форм иммуноглобулинов

В РФ в соответствии с требованиями НД контроль иммуноглобулинов на HBsAg, анти-ВГС, анти-ВИЧ1,2 является обязательным, при этом условия проведения тестов не определены. В то же время, некоторые показатели качества, например, уровень анти-HBs, в отечественных препаратах не определяют. Не оценена также роль молекулярно-генетических тестов для контроля готовых лекарственных форм. Обсуждению этой проблемы и посвящена последняя глава диссертации.

Препараты иммуноглобулинов представляют собой концентрат антител различной специфичности, при этом уровень анти-HBs нормируется Европейской фармакопей и составляет не менее 0,5 МЕ/г IgG [Human Normal immunoglobulin (2007:0338) In.European Pharmacopoeia; 6st ed.]. В связи с этим целесообразность тестирования препаратов иммуноглобулинов на HBsAg нами была подвергнута сомнению. Даже в случае контаминации иммуноглобулинов антигеном существует возможность нейтрализации последнего специфическими антителами. Необходимо было определить уровень связывания (нейтрализации) HBsAg специфическими антителами и оценить какой реальный вклад в повышение вирусной безопасности может внести контроль иммуноглобулинов методами ИФА и ПЦР.

Вируснейтрализующая способность анти-HBs изучена в опытах in vitro с использованием разведений ОСО HBsAg и раствора IgG. Показано, что 1 ME анти-HBs связывал не менее 50 нг HBsAg до неопределяемого методом ИФА уровня. Аналогичные результаты были получены в модельных опытах с плазмой крови донора-вирусоносителя, которую добавляли в определенных соотношениях к препаратам иммуноглобулинов. Результаты опытов показали, что уровень нейтрализации в расчете на 1 ME анти-HBs составил 34,6+0,9 нг через 2 ч инкубации и 70,7+1,8 нг HBsAg через 24 ч инкубации при температуре 37°С. При этом было выявлено, что нейтрализация HBsAg специфическими антителами не оказывала влияния на способность метода ПЦР выявлять ДНК ВГВ.

Полученные данные показали, что обязательный контроль препаратов иммуноглобулинов на HBsAg не является информативным. В НД на препараты иммуноглобулинов представляется целесообразным заменить этот тест на контроль уровня анти-HBs.

Для определения концентрации специфических антител в препаратах иммуноглобулинов была разработана иммуноферментная тест-система для количественного определения анти-HBs «МикрАТ-HBs», в основу которой положен принцип одностадийного прямого ИФА с использованием реагентов на

основе HBsAg, выделенного из плазмы крови вирусоносителей. Предел обнаружения анти-HBs при использовании тест-системы составил 8+2 МЕ/л.

В период с 2003 по 2010 г. с использованием разработанной тест-системы нами было исследовано 725 серий препаратов иммуноглобулина G человека для внутривенного введения. Средние значения концентраций специфических антител составили от 12,6 ± 3,5 до 60,2 ± 16,9 МЕ/г иммуноглобулина. При оценке данных было обнаружено заметное увеличение концентрации анти-HBs в препаратах иммуноглобулинов после 2004 г. Возможно, это связано с достижением донорского возраста лицами, массовая вакцинация которых осуществлялась в школах и других учебных заведениях страны в середине 90-х годов.

Полученные данные свидетельствовали, что уровень анти-HBs в препаратах иммуноглобулинов целесообразно увеличить, и установить минимальный предел 5 ME на 1 г иммуноглобулина.

Для дополнительной гарантии безопасности препараты иммуноглобулинов рекомендуется исследовать на ДНК ВГВ. Однако следует учитывать, что метод ПЦР не различает живой вирус, поэтому может быть рекомендован только для препаратов, не подвергающихся дополнительной инактивации вирусов в процессе производства.

На следующем этапе работы нами была оценена чувствительность и специфичность метода ИФА для определения анти-ВГС в препаратах иммуноглобулинов. Показано, что при исследовании их на диагностических наборах, предназначенных только для плазмы крови, частота выявления неспецифических (ложноположительных) реакций составляла от 1,4 до 4,3% на разных тест-системах. Поэтому нами была разработана иммуноферментная тест-система «ИФА-анти-ВГС», предназначенная для контроля иммуноглобулинов и других препаратов крови. Специфичность и чувствительность диагностических наборов были обеспечены благодаря оптимизации условий сорбции иммунологических планшет антигепами ВГС (синтетическими и рекомбинантными) и разработке оригинального состава раствора для разведения исследуемых проб. Оптимальный уровень разведения иммуноглобулинов был установлен на основании результатов тестирования препаратов иммуноглобулинов, полученных в лабораторных условиях из пулов плазмы крови доноров, контаминированных анти-ВГС-позитивными образцами с разным уровнем активности антител (КП от 1 до 3,5). Препараты исследовали без разведения или в разведении в 5, 20, 100 и 200 раз. Анализируя полученные данные, мы определили, что для контроля иммуноглобулинов методом ИФА с использованием диагностических наборов «ИФА-анти-ВГС» оптимальным будет разбавление препаратов IgG до концентрации белка 5-10 мг/мл, что приблизительно равно нормальному содержанию IgG в плазме крови человека.

выводы

1. На основании изучения закономерностей выявления серологических и молекулярно-генетических маркеров гемотрансмиссивых вирусов в индивидуальных донациях и пулах плазмы разработан научно-обоснованный алгоритм входного контроля безопасности сырья на предприятиях по переработке плазмы крови доноров, гарантирующий безопасность производственных пулов плазмы. Утверждены Методические рекомендации «Порядок проведения входного контроля па вирусную безопасность сырья для производства препаратов из плазмы крови доноров», в которых регламентирована процедура минипулирования плазмы, позволяющая идентифицировать каждую инфицированную донацию, установлен максимальный размер минипулов и требования к обеспечению качества исследований. Разработанный алгоритм контроля вирусной безопасности сырья внедрен в Нижегородском и Пермском филиалах ФГУП «НПО Микроген» Минздравсоцразвития России.

2. Разработан и утвержден Отраслевой стандартный образец содержания РНК ВГС (ОСО 42-28-366(1 )-11П). Разработана методология аттестации стандартных образцов содержания НК вирусов относительно Международных стандартов, основанная на статистической обработке данных с помощью метода параллельных линий. В программе Microsoft Excel создан модуль для выполнения расчетов.

3. Разработан и внедрен в производство препарат иммуноглобулина человека для внутривенного введения нового поколения, инактивированный сольвент-детергентным методом, по показателям качества и безопасности соответствующий требованиям отечественных НД и Европейской фармакопеи. Разработана и утверждена в установленном порядке НД на «Имбиоглобулин» (Иммуноглобулин человека нормальный, раствор для инфузий, 50 мг/мл/ JIC-000177).

