Интерлейкин-18: биологические эффекты и перспективы клинического применения.

Якушенко, Елена Владимировна

Диссертации по медицине → Клиническая иммунология, аллергология

Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Интерлейкин-18: биологические эффекты и перспективы клинического применения.

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Якушенко, Елена Владимировна Новосибирск 2012 г.

Ученая степень: доктора медицинских наук

ВАК РФ: 14.03.09

Автореферат диссертации по медицине на тему Интерлейкин-18: биологические эффекты и перспективы клинического применения.

005008567

ЯКУШЕНКО Елена Владимировна

ИНТЕРЛЕЙКИН-18: БИОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ КЛИНИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

1 9 ЯНВ 2012

Новосибирск - 2011

005008567

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Сергей Витальевич Сенников

Владимир Сергеевич Кожевников Юрий Геннадьевич Суховей Иван Генрихович Козлов

Ведущее учреждение:

Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт фармакологии Сибирского отделения РАМН

Защита состоится «¿9» 2012г. в 1400 часов на заседании

диссертационного совета Д 001.001.01 в НИИ клинической иммунологии СО РАМН по адресу: 630099 г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ клинической иммунологии СО РАМН по адресу: 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14.

Автореферат разослан «¿£» декабря 2011г.

И.о. ученого секретаря диссертационного совета доктор медицинских наук

¿//«¿V"

Колесникова О.П.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Цитокины, будучи эндогенными иммуномодуляторами, имеют универсальное значение в регуляции практически всех систем организма. По сравнению с экзогенными модуляторами (химического, бактериального или растительного происхождения) цитокины оказывают свои эффекты через специфические рецепторы и являются естественными регуляторами функциональной активности различных типов клеток. Эти свойства обусловливают перспективы применения цитокинов в лечении и профилактике различных иммунопатологических заболеваний, а также для генерации различных типов клеток при проведении клеточной иммунотерапии. В настоящее время в клинической практике используется целый ряд лекарственных препаратов на основе цитокинов (ИФНа, ФНО, ИЛ-1, ИЛ-2, ГМ-КСФ, Г-КСФ и т.д.). Вместе с тем, побочные эффекты цитокинов, связанные с плейотропным характером их действия и экспрессией рецепторов на многих типах клеток отчасти ограничивают широкое внедрение указанных молекул в клиническую практику и диктуют необходимость всестороннего изучения биологических эффектов цитокинов.

Интерлейкин-18 (ИЛ-18) в ряду иммунорегуляторных медиаторов занимает особое положение, так как является одним из ключевых цитокинов, вовлеченных в формирование врожденного и приобретенного иммунного ответа. Обладая способностью стимулировать продукцию ИФН-у, ГМ-КСФ [Dinarello С.A. et al., 1999; Udagawa N. et.al., 1997], ФНО [Fehniger T.A. et al„ 1999; Moller B. et al., 2001], ИЛ-1 [Puren A.J., 1998], ИЛ-2 [Kohno K„ 1997], молекул адгезии [Merendino R.A. et al. 2003; Wang J. et al., 2001] и факторов апоптоза Fas/FasL [Golab J., 2000], ИЛ-18 участвует в активации цитотоксических Т-лимфоцитов, НК-клеток, макрофагов, дендритных клеток и способствует формированию эффективного противоинфекционного и противоопухолевого иммунного ответа [Jablonska Е. et al., 2006; Kito T. et al., 2003; Ueno N. et al., 2005].

Способность ИЛ-18 активировать клеточный иммунитет обосновывает значительный интерес к данному цитокину в качестве потенциального индуктора протективного иммунитета при онкологических и инфекционных процессах (вирусной и бактериальной природы). Действительно, многие заболевания сопровождаются снижением продукции иммунорегуляторных цитокинов и в частности ИЛ-18 [Vankayalapati R. et al., 2000]. Важно отметить, что в функционально-активных участках промотора гена ИЛ-18 обнаружено несколько одиночных нуклеотидных полиморфизмов, которые могут влиять на продукцию ИЛ-18. Поэтому уровень продукции ИЛ-18 может быть обусловлен генетическими механизмами. Важную роль в регуляции ИЛ-18 играет также блокатор ИЛ-18 - ИЛ-18 связывающий белок (ИЛ-18СБ), представляющий собой физиологическую ловушку-рецептор. ИЛ-18СБ может являться перспективным фактором для отмены нежелательных действий ИЛ-18, поскольку нейтрализует его эффекторные функции [Novick D. et al., 1999].

(ч

Учитывая перспективность клинического применения ИЛ-18 в лечении онкологических и инфекционных заболеваний, создание препаратов на основе ИЛ-18 и их тестирование является важной научно-практической задачей. Наиболее распространенными продуцентами, используемыми для получения генноинженерных форм цитокинов являются клетки бактерий, дрожжей и млекопитающих. По сравнению с вышеупомянутыми системами экспрессии, растения, как продуценты иммунорегуляторных белков, имеют ряд преимуществ: гликозилирование и фолдинг белков схож с таковыми в клетках млекопитающих, культивирование растений не требует дорогостоящего оборудования, а сельскохозяйственные масштабы продукции гарантируют доступность рекомбинантного препарата. Однако сведения о биологических эффектах цитокинов и, в частности ИЛ-18, продуцируемых трансгенными растениями, практически отсутствуют.

Данные о значительной роли ИЛ-18 в регуляции большого числа иммунных реакций позволяют предположить, что ИЛ-18 и ИЛ-18СБ займут свое достойное место в арсенале препаратов для борьбы с множеством патологических состояний человека. Поэтому исследование биологических эффектов и механизмов действия рекомбинантного ИЛ-18, получаемого из различных источников (бактериальные и растительные продуценты) представляется чрезвычайно актуальным. При этом, учитывая особенности эффектов ИЛ-18, одним из востребованных направлений является разработка протоколов и схем использования этого белка не только в клинической практике, но и для регуляции функциональной активности клеток иммунной системы in vitro, что может быть успешно использовано при создании новых клеточных технологий. Поскольку имеются данные об эффективности перорального введения антигенов и цитокинов и использованию трансгенных растений, нам также представлялось актуальным оценить эффекты перорального применения трансгенного растения Daucus carota L., несущего ген ИЛ-18 человека.

В связи с вышесказанным была сформулирована цель работы: изучить биологические эффекты ИЛ-18 in vitro и на экспериментальных моделях животных in vivo, эффективность его использования в клеточных технологиях, а также при пероральном применении в составе трансгенных растений. В рамках поставленной цели решались следующие задачи:

1. Охарактеризовать иммунохимическую и биологическую активность рекомбинантного человеческого ИЛ-18, полученного по оригинальной методике, в реакции иммуноанализа, по способности стимулировать продукцию ИФН-у, ФИО мононуклеарными клетками in vitro и реакцию гиперчувствительности замедленного типа in vivo.

2. Охарактеризовать иммунохимическую и биологическую активность рекомбинантного ИЛ-18 связывающего белка, полученного по оригинальной методике, в реакции иммуноанализа, по способности отменять специфические эффекты эндогенного и рчИЛ-18 в

экспериментах in vitro и в модели ЛПС-индуцированной летальности экспериментальных животных in vivo.

3. Изучить противоопухолевую активность рекомбинантных ИЛ-18 и ИЛ-18 связывающего белка в экспериментальных моделях перевиваемых опухолей (ортотопической солидной и гематогенной меланомы В16) у мышей.

4. Изучить ассоциированность аллельного полиморфизма промотора гена ИЛ-18 в позициях -607 и - 137 с уровнем его продукции мононуклеарными клетками периферической крови человека.

5. Изучить частоту встречаемости аллельных вариантов в промоторе гена ИЛ-18 в позициях -607 и - 137 в мононуклеарных клетках здоровых доноров и больных вирусным гепатитом В.

6. Изучить эффективность использования рИЛ-18 для индукции специфического иммунного ответа в культуре мононуклеарных клеток в присутствии дендритных клеток, нагруженных антигенами вируса гепатита В и М. tuberculosis.

7. Изучить биологические эффекты модифицированной по гену ИЛ-18 моркови Daucus carota L. в экспериментальных моделях на мышах при пероральном применении.

Научная новизна.

Впервые установлено, что блокирование ИЛ-18 с помощью ИЛ-18 связывающего белка полностью ингибирует продукцию ФНО КонА-стимулированными мононуклеарами человека (МНК). Установлено, что ИЛ-18 при введении in vivo оказывает разнонаправленный эффект на опухолевый рост в зависимости от модели опухолевого процесса, в частности ингибирует рост солидной опухоли и увеличивает количество метастатических очагов в модели гематогенной меланомы В16 у мышей. Получены новые данные о связи уровня продукции ИЛ-18 с аллельным полиморфизмом промотора гена в позиции -607 и - 137. Впервые выявлено снижение частоты встречаемости генотипов -607АА и -607AA/-137CG у больных хроническим вирусным гепатитом В и увеличение частоты встречаемости генотипа -607СС/-137СС, ассоциированного с низким уровнем спонтанной и стимулированной продукции ИЛ-18 МНК. Получены новые данные об эффективности использования рИЛ-18 для стимуляции иммунного ответа МНК in vitro, в том числе, при совместном культивировании с дендритными клетками (ДК). В частности, добавление рИЛ-18 приводит к выраженной стимуляции антиген-индуцированной продукции ИФН-у, достоверному повышению содержания ИФНу-продуцирующих клеток. Впервые установлено, что ИЛ-18, экспрессируемый растительной клеткой, при пероральном применении оказывает характерные для него специфические эффекты в экспериментальных моделях на животных.

Теоретическая и практическая значимость исследования.

Блокирование продукции ФНО в культурах МНК в присутствии рИЛ-18 СБ свидетельствует о важной роли системы ИЛ-18/ИЛ-18СБ в регуляции

провоспалительной активности мононуклеарных клеток. Способность ИЛ-18 ингибировать рост ортотопической солидной меланомы В16, а ИЛ-18СБ -гематогенной метастатической меланомы указывает на существование различных механизмов подавления опухолевого роста указанными белками. Выявленная ассоциация продукции ИЛ-18 с аллельными вариантами промоторного региона гена ИЛ-18 в позициях -607 и -137 свидетельствует о генетической детерминированности уровня продукции ИЛ-18. В свою очередь установленное возрастание частоты встречаемости генотипов, ассоциированных с низким уровнем продукции ИЛ-18 при хроническом вирусном гепатите В указывает на патогенетическую значимость ИЛ-18 при данной патологии.

Характеристика полученных по оригинальной методике белков ИЛ-18 и ИЛ-18СБ свидетельствует о возможности их использования в дальнейшей разработке лекарственных средств. Продемонстрированная эффективность рИЛ-18 в подавлении роста солидных опухолей и ИЛ-18СБ в гематогенной метастатической модели обосновывает целесообразность применения этих белков для цитокиновой и антицитокиновой иммунотерапии при онкопатологии. Способность рИЛ-18 усиливать функциональную активность мононуклеарных и дендритных клеток т укго свидетельствует об эффективности использования данного цитокина при разработке клеточных технологий, в том числе на основе дендритных клеток. Эффективность перорального применения трансгенной моркови, экспрессирующей ген ИЛ-18 человека, является экспериментальным обоснованием создания нового поколения иммуноактивных субстанций на основе трансгенных растений.

Положения, выносимые на защиту.

1. ИЛ-18 и ИЛ-18СБ оказывают противоопухолевые эффекты в зависимости от типа и стадии опухолевого процесса.

2. Полиморфные варианты в промоторном участке гена ИЛ-18 (в позициях -607 и -137) ассоциированы с различными уровнями продукции белка и частотой встречаемости у больных хроническим вирусным гепатитом В.

3. Использование рИЛ-18 эффективно для стимуляции клеточных иммунных реакций при взаимодействии ДК, презентирующих различные антигены, и мононуклеаров периферической крови.

4. Использование трансгенных растений, экспрессирующих ген ИЛ-18 человека, эффективно для модуляции иммунных реакций при пероральном применении.

Личный вклад автора в проведение исследования.

Все представленные результаты экспериментальных исследований получены лично автором или при его непосредственном участии.

Апробация материалов диссертации.

объединенном иммунологическом форуме (Екатеринбург, 2004г), 4) 8-ом Всероссийского научном форуме с международным участием имени В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2004г), 5) конференции «Технология и онкология» (Санкт-Петербург, 2005г), 6) 4-ой конференции иммунологов Урала (Уфа, 2005г), 7) Всероссийском научном симпозиуме «Цитокины, стволовая клетка, иммунитет» (Новосибирск, 2005г), 8) Всероссийской научно-практической конференции посвященной 15-летнему юбилею Красноярского Краевого Центра по профилактике и борьбе со СПИД и другими инфекционными заболеваниями. «Дни иммунологии в Сибири» (Красноярск, 2005г), 9) Московской международной конференции «Биотехнология и медицина» (Москва, 2006г), 10) конференции «Иммунопатогенез и иммунотерапия основных заболеваний человека: от эксперимента к клинике» 7-ой отчетной конференции ГУ НИИКИ СО РАМН (Новосибирск, 2006г), 11) Московской международной конференции «Биотехнология и медицина» (Москва, 2006г), 12) Российской научно-практической конференции «Современные технологии в иммунологии: иммунодиагностика и иммунотерапия» (Курск, 2006г), 13) III Международной конференции "Фундаментальные науки - медицине" (Новосибирск, 2007г), 14) Межрегиональной научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири» (Омск, 2007г), 15) Межрегиональной научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири» (Красноярск, 20 Юг), 16) Всероссийской научной конференции «Молекулярно-генетичекие основы функционирования цитокиновой сети в норме и при патологии» (Новосибирск, 20 Юг), 17) Annual conference on cancer immunotherapy and vaccination (Czech Republic, Mikulov, 2011). Апробация диссертации состоялась на расширенном заседании Проблемной комиссии МНС 55.07 «Иммунология» с участием сотрудников НИИ клинической иммунологии СО РАМН 30 июня 2011 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 69 работ, из них 24 статьи, из них 14 статей в изданиях, включенных в системы цитирования, рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертационных работ. Получено 3 патента.