4. Создана перспективная технология производства иммуноглобулина человека для внутривенного введения с применением каприлата натрия, вирулицидная активность которого в концентрации более 10 ммоль подтверждена экспериментально. Для усиления вирулицидного эффекта предложено совмещать обработку каприлатом натрия и сольвент-детергентом в одном технологическом цикле.

5. Разработана методология валидации технологических стадий инактивации и элиминации вирусов. Эффективность элиминации вирусов рекомендуется определять с использованием метода ПЦР с количественной детекцией результатов, эффективность инактивации вирусов — в опытах in vivo на восприимчивых животных или в опытах т vitro на культурах клеток.

6. Экспериментально доказана нецелесообразность обязательного тестирования иммуноглобулинов на содержание HBsAg по причине иммунной нейтрализации антигена специфическими антителами.

7. Для количественного определения анти-HBs в сыворотке/плазме крови и препаратах иммуноглобулинов разработана и внедрена в производство иммуноферментная тест-система «МикрАт-HBs», защищенная патентом РФ ФСР 2009/05914 от 07.07.2009). Разработана и внедрена в производство тест-система «ИФА-анти-ВГС», валидированная для исследования препаратов крови, включая иммуноглобулины (ФСР 2009/05264 от 24.03.2009).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Рекомендовать включить парвовирус В19 в перечень актуальных для РФ вирусных инфекций и внедрить скрининговое исследование донорской плазмы с целью исключения донаций с высокой концентрацией ДНК В19 V.

2. При регистрации новых препаратов из плазмы крови доноров и при внесении изменений в действующие технологические процессы в обязательном порядке подтверждать экспериментально и документировать эффективность технологических стадий удаления и инактивации вирусов.

3. Исключить тест на HBsAg в нормативной документации на препараты иммуноглобулинов и заменить его на определение антител к HBsAg. Обоснована целесообразность повышения минимально допустимого уровня апти-НВз с 0,5 до 5 МЕ/г иммуноглобулина.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК

1. Зубкова, Н. В. Эффективность тепловой инактивации вирусов в производстве внутривенного иммуноглобулина/ Н. В. Зубкова, В. В. Анастасиев, В. Н. Мазепа, К. А. Орлова// Вестн. службы крови России. - 2002. - №1. - С.31-33.

2. Зубкова, Н. В. Нейтрализация поверхностного антигена вируса гепатита В препаратами иммуноглобулинов/ Н. В. Зубкова, В. В. Анастасиев, М. А. Моисеева, С. В. Зубов// Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2006. — № 2. - С. 60-65.

3. Зубкова, Н. В. Оценка специфичности и чувствительности метода ИФА для определения анти-ВИЧ-1,2 в препаратах внутривенного иммуноглобулина/ Н. В. Зубкова, С. В. Зубов, М. А. Моисеева// Вестн. службы крови России. - 2006. -№4.-С. 31-33.

4. Зубкова, Н.В. Организация входного контроля пулов плазмы для фракционирования на маркеры вирусных гепатитов В и С/ Н. В. Зубкова, Е. В. Филатова, В. В. Анастасиев, М. А. Моисеева// Вестн. новых мед. технологий. -2007,-№4. -С. 100-102.

5. Зубкова, Н. В. Сольвент-детергентный метод инактивации вирусов в технологии производства иммуноглобулинов // Гематология и трансфузиология. -2010,-№2.-С. 39^4.

6. Зубкова, Н. В. Серологические и молекулярно-генетические маркеры вируса гепатита С у инфицированных доноров/ Н. В. Зубкова, Е. В. Филатова, С. В. Зубов // Вопр. вирусологии. - 2010. - № 5. - С.34-36.

7. Филатова, Е. В. Выявление маркеров парвовируса В19 в образцах крови доноров/ Е.В. Филатова, Н. В. Зубкова. Н. А. Новикова, JI. Н. Голицына, К. В.Кузнецов// Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2010. - № 5. - С. 67-70.

8. Филатова, Е. В. Оценка изменения концентрации ДНК парвовируса В19 при модельном фракционировании плазмы крови доноров/ Е. В. Филатова, Н. В. Зубкова. Т. В. Короткова, С. А. Гальговская, В. В. Анастасиев // Гематология и трансфузиология. - 2011. - № 3. - С. 10-14.

9. Зубкова, Н.В. Оценка роли серологических и молекулярно-генетических методов при выявлении маркеров вируса гепатита В в плазме крови доноров / Н.В.Зубкова! М.А.Моисеева, С.В.Зубов, Е.В.Филатова // Вестн. службы крови России. - 2011. - № 3. - С. 5-9.

10. Зубкова, Н. В. Алгоритм входного контроля вирусной безопасности плазмы при производстве лечебных препаратов из плазмы крови доноров/ Н. В.Зубкова, А. В. Казьянин, А. М. Николаева, Л. К. Лаптева, Е. В. Силин // Гематология и трансфузиология. - 2012. - № 1. - С. 9-13.

11. Филатова, Е. В. Оценка безопасности производства препаратов альбумина в отношении парвовируса В19/ Е. В.Филатова, Н. В .Зубкова. Т. В.Короткова, С. А. Гальговская // Вестн. Нижегород. ун-та им. Н. И. Лобачевского. - 2012. -№ 1(1).-С. 106-109.

12. Зубкова, Н.В. Разработка и аттестация национального лиофилизированного отраслевого стандарта содержания РНК вируса гепатита С (ОСО РНК ВГС) / Н. В. Зубкова, Р. А. Волкова, Е. В. Филатова, Е. В. Эльберг, Е. В. Силин,

А. К. Лобастова, И. В. Красильников // Вестн. службы крови России. - 2012. - № 1. -

С.41-44.

Патенты

13. Патент 2192279 Российская Федерация, А61К39/395. Способ получения иммуноглобулинового препарата [Электронный ресурс] / В. В. Анастасиев, Т. В. Короткова, Т. Б. Змачинская, Т. А. Крайнова, Н. В. Зубкова ; патентообладатель Нижегород. предприятие по производству бактерийных препаратов «ИмБио». - 2000123226/14 ; заявл 07.09.00 ; опубл. 10.11.02. -Электрон, дан. - Режим доступа : //Ьйр//\лг\ул'.йр8.ги.

14. Патент 2290642 Российская Федерация, 001ЫЗЗ/576. Тест-система для количественного определения анти-ИВв в биологическом образце [Электронный ресурс] / М. А. Моисеева, С. В. Зубов, Н. В. Зубкова ; патентообладатель ФГУП «НПО «Микроген» М-ва здравоохранения Рос. Федерации. - 2005107749/13 ; заявл 21.03.05 ; опубл.27.12.06. - Электрон, дан. -Режим доступа : //ЬИр/Лу\у\у.йрз.ги.