Структура и объем диссертации.

Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, глав, содержащих результаты собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения и выводов. Диссертация изложена на 210 страницах машинописного текста, иллюстрирована 31 рисунками и 4 таблицами. Список цитируемой литературы включает 245 источников, из них 11 работ отечественных авторов.

Работа выполнена в лаборатории молекулярной иммунологии (руководитель лаборатории д.м.н., проф. Сенников C.B.) НИИ клинической иммунологии СО РАМН.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Объекты исследования:

Лабораторные животные. В работе использовались мыши линии С57В1/6, BALB/c и гибриды (CBAxC57Bl/6)Fl (CBF1). Мыши получены из лаборатории экспериментальных моделей НИИКИ СО РАМН. Содержали животных в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей. Мононуклеарные клетки (МНК) периферической крови условно здоровых доноров в возрасте от 20 до 50 лет. МНК больных хроническим гепатитом В, находящихся на лечении в Муниципальной инфекционной больнице №1 и Новосибирском областном центре по борьбе с ВИЧ-инфекцией (30 человек) МНК пациентов, больных туберкулезом легких, получающих стандартную терапию на базе Новосибирского НИИ туберкулеза (30 человек). ДНК лейкоцитов периферической крови условно здоровых доноров в возрасте от 20 до 50 лет (147 человек) и доноров положительных по HbsAg (107 человек) в возрасте от 20 до 50 лет, сыворотка периферической крови условно здоровых доноров (147 человек) в возрасте от 20 до 50 лет. Экспериментальные модели.

Перевиваемые опухолевые модели - Меланома В16. Для данных экспериментальных моделей использовалась перевиваемая клеточная линия мышиной меланомы В16. Клетки вводили подкожно в район холки - солидная опухоль, либо внутривенно - гематогенная модель - в количестве 2х 105 на мышь, в объеме 0,3 мл. Для проведения опытов использовались мыши линии С57В1/6. На 23 день измеряли вес солидной опухоли. Опухолевый процесс в гематогенной модели оценивали, подсчитывая количество и измеряя диаметр метастазов в легких у каждого животного. Выживаемость оценивали ежедневно до последней мыши.

Канцероген-индуцированная аденокарцинома легких мыши. Индукция опухоли проводилась на мышах линии BALB/c, вес животных на момент начала опыта составлял 20-24гр. Раствор уретана (10%) вводили внутрибрюшинно (в/б), из расчета 0,7мг уретана на 1 грамм веса мыши в течение месяца с интервалом в 3 дня (8 раз) [Ложкин И.Д., 1996; Bentel J. et al., 1989]. Выраженность опухолевого процесса оценивали путем подсчета количества аденоматозных образований и измерением среднего диаметра опухолевых узлов у каждого животного.

Липополисахарид-индуцированная летальность. Опыт проводили на мышах линии BALB/c в возрасте 2 месяцев. Мышам в/б вводили ИЛ-18СБ в дозе 5 мг/кг и затем через 10 минут в/б ЛПС (E.coli 0111:В4) в дозе 15 мг/кг. Выживаемость оценивали в течение недели ежедневно [Faggioni R. et al, 2001].

Пероральное применение Daucus carota L. Мыши получали дополнительно к стандартному рациону, в течение времени указанного для каждого опыта, морковь обычную или несущую ген ИЛ-18, в дозе 1,7-2 г/мышь ежедневно.

Оценка клеточного ответа на Т-зависимый антиген (ЭБ). Клеточный иммунитет оценивали по степени выраженности реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) [Yaoshikai Y. et al., 1979]. Гистологическое и морфологические исследования меланомы. Солидную опухоль фиксировали в 10% нейтральном формалине, заключали в парафин. Срезы толщиной 5-8 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. В тестовом поле определяли частоту встречаемости митозов опухолевых клеток, оценивали количественно и качественно инфильтрацию окружающих тканей, определяли размер некроза, оценивали ангиогенез опухоли. Методы выделения и культивирования клеток мыши и человека. Получение и культивирование спленоцитов мышей. Селезенку выделяли в полустерильных условиях. Клетки выделяли путем ресуспендирования в среде RPMI-1640 и центрифугирования при 1000 оборотов/мин в течение 10 минут. Оценку жизнеспособности клеток проводили методом исключения трипанового синего или эритрозина [Гольдберг Е.Д., 1992]. Для стимуляции использовали Конканавалин А (КонА) (5 мкг/мл). Время культивирования - 48 и 72 часа во влажной атмосфере при температуре +37°С и при концентрации С025%. Выделение и культивирование мононуклеарных клеток периферической крови человека (МНК). Для исследований использовали гепаринизированную венозную кровь (50 Ед на 1 мл крови). МНК выделяли стандартно, путем центрифугирования венозной крови в градиенте плотности фиколл-урографина (р=1,082 г/л). Для стимуляции МНК использовали КонА (5 мкг/мл). Время культивирования - 24, 48 или 72 часа во влажной атмосфере при температуре +37°С и при концентрации С02 5%. Получение дендритных клеток (ДК).

Моноциты периферической крови выделялись методом адгезии на пластике.

Прилипшую фракцию культивировали в 48-луночном планшете в количестве 1

млн/мл в полной среде RPMI-1640. Для презентации антигена незрелым

дендритным клеткам (нДК) больных гепатитом В (ВГВ) использовали rHBcAg

(НПО «Диагностические Системы, Нижний Новгород») (5 мкг/мл, 2 часа), для

нДК больных туберкулезом использовали специфический антиген M. tuberulosis

ESAT-6 (Statens Serum Institut, Дания) в дозе 3 мкг/мл.

Для генерации ДК использовали следующие протоколы:

Протокол 1 (для генерации ДК пациентов ВГВ): дифференцировка 50 нг/мл

рчГМ-КСФ, 100 нг/мл рчИЛ-4 в течение 24 часов, презентация антигена 2

часа, созревание рчФНО-а (25 нг/мл) в течение 24 часов.

Протокол 2 (для генерации ДК пациентов с туберкулезом легких):

дифференцировка 50 нг/мл рчГМ-КСФ, 100 нг/мл рчИЛ-4 в течение 24 часов,

презентация антигена 2 часа, созревание ЛПС (штамм 055:В5, Sigma) (5

мкг/мл) в течение 24 часов.

Совместное культивирование ДК и МНК проводилось в течение 48 часов, соотношение МНК:ДК=10:1. Для совместного культивирования использовали аутологичные МНК, истощенные по моноцитарной фракции. Совместное

культивирование проводили в присутствии или отсутствии рчИЛ-18 - 40 нг/мл.

Оценка пролиферативной активности клеток проводилась по включению 3Н-тимидина в нуклеопротеидные фракции клеток с помощью прибора Cell Harvester (Flow Labs).

Определение количественного содержания цитокинов

электрохемилюминесцентным методом (ЭХЛ). Исследование проводили по описанной ранее методике [Sennikov S.V. et al., 2000].

Определение цитокинов методом ИФА. Уровень ИЛ-18 (наборы Bender Med Systems, Австрия), ИЛ-4, ИНФ-у, ФНО (Вектор-Бест, Россия) оценивали в сыворотке и супернатантах МНК согласно заводской инструкции. ELISpot анализ. ELISpot анализ проводился согласно заводской инструкции (R&D system, США).

Определение содержания перфорин-позитивных клеток проводили методом проточной цитофлюорометрии с использованием лазерного клеточного сортера-анализатора FACSCalibur (Becton Dickinson, США) в общем лимфоцитарном регионе.

Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови проводили с помощью набора Проба-НК (ДНК-технология, Россия) согласно заводской инструкции.

Определение генотипов ИЛ-18 проводили методом аллель специфической амплификации с флуоресцентной детекцией результатов в режиме реального времени (Real-time PCR). Для проведения специфической амплификации использовали четыре праймера, два специфических к полиморфизму в позиции -607 и два специфических к полиморфизму в - 137. ПЦР проводили в амплификаторе MiniOptocon (Bio-Rad, USA).

Статистическая обработка данных производилась при помощи методов параметрической (t-критерий Стьюдента) и непараметрической (тесты Манн-Уитни и Уилкоксона) статистики с использованием программ «Statistica 6.0» и Epi Info. Для оценки выживаемости животных в экспериментальных моделях in vivo использовали тест log-rank. Для выделения качественно отличающихся между собой уровней продукции ИЛ-18 при изучении ассоциированности полиморфных вариантов с уровнем продукции ИЛ-18, использовали методы квантильно-ранговой классификации по алгоритму Мостеллера и Тьюки [Мостеллер Ф., 1982]. В процессе проведения анализа для эмпирически наблюдаемых концентраций ИЛ-18 вычисляли вероятностные границы квантилей эмпирических распределений - X(qi). Число квантильных диапазонов (К), на которое разбивался общий размах вариации уровня ИЛ-18, вычисляли исходя из объема минимальной выборки (Nmin) по формуле Стерджеса [Лакин Г.Ф., 1990]. Для суждения о достоверности различий встречаемости качественных признаков и частоты событий в различных диапазонах варьирования уровня ИЛ-18, применяли критерий %2 (Рх) и точный метод Фишера для малых выборок (Ртмф) [Лакин Г.Ф., 1990; Гублер Е. В., 1978]. Для

оценки частотного распределения генотипов по уровням секреции ИЛ-18 использовали квантильно-ранговый анализ. Расчет соответствия частот встречаемости генотипов распределению Харди-Вайнберга использовали критерий yl.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Получение и характеристика рчИЛ-18

В ИХБФМ СО РАН (г. Новосибирск) по оригинальной методике было получено несколько партий рчИЛ-18, все они были протестированы на приборе ORIGEN методом ЭХЛ для выбора оптимального способа получения, выделения [ и хранения препарата. В качестве стандарта использовался рИЛ-18 фирмы PeproTech. В результате проведенных исследований был выбран рчИЛ-18, который сохранял свою иммунохимическую активность в течение 21 дня хранения при +4°С (рисунок 1).

Рис. I. Изучение иммунохимической активности рИЛ-18 при хранении.

Примечание: Для калибровочных кривых использовались: рИЛ-18 (ИХБФМ), меченные рутением моноклональные антитела (РергоТесИ) и меченные биотином ' кроличьи политональные антитела.

1-сразу после разведения; 2-21 день хранения при +4°С

По литературным данным известно, что ИЛ-18 индуцирует продукцию ИФН-у, причем следует отметить, что он способен активировать ее как самостоятельно, активируя АР-1 сайт промоторного региона ИФН-у, так и совместно с ИЛ-12, который влияет на продукцию ИФН-у только после активации костимуляторной молекулы СБ28 на Т-лимфоцитах [ВагМевси К., 1998]. Нами было выявлено достоверное повышение продукции ИФН-у МНК в ответ на моностимуляцию рИЛ-18 (40нг/мл). Также в нашем эксперименте показано, что рИЛ-18 способен увеличивать продукцию ФНО МНК по сравнению со спонтанной продукцией {рисунок 2). Интересно отметить, что рИЛ-18 значительно потенцирует стимулирующий эффект Т-клеточного митогена КонА на продукцию ФНО, причем наблюдается не суммирование эффектов этих эффекторных молекул (КонА - 414,3пг/мл; рИЛ-18 — 300,2пг/мл,

КонА+рИЛ-18 - 1224 пг/мл), а именно суперпродукция ФНО МНК при совместной стимуляции КонА+рИЛ-18.

3000 2500 2000 1 1500

спонтанная

ИЛ-18 КонА+ИЛ-18

20С0С 15G0G

с;

5 10000

500C

спонтанная

КонА+ИЛ-18

Рис.2. Влияние рИЛ-18 на продукцию ФНО и ИФНуМНК человека.

Примечание: Клетки культивировали 24 и 48 часов, соответственно, в присутствии КонА (5 мкг/мл) и/или рчИЛ-18(40нг/мл). Данные представлены как медиана и размах

квартилей. На рисунке стрелками обозначены статистически достоверные различия при

......- . : ;

По результатам исследований [Kares R. et al., 2000] известно, что гомология человеческого и мышиного ИЛ-18 довольно высока, в частности 5'-фланкирующий регион гена ИЛ-18 идентичен на 75%, а аминокислотная | последовательность на 65% [Ushio S. et al., 1996]. Исходя из этого мы посчитали | возможным изучить отдельные эффекты биологической активности рчИЛ-18 в экспериментальных моделях на мышах.

Показано, что у мышей с нокаутом гена ИЛ-18 развивается сниженный клеточный иммунный ответ, что выражается в снижении реакции ГЗТ [Kawakami К. et al., 1997], при этом следует отметить, что при нокауте гена ИЛ-12, ИЛ-18, тем не менее, стимулирует реакцию ГЗТ [Kitching А. R. et al., 2000]. Изучение клеточного иммунного ответа показало, что рИЛ-18 (1мкг/мышь) стимулирует реакцию ГЗТ (рисунок 3), что согласуется с данными, полученными 1 рядом авторов в других экспериментальных моделях, и говорит о том, что полученный препарат рИЛ-18 обладает специфической активностью и способен сдвигать баланс иммунного ответа у интактных животных в сторону клеточного иммунного ответа.