15. Патент 2352358 Российская Федерация, А61К39/395. Способ приготовления вирусинактивированных растворов иммуноглобулинов [Электронный ресурс] / Н. В. Зубкова. В. В. Анастасиев, Т. В. Короткова. -2007136861/15 ; заявл. 04.10. 07 ; опубл. 20.04. 09. - Электрон, дан. - Режим доступа : /Л1Ир/Лу\у\у.Г1р8.ги. Методические рекомендации и пособия

16. Порядок проведения входного контроля на вирусную безопасность сырья для производства препаратов из плазмы крови доноров : метод, рекомендации : утв. ФГБУ «ГИСК им. Л. А. Тарасевича» Минздравсоцразвития России № 59-ОД от 21.07.11 / Н.В.Зубкова, Л.К.Лаптева, Р.А.Волкова, А.В.Казьянин, И.С.Горлова, Н.В.Шалунова, М.С.Воробьева, Е.В.Филатова, Н.А.Спиридонова, А.Б.Перевозчиков. - М. : ФГБУ «ГИСК им. Л. А. Тарасевича» Минздравсоцразвития России, 2011. - 38 с.

Статьи, опубликованные в сборниках научных трудов и других центральных и региональных журналах

17. Зубкова, Н. В. Применение сольвент-детергентного метода для инактивации вирусов при получении иммуноглобулина // Пробл. гематологии и переливания крови. - 2001.-№3.-С. 51.

18. Зубкова, Н. В. Методы инактивации вирусов в технологии производства иммуноглобулиновых препаратов / Н. В. Зубкова, В. В. Анастасиев // Новое в трансфузиологии. - 2002. - Вып.ЗЗ. - С. 52-59.

19. Зубкова, Н. В. Сольвент-детергентный метод инактивации вирусов в технологии производства иммуноглобулина / Н. В. Зубкова, О. В. Миловидова // Здоровье населения Нижегородской области. Итоги региональной программы : сб.тр. - Нижний Новгород, 2002. - С. 123-128.

20. Зубкова, Н. В. Эффективность методов тепловой инактивации в производстве внутривенного иммуноглобулина / Н. В. Зубкова, В. В. Анастасиев, К. А. Орлова// Мир вирусных гепатитов. - 2002. - № 1. - С. 3-7.

21. Зубкова, Н. В. Использование иммуноферментной тест-системы «ИмБио анти-НВв» для количественного определения антител к вирусу гепатита В / Н._В. Зубкова, С. В. Зубов, М. А. Моисеева // Мир вирусных гепатитов. - 2003. -№ 9.-С. 9-13.

22. Зубкова, Н. В. О возможности отбора сырья для производства специфического иммуноглобулина против гепатита А / Н. В. Зубкова,

Н. А. Спиридонова, Е. В. Филатова, С. В. Зубов // Мир вирусных гепатитов. - 2009. - № 1. - С. 23-25.

Опубликованные научные сообщения и тезисы научных докладов

23. Анастасиев, В В. Влияние солей на стабильность иммуноглобулина при пастеризации / В. В. Анастасиев, Н. В. Зубкова. Т. А. Крайнева, Т. Б. Змачинская // Russian Journal of Immunology. - 1999. -Т. 4, № 1. - P. 70.

24. Моисеева, M. А. Оценка специфического иммунитета против гепатита В у персонала, работающего с кровью / М. А. Моисеева, Н. В. Зубкова. С. В. Зубов // Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера : тез. докл. II науч. конф. с междунар. участием, Новосибирск, 12-15 окт. 2002 г. - Новосибирск, 2002. - С. 43.

25. Зубкова, Н. В. Разработка ИФА-тест-системы для количественного определения анти-HBs в сыворотке крови и препаратах иммуноглобулинов / Н. В. Зубкова, С. В. Зубов, М. А. Моисеева // Ликвидация и элиминация инфекционных болезней — прогресс и проблемы : тез. докл. междунар. конгр., Санкт-Петербург, 4-5 сент. 2003 г. - Санкт-Петербург, 2003. - С. 12-13.

26. Зубкова, Н. В. Проблема вирусной безопасности препаратов из плазмы крови: входной и выходной производственный контроль на маркеры вирусных гепатитов / Н. В. Зубкова, Н. А. Спиридонова, М. А. Моисеева // Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии : материалы Всерос. науч. конф. молодых учен., Уфа, 27 февр. 2004 г. -Уфа, 2004. - С. 238 - 240.

27. Моисеева, М. А. Выявление маркеров парентеральных вирусных гепатитов среди различных групп детей Нижегородской области / М. А. Моисеева, Н. В Зубкова. С. В. Зубов // Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний : материалы конф., посвящ. 75-летию Нижегород. НИИЭМ, 28-29 окт. 2004 г. - Нижний Новгород, 2004. - С. 3843.

28. Моисеева, М. А. Определение антител к поверхностному антигену вируса гепатита В в препаратах иммуноглобулинов / М. А. Моисеева, Н. В. Зубкова // Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии : материалы Всерос. науч. конф. молодых учен., Уфа, 27 февр. 2004 г. - Уфа, 2004. - С. 235-236.

29. Худякова, Н. Е. Разработка иммуноферментной тест-системы для определения суммарных антител к вирусу иммунодефицита 1-го и 2-го типов/ Н. Е. Худякова, С. В. Зубов, Н. В. Зубкова // Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний : материалы конф., посвящ. 75-летию Нижегород. НИИЭМ, 28-29 окт. 2004 г. - Нижний Новгород, 2004. - С. 173-177.

30. Зубкова, Н.В. Определение маркеров гемотрансмиссивных инфекций в препаратах крови/ М. А. Моисеева, Н. В. Зубкова. Н. А. Спиридонова, С. В. Зубов// VI Российская научно-практическая конференция с международным участием «Вирусные гепатиты - проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики» : тез. докл., Москва, 24—26 мая 2005 г. - Москва, 2005 - С. 212-214.

31. Зубкова, Н.В. Определение уровня нейтрализации поверхностного антигена вируса гепатита В специфическими антителами / Н. В. Зубкова, М. А. Моисеева, С. В. Зубов, В. В. Анастасиев // VI Российская научно-практическая конференция с

международным участием «Вирусные гепатиты — проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики» : тез. докл., Москва, 24—26 мая 2005 г. — Москва, 2005. - С. 116-118.