Рис.3. Влияние рИЛ-18 на выраженность реакции гиперчувствительности замедленного типа.

Примечание: рИЛ-18 (1мкг/мышь СВИ 5-кратно в/в через день), контрольная группа - среда ИРМ1-1640 в том же режиме. Данные представлены в виде (М±т), стрелками обозначены статистически достоверные различия при р<0,05.

Таким образом, рИЛ-18, полученный по оригинальной методике, обладает специфической иммунохимической активностью, стабилен при хранении и обладает биологической активностью, стимулируя продукцию ФИО и ИФН-у МНК человека in vitro, а также активируя реакцию гиперчувствительности замедленного типа в системе in vivo у мышей.

Получение и характеристика ИЛ-18СБ

В ИХБФМ СО РАН был получен ИЛ-18 связывающий белок (ИЛ-18СБ). Установлено, что полученный по оригинальной методике рИЛ-18СБ калибровался в реакции иммуноанализа с использованием как набора состоящего из пары поликлональных кроличьих антител (полученных нами), так и набора состоящего из поликлональных кроличьих антител и поликлональных антител фирмы R&D (данные не приводятся).

Следует отметить, что человеческий ИЛ-18СБ также как и ИЛ-18 имеет высокую гомологию по аминокислотному составу с белком мыши и крысы [1ш S. Н. et al., 2002]. Кроме того, существуют исследования и других авторов также с использованием рекомбинантного человеческого ИЛ-18СБ у мышей, где была показана его эффективность [Romero J. F. et al., 2007].

Биологическая активность ИЛ-18СБ, который проявляет свое действие, блокируя эффекты ИЛ-18, была исследована в эксперименте по влиянию на продукцию ФНО культурой МНК человека. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что ИЛ-18СБ отменяет стимулированную рчИЛ-18 продукцию ФНО культурой МНК человека. Более того, ИЛ-18СБ отменяет не только продукцию ФНО, стимулированную ИЛ-18, но и КонА и КонА+рчИЛ-18, который в свою очередь еще больше потенцирует продукцию ФНО, стимулированную этим митогеном. Этот факт может свидетельствовать о том, что эндогенный ИЛ-18 в данной ситуации является одним из ключевых факторов, запускающих каскад реакций в ответ на КонА, поскольку продукция ФНО снижается во всех случаях до спонтанного уровня {рисунок 4).

Для исследования биологической активности рИЛ-18СБ in vivo была использована модель ЛПС-индуцированной летальности мышей [Faggioni R, 2001]. В нашем опыте рИЛ-18СБ (5мг/кг), введенный в/б за 10 минут до инъекции ЛПС (15 мг/кг, LD90), достоверно увеличивал выживаемость мышей по сравнению с контрольной группой {рисунок 5). Поскольку в этой модели ИЛ-18СБ показал себя эффективным блокирующим летальность мышей фактором, можно утверждать, что эндогенный ИЛ-18 является одним из центральных медиаторов, запускающих каскад реакций после введения липополисахарида.

Таким образом, полученный рчИЛ-18СБ обладает биологической активностью в тесте in vitro, отменяя влияние ИЛ-18 на продукцию ФНО мононуклеарами периферической крови, и в тесте in vivo значительно снижая уровень ЛПС-индуцированной летальности мышей. И, что немаловажно, следует отметить, что ИЛ-18СБ, являясь специфическим блокатором ИЛ-18,

способен блокировать каскад событий, запускаемых КонА и ЛПС, что свидетельствует о важной роли ИЛ-18 в этих реакциях.

спонтанная КонА ИЛ-18 КонА+ИЛ-1а ИЛ-18СБ ИЛ-13 + ИЛ- КонА + ИЛ- КонА + ИЛ-18

(5мкг/мл) (40нг/мл) (80мкг/мл) 18СБ 18СБ + ИЛ-18СБ

Рис.4. Влияние рИЛ-18СБ на продукцию ФНО в культуре МНК человека.

Примечание: Клетки культивировали 24 часа в присутствии различных стимуляторов. Данные представлены как медианы и размах квартилей. На рисунке стрелками обозначены статистически достоверные различия при р<0,05.

Рис.5. Влияние ИЛ-18СБ на ЛПС-индуцированную летальность мышей (LD90).

Примечание: Мышам линии BALB/c за 10 минут до инъекции ЛПС (0111:В4, 15мг/кг) вводили рИЛ-18СБ (5мг/кг). Мониторинг выживаемости проводили в течение 7 дней. Результаты, представленные на диаграмме, получены в двух сериях опытов. n=20, log-rank test: d=0,00191.

Противоопухолевая активность рИЛ-18 и рИЛ18СБ

Механизмы противоопухолевой активности ИЛ-18 включают в себя: усиление продукции ряда провоспалительных цитокинов, экспрессии БазЬ на НК и Т-клетках [ТзШэш Н. е1 а!., 1996], увеличение цитотоксической активности НК и Т-клеток [ивЫо 8. ех. а1., 1996], ингибирование ангиогенеза [Сои§Ыт С.М. й а1., 1998], активацию экспрессии молекул адгезии и хемокинов, а также стимуляцию продукции ИФН-у, который сам обладает рядом противоопухолевых свойств [Окашига Н. е1 а1., 1995]. Данные механизмы предполагают прямое и опосредованное влияние ИЛ-18 на опухолевый процесс.

Мы исследовали биологическую активность полученного рИЛ-18 в опыте с перевиваемой ортотопической мышиной меланомой В16. Показано, что введение мышам рИЛ-18 (1мкг/мышь, в/в) 1-, 2- и 3-кратно через день после инокуляции опухолевых клеток приводит к снижению веса солидной меланомы

В16, причем при двух- и трехкратном введении ИЛ-18 обнаружена тенденция к более выраженному снижению веса опухоли, чем при однократном (статистической достоверности не показано) (рисунок б). Качественное гистологическое исследование опухоли показало, что исследуемый препарат рИЛ-18 подавляет митотическую активность опухолевых клеток меланомы В16, усиливает дегенеративные процессы, уменьшает васкуляризацию ткани опухоли и повышает ее инфильтрацию лимфоцитами и макрофагами. Продолжительность жизни экспериментальных животных при 1-, 2- и 3-кратном введении рИЛ-18 статистически достоверно увеличивалась в сравнении с контрольной группой. Статистически значимого влияния кратности введения рчИЛ-18 на вес опухоли и выживаемость экспериментальных животных не обнаружено.

ВЕС ОРТОТОПИЧЕСКОИМЕЛАНОМЫ

I I

ВЫЖИВАЕМОСТЬ

70 60 I 50

40 -30 20 ■ 10

ífl

Рис.6. Влияние рИЛ-18 на вес солидной меланомы В16 и выживаемость.

Примечание: Клетки меланомы В16 вводили п/к в район холки в количестве 200 тыс/мышь мышам линии C57BL6. ИЛ-18 (1мкг/мышь) или физ. раствор вводили в/в через день. Взвешивание опухоли проводили на 23 день. Выживаемость оценивали ежедневно до последней мыши. Данные представлены как медиана и размах квартилей. На рисунке стрелками обозначены достоверные различия при р< 0.05. Группы: 1- интактная; 2- контроль 3-кратно в/в (физ. раствор); 3- рИЛ-18 в/в 1-кратно; 4-рИЛ-18 в/в 2-кратно; 5- рИЛ-18 в/в 3-кратно

Несмотря на то, что ИЛ-18 активно участвует в противоопухолевой защите организма, некоторые его свойства могут проявлять двойственную активность. Например, стимулируя экспрессию молекул адгезии ICAM-1 и VCAM-1, ИЛ-18 может способствовать инфильтрации опухоли иммунокомпетентными клетками [Yamada М. et al., 2005], однако это же качество может являться патогенетическим фактором при метастазировании злокачественных новообразований [Vidal-Vanaclocha F. et al., 2000]. Исходя из этого, рчИЛ-18СБ, как блокатор эффектов ИЛ-18 и, в том числе, как ингибитор экспрессии молекул адгезии [Carrascal М. Т. et al., 2003], был исследован в гематогенной модели мышиной меланомы В16.

Показано, что введение рИЛ-18 увеличивает интегративный количественный показатель (ИКП) опухолевого процесса, определяемый как произведение количества и диаметра метастазов. Введение рИЛ-18СБ как внутривенное, так и внутрибрюшинное статистически достоверно снижает этот

показатель по сравнению с контрольной группой и группой с введением рИЛ-18 (рисунок 7).

контроль №18 внутривенно

ИЛ-18СБ внутривенно

ИЛ« внутриорюшннно

Рис. 7. Влияние введения рИЛ-18 и рИЛ-18СБ на выраженность опухолевого процесса в модели гематогенной меланомы В16 у мышей С57ВЬ6. /7р1шечание:Выраженность опухолевого процесса представлена как

интегративный количественный

показатель (ИКП)=число

опухолей*средний диаметр. Стрелками обозначены достоверные различия при р<0,05

Группы: контроль-введение В16 (200тыс/мышь) и физ. раствора (в/в Зх-кратно); 2-рИЛ-18 (в/в 1мкг/мышь Зх-кратно); 3- рИЛ-18СБ (в/в Змкг/мышь Зх-кратно); 4- введение рИЛ-18СБ (в/б Змкг/мышь Зх-кратно ежедневно после введения В16).

Исследование противоопухолевой активности рИЛ-18 и рИЛ-18СБ показало, что рчИЛ-18 снижает вес солидной меланомы В16 и увеличивает выживаемость животных, а рИЛ-18СБ уменьшает количество метастазов в легких мышей в модели гематогенной меланомы В16, т.е. оба полученных белка проявляют активность в различных экспериментальных моделях соответственно своим биологическими свойствам, что свидетельствует о существовании различных механизмов подавления опухолевого роста указанными белками.

Эндогенный ИЛ-18 участвует во многих процессах в организме, и наряду с участием в формировании иммунного ответа, этот белок является патогенетическим звеном многих заболеваний. Как известно, индивидуальная восприимчивость организма к инфекциям определяется патогенностью микроорганизма, факторами окружающей среды и состоянием иммунной системы. Различия в генах, контролирующих защитные реакции организма, могут определять различный характер протекания воспалительного ответа и специфических иммунологических реакций при внедрении патогенов. В первую очередь это касается генов регуляторных молекул, обеспечивающих начальные этапы развития воспалительной реакции: распознавание патогена, проведение внутриклеточного активационного сигнала и синтез медиаторов развития воспалительной реакции, в состав которых входят и цитокины (^певе О. е1 а1., 2002]. Наиболее частым изменением структуры генов является так называемый полиморфизм единичных нуклеотидов, определяющий функциональный полиморфизм различных генов, связанный с количественными изменениями их функционирования. Эти генетические различия вносят важный вклад в индивидуальные особенности развития защитных реакций и

предрасположенность к целому ряду заболеваний. В первую очередь это касается генов регуляторных молекул воспаления, к которым относится ИЛ-18. Полиморфизм генов цитокинов, в частности в промоторном регионе, может быть одним из механизмов, который участвует в формировании индивидуальной вариабельности уровня продукции белка. При патологии этот феномен может иметь значение, поскольку цитокины, и ИЛ-18, в частности, являются ключевыми факторами формирования эффективного иммунного ответа.

Изучение полиморфизма промоторного региона гена ИЛ-18

Изучение ассоциированности продукции ИЛ-18 в культуре МНК ПК здоровых доноров с генотипом - 607 С—>А ИЛ-18.

Известные полиморфные варианты промотора гена ИЛ-18 -607С—>А и -137С-^С, расположенные в сайтах связывания для транскрипционных факторов СИЕВ, и Н4ТР-1 ядерного фактора, соответственно, могут влиять на экспрессию ИЛ-18 и приводить к изменению уровня его продукции (ХНеёгаШв V. с1 а1., 2001].

Для исследования наличия ассоциированности аллельных вариантов гена ИЛ-18 и уровня его продукции было проведено исследование концентрации ИЛ-18 в кондиционных средах МНК здоровых доноров. Средний уровень продукции ИЛ-18 составил для спонтанной продукции 48,07+3,96 пкг/мл, для ЛПС-стимулированной - 80,42±4,56 пкг/мл. Далее при сопоставлении уровня продукции ИЛ-18 МНК здоровых доноров с вариантами генотипа ИЛ-18 в позиции - 607 были получены следующие данные. Показано статистически значимое увеличение уровня ЛПС-стимулированной продукции ИЛ-18 МНК здоровых доноров несущих генотип СА по сравнению с генотипом СС в позиции -607 промотора гена ИЛ-18 (рисунок 8). Поскольку сопоставление средних величин продукции не всегда отражает реальный уровень продукции белка у каждого конкретного индивида, мы исследовали различные уровни продукции ИЛ-18 МНК здоровых доноров в сопоставлении с генотипами промотора гена ИЛ-18. При исследовании частотных распределений генотипов ИЛ-18 в позиции -607 промотора гена ИЛ-18 показано статистически значимое увеличение частоты встречаемости аллеля А в позиции - 607 промотора гена ИЛ-18 у лиц с высоким уровнем спонтанной продукции ИЛ-18 (данные не представлены).

Таким образом, показано увеличение частоты встречаемости носителей аллеля А среди доноров с высоким уровнем спонтанной продукции ИЛ-18 и статистически достоверное увеличение уровня ЛПС-стимулированной продукции ИЛ-18, ассоциированное с генотипом -607СА по сравнению с генотипом -607СС.

Изучение ассоциированности продукции ИЛ-18 в культуре МНК ПК здоровых доноров с генотипом -137С—>С ИЛ-18.

Далее уровень продукции ИЛ-18 был сопоставлен с полиморфными вариантами -137 С—Ю промоторного участка гена ИЛ-18 (рисунок 9). Показан статистически значимо меньший уровень ЛПС-стимулированной продукции ИЛ-

—-------■»---——----—----—----»— —™» —— —»ы-----**-----I

18 МНК у лиц несущих генотип СС относительно лиц с генотипом вв в позиции -137 промотора гена ИЛ-18. Для дальнейшего исследования провели анализ частотных распределений генотипов для различных уровней продукции ИЛ-18, оценив ассоциированность частоты встречаемости изучаемых аллельных вариантов с разными уровнями продукции ИЛ-18. Показано статистически -значимое увеличение частоты встречаемости аллеля С в позиции - 137 промотора гена ИЛ-18 у лиц с низким уровнем ЛПС-стимулированной продукции ИЛ-18.

Рис.8. Ассоциированность полиморфного варианта промоторного участка гена ИЛ-18 в позиции -607А—»С с уровнем спонтанной и стимулированной (ЛПС) продукции ИЛ-18 МНК. Примечание: Данные представлены в виде медианы и размаха квартилей. (п=143). Стрелками обозначены достоверные различия при р<0,05

Рис.9. Ассоциированность спонтанного и стимулированного (ЛПС) уровня продукции ИЛ-18

МНК ПК с полиморфными вариантами гена ИЛ-18 в позиции -137С—»С.

Примечание: Данные представлены в виде медианы и размаха квартилей. (п=143) Стрелками обозначены достоверные различия при р<0,05

Таким образом, показана сниженная ЛПС-стимулированная продукция ИЛ-18 у лиц с генотипом СС относительно доноров с генотипом вв в позиции -137 промотора гена ИЛ-18, так же наблюдается повышение частоты встречаемости доноров несущих аллель С в группе с низким уровнем стимулированной продукции ИЛ-18, т.е. аллель С в позиции -137 промотора гена ИЛ-18 ассоциирован с низким уровнем продукции ИЛ-18 МНК ПК. Изучение влияния генотипа промотора гена ИЛ-18 на уровень продутой ИЛ-18 в культуре МНК.

Поскольку оба изучаемых нами полиморфизма находятся в неравновесном сцеплении, мы исследовали все возможные комбинации аллелей.

стимулированная

□ СС а вС неэ

сталированная

Показано, что наличие минорного генотипа -607С№-137вН ассоциировано с повышенной спонтанной продукцией ИЛ-18 в сравнении с минорными генотипами -607АА/-137СЫ и -607СИ/-137СС. Увеличение ЛПС-стимулированной продукции ИЛ-18 ассоциировано с минорным генотипом -607СМ/-137СК в сравнении с -60704/-137СС {рисунок 10).

а -607СЬ1/-137СМ 0 -607АА/-1376Ы а -607С!\1/-137СС

спонтанная ЛПС-стимуди-рованная

Рис. 10. Ассоциированность уровня продукции ИЛ-18 МНК с

полиморфными вариантами -607/-137 промотора гена ИЛ-18

Для исследования ассоциированности генотипов промотора ИЛ-18 с уровнем спонтанной и стимулированной продукции был проведен сравнительный анализ между каждым генотипом в сравнении с остальной популяцией, исключая исследуемый генотип. Показано: пониженная спонтанная продукция ИЛ-18 связана с генотипами -607СС/-137СС и -607ААУ-137СС, сниженная стимулированная продукция связана с генотипом -607СС/-137СС.

Таким образом, показана сниженная ЛПС-стимулированная продукция ИЛ-18 у лиц с генотипом СС относительно доноров с генотипом Св позиции -137 промотора гена ИЛ-18, так же показано повышение частоты встречаемости доноров несущих аллель С в группе с низким уровнем ЛПС-стимулированной продукции ИЛ-18. Показано статистически значимое увеличение уровня ЛПС-стимулированной продукции ИЛ-18 МНК здоровых доноров несущих генотип С А по сравнению с генотипом СС в позиции -607. При исследовании частотных распределений генотипов ИЛ-18 в позиции -607 промотора гена ИЛ-18 показано увеличение частоты встречаемости носителей аллеля А и гапло-генотип -607СМ/-137вК среди лиц с высоким уровнем спонтанной продукции ИЛ-18.

ИЛ-18, как один из ключевых факторов формирования врожденного и приобретенного иммунного ответа, способствует формированию эффективного клеточного иммунного ответа, в частности противовирусного. Вирусный гепатит В - одно из самых распространенных инфекционных заболеваний в мире.

Полиморфизм генов различных цитокинов (ИФН-а, ИФН-у, ФНО-а, ИЛ-1 и др.) играет важную роль в заболеваемости и определении исхода ВГВ [Ben-Ari Z., 2006]. Поскольку известно, что на течение вирусных заболеваний влияет не только особенности вируса, но и генетические особенности организма хозяина, мы исследовали особенности распределения аллельных вариантов гена ИЛ-18 (-607С/А и -137G/C), ассоциированных с уровнем продукции белка ИЛ-18, у здоровых доноров и больных хроническим вирусным гепатитом В (ВГВ). Анализ распределения полиморфных вариантов гена ИЛ-18 среди здоровых доноров Юго-Западной Сибири и больных хроническим вирусным гепатитом В.

Распределение аллелей генов предрасположенности/резистентности, формирующие риск развития заболевания или устойчивости к нему, являются уникальными для каждой популяции, что может быть одной из причин разнообразного иммунного ответа на антиген. Исследование двух полиморфизмов промотора гена ИЛ-18 (-607С->А и -137G->C) было проведено в группе практически здоровых лиц (п=147) и больных хроническим ВГВ (п=103). В группе больных хроническим ВГВ выявлено снижение частоты встречаемости генотипа -607АА полиморфного участка гена ИЛ-18 по сравнению со здоровыми донорами. При анализе различий в распределении генотипов полиморфного участка -137 G->C гена ИЛ-18 между группами больных и здоровых лиц статистически значимые отличия не выявлены.

Для определения ассоциированности наличия заболевания хроническим ВГВ с определенным генотипом был проведен анализ распределения генотипов среди здоровых и больных индивидов. При сравнительном анализе встречаемости генотипов в двух изучаемых группах было выявлено снижение частоты встречаемости генотипа -607AA/-137CG (0%) и увеличение частоты встречаемости генотипа -607СС/-137СС до 6,8% среди больных вирусным гепатитом В (по сравнению с 2,7% у здоровых).

Таким образом, среди больных хроническим ВГВ по сравнению со здоровыми донорами снижены частоты встречаемости генотипов -607АА и -607AA/-137CG и увеличена частота встречаемости генотипа -607СС/-137СС, ассоциированного со сниженной спонтанной и стимулированной продукцией ИЛ-18, что свидетельствует об участии ИЛ-18 в патогенезе вирусного гепатита В

Использование рИЛ-18 для индукции специфического иммунного ответа in vitro

ИЛ-18 являясь одним из ключевых провоспалительных цитокинов, индуцирует формирование приобретенного иммунного ответа. ИЛ-18 продуцируется антигенпрезентирующими клетками (макрофагами и дендритными клетками), участвует в их взаимодействии с клетками эффекторами. Кроме того, ИЛ-18 активирует функциональную активность клеток, непосредственно участвующих в формировании специфического ответа, в частности противоинфекционного (противовирусного и антибактериального). Однако, в связи с аллельными вариантами гена ИЛ-18 у некоторых индивидов

продукция ИЛ-18 может быть сниженной, что может негативно отражаться на всех этапах формирования эффективного иммунного ответа. Кроме того, плейотропность ИЛ-18 может играть негативную роль в формировании иммунных реакций, может вызывать нежелательные в некоторых ситуациях эффекты, как например, продукцию молекул адгезии при метастатической болезни или запуск каскада воспалительных реакций при наличии воспаления в организме, что может приводить к повреждению тканей. Избежать системных тканевых воспалительных реакций и других нежелательных эффектов ИЛ-18 можно, используя его для стимуляции функций клеток in vitro. Существуют данные о том, что у пациентов с хроническим вирусным гепатитом В наблюдается ослабление взаимодействия между ДК и Т-клетками [Zheng В. J. et al., 2004]. В то же время показана возможность индукции с помощью ДК специфических иммунных реакций in vitro, в частности противовирусных, антибактериальных и противоопухолевых [Mohamadzadeh М. et al., 2004]. Для «перепрограммирования» иммунных реакций используют стимуляцию ДК и собственно эффекторных клеток различными антигенами и цитокинами [O'Neill D.W. et al., 2004]. Поэтому мы предприняли попытку модулировать специфический иммунный ответ против антигена вирусного гепатита В и антигена туберкулеза с помощью цитотоксических клеток, полученных при культивировании совместно с антиген-презентирующими ДК и рекомбинантным ИЛ-18.

Влияние рчИЛ-18 на модуляцию функциональной активности мононуклеарных клеток периферической крови больных хроническим гепатитом В, культивированных совместно с аутологичными ДК.

Известно, что персистенция вируса гепатита В развивается в результате подавления индукции и реализации иммунного ответа, в частности, вследствие истощения антивирусных Т-клонов, блокирования представления антигенов и разобщения всех клеток иммунной системы. В связи с этим иммунокомпетентные клетки больных вирусным гепатитом являются функционально несостоятельными. В нашем исследовании при сравнении пролиферативного потенциала МНК здоровых доноров и больных хроническим ВГВ показано достоверное снижение уровня спонтанной и стимулированной с помощью ДК пролиферации МНК у больных хроническим вирусным гепатитом В (данные не приводятся). Также у больных хроническим вирусным гепатитом В наблюдается сниженная продукция ИНФ-у МНК после совместного культивирования с аутологичными активированными ДК и отсутствие статистически значимой стимуляции продукции в ответ на совместное культивирование в отличие от здоровых доноров (данные не приводятся). То есть, аутологичные активированные ДК больных хроническим вирусным гепатитом В в отличие от аутологичных активированных клеток здоровых доноров обладают сниженным стимуляторным потенциалом в отношении МНК.

Поскольку известно, что ИЛ-18 способен стимулировать клеточный иммунный ответ Тх1типа и продукцию ИФН-у, мы исследовали возможность и

эффективность использования рИЛ-18 для модуляции противовирусного иммунного ответа с помощью дендритных клеток. В качестве активатора функциональной активности МНК и ДК мы использовали рИЛ-18 (40 нг/мл), добавленный при совместном культивировании клеток. Как видно из рисунка 11, наблюдается достоверное усиление пролиферативного ответа МНК на HBcAg, при этом рИЛ-18 достоверно более эффективно усиливает спонтанную и антиген-стимулированную пролиферативную активность МНК и МНК культивированных совместно с ДК.

10000 8000 вооо

7000 6000 . 5000 4000 3000 2000 1000 0

(оспонтанная РНЬсогАд)

Рис.11. Влияние ИЛ-18 на пролиферативную активность МНК больных хроническим

вирусным гепатитом В.

МНК+ДК (полученные без НВсскАц)

МНК+ДК МНК+ДК с 1L-18

Примечание: Совместное культивирование МНК и ДК рИЛ-18 проводилось в течение 48 часов. Пролиферацию оценивали по включению 3Н-тимидина на 72 часах культивирования (п=16). Данные представлены в виде медианы и размаха квартилей, р\УПкохоп<0,05.

Эффективность использования рИЛ-18 в процессе индукции специфического иммунного ответа оценивалась с помощью методики ELISpot, в которой тестируется количество ИФНу-продуцирующих клеток. Среди цитокинов, ИФН-у один из самых важных медиаторов иммунной системы, кроме того, этот фактор способен проявлять прямой ингибирующий эффект в отношении репликации вируса [Farrar М. F. et al., 1993; Boehm U. et al., 1997]. Показано, что при индукции специфического иммунного ответа у больных хроническим ВГВ не наблюдается увеличения количества ИФН-у-продуцирующих клеток в ответ на совместное культивирование с ДК, презентирующих HbcAg, однако применение рИЛ-18 при культивировании МНК и ДК достоверно увеличивает количество МНК продуцирующих ИФН-у по сравнению как с МНК, культивировавшимися в отсутствии ДК, так и после совместного культивирования МНК и ДК или применения только одного рИЛ-18. Кроме того, количество ИНФ-у продуцирующих клеток статистически значимо увеличивается в ответ стимуляцию HbcAg в группе МНК, культивированных с ДК в присутсвии рИЛ-18 (рисунок 12).

|оспонтанная РНЬсог Ад |

МНК+ДК (полученные без НВсогдд)

МНК+ДКс 11_-1 8

Рис. 12. Влияние рИЛ-18 и аутологичных ДК на количество ИНФу-

продуцирующих МНК больных хроническим вирусным гепатитом В.

Примечание: Совместное культивирование проводилось в течение 48 часов. Количество ИНФу-продуцирующих клеток оценивали через 72 часа культивирования (п=17). Количество ИНФ-у продуцирующих клеток определялось с помощью технологии ЕЬВро! (данные представлены в виде медианы и размаха квартилей) (р\^11кохоп<0,05)

Так как ИЛ-18 может в том числе стимулировать и продукцию цитокинов Тх2 профиля, и в частности, продукцию ИЛ-4, было проведено исследование количества клеток, продуцирующих ИЛ-4 с помощью метода ЕЬКро! и уровня продукции ИЛ-4 с помощью ИФА. Показано, что рИЛ-18 и ДК как по отдельности, так и вместе не влияют на количество клеток продуцирующих ИЛ-4 и уровень его продукции (данные не приводятся).