32. Зубов, C.B. Распределение концентрации HBsAg в плазме крови доноров-вирусоносителей / С. В. Зубов, Н. И. Егорова, М. А. Моисеева, Н.В Зубкова. КВ. Кузнецов// VI Российская научно-практическая конференция с международным участием «Вирусные гепатиты - проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики» : тез. докл., Москва, 24—26 мая 2005 г. — Москва, 2005. - С. 118-120.

33. Зубкова, Н. В. Определение антител к вирусу иммунодефицита человека в препаратах иммуноглобулинов / Н. В. Зубкова, С. В. Зубов, М. А. Моисеева// Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 21—22 нояб. 2006 г. — Москва, 2006. — С. 44.

34. Зубкова, Н. В. Распределение концентраций антител к вирусу гепатита А у доноров / Н. В. Зубкова, Н. А. Спиридонова // Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний : материалы конф., посвящ. 85-летию со дня рождения акад. РАМН И. Н. Блохиной. - Нижний Новгород, 2006. - С. 216-217.

35. Зубкова, Н.В. Опыт организации входного контроля отдельных фракций плазмы на ВИЧ и гепатит С / Н. В. Зубкова, Е. В. Филатова, Л. М. Ефремова, С. В. Зубов // Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 21—22 нояб. 2006г.-М., 2006.-С. 113.

36. Зубкова, Н.В. Основы вирусбезопасной технологии производства иммуноглобулиновых препаратов / Н. В.Зубкова, В. В. Апастасиев, Т. В. Короткова, Е. В. Филатова// Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 21-22 нояб. 2006 г. -Москва, 2006. - С.43.

37. Моисеева, М.А. Особенности выявления поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) в пулах плазмы для фракционирования/ М. А. Моисеева, Н. В. Зубкова, В. В. Анастасиев, С. В. Зубов// Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний: материалы конф., посвящ. 85-летию со дня рождения акад. РАМН И. Н. Блохиной — Нижний Новгород, 2006. - С. 197-198.

38. Зубкова, Н. В. Эффективность элиминации вирусов при использовании фильтров CUNO ZETA PLUS серии VR в технологии производства препаратов из плазмы крови / Н. В. Зубкова, М. Ю. Фирсова // VII Российская научно-практическая конференция с международным участием «Вирусные гепатиты — эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика» : тез. докл., Москва, 29—31 мая 2007 г. - Москва, 2007. - С. 31-32.

39. Зубкова, Н.В. Распределение РНК вируса гепатита С при фракционировании инфицированной плазмы/ Н. В. Зубкова, Е. В. Филатова, Л. М. Ефремова, С. В. Зубов// VII Российская научно-практическая конференция с международным

участием «Вирусные гепатиты - эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика» : тез. докл., Москва, 29-31 мая 2007 г. - Москва, 2007 - С. 30-31.

40. Филатова, Е. В. Параллельное скринирование минипулов плазмы для фракционирования методом ИФА и ПЦР на маркеры вирусного гепатита С / Е. В. Филатова, Н. В. Зубков а // VII Российская научно-практическая конференция с международным участием «Вирусные гепатиты - эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика» : тез. докл., Москва, 29-31 мая 2007 г. - Москва, 2007. -С. 74-75.

41. Зубкова, Н.В. Влияние химических вирусинактивирующих реагентов на свойства препаратов внутривенного иммуноглобулина / Н. В. Зубкова, М. Ю. Фирсова, Н. Е. Худякова, О. В. Миловидова // Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 11-12 нояб. 2008 г. - Москва, 2008. - С. 56.

42. Худякова, Н.Е. Микрометод для определения показателя цветности в плазме для фракционирования / Н. Е. Худякова, Е. Н. Шарапова, С. В. Зубов, Н. В. Зубкова // Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 11-12 нояб. 2008 г. - Москва, 2008. -С. 121.

43. Филатова, Е. В. Выбор оптимальных диагностических подходов для контроля плазмы на маркеры вируса гепатита С / Е. В. Филатова, Н. В. Зубкова. М. А. Моисеева // Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 11—12 нояб. 2008 г. - Москва, 2008. - С. 119.

44. Зубкова, Н. В. Использование in vivo модели инфекции вируса гепатита В уток для оценки эффективности инактивации вирусов при сольвент-детергентной обработке иммуноглобулинов / Н. В. Зубкова, К. К. Кюрегян // VIII Российская научно-практическая конференция с международным участием «Вирусные гепатиты - эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика» : тез. докл., Москва, 26-28 мая 2009 г. - Москва, 2009. - С. 41.

45. Моисеева, М.А. Содержание антител к поверхностному антигену вируса гепатита В в препаратах иммуноглобулинов для внутривенного введения / М. А. Моисеева, Е. В. Филатова, Н. В. Зубкова. С. В. Зубов// VIII Российская научно-практическая конференция с международным участием «Вирусные гепатиты -эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика» : тез. докл., Москва, 26-28 мая 2009 г. - Москва, 2009. - С. 17.

46. Анастасиев, В.В. Разработка нового отечественного иммуноглобулина для внутривенного введения с сольвент-детергентной стадией инактивации вирусов / В. В. Анастасиев, Т. В. Короткова, Н. В. Зубкова. И. П. Мулина, О. В. Миловидова, Л. М. Ефремова, Е. В. Евдокимова // Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения : материалы .юбилейн. Всерос. науч.-практ. конф., посвящ.. 90-летию Нижегородского НИИЭМ им. И. Н. Блохиной Роспотребнадзора и 20-летию Приволжского окруж. центра по профилактике и борьбе со СПИД, 15-17 июня 2009 г. - Нижний Новгород, 2009 г. - С. 326-329.

47. Зубкова, H.B. Химические методы инактивации вирусов в препаратах иммуноглобулинов / Н. В. Зубкова, М. Ю. Фирсова, Н. Е. Худякова, Т. Б. Змачинская, С. А. Гальговская., К. К. Кюрегян // Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения : материалы юбилейн. Всерос. науч,-практ. конф., посвящ. 90-летию Нижегород. НИИЭМ им. И. Н. Блохиной Роспотребнадзора и 20-летию Приволжского окруж. центра по профилактике и борьбе со СПИД, 15-17 июня 2009 г. - Нижний Новгород, 2009. - С. 349-352.

48. Зубкова, Н. В. Обеспечение вирусной безопасности препаратов из плазмы крови человека // Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины : материалы Всерос. науч.-практ. конф., посвящ. 50-летию ФГУ «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови ФМБА России» : тез. докл., Киров, 6-7 окт. 2010 г. - Киров, 2010. - С. 120-121.