Кроме того, для определения направленности иммунных реакций мы исследовали продукцию ИНФ-у МНК культивированных в присутствии ДК. Показано увеличение спонтанной и антигенстимулированной продукции ИНФ-у МНК после совместного культивирования с аутологичными активированными ДК в присутствии рИЛ-18 по сравнению с МНК обработанных только рИЛ-18 или культивированными только с аутологичными ДК {табл.1).

Таким образом, показано, что присутствие рИЛ-18 при совместном культивировании МНК с аутологичными ДК, нагруженными антигеном ВГВ, у больных вирусным гепатитом В смещает профиль цитокинов в сторону медиаторов Тх-1 типа.

Для определения эффективности использования ИЛ-18 для индукции потенциальной цитотоксической активности лимфоцитов устанавливалось содержание клеток, экспрессирующих внутриклеточный белок перфорин. Показано, что НВсА£ обладает выраженным индуцирующим эффектом на уровень экспрессии перфориновых гранул в МНК. При этом, добавление рИЛ-18 к совместному культивированию МНК и ДК приводит к достоверно значимому увеличению уровня экспрессии перфорина, как одними МНК, так и в ответ на НВсА§ {рисунок 13).

Таблица 1.

Влияние рИЛ-18 на продукцию ИНФ-у МНК больных хроническим ВГВ, __культивированными с ДК.__

спонтанная НЬсог Ag

МНК 12,3 пг/мл [6,1;15,1], (21,7) 14,8 пг/мл # [9,9; 18,5], (77,1)

МНК+ИЛ-18 11,7 пг/мл # [4,3;18,6], (45,4) 15,5 пг/мл # [6,6;81,5]. (99,0)

МНК+ДК (полученные без НВсогА§) 13,8 пг/мл * [5,2;47,2], (57,2) 16,7 пг/мл # [2,6;74,2], (46,3)

МНК+ДК 17,4 пг/мл * [7,3;45,7], (67,5) 16,7 пг/мл #, & [3,7;69,7], (107,0)

МНК+ДК с ИЛ-18 16,8 пг/мл * [6,7;35,0], (57,9) 20,4 пг/мл *, & [2,9:171,6],(138,4)

Примечание: Совместное культивирование проводилось в течение 48 часов. Продукция ИНФ-у определялась методом ИФА через 72 часа культивирования (п=16). Данные представлены в виде медианы [размах квартилей] и (среднее).

* достоверные отличия от МНК; #- достоверные отличия от МНК+ДК+ИЛ18; &-достоверные отличия от спонтанного уровня (р<мпшхоп<0,05)

^спонтанная ВНвюг Да

МНК*|Ы8 МНК+ДКО МНК*ДК

МНК+ДКСИ--18

Рис.13. Влияние рИЛ-18 на экспрессию перфорина МНК больных хроническим ВГВ, культивированными с ДК.

Примечание-. Совместное культивирование проводилось в течение 48 часов. Экспрессию перфорина определялась методом проточной цитометрии через 72 часа культивирования (п=16). Данные представлены в виде среднего и ошибки среднего, р<0,05.

Таким образом, в результате проведенных исследований показано, что при совместном культивировании МНК и ДК для максимально эффективной активации специфического клеточного иммунного ответа у больных хроническим вирусным гепатитом В необходимо добавление рИЛ-18.

Поскольку известно, что ИЛ-18 принимает активное участие в формировании антибактериальной защиты организма, мы изучили влияние ИЛ-18 на функциональную активность МНК больных туберкулезом легких, после активации и представления специфического антигена ESAT6 в присутствии аутологичных, дифференцированных in vitro, дендритных клеток. Влияние рИЛ-18 на эффекторные функции МНК, сокулътивированных с ДК больных туберкулезом легких.

Для определения эффективности использования рИЛ-18 для модуляции противотуберкулезного иммунного ответа in vitro мы оценивали пролиферативную активность МНК, предварительно культивированных с антиген-нагруженными ДК, в ответ на специфический антиген М. tuberculosis ESAT-6. Показано, что ДК, нагруженные и ненагруженные антигеном, способны активировать пролиферативный потенциал МНК пациентов, больных туберкулезом легких. Добавление рИЛ-18 при совместном культивировании дендритных и мононуклеарных клеток пациентов, больных туберкулезом не приводит к статистически значимому усилению пролиферативной активности МНК. То есть, совместное культивирование зрелых ДК и МНК приводит к активации пролиферативной активности МНК пациентов больных туберкулезом легких in vitro, однако использование рИЛ-18 не сопровождается в данных условиях усилением пролиферативной активности.

Для изучения эффективности использования рИЛ-18 при совместном культивировании ДК и МНК с целью стимуляции и поддержания направленной дифференцировки наивных Т-клеток в Т-хелперы первого типа исследовали секрецию ИФНу МНК у больных туберкулезом легких. С помощью технологии ELISpot показано, что ДК, нагруженные антигеном, эффективно повышают количество ИФНу-продуцирующих клеток самостоятельно и еще более эффективно в ответ на антиген ESAT-6 по сравнению с исходной популяцией МНК. ДК, не нагруженные антигеном, также повышают количество ИФНу-продуцирующих клеток, однако, не происходит прироста цитокин-продуцирующих клеток в ответ на антиген. Добавление рИЛ-18 при культивировании ДК и МНК повышает количество ИФНу-продуцирующих клеток по сравнению с исходной фракцией МНК, при этом количество ИФНу-продуцирующих клеток значительно увеличивается в присутствии рИЛ-18 и туберкулезного антигена ESAT-6 (рисунок 14).

Таким образом, совместное культивирование МНК и ДК больных туберкулезом легких в присутствии рИЛ-18 приводит к максимально эффективному увеличению количества ИФН-у-продуцирующих клеток по сравнению с культивированием в отсутствии рИЛ-18.

Рис.14. Влияние рИЛ-18 на

количество ИФНу-продуцирующих клеток в культуре МНК и ДК пациентов, больных туберкулезом легких.

Примечание: Оценивалась спонтанная секреция ИФН-у и секреция в ответ на антиген ЕвАТ-б (1мкг/мл) у интактных МНК и МНК, культивированных с ДК. (п=16). Группы: 1. МНК; 2. МНК +ИЛ-18; 3. МНК+ДК (без антигена); 4. МНК+ДК (ЕБАТ-б); 5. МНК+ДК (Е8АТ-б)+ИЛ-18

Данные представлены в виде медианы и диапазона значений квартилей. Достоверность различий определена с помощью критериев Уилкоксона и Манна-Уитни. # - по сравнению с интакгными МНК (как спонтанная, так и ЕЭАТ-б-стимулированная секреция). р<0,05.

Кроме того, культивирование МНК с аутологичными ДК приводит к достоверно более высокому уровню как спонтанной продукции ИФНу, так и продукции в ответ на ЕБАТ-б по сравнению с исходной популяцией МНК. При добавлении рИЛ-18 при совместном культивировании МНК и ДК наблюдается максимальная секреция ИФНу, достоверно отличающаяся от продукции цитокина МНК, культивированными с ДК без ИЛ-18 (рисунок 15).

Рис.15. Влияние рИЛ-18 на уровень продукции ИФН-у МНК и ДК больных туберкулезом легких. (п=10).

о спонгажая я ЕЗАГ-6

Примечание: Группы: 1 - МНК; 2- МНК +ИЛ-18; 3-МНК+ДК (без антигена); 4- МНК+ДК (ЕвАТ-б); 5-МНК+ДК (Е8АТ-6)+ИЛ-18.Данные представлены в виде медианы и диапазона значений квартилей. Достоверность различий определена с помощью критериев Уилкоксона и Манна-Уитни. р<0,05.

При определении содержания ИЛ-4 в кондиционных средах МНК, культивированных с ДК и рИЛ-18 достоверных различий не выявлено (данные не приводятся).

Таким образом, использование ИЛ-18 при совместном культивировании МНК и ДК больных туберкулезом легких приводит к выраженному увеличению уровня продукции ИФНу по сравнению с культивированием в отсутствии этого активирующего фактора. При этом, рИЛ-18 не оказывает влияния на продукцию Тх2 цитокина ИЛ-4, что свидетельствует о влиянии ИЛ-18 на формирование Т-клеточного ответа первого типа.

Для оценки эффективности использования рИЛ-18 с целью активации потенциальной цитотоксической активности МНК, культивированных с ДК больных туберкулезом, мы определяли содержание клеток, секретирующих внутриклеточный белок перфорин. Экспрессия перфорина мононуклеарными клетками, предварительно культивированными с ДК, как нагруженными, так и ненагруженными антигеном ЕБАТб, достоверно повышается по сравнению с интактными МНК. При этом добавление рИЛ-18 при совместном культивировании МНК и ДК более выражено стимулирует продукцию молекул перфорина (рисунок 16).

Рис.16. Влияние рИЛ-18 на уровень экспрессии перфорина МНК больных туберкулезом легких (п=8).

Примечание: Группы: 1-МНК; 2- МНК+ИЛ-18; 3-МНК+ДК (без антигена); 4-МНК+ДК (ЕвАТ-б); 5-МНК+ДК (Е5АТ-6)+ИЛ-18

Данные представлены в виде медианы и диапазона значений квартилей. Достоверность различий определена с помощью критериев Уилкоксона и Манна-Уитни. р<0,05.

То есть, использование рИЛ-18 при совместном культивировании ДК и МНК приводит к достоверному и наиболее эффективному повышению содержания перфорин-позитивных клеток с потенциальной цитотоксической активностью.

Таким образом, в исследованиях in vitro показано, что использование рИЛ-18 при совместном культивировании специфических аутологичных

дендритных и мононуклеарных клеток больных вирусным гепатитом В и туберкулезом легких является эффективным способом активацииклеток-эффекторов, что проявляется в значительно более выраженном усилении их пролиферативного потенциала, стимуляции продукции ИФН-у и формировании цитотоксических клеток, экспрессирующих перфорин по сравнению с клетками, культивированными в тех же условиях, но без рИЛ-18. То есть, использование рИЛ-18 в клеточных технологиях для стимуляции клеточных иммунных реакций является обоснованным и целесообразным.

Итак, использование рекомбинантного ИЛ-18 может быть эффективным как при введении в организм, так и при использовании в клеточных технологиях.

Биологическая характеристика трансгенного растения Daucus carota L., несущего ген ИЛ-18 человека.

В своей работе в качестве нового источника рекомбинантных белков мы изучали растения Daucus carota L. (морковь обыкновенная), генетически модифицированного по гену ИЛ-18 человека, в экспериментах in vitro и in vivo.

Трансформация и получение растений Daucus carota L. была осуществлена при сотрудничестве трех институтов: ИХБФМ СО РАН, ИЦиГ СО РАН, ВНИИССОК РАСХН. В ИХБФМ СО РАН было подтверждено наличие гена ИЛ-18 в ДНК растений методом ПЦР.

Для изучения биологических эффектов генетически модифицированной моркови, несущей ген чИЛ-18, были использованы трансгенные растения поколения ТО и Т1. На первом этапе исследования мы определили влияние перорального применения моркови, экспрессирующей ген ИЛ-18 человека, на пролиферативную активность и продукцию ИФНу спленоцитами мышей. Экспериментальные животные содержались на стандартном рационе (интактная группа), либо с добавлением к рациону трансгенной (опытная группа) или обычной моркови того же сорта и выращенной в тех же условиях (контрольная группа). Установлено, что прием в пищу трансгенной моркови в течение 16 дней не влияет на спонтанную и митоген-индуцированную пролиферативную активность спленоцитов. Функциональные свойства спленоцитов мышей, получавших трансгенную морковь, оценивали по способности к продукции ими ИФН-у. Было показано, что пероральное применение трансгенной моркови увеличивает спонтанную продукцию ИФНу спленоцитами мышей опытной и контрольной группы по сравнению с интактной группой. Стимулированная

КонА продукция ИФНу спленоцитами была достоверно выше у мышей опытной группы по сравнению с интактной и контрольной группами (рисунок 17).

14000 и 12000

Рис.17. Влияние

- 10000 -I 8000 -£ 6000 н

I 4000 -

■опытная

перорального применения трансгенной по гену чИЛ-18 моркови на продукцию

ИФН-у спленоцитами

2000 0

мышей.

Примечание: Мыши СВП получали к стандартному рациону трансгенную или обычную морковь в дозе 1,7-2 гр/мышь в течение 16 дней. Клетки селезенки культивировали без или в присутствии КонА (5мкг/мл) 48 часов. ИФН-у определяли в супернатантах методом ЭХЛ. Данные представлены как медиана и размах квартилей. На рисунке стрелками обозначены статистически достоверные различия при р<0,05.

Таким образом, нами было выявлено влияние моркови, несущей ген ИЛ-18, на продукцию спленоцитами мыши регуляторного цитокина ИФНу, что свидетельствует о наличии специфических для ИЛ-18 иммуномодулирующих свойств трансгенной моркови при пероральном применении.

Установлено, что добавление в пищу трансгенной моркови (в дозе 1,7-2 гр/мышь/сут) в течение 16 дней достоверно стимулирует выраженность ГЗТ по сравнению с интактной и контрольной группами. При изучении формирования гуморального иммунного ответа не выявлено достоверного влияния перорального применения трансгенной моркови с ИЛ-18 на уровень первичного гуморального ответа на Т-зависимый антиген (эритроциты барана) (данные не представлены). Трансгенное растение, несущее ген ИЛ-18 человека, при пероральном применении оказывает действие аналогичное рекомбинантному белку, то есть увеличивает продукцию ИФНу иммунокомпетентными клетками и стимулирует выраженность реакции ГЗТ, что отражает влияние этого продукта на формирование клеточного иммунного ответа.

Для изучения противоопухолевых свойств трансгенного растения, несущего ген ИЛ-18, использовалась модель уретан-индуцированной аденокарциномы легких. В наших опытах показано, что употребление в пищу моркови, несущей ген ИЛ-18, приводит к достоверному уменьшению числа аденоматозных узлов у опытной группы по сравнению с контрольной и интактной группами, а также снижению среднего диаметра аденом у опытной и контрольной групп мышей по сравнению с интактной (рисунок 18).

Поскольку данная модель аденомы легких является истинной опухолью и может служить моделью доброкачественного и злокачественного процесса [ВеЩе1 ГМ., 1989], мы предполагаем, что ИЛ-18 человека, продуцирующийся в

клетках трансгенного растения, может оказывать противоопухолевое действие через механизмы, описанные в литературе, а именно стимуляцию экспрессии БавЬ, увеличение цитотоксичности Т- и НК-клеток, ингибирование ангиогенеза, стимуляцию продукции иммунорегуляторных цитокинов и др. Кроме того, возможный механизм действия генетически модифицированной моркови, несущей ген ИЛ-18 человека, при пероральном применении может осуществляться через иммунокомпетентные клетки слизистой кишечника.

диаметр

(ад.) 20

10 -

Диаметр аденоматозных ^ образований_

интактная контрольная опытная

Количество аденоматозных

3 (шт.)

образований

10 -

интактная контрольная опытная

Рис.18. Влияние перорального применения трансгенной моркови, экспрессирующей ген чИЛ-18, на опухолевый процесс в модели уретан-индуцированной аденокарциномы легких.

Примечание: Мыши линии ВАЬВ/с получали трансгенную или обычную морковь в дозе 1,7-2 гр/мышь 16 дней ежедневно, и 2 месяца по 3 раза в неделю. Через 4 месяца легкие фиксировали в 10% формалине и проводили подсчет количества и измерение диаметра аденоматозных образований при помощи бинокулярной лупы. Данные представлены как медиана и размах квартилей. п=36. На рисунке стрелками обозначены статистически достоверные разлйчв/я при р<0,05.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что трансгенная морковь, несущая ген ИЛ-18 человека, при пероральном применении обладает активностью, схожей с рекомбинантным белком, в частности, стимулирует продукцию ИФНу иммунокомпетентными клетками и реакцию ГЗТ, а также проявляет противоопухолевую активность в модели уретан-индуцированной аденокарциномы легких.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итак, в результате проведенных исследований нами показано, что рекомбинантный ИЛ-18, полученный по оригинальной методике, обладает иммунорегуляторной активностью, стимулируя продукцию ИФНу и ФНО мононуклеарными клетками периферической крови, увеличивая выраженность реакции гиперчувствительности замедленного типа. Рекомбинантные ИЛ-18 и его антагонист ИЛ-18 связывающий белок обладают противоопухолевой активностью, но в разных моделях. Так, рИЛ-18 при внутривенном введении уменьшает вес солидной опухоли меланомы В16 и продолжительность жизни мышей, а ИЛ-18СБ уменьшает количество опухолевых очагов в гематогенной

метастатической модели меланомы В16, что свидетельствует о разных механизмах подавления опухолевых процессов для указанных белков и целесообразности их применения в цитокиновой и антицитокиновой терапии онкопатологии. ИЛ-18 также эффективен при использовании в клеточных технологиях для активации функций клеток-эффекторов противовирусного и антибактериального иммунного ответа. Кроме того, ИЛ-18 может участвовать в механизмах несостоятельности иммунного ответа при хронизации и прогрессии гепатита В, поскольку уровень продукции эндогенного ИЛ-18, являющегося одним из активных участников противовирусной защиты, связан с аллельными вариантами его гена, что может отражаться на формировании эффективного иммунного ответа у каждого конкретного индивида. При исследовании эффективности перорального использования генетически модифицированного растения моркови, несущей ген ИЛ-18 человека, показана принципиальная возможность использования этого продукта для стимуляции реакций клеточного иммунного ответа. Таким образом, рИЛ-18 является одним из перспективных иммунорегуляторных факторов для применения как в цитокинотерапии иммуноопосредованных заболеваний, так и в клеточных технологиях.

ВЫВОДЫ:

1. Рекомбинантный ИЛ-18 человека, полученный по оригинальной методике (продуцент E.coli), связывается с моно- и поликлональными анти-ИЛ-18 антителами, стимулирует продукцию ИФНу, ФИО в культурах МНК человека и реакцию гиперчувствительности замедленного типа у экспериментальных животных in vivo, что свидетельствует о специфической иммунохимической активности выделенного белка и его способности активировать клеточный иммунитет.

2. Рекомбинантный ИЛ-18 связывающий белок человека, полученный по оригинальной методике (продуцент E.coli), взаимодействует с поликлональными анти-ИЛ-18СБ антителами, в экспериментах in vitro отменяет стимулирующий эффект рИЛ-18 на продукцию ФИО мононуклеарными клетками человека и снижает ЛПС-индуцированную летальность экспериментальных животных in vivo, что подтверждает его специфические иммунохимические свойства и блокирующий эффект в отношении ИЛ-18.

3. Рекомбинантный ИЛ-18 связывающий белок снижает уровень продукции ФИО, стимулированный КонА, до спонтанного уровня, что свидетельствует о роли ИЛ-18 в регуляции провоспалительной активности мононуклеарных клеток.

на существование различных механизмов подавления опухолевого роста указанными белками.

5. Генотип СС, аллель С в позиции -137 промоторного участка гена ИЛ-18 и гапло-генотипы -607СС/-137СС и -607AA/-137GC у здоровых доноров сопряжены с низкой продукцией белка ИЛ-18, генотип CA, аллель А в позиции -607 и гапло-генотип -607CN/-137GN ассоциированы с относительно высоким уровнем продукции ИЛ-18, что свидетельствует о генетической детерминированности уровня продукции белка ИЛ-18.

6. Больные хроническим ВГВ характеризуются снижением частоты встречаемости генотипов -607АА и -607AA/-137CG и увеличением частоты встречаемости генотипа -607СС/-137СС по сравнению со здоровыми донорами, что указывает на роль генетического фактора в патогенезе вирусного гепатита В. 7. ИЛ-18 в культурах МНК больных хроническим вирусным гепатитом В восстанавливает исходно сниженный Тх1 ответ и усиливает генерацию цитотоксических Т-клеток, о чем свидетельствует усиление пролиферативной активности МНК, продукции ИФНу и возрастание доли Т-клеток с внутриклеточным содержанием ИФНу и перфорина при сокультивировании с ДК, нагруженными антигеном вируса гепатита В.

7. Совместное культивирование ДК, нагруженных антигеном М. tuberculosis (ESAT-6) и МНК больных туберкулезом легких в присутствии рИЛ-18 приводит к усилению антиген-специфических клеточных реакций, что подтверждается возрастанием продукции ИФНу, а также увеличением количества ИФНу-продуцирующих- и цитотоксических Т-лимфоцитов.

8. Пероральное применение трансгенной по гену ИЛ-18 моркови Daucus carota L. приводит к усилению продукции ИФНу спленоцитами, увеличению реакции гиперчувствительности замедленного типа и угнетению опухолевого роста в уретан-индуцированной модели аденокарциномы легких у мышей, что свидетельствует о наличии биологического эффекта ИЛ-18 в составе трансгенного растения.

9. Рекомбинантный белок ИЛ-18 обладает рядом специфических биологических эффектов и может быть эффективен для стимуляции клеточных иммунных реакций при онкологических состояниях, а также в клеточных технологиях при разработке дендритно-клеточных вакцин для модуляции иммунного ответа при инфекционных процессах.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Якушенко Е.В., Лопатникова Ю.А., Храпов Е.А., Курамшин Д.Х., Лыков А.П., Ведина Л.В., Филипенко М.Л., Сенников C.B., Власов В.В., Козлов В.А. Биологическая активность рекомбинантного человеческого ИЛ-18 // Материалы 6-й отчетной конференции ГУ НИИКИ СО РАМН. 5-6 марта 2003 г.-с 256.

2. Якушенко Е.В., Лопатникова Ю.А., Храпов Е.А., Курамшин Д.Х., Лыков А.П., Ведина Л.В., Филипенко М.Л., Сенников C.B., Власов В.В., Козлов В.А. Биологическая активность рекомбинантного человеческого ИЛ-18 // Материалы 7-го Всероссийского научного Форума с международным участием им. Акад. В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге». 2326 июня. Медицинская иммунология. - 2003. - Том 5, № 3-4. - С.429.

3. Якушенко Е.В., Сенников C.B., Козлов В.А. Эритропоэтин в' лечении канцериндуцированных анемий II Евразийский медицинский журнал. - 2003.

- № 1. - С.19-25.

4. Лопатникова Ю.А., Якушенко Е.В., Храпов Е.А., Балданов Н., Жеребцова И.О., Филиппенко М.Л., Сенников C.B., Козлов В.А. ИнТерлейкин-18: противоопухолевая активность И Материалы объединенного иммунологического форума, Екатеринбург 2004. Russian Journal of Immunology. - 2004. - V.9. - № 1. - P. 49.

5. Якушенко E.B., Сенников C.B., Козлов В.А. Проблемы использования рекомбинантного эритропоэтина для лечения канцериндуцированных анемий // В сб.: «Система цитокинов. Теоретические и клинические аспекты». -Новосибирск, Наука, 2004. - С. 286-296.

6. Якушенко Е.В., Лопатникова Ю.А., Сенников C.B. Характеристика интерлейкин-18 и его роль в иммунном ответе И В сб.: «Система цитокинов. Теоретические и клинические аспекты». - Новосибирск, Наука. 2004. - С. 125-140.

7. Якушенко Е.В., Лопатникова Ю.А., Храпов М.Л., Филипенко Е.А., Пустошилова Н.М., Закабунин А.И., Сенников C.B., Козлов В.А. Получение рекомбинантных цитокинов IL-18 и IL-18-связывающего протеина и исследование их биологической активности // Молекулярн. основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунотерапии Матер. VIII Всеросс. научн. Форума с междунар. участ. им. акад. В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге». - Мед. иммунология. - 2004. - Т. 6, № 35. - С. 263-264.

8. Yakushenko E.V., Lopatnikova J.A., Khrapov Е.А., Filipenko M.L., Pustoshilova N.M., Zakabunin A.L., Sennikov S.V., Kozlov V.A. Biological and specific activity of recombinant human Interleukin-18 II Cytokine network, and Regulatory Cells.-2004.-P. 423-428.

9. Yakushenko E.V., Lopatnikova J.A., Khrapov E.A., Filipenko M.L., Sennikov S.V., Vlasov V.V., Kozlov V.A. Preclinical trials of Recombinant Human Interleukin-18 // Clinical and Investigative Medicine. - 2004. - № 4. - P. 70B.

10. Якушенко E.B., Лопатникова Ю.А., Сенников C.B. Интерлейкин-18 и его роль в иммунном ответе И Медицинская иммунология. - 2005 . - Т. 7, № 4.

- С. 355-364.

П.Шевченко Ю.А., Якушенко Е.В., Романов В.В., Сенников C.B., Козлов В.А. Применение технологии ELTISpot для оценки специфического иммунного ответа на туберкулезный антиген ESAT-6 мононуклеарными клетками

больных туберкулезом // Матер. Всеросс. науч. симп. с междунар. участием: «Цитоки-ны. Стволовая клетка. Иммунитет», Новосибирск. 19-21 июля. -Цитокины и воспаление. - 2005. - Т. 4, № 2. - С. 103.

12. Лопатникова Ю.А., Якушенко Е.В., Дейнеко Е.В., Храпов Е.А., Воронина E.H., Филипенко М.Л., Сенников C.B., Шумный В.К., Козлов В.А. Изучение иммунорегуляторных эффектов перорального применения трансгенной моркови несущей ген ИЛ-18 // Матер. Всеросс. науч. симп. с междунар. участием: «Цитоки-ны. Стволовая клетка. Иммунитет», Новосибирск. 19-21 июля. - Цитокины и воспаление. - 2005. - Т. 4, № 2. - С. 119.

13. Лопатникова Ю.А., Якушенко Е.В., Храпов Е.А., Воронина E.H., Филипенко М.Л., Пустошилова Н.М., Закабунин А.И., Сенников C.B., Козлов В.А. Исследование биологической активности рекомбинантных IL-18 и IL-18 связывающего белка // Матер. Всеросс. науч. симп. с междунар. участием: «Цитокины. Стволовая клетка. Иммунитет», Новосибирск. 19-21 июля. -Цитокины и воспаление. - 2005. - Т. 4, № 2. - С. 120.

14. Храпов Е.А., Воронина E.H., Закабунин А.И., Лопатникова Ю.А., Якушенко Е.В., Сенников C.B. и др. Получение рекомбинантного интерлейкина-18 человека в клетках E.coli. // Матер. Всеросс. науч. симп. с междунар. участием: «Цитокины. Стволовая клетка. Иммунитет», Новосибирск. 19-21 июля. - Цитокины и воспаление. - 2005. - Т. 4, № 2. - С. 125.