49. Филатова, Е. В. Результаты тестирования сыворотки крови доноров на ДНК парвовируса В19 / Е. В. Филатова, Н. В. Зубкова // Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины : материалы Всероссийской научно-практической конф., посвящ. 50-летию ФГУ «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови ФМБА России» : тез. докл., Киров, 6-7 окт. 2010 г. - Киров, 2010. - С. 96-97.

50. Зубкова, Н.В. Валидация вирусинактивирующих технологий с помощью in vivo модели инфекции вируса гепатита В уток (ВГВУ) / Н. В. Зубкова, М. Ю. Фирсова, О. В. Миловидова, К. К. Кюрегян, И. В. Красильников, А. К. Лобастова // Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2010. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 9-10 нояб. 2010г.-Москва, 2010.-С. 51.

51. Короткова, Т.В. Разработка концентрированных форм вирусбезопасных препаратов иммуноглобулинов / Т. В. Короткова, В. В. Анастасиев, С. А. Гальговская, Н. В. Зубкова // Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2010. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 9-10 нояб. 2010 г. - Москва, 2010. - С. 60.

52. Филатова, Е В. Организация входного контроля на вирусную безопасность сырья для производства лечебных препаратов из плазмы крови доноров / Е. В. Филатова, Н. В. Зубкова И. С. Горлова, Н. А. Спиридонова, А. В. Казьянин, А. Б. Перевозчиков , Р. А. Волкова, М. С. Воробьева, Л. К. Лаптева, Н. В. Шалунова// Молекулярная диагностика-2010 : сб. тр. VII Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием, Москва 24—26 нояб. 2010 г. — Москва, 2010. — Т. 5,— С. 105-106.

53. Зубкова, Н.В. Особенности выявления маркеров вируса гепатита В в плазме крови инфицированных доноров/ Н. В. Зубкова, М. А. Моисеева, С. В. Зубов, Е. В. Филатова // Молекулярная диагностика-2010 : сб. тр. VII Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием, Москва 24—26 нояб. 2010 г. — М. 2010. — Т. 1. — С. 332— 335.

54. Волкова, P.A. Разработка лиофилизированной формы стандартного образца содержания РНК вируса гепатита С/ Р. А. Волкова, Е. В. Эльберт, В. Г. Петухов, Н. В. Шалунова, Н. В. Зубкова. Е. В. Филатова, Е. В. Силин // Молекулярная

диагностика-2010 : сб. тр. VII Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием, Москва 24-26 нояб. 2010 г. - Москва, 2010. - Т. 4. - С. 356-357.

55. Филатова, Е. В. Оценка частоты контаминации производственных пулов плазмы для фракционирования парвовирусом В19/ Е. В. Филатова, Н. В. Зубкова // Молекулярная диагностика-2010 : сб. тр. VII Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием, Москва 24-26 нояб. 2010 г. - Москва, 2010. - Т. 1. -С. 353-355.

56. Зубкова, Н.В. Валидация техпологических стадий по элиминации и инактивации вирусов при производстве внутривенного иммуноглобулина G человека / Н. В. Зубкова, И. В. Красильников, А. К. Лобастова, А. В. Казьянин, Л. К. Лаптева, К. К. Кюрегян, Т. И. Глотова// Материалы Международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии», Москва, 22-24 марта 2012 г. - Москва, 2012. - С. 31-34.

57. Zubkova, N. V. The use of the method of polimerase chain reaction for an estimation of efficacy of virus inactivation in model experiment / N. V. Zubkova, V. N. Mazepa, K. A. Orlova // Russian Journal of HIV/AIDS and Related Problems. - 2000. - Vol. 4, №1. -P. 175.

58. Zubkova, N. V. Anti-HBs content in the intravenous Immunoglobulin preparation at different viruses inactivation methods / N. V. Zubkova, M. A. Moiseyeva // Russian Journal of HIV/AIDS and Related Problems. - 2002. - Vol. 6, № 1. - C. 189.

Зубкова Наталия Васильевна (Россия)

Биотехнологические аспекты вирусной безопасности препаратов иммуноглобулинов: методология, производство, стандартизация

Работа посвящена актуальной проблеме — повышению вирусной безопасности препаратов иммуноглобулинов и охватывает все ее аспекты: обеспечение безопасности плазмы для фракционирования, стандартизацию исследований на маркеры гемотрансмиссивпых вирусов, разработку современных технологий производства и их валидацию, контроль качества готовых лекарственных форм. На основании изучения закономерностей выявления серологических и молекулярно-генетических маркеров в индивидуальных допациях и пулах плазмы разработан научно-обоснованный алгоритм входного контроля плазмы для фракционирования, обеспечивающий безопасность производственных пулов плазмы на уровне международных стандартов. Разработана современная технология производства препаратов иммуноглобулина человека для внутривенного введения, включающая валидированные стадии инактивации вирусов. Доказано, что препараты, полученные по этой технологии, превосходят по ряду показателей качества препараты иммуноглобулина, полученные по традиционной технологии с использованием гидролитических ферментов. Разработаны рекомендации и диагностические наборы для контроля вирусной безопасности готовых препаратов.

Biotcchnological aspects of virus safety of immunoglobulin preparations: methodology, production, standardization

This work is devoted to the relevant issue - to increase viral safety of immunoglobulin preparations and it covers all aspects of it: providing of plasma safety for fractionation, standardization of researches on markers of blood-borne viruses, development of modern production technologies and their validation, quality control of the finished products. The effective and scientifically-proved algorithm of plasma control for fractionation is developed by results of studying of the patterns of serological and molecular-genetic markers identification in individual donations and plasma pools. It provides safety of manufacturing plasma pools according to the international standards. The modern technology is developed to produce the intravenous human immunoglobulin preparation including additional stages of viruses' inactivation which efficiency has been confirmed experimentally. It is proved that the preparations obtained by this technology are superior in some indicators of quality to immunoglobulin preparations obtained by the traditional technology with the enzymatic digestion. Recommendations and diagnostic kits for the control of viral safety of the immunoglobulin medicines have been developed.

Автор выражает признательность и благодарность за сотрудничество, и помощь в работе заместителю директора по науке "Пермское НПО "Биомед" д.б.н., профессору Николаевой A.M.; д.б.н., профессору Красильникову И.В.; заместителю начальника управления науки и инновационного развития ФГУП «НПО «Микроген» Минздравсоцразвития России Лобастовой А.К; директору Нижегородского филиала ФГУП НПО «Микроген» Минздравсоцразвития России Полякову В.И., а также сотрудникам филиала: заместителю директора по науке д.б.н., профессору Апастасиеву В В., начальнику цеха гамма-глобулипов, к.м.н. Коротковой Т В., начальнику отделения НВ-диагностикумов Зубову C.B., ведущим специалистам цеха гамма-глобулинов и цеха диагностических препаратов; директору ООО «Биометрика» Силину Е.В.; директору «ИПВЭ им. М.П.Чумакова» РАМН д.м.п., профессору Михайлову М.И., заведующей лабораторией вирусологии, д.б.н., профессору Глотовой Т.И.

Список сокращений

CI - confidence interval (доверительный интервал)

GMP - стандарт Good Manufacturing Practice (надлежащая производственная практика) HLTV 1.2- Т-лимфортопный вирус I и 2 типа (Т-клеточного лейкоза) HBsAg - поверхностный антиген вируса гепатита В

В19 V - парвовирус В19

ГО50 - средняя инфицирующая доза, которая

вызывает развитие болезни у 50% зараженных

экспериментальных животных

IgG - иммуноглобулин человека класса G

IgA - иммуноглобулин человека класса А IgM - иммуноглобулин человека класса М Анти-ВГА - антитела к вирусу гепатита А Анти-ВГС- антитела к вирусу гепатита С Анти-НИЧ! ,2 — антитела к вирусу иммунодефицита человека 1 и 2 типов Анти-HBs - антитела к HBsAg Анти-НВс — антитела к ядерному антиген}' вируса гепатита В

ВВД-БС КРС - возбудитель вирусной диареи -болезни слизистых крупного рогатого скота ВГВ - вирус гепатита В

ВГВУ - вирус гепатита В утят

ВГС - вирус гепатита С

ВЗН - вирус лихорадки Западного Нила

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека

ДНК - дезоксирибонулеиновая кислота

ИФА - иммуноферментный анализ

КП - коэффициент позитивности МЕ - Международная единица

МСО - Международный стандартный образец

НД - нормативный документ

НК- нуклеиновая кислота

ОП - оптическая плотность

ОСО - отраслевой стандартный образец

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота СД - сольвент-детергентный

ТЕФ - три-п-бутилфосфат

ТЦД5о/мл - тканевая цитопатогенная доза для 50% зараженных клеток ФСП- фармакопейная статья предприятия

Печать: типография ЗАО «Нижегородская Радиолаборатория», Н. Новгород, ул. Б. Покровская, 60-46. ИНН 5260946720 Заказ №83335/1 от 29.10.2012 г. Тираж 100 экз.

Актуальность проблемы. Плазма крови человека является источником более 100 различных белков и биологически активных соединений, часть которых получают промышленным способом и используют в качестве лечебных препаратов для профилактики и лечения широкого спектра заболеваний [285]. Глобальный рынок лекарственных препаратов из плазмы крови доноров за период с 2000 года увеличился в 2 раза и имеет постоянную тенденцию к росту. При этом производство препаратов иммуноглобулинов обеспечивает более 50% данного сегмента рынка и является движущей силой фракционирования плазмы крови в целом [263].

Потребность в препаратах иммуноглобулинов, особенно для внутривенного введения, постоянно растет. В России она удовлетворена только на 5-15%, а обеспеченность страны препаратами из плазмы крови доноров обычно рассматривается с позиций экономического развития и мобилизационной готовности страны [46]. Поэтому усовершенствование технологии производства отечественных препаратов иммуноглобулинов и более полное удовлетворение в них потребности здравоохранения - это государственная проблема национальной безопасности и актуальность ее не вызывает сомнения.

Основным сырьем для получения препаратов иммуноглобулинов является плазма для фракционирования, представляющая собой жидкую часть крови из индивидуальных порций, отделенную от форменных элементов центрифугированием или методом плазмафереза в присутствии антикоагулянта, полученную от здоровых доноров, и предназначенную для объединения в производственный пул [4; 269]. Являясь уникальной биологической субстанцией - живой тканью человеческого организма, плазма крови доноров может содержать различные инфекционные агенты, наиболее опасными из которых признаны бактерии и вирусы. В ходе технологической переработки бактериальное загрязнение легко устраняется, а вирусы, относящиеся к наноструктурам, могут оставаться в полупродуктах и проникать в готовые препараты.

В последние годы ухудшение эпидемической ситуации в отношении основных гемотрансмиссивных вирусов, появление новых инфекционных агентов обострили проблему вирусной безопасности препаратов из плазмы крови доноров [26; 29; 34; 46]. Случаи инфицирования пациентов вирусом гепатита С (ВГС) после применения препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения привели к активизации исследований, направленных на разработку новых методологических и технологических подходов к повышению вирусной безопасности препаратов [84; 86; 89; 92; 97; 98; 115; 131; 143; 149; 212; 215; 232; 240; 252]. В Европе, США и других развитых странах мира под руководством Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) были разработаны и приняты к исполнению национальные директивы в области безопасности гемотрансфузий и производства препаратов из плазмы крови доноров [55; 261; 264; 265; 266; 273; 270; 284; 285].

В России нормативная база, регламентирующая работу в этой области, несовершенна и противоречива. Несмотря на то, что на технологическую переработку поступает плазма крови доноров, разрешенная для использования в лечебно-профилактических учреждениях, риск получения инфицированных донаций существует [34]. При этом производство лечебных препаратов ориентировано, главным образом, на метод спиртового фракционирования по Кону, а дополнительные стадии инактивации вирусов не используются или используются устаревшие технологии. Не разработаны также методы валидации вирусинактивирующих стадий, при этом главный упор делается на контроль готовых лекарственных форм, хотя диагностические наборы, предназначенные для этой цели, отсутствуют.

Комплексные исследования в этой области позволят повысить безопасность отечественных препаратов иммуноглобулинов, привести их качество в соответствие с рекомендациями ВОЗ и повысить конкурентоспособность на рынке лекарственных средств.

Цель работы - разработка методологической базы и технологических подходов к обеспечению вирусной безопасности препаратов иммуноглобулинов.

Задачи исследования:

1. Определить закономерности выявления серологических и молекулярно-генетических маркеров гемотрансмиссивных вирусов в индивидуальных образцах и пулах плазмы крови доноров и разработать научно-обоснованный алгоритм входного контроля безопасности сырья на предприятиях по фракционированию плазмы крови доноров.

2. На примере стандартного образца содержания РНК ВГС разработать методологию создания стандартных образцов содержания нуклеиновых кислот (НК) гемотрансмиссивных вирусов, необходимых для контроля качества генамплификационных методов исследования.

3. Создать современную вирусбезопасную технологию производства иммуноглобулина в (1§0) человека для внутривенного введения.

4. Разработать методологические основы валидации вирусинактивирующих и вирусэлиминирующих технологий.

5. Разработать рекомендации по контролю вирусной безопасности готовых лекарственных форм препаратов иммуноглобулинов.