15. Лопатникова Ю.А., Якушенко Е.В., Храпов Е.А., Воронина E.H., Сенников C.B., Филипенко М.Л., Дейнеко Е.В., Закабунин А.И., Пустошилова Н.М., Шумный В.К., Власов В.В., Козлов В.А. ИЛ-18: биологические свойства и противоопухолевая активность рекомбинантного белка итрансгенного растения DAUCUS CAROTA L // Дни иммунологии в Сибири: Матер. Всеросс. научно-практ. конф., посвящен. 15-летнему юбилею Красноярского Краевого Центра по профилактике и борьбе со СПИД и другими инфекционными заболеваниями. (7-9 сентября 2005), Красноярск, 2005. - С. 134-136.

16. Сенников C.B., Филипенко М.Л., Якушенко Е.В., Храпов Е.А., Лопатникова Ю.А., Воронина E.H., Дейнеко Е.В., Закабунин А.И., Пустошилова Н.М., Шумный В.К., Власов В.В., Козлов В.А. ИЛ-18 как стимулятор клеточного иммунитета // Сборник тезисов 1 Российско-американ-ской конференции «Биотехнология и онкология». - Санкт-Петербург, 29-31 мая 2005. - С. 35.

17. Якушенко Е.В., Лопатникова Ю.А., Задорожный A.B., Закабунин А.И., Пустошилова Н.М., Филипенко М.Л., Храпов Е.А., Воронина E.H., Сенников C.B., Козлов В.А. Экспрессия ИЛ-18 связывающего белка человека в клетках Е. COLI. И изучение биологической активности рекомбинантного белка // Сборник тезисов 1 Российско-американ-ской конференции «Биотехнология и онкология». - Санкт-Петербург 29-31 мая 2005. - С. 146-147.

18. Лопатникова Ю.А., Якушенко Е.В., Сенников C.B., Храпов Е.А., Воронина E.H., Филипенко М.Л., Дейнеко Е.В., Филипенко Е.А., Пухначева H.A., Тюкавин Г.Б., Шмыкова H.A., Шумный В.К., Козлов В.А. Трансгенная

морковь, экспрессирующая ИЛ-18 и ее иммуномодулирующие свойства // «Иммунология Урала». - 2005. - №1(4). - С. 140-141.

19.Якушенко Е.В., Лопатникова Ю.А., Храпов Е.А., Воронина E.H., Филипенко M.JI., Закабунин А.И., Пустошилова Н.М., Сенников C.B., Власов В.В., Козлов В.А. Рекомбинантный человеческий интерлейкин-18: биологическая активность и противоопухолевые свойства // «Иммунология Урала». - 2005. -№1(4).-С. 162-163.

20. Храпов Е.А., Задорожный A.B., Воронина E.H., Филипенко М.Л., Козлова Ю.Н., Литовченко Л.Л., Каньшина A.B., Закабунин А.И., Пустошилова Н.М., Якушенко Е.В., Лопатникова Ю.А., Сенников C.B., Козлов В.А. Получение и изучение биологической активности рекомбинантного ИЛ-18 связывающего белка // Материалы Всероссийской конференции «Фундаментальные науки - медицине». - Новосибирск, 2005. - С. 105.

21. Шевченко Ю.А., Якушенко Е.В., Сенников C.B. Оценка специфического иммунного ответа на туберкулезный антиген ESAT-6 мононуклеарными клетками больных туберкулезом на основе технологии ELISPOT // Материалы ежегодной конкурса-конференции студентов и молодых ученых «Авиценна - 2005». - Новосибирск, 2005. - С. 115-116.

22. Khrapov Е.А., Lopatnikova J.A., Voronina E.N., Yakushenko E.V., Zakabunin

A.I., Sennikov S.V., Pustoshilova N.M., Kozlov V.A., Filipenko M.L. Expression of human interleukin-18 in E.coli and biological activity of recombinant protein // Biotechnology in biology and medicine. Editors: A.M. Egorov and G. Zaikov, 2006, Nova Science Publishers, Inc., New York. - P. 13-24.

23. Yakushenko E.V., Lopatnikova J.A., Khrapov E.A., Deineko E.V., Filipenko M.L., Voronina E.N., Turchinovich A.A., Filipenko E.A., Pukhnatcheva N.A., Tukavin G.B., Schmikova N.A., Shumny V.K., Sennikov S.V., Kozlov V.A. Use of transgenic carrot plants producing human interleukin-18 for modulation of mouse immune response // Biotechnology in biology and medicine. Editors: A.M. Egorov and G. Zaikov, 2006, Nova Science Publishers, Inc., New York. - P. 97107.

24. Якушенко E.B., Лопатникова Ю.А., Козлова Ю.Н., Пустошилова Н.М., Филипенко М.Л., Храпов Е.А. и др. Получение рекомбинантного интерлейкин-18 связывающего белка, изучение его биологической активности и антиметастатичекого действия // Московская междунарожная конференция «Биотехнология и медицина» материалы московской международной конференции. - 2006. - С. 150.

25. Сенников C.B., Жеребцова Н.О., Хрипко О.П., Шевченко Ю.А., Якушенко Е.В., Облеухова И.А. и др. Модуляция специфического иммунного ответа аутологичными активированными дендритными клетками in vitro // Материалы Московской международной конференции «Биотехнология и медицина», 14-17 марта 2006.

26. Шевченко Ю.А., Хрипко О.П., Якушенко Е.В., Пронкина Н.В., Кожевников

B.C., Романов В.В. и др. Оптимизация протоколов получения антиген-

активированных дендритных клеток для стимуляции специфического иммунного ответа in vitro при туберкулезе легких И Материалы V конференции иммунологов Урала. 30 октября - 1 ноября. Оренбург, 2006. -Иммунология Урала. - 2006. - №1(5). _ с. 181-182.

27.Хрипко О.П., Шевченко Ю.А., Якушенко Е.В., Пронкина Н.В., Кожевников B.C., Сенников С.В., Козлов В.А. Индукция иммунного ответа против Hbcorag in vitro с помощью аутологичных активированных дендритных клеток // Материалы V конференции иммунологов Урала. 30 октября - 1 ноября. Оренбург, 2006. - Иммунология Урала. - 2006. - №1(5). - С. 32-33.

28.Sennikova N.S., Khripko Y.I. , Lopatnikova J.A., Yakushenko E.V., Filipenko M.L., Kozlov V.A. Single-nucleotide polymorphisms of the interleukin-18 gene promoter region in healthy donors of southwest Siberian population // European Cytokine Network, (Abstracts 6th International Cytokine Conference). - 2006. - v. 17, Supplement. 02-13/P, - P.38-39.

29. Yakushenko E.V., Lopatnikova J.A., Sennikov S.V., Khrapov E.A., Voronina E.N., Filipenko M.L. и др. Expression of the human IL 18 binding protein in e. coli cells and study of its biological properties // European Cytokine Network, (Abstracts 6th International Cytokine Conference). - 2006. - v. 17, Supplement. 14-05/P. -P.136

30.Сенникова H.C., Хрипко Ю.И., Лопатникова Ю.А., Якушенко Е.В., Филипенко М.Л., Козлов В.А., Сенников С.В. Полиморфизм промоторного участка гена ИЛ-18 у здоровых доноров Юго-Западной Сибири // Материалы международной конференции «Фундаментальные науки для биотехнологии и медицины. 3-7 сентября. - Новосибирск. - 2006. - С. 102.

31. Хрипко О.П„ Сенникова Н.С., Лопатникова Ю.А., Хрипко Ю.И., Филиппенко М.Л., Якушенко Е.В., Сенников С.В., Козлов В.А. Аллельный полиморфизм гена ИЛ-18 и уровень его продукция мононуклеарными клетками здоровых доноров Юго-Западной Сибири // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2006. - №3,1(14). - С. 266-269.

32. Якушенко Е.В., Хрипко О.П., Пронкина Н.В., Красильникова И.В., Романов

B.В., Романов В.В., Сенников С.В., Козлов В.А. Модуляция противоинфекционного иммунного ответа аутологичными активированными дендритными клетками при гепатите и туберкулезе легких in vitro // Материалы Российской научно-практической конференции «Современные технологии в иммунологии: иммунодиагностика и иммунотерапия». Russian Journal of Immunology. - 2006. - v. 9, suppl. 3.

33. Лопатникова Ю.А., Якушенко E.B., Храпов E.A., Воронина Е.Н., Сенников

C.В., Филипенко М.Л., Дейнеко Е.В., Пустошилова Н.М., Шумный В.К., Козлов В.А. ИЛ-18: биологические свойства и противоопухолевая активность рекомбинантного белка и трансгенного растения Daucus carotaL несущего ген ИЛ-18 человека // Иммунопатогенез и иммунотерапия основных заболеваний человека: от эксперимента к клинике. Материалы 7-й отчетной конференции ГУ НИИКИ СО РАМН. - Новосибирск, 2006. - С. 61-67.

34.Якушенко Е.В., Лопатникова Ю.А., Сенников C.B., Храпов Е.А., Воронина E.H., Филипенко М.Л., Козлова Ю.Н., Пустошилова Н.М., Козлов В.А. Получение рекомбинантного интерлейкин-18 связывающего белка и исследование его биологической и специфической активности // Иммунопатогенез и иммунотерапия основных заболеваний человека: от эксперимента к клинике. Материалы 7-й отчетной конференции ГУ НИИКИ СО РАМН. - Новосибирск, 2006. - С. 94-98.

35. Хрипко О.П., Якушенко Е.В., Красильникова И.В., Позднякова Л.Л., Толоконская Н.П., Сенников C.B., Козлов В.А. Использование интерлейкина-18 для генерации цитотоксических мононуклеарных клеток больных гепатитом в in vitro // 3rd International Confer. Basic Science for Medicine. - September 2-8,2007.-P. 91.

36. Лопатникова Ю.А., Якушенко E.B., Храпов E.B., Дейнеко Е.В., Воронина E.H., Филиппенко М.Л., Шумный В.К., Сенников C.B., Козлов В.А. Иммунорегуляторные свойства перорального применения трансгенной моркови Daucus carota L., несущей ген интерлейкина-18 человека // З"1 International Confer. Basic Science for Medicine. - September 2-8,2007. - P. 42

37. Шевченко Ю.А., Якушенко E.B., Лаушкина Ж.А., Романов В.В., Свистельник A.B., Сенников C.B., Козлов В.А. Аутологичные дендритные клетки как основа для модуляции специфического противотуберкулезного клеточного иммунного ответа in vitro // 3,<J International Confer. Basic Science for Medicine. - September 2-8,2007. - P. 86

38. Хрипко О.П., Сенникова H.C., Лопатникова Ю.А., Хрипко Ю.И., Филиппенко М.Л., Якушенко Е.В., Козлов В.А., Сенников C.B. Аллельный полиморфизм гена ИЛ-18 и уровень его продукции мононуклеарными клетками здоровых доноров Юго-Западной Сибири И Молекулярные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунотерапии Матер. XI Всеросс. научн. Форума с междунар. участ. им. акад. В.ИИоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге». Мед. Иммунология. - 2007. - Т. 9, № 2-3. - С. 314-315.

39. Лопатникова Ю.А., Якушенко Е.В., Храпов Е.В., Дейнеко Е.В., Воронина E.H., Филиппенко М.Л., Шумный В.К., Сенников C.B., Козлов В.А. Иммунорегуляторные свойства перорального применения трансгенной моркови Daucus carota L., несущей ген ИЛ-18 человека // Молекулярные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунотерапии Матер. XI Всеросс. научн. Форума с междунар. участ. им. акад. В.ИИоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге». Мед. Иммунология. - 2007. - Т. 9, № 2-3. - С. 150.

40. Хрипко О.П., Якушенко Е.В., Сенников C.B., Пронкина Н.В., Красильникова И.В., Позднякова Л.Л., Кожевников B.C., Козлов В.А. Модуляция противовирусного иммунного ответа аутологичными активированными дендритными клетками при гепатите в in vitro // Молекулярные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунотерапии Матер. XI Всеросс. научн. Форума с междунар. участ. им. акад. В.И.Иоффе «Дни

иммунологии в Санкт-Петербурге». Мед. Иммунология. - 2007. - Т. 9, № 2-3. - С. 253.

41. Шевченко Ю.А., Сенников С.В., Якушенко Е.В., Лаушкина Ж.А., Романов

B.В., Тугов А.А., Козлов В.А. Влияние аутологичных антиген-активированных дендритных клеток на формирование иммунного ответа in vitro при туберкулезе // Молекулярные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунотерапии Матер. XI Всеросс. научн. Форума с междунар. участ. им. акад. В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге». Мед. Иммунология. - 2007. - Т. 9, № 2-3. - С. 254.

42. Якушенко Е.В., Лопатникова Ю.А., Храпов Е.В., Воронина Е.Н., Филиппенко М.Л., Козлова Ю.Н., Пустошилова Н.М., Шурлыгина А.В., Сенников С.В., Козлов В.А. Получение рекомбинантного интерлейкина-18 и изучение его противоопухолевой активности // Бюлл. СО РАМН. - 2007. -№2 (124).-С. 23-26.

43. Шевченко Ю.А., Якушенко Е.В., Лаушкина Ж.А., Романов В.В., Свистельник А.В., Сенников С.В., Козлов В.А. Индукция специфического противоинфекционного иммунного ответа с помощью аутологичных антиген-активированных дендритных клеток у пациентов, больных туберкулезом // Омский научный вестник. - 2007. - № 3, приложение 2. -

C. 142-144.

44.Хрипко О.П., Якушенко Е.В., Сенников С.В., Пронкина Н.В., Красильникова И.В., Позднякова Л.Л., Толоконская Н.П., Кожевников B.C., Козлов В.А. Модуляция противовирусного иммунного ответа аутологичными активированными дендритными клетками при гепатите в in vitro // Омский научный вестник. - 2007. - № 3, приложение 2. - С. 376-378.