Научная новизна работы. Впервые применен комплексный подход к проблеме обеспечения вирусной безопасности препаратов иммуноглобулинов, включающий определение требований к качеству сырья, разработку современных технологий производства, валидацию методов вирусной инактивации и усовершенствование методов контроля готовых препаратов.

Изучено распределение вирусной нагрузки и коэффициентов позитивности (КП) антител в плазме крови доноров, инфицированных ВГС и вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), а также распределение концентраций поверхностного антигена (НВбА§) вируса гепатита В (ВГВ) и ДНК ВГВ у доноров-вирусоносителей. Продемонстрировано отсутствие корреляции между активностью антител к ВГС (анти-ВГС) и концентрацией

РНК ВГС, активностью антител к ВИЧ (анти-ВИЧ1,2) и концентрацией РНК ВИЧ, а также концентрацией поверхностного антигена ВГВ (HBsAg) и ДНК вируса гепатита В (ВГВ).

Выявлен высокий уровень распространенности парвовируса В19 (В 19 V) в популяции доноров и установлена вероятность контаминации этим вирусом производственных пулов плазмы.

Создана вирусбезопасная технология производства препаратов иммуноглобулина G человека, включающая стадию удаления вирусов с помощью гидроксида алюминия и сольвент-детергентную (СД) обработку с использованием три-п-бутилфосфата (ТБФ) и натрия холата. Оптимизированы условия СД-обработки, разработан оригинальный способ очистки от вирусинактивирующих реагентов. Научная новизна исследований подтверждена патентами на изобретение (RU 2192279 и RU 2352358).

Экспериментально подтверждена вирулицидная активность каприлата натрия и разработана перспективная технология производства иммуноглобулина с его использованием.

Впервые для инактивации вирусов использованы алкилирующие соединения (карбоплатин, хлорамбуцил), воздействующие непосредственно на вирусный геном. На примере хлорамбуцила продемонстрировано усиление вирулицидного действия при использовании его с реагентами, разрыхляющими оболочку вирусов.

Теоретическая и практическая значимость работы. Разработана универсальная методика аттестации стандартных образцов содержания НК, основанная на параллельном тестировании Международного стандартного образца (МСО) и исследуемого препарата с последующей статистической обработкой данных методом параллельных линий, реализованным в виде программного модуля в среде Microsoft Excel. Разработан и утвержден отраслевой стандартный образец содержания РНК ВГС (ОСО РЖ ВГС) 4228-366 (1)-11(П).

Разработаны методы определения ТБФ и натрия холата в препаратах иммуноглобулинов и обоснованы предельно допустимые нормы их остаточного содержания. Технология СД-обработки унифицирована и рекомендована для внедрения в процесс производства нормальных и специфических иммуноглобулинов для внутримышечного и внутривенного введения.

Разработана методология валидации вирусэлиминирующих и вирусинактивирующих технологий с использованием модельных гемотрансмиссивных вирусов, включающая контаминацию объекта исследования, моделирование технологического процесса с адекватным масштабированием, определение концентрации вирусов по стадиям производства. Установлен суммарный уровень редукции ВГС и В19 V при спиртовом фракционировании вируссодержащей плазмы. Подтверждена эффективность СД-обработки в опытах с вирусом гепатита В утят (ВГВУ) и возбудителем вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота (ВВД-БС КРС).

Экспериментально доказана нецелесообразность тестирования иммуноглобулинов на наличие НВзА§ по причине иммунной нейтрализации последнего избытком специфических антител. В нормативной документации (НД) на препараты иммуноглобулинов рекомендовано тест на НВзА£ заменить на определение антител к поверхностному антигену ВГВ (анти-НВБ), при этом обоснована целесообразность повышения минимально допустимого уровня концентрации последних с 0,5 до 5 Международных единиц (МЕ) на 1 г иммуноглобулина.

Для количественного определения анти-НВэ разработана оригинальная технология изготовления иммуноферментной тест-системы «МикрАт-НВв» с использованием HBsAg, полученного из плазмы крови вирусоносителей (патент БШ 2290642).

Внедрение результатов работы. Разработаны и утверждены приказом №59-ОД от 21.07.2011 ФГБУ «ГИСК им. Л.А. Тарасевича»

Минсоцздравразвития России Методические рекомендации «Порядок проведения входного контроля на вирусную безопасность сырья для производства препаратов из плазмы крови доноров». Процедура контроля плазмы для фракционирования, включающая формирование минипулов плазмы и тестирование их методами иммуноферментного анализа (ИФА) и полимеразной цепной реакции (ПЦР) на маркеры ВГВ, ВГС и ВИЧ, внедрена в практику в Нижегородском и Пермском филиалах ФГУП «НПО «Микроген» Минздравсоцразвития России (акт внедрения от 01.12.2011; акт внедрения от 19.08.2011) и утверждена в регламентах производства на лекарственные средства, получаемые из плазмы крови доноров (ПР № 01898718-10-09; ПР № 01898718-27-08; ПР № 01898718-28-11).

Технология СД-обработки иммуноглобулинов внедрена в Нижегородском и Пермском филиалах ФГУП «НПО «Микроген» Минздравсоцразвития России (акт внедрения от 18.08.2010; акт внедрения от 21.05.2010). Утверждена в установленном порядке НД на «Имбиоглобулин» (Иммуноглобулин человека нормальный, раствор для инфузий, 50 мг/мл/ ЛС-000177). Стадия удаления вирусов с помощью гидроксида алюминия и СД-обработка включены в промышленный регламент производства (ПР № 01898718-28-11).

ОСО РНК ВГС 42-28-366 (1)-11(П) используется в учреждениях практического здравоохранения для оценки качества коммерческих диагностических наборов для выявления и количественного определения РНК ВГС (Акты внедрения «Сургутский центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями» от 16.11.2011 №2703, Сургут, Тюменской области; Бюджетное учреждение Чувашской Республики «Республиканский центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями» от 28.08.2012 №01-10/379, Чебоксары; ФГБУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. Н.П. Чумакова» от 03.10.2012 №1132).

Разработаны технические условия, промышленные регламенты и получены регистрационные документы на производство и реализацию следующих диагностических препаратов:

1. Набор реагентов «МикрАт-НВБ» Тест-система иммуноферментная для определения антител к поверхностному антигену к вируса гепатита В / ФСР 2009/05914 от 07.07.2009.

2. Набор реагентов «ИФА-анти-ВГС» Тест-система иммуноферментная для выявления антител к вирусу гепатита С / ФСР 2009/05264 от 24.03.2009.

3. Набор реагентов «СПЕКТР-4» Тест-система иммуноферментная для подтверждения положительных результатов при выявлении антител к вирусу гепатита С / ФСР 2009/05263 от 24.03.2009.

4. Набор реагентов «ИФА-НВзА£» Тест-система иммуноферментная для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В / ФСР 2000/05265 от 15.03.2010.

Разработанные диагностические наборы используются в практическом здравоохранении.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Входной контроль вирусной безопасности плазмы для фракционирования обеспечивает снижение риска вирусной контаминации сырья для изготовления лечебных препаратов крови.

2. Аттестованные стандартные образцы содержания НК гемотрансмиссивных вирусов предназначены для стандартизации генамплификационных методов исследования и ратификации требований к вирусной безопасности плазмы для фракционирования.

3. Технология производства препаратов иммуноглобулинов, включающая дополнительные стадии инактивации вирусов (обработка сольвент-детергентом или каприлатом натрия), обеспечивает получение безопасных препаратов, соответствующих по физико-химическим и биологическим показателям качества требованиям отечественных нормативных документов (НД) и Европейской фармакопее.

4. Валидация технологических стадий инактивации и элиминации вирусов подтверждает адекватность технологических режимов и гарантирует безопасность готовых препаратов.

5. Состав и биологические свойства иммуноглобулинов определяют специфику контроля готовых лекарственных форм на маркеры гемотрансмиссивных вирусов.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа соответствует основным направлениям научных исследований ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздравсоцразвития России (номер государственной регистрации темы: 01.9.50.007426) и ФГУП НПО «Микроген» Минздравсоцразвития России.

Апробация работы. Материалы и положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на Международном конгрессе «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы», С.-Петербург, 2003; на Российской научно-практической конференции с международным участием «Вирусные гепатиты - проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики», Москва 2005, 2007, 2009; на Всероссийской конференции по вакцинологии «Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 2006, 2008, 2010; на VII Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярная диагностика», Москва, 2010; на Всероссийских научно-практических конференциях в Уфе, 2004, Нижнем Новгороде, 2006, Кирове, 2010; на Международном конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития», Москва, 2012.

Личный вклад автора и взаимодействие с другими организациями. Все приведенные в диссертации данные были получены под руководством и при личном участии автора на базе Нижегородского филиала ФГУП НПО «Микроген» Минздравсоцразвития России. На базе Пермского филиала ФГУП НПО «Микроген» Минздравсоцразвития России с участием автора выполнены работы по внедрению генамплификационного тестирования минипулов плазмы для фракционирования и масштабированию технологии производства «Имбиоглобулина». Исследования по валидации вирусинактивирующих технологий выполнены по разработанным автором программам на базе ФГБУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. Н.П. Чумакова» РАМН и ГНУ «Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока» Россельхозакадемии. Методы определения остаточного содержания ТБФ и натрия холата разработаны при личном участии автора на базе НИИ молекулярной медицины Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 54 научные работы, в том числе 12 в изданиях, рекомендованных ВАК, получено 3 патента РФ, разработаны и утверждены Методические рекомендации.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 220 страницах машинописного текста и состоит из общей характеристики работы, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и приложений. Работа иллюстрирована 39 таблицами, 29 рисунками. Библиография включает 287 источников, в том числе 71 -отечественный, 216 - зарубежные.

выводы

1. На основании изучения закономерностей выявления серологических и молекулярно-генетических маркеров гемотрансмиссивых вирусов в индивидуальных донациях и пулах плазмы разработан научно-обоснованный алгоритм входного контроля безопасности сырья на предприятиях по переработке плазмы крови доноров, гарантирующий безопасность производственных пулов плазмы. Утверждены Методические рекомендации «Порядок проведения входного контроля на вирусную безопасность сырья для производства препаратов из плазмы крови доноров», в которых регламентирована процедура минипулирования плазмы, позволяющая идентифицировать каждую инфицированную донацию, установлен максимальный размер минипулов и требования к обеспечению качества исследований. Разработанный алгоритм контроля вирусной безопасности сырья внедрен в Нижегородском и Пермском филиалах ФГУП «НПО Микроген» Минздравсоцразвития России.

2. Разработан и утвержден Отраслевой стандартный образец содержания РНК ВГС (ОСО 42-28-366(1)-11П). Разработана методология аттестации стандартных образцов содержания НК вирусов относительно Международных стандартов, основанная на статистической обработке данных с помощью метода параллельных линий. В программе Microsoft Excel создан модуль для выполнения расчетов.

3. Разработан и внедрен в производство препарат иммуноглобулина человека для внутривенного введения нового поколения, инактивированный сольвент-детергентным методом, по показателям качества и безопасности соответствующий требованиям отечественных НД и Европейской фармакопеи. Разработана и утверждена в установленном порядке НД на «Имбиоглобулин» (Иммуноглобулин человека нормальный, раствор для инфузий, 50 мг/мл/ЛС-000177).

4. Создана перспективная технология производства иммуноглобулина человека для внутривенного введения с применением каприлата натрия, вирулицидная активность которого в концентрации более 10 ммоль подтверждена экспериментально. Для усиления вирулицидного эффекта предложено совмещать обработку каприлатом натрия и сольвент-детергентом в одном технологическом цикле.

5. Разработана методология валидации технологических стадий инактивации и элиминации вирусов. Эффективность элиминации вирусов рекомендуется определять с использованием метода ПЦР с количественной детекцией результатов, эффективность инактивации вирусов - в опытах in vivo на восприимчивых животных или в опытах in vitro на культурах клеток.

6. Экспериментально доказана нецелесообразность обязательного тестирования иммуноглобулинов на содержание HBsAg по причине иммунной нейтрализации антигена специфическими антителами.

7. Для количественного определения анти-HBs в сыворотке/плазме крови и препаратах иммуноглобулинов разработана и внедрена в производство иммуноферментная тест-система «МикрАт-HBs», защищенная патентом РФ ФСР 2009/05914 от 07.07.2009). Разработана и внедрена в производство тест-система «ИФА-анти-ВГС», валидированная для исследования препаратов крови, включая иммуноглобулины (ФСР 2009/05264 от 24.03.2009).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Рекомендовать включить парвовирус В19 в перечень актуальных для РФ вирусных инфекций и внедрить скрининговое исследование донорской плазмы с целью исключения донаций с высокой концентрацией ДНК В19 V.

2. При регистрации новых препаратов из плазмы крови доноров и при внесении изменений в действующие технологические процессы в обязательном порядке подтверждать экспериментально и документировать эффективность технологических стадий удаления и инактивации вирусов.

3. Исключить тест на HBsAg в нормативной документации на препараты иммуноглобулинов и заменить его на определение антител к HBsAg. Обоснована целесообразность повышения минимально допустимого уровня анти-HBs с 0,5 до 5 МЕ/г иммуноглобулина.