45.Khripko О.Р., Sennikova N.S., Lopatnikova Y.A., Khripko Y.I., Filipenko M.L., Yakushenko E.V., Kozlov V.A.K), Sennikov S.V. Allele polymorphism of IL-18 gene and level its production by mononuclear cells of healthy donors of Southwest Siberia // IMMUNORI02007. 13th International Congress of Immunology, Rio de Janeiro, 2007. - P. 98.

46. Shevchenko Y.A., Sennikov S.V., Laushkina Z.A., Yakushenko E.V., Romanov V.V., Tugov A.A., Kozlov V. A. Modulation of the specific antituberculosis immune response in vitro by means of antigen-activated dendritic cells II IMMUNORI02007. 13th International Congress of Immunology, Rio de Janeiro, 2007.-P. 183.

47.Хрипко О.П., Шевченко Ю.А., Облеухова И.А., Гончаров М.А., Якушенко Е.В., Сенников С.В., Пронкина Н.В., Бровкина Г.И., Кожевников B.C., Козлов В.А. Модуляция противоопухолевого иммунного ответа аутологичными активированными дендритными клетками при раке яичника in vitro И Сибирский онкологический журнал. - 2007. - Приложение 2. - с. 120-121.

48.Хрипко О.П., Облеухова И.А., Гончаров М.А., Якушенко Е.В., Сенников С.В., Пронкина Н.В., Бровкина Г.И., Кожевников B.C., Козлов В.А.

Модуляция противоопухолевого иммунного ответа аутологичными активированными дендритными клетками при раке яичника in vitro II „Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии". Сборник материалов II региональной конференции молодых ученых им.академика РАМН Н.В. Васильева 27 апреля 2007 г. Томск. - С.75-76

49. Shevchenko Y., Sennikov S., Laushkina J., Yakushenko E,, Romanov V., Tugov

A., Kozlov V. Autologous dendritic cell for modulation of the specific antituberculosis immune response in vitro II World Immune Regulation Meeting. Final Programme and Abstracts. 11-15 April Davos, Switzerland. - 2007. - P. 143144.

50.Якушенко E.B., Шевченко Ю.А., Хрипко О.П., Жеребцова Н.О., Облеухова И.А, Силков А.Н., Сенников С.В., Козлов В.А. Методические подходы к оценке эффективности генерации дендритных клеток и модуляции специфического иммунного ответа II Тезисы объединенного иммунологического форума. Санкт-Петербург, 30 июня-5 июля, 2008. Российский иммунологический журнал. - 2008. - Т. 2(11), №2-3. - С. 126127.

51.Сенникова Н.С., Хрипко О.П., Лопатникова Ю.А., Хрипко Ю.И., Филипенко М.Л., Якушенко Е.В., Козлов В.А., Сенников С.В. Влияния аллельного полиморфизма промотора гена интерлейкина-18 на уровень его продукции мононуклеарными клетками // Тезисы объединенного иммунологического форума. Санкт-Петербург, 30 июня-5июля, 2008. Российский иммунологический журнал. - 2008. - Т. 2(11), №2-3. - С. 136.

52. Якушенко Е.В., Лопатникова Ю.А., Сенников С.В., Шаталина М.Н., Филиппенко Е.А., Дейнеко Е.В., Воронина Е.Н., Храпов Е.А., Филиппенко М.Л., Шумный В.К., Козлов В.А. Использование трансгенных растений моркови - продуцентов интерлейкина-18 человека для модуляции иммунных реакций у мышей // Бюлл. СО РАМН. - 2008. - № 3 (май-июнь). - С. 70-75.

53. Шевченко Ю.А., Якушенко Е.В., Сенников С.В., Лаушкина Ж.А., Романов

B.В., Свистельник А.В., Козлов В.А. Модуляция противотуберкулезного иммунного ответа in vitro с помощью антиген-активированных дендритных клеток // Проблемы туберкулеза и болезней легких. - 2008. - №2. - С. 3335.

54. Хрипко О.П., Якушенко Е.В., Сенников С.В., Красильникова И.В., Козлов В.А. Использование дендритных клеток и интерлейкина-18 для модуляции иммунного ответа против HBcAg in vitro // Бюллетень СО РАМН. - 2008. -№5.-С. 109-113.

55.Khripko О.Р., Sennikova N.S., Lopatnikova J.A., Khripko J.I., Filipenko M.L., Khrapov E.A., Gelfgat E.L., Yakushenko E.V., Kozlov V.A., Sennikov S.V. Association of Single Nucleotide Polymorphisms in the IL-18 Gene with Production of IL-18 Protein by Mononuclear Cells from Healthy Donors II Mediators of Inflammation. - 2008. - 2008:309721. Epub 2008 Oct 20. 6 pages.

56. Сенников C.B., Шевченко Ю.А., Хрипко О.П., Облеухова И.А., Якушенко Е.В., Лаушкина Ж.А., Лебедева В.А., Ласкавая Е.Г., Гончаров М.А., Свиетельник A.B., Красильникова И.В., Позднякова Л.Л., Козлов В.А. Экспериментальные подходы к разработке клеточных протоколов модуляции специфических иммунных реакций с помощью дендритных клеток // Сб. науч. тр.: Клеточные технологии: Теоретические и прикладные аспекты / Под ред. В.А.Козлова, С.В.Сенникова, Е.Р.Черных, А.А.Останина. - Новосибирск: Наука, 2009. - С. 53-75.

57. Хрипко О. П., Якушенко Е. В., Сенникова Н. С., Хрипко Ю. И., Лопатникова Ю. А., Филиппенко М. Л., Козлов В. А., Сенников С. В. Аллельный полиморфизм промотора гена интерлейкина-18 при хроническом гепатите В // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2009. - №1. - С. 18-22.

58.Перминова Е.И., Гришина Л.В., Щепотина Е.Г., Голикова Е.А., Пашкина Е.А., Магаева A.A., Итин В.И., Терехова О.Г., Якушенко Е.В., Козлов В.А. Токсическое действие и распределение в организме оксида железа Fe304 // Материалы Всероссийской научно-практ. конф. с междунар. участием «Дни иммунологии в Сибири», 1-3 марта 2010 г., Красноярск. - 2010. - С. 139-140.

59. Курилин В.В., Облеухова И.А., Якушенко Е.В., Лопатникова Ю.А., Якушенко В.К., Сенников C.B. Стимуляция цитотоксического ответа против опухолевых клеток больных колоректальным раком в культуре мононуклеарных клеток с помощью дендритных клеток // Материалы Всероссийской научно-практ. конф. с междунар. участием «Дни иммунологии в Сибири», 1-3 марта 2010 г., Красноярск. - 2010. - С. 247-249.

60. Якушенко Е.В., Лопатникова Ю.А., Храпов Е.А., Закабунин А.И., Пустошилова Н.М., Филиппенко М.Л., Сенников C.B., Козлов В.А. Биологическая, активность рекомбинантного человеческого ИЛ-18-связывающего белка и перспективы его клинического применения // Материалы Всероссийской научно-практ. конф. с междунар. участием «Дни иммунологии в Сибири», 1-3 марта 2010 г., Красноярск. - 2010. - С. 277-278.

61. Якушенко Е.В., Лопатникова Ю.А., Сенников C.B., Козлов В.А. Биологическая активность интерлейкина 18 и интерлейкина 18-связывающего белка в тестах in vitro и in vivo. Перспективы клинического применения И Мат. Всеросс. научн. конф. «Молекулярно-генетические основы функционирования цитокиновой сети в норме и при патологии». Новосибирск, 15-17 сентября 2010 г. // Цитокины и воспаление. - 2010. - Т. 9, № 3. - С. 83-84.

62. Курилин В.В., Облеухова И.А., Якушенко Е.В., Якушенко В.К. Влияние дендритных клеток и цитокинов на стимуляцию цитотоксического ответа против опухолевых клеток больных колоректальным раком в культуре мононуклеарных клеток // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2010. - №2/1(29). - С. 159-160.

63. Курилин В.В., Облеухова И.А., Якушенко Е.В., Лопатникова Ю.А., Якушенко В.К., Сенников C.B. Модуляция цитотоксического противоопухолевого ответа в культуре мононуклеарных клеток с помощью

дендритных клеток // Сибирский онкологический журнал. - 2010. - № S1. -С.64-65.

64. Лоиатникова Ю.А., Якушенко Е.В., Храпов Е.А., Козлов В.А., Филиппенко М.Л., Сенников C.B. Биологическая активность рекомбинантного человеческого ИЛ-18-связывающего белка // Российский иммунологический журнал. - 2010. - Т. 4(13), № 2. - С. 163-167.

65. Курилин В.В., Облеухова И.А., Куликова Е.В., Рябкова Ю.Н., Якушенко Е.В., Лопатникова Ю.А., Якушенко В.К., Сенников C.B., Карпенко Л.И., Нечаева Е.А., Ильичев A.A., Козлов В.А. Иммунопатогенез и иммунотерапия основных заболеваний человека: от эксперимента к клинике / Под ред. акад. РАМН В.А.Козлова и д.м.н., проф. С.В.Сенникова. Новосибирск, 2011. - С. 77-79.

66. Курилин В.В., Облеухова И.А., Куликова Е.В., Якушенко Е.В., Якушенко В.К., Сенников C.B. Модуляция опухолеспецифичной цитотоксической иммунной реакции в совместной культуре мононуклеарных и дендритных клеток больных колоректальным раком // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2011. - № 2/1 (35). - С. 164-165.

Патенты

67. Сенников C.B., Якушенко Е.В., Хрипко О.П., Козлов В.А. Способ генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с активностью против клеток, инфицированных вируса гепатита В // Патент на изобретение №2366707 Российская Федерация. Приоритет от 11.03.2008 опубликовано 10.09.2009 Бюл №25.

68. Сенников C.B., Якушенко Е.В., Шевченко Ю.А., Лаушкина Ж.А., Свистельник A.B., Козлов В.А. Способ генерации антиген-специфических противотуберкулезных клеток // Патент на изобретение №2378373 Российская Федерация приоритет от 04.02.08. опубликовано 10.01.2010г. Бюл. №1.

69.Дейнеко Е.В., Шумный В.К., Филипенко Е.А., Загорская A.A., Сидорчук Ю.В., Филипенко М.Л., Власов В.В., Сенников C.B., Козлов В.А., Якушенко Е.В. Способ получения трансгенных растений моркови, продуцирующих интерлейкин-10 человека // Патент на изобретение №2374321 Российская Федерация. Приоритет от 12.12.2007, опубликовано 27.11.2009

Отпечатано в типографии Новосибирского Государственного технического университета 630092, г.Новосибирск, пр. К. Маркса, 20, Тел./факс (383) 346-08-57 Формат 60 х 84/16. Объем 2.75 п.л. Тираж 100 экз. Заказ 45. Подписано в печать 26.12.2011 г.

Оглавление диссертации Якушенко, Елена Владимировна :: 2012 :: Новосибирск

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1 Молекулярная структура интерлейкина-18, рецептора ИЛ-18 и интерлейкин-18 связывающего белка.

1.1.1 Структура гена ИЛ-18.

1.1.2 Молекулярная характеристика белка ИЛ-18.

1.1.3 Молекулярная характеристика рецептора ИЛ-18.

1.1.4 Молекулярная характеристика ИЛ-18 связывающего белка.

1.2 Биологические эффекты интерлейкина-18.

1.2.1 Биологические эффекты ИЛ-18 in vitro.

1.2.2 Биологические эффекты ИЛ-18 in vivo.

1.2.3 Биологические свойства ИЛ-18 связывающего белка.

1.2.4 Противоопухолевая активность ИЛ-18.

1.2.5 Антибактериальная активность ИЛ-18.

1.2.6 Противовирусное действие ИЛ-18.

1.2.7 Роль ИЛ-18 в патогенезе иммуноопосредованных заболеваний.

1.3 Использование ИЛ-18 для лечения онкозаболеваний.

Глава 2. Материалы и методы.

Глава 3. Результаты собственных исследований.

3.1 Получение и характеристика рчИЛ-18.

3.1.1 Иммунохимическая характеристика рчИЛ-18, полученного из продуцента E.coli.

3.1.2 Биологические свойства рчИЛ-18 in vitro.

3.1.3 Влияние рчИЛ-18 на формирование иммунного ответа в экспериментальных моделях in vivo.

3.2 Получение и характеристика ИЛ-18 связывающего белка.

3.2.1 Иммунохимическая характеристика ИЛ-18СБ.

3.2.2 Изучение биологической активности рчИЛ-18СБ in vitro.

3.2.3 Исследование биологической активности рчИЛ-18СБ in vivo.

3.3 Противоопухолевая активность рчИЛ-18 и рчИЛ18СБ.

3.3.1 Противоопухолевая активность рчИЛ-18 в модели солидной меланомы В16.

3.3.2 Противоопухолевая активность рчИЛ-18СБ.

3.4 Изучение полиморфизма промоторного региона гена ИЛ-18.

3.4.1 Изучение ассоциированности продукции ИЛ-18 в культуре МНК

ПК с генотипом ИЛ-18.

3.4.1.1 Изучение ассоциированности продукции ИЛ-18 в культуре МНК ПК здоровых доноров с генотипом - 607 С—>А ИЛ-18.

3.4.1.2 Изучение ассоциированности продукции ИЛ-18 МНК здоровых доноров с генотипом -137G-»C ИЛ-18.

3.4.1.3 Изучение влияния генотипа промотора гена ИЛ-18 на уровень продукции ИЛ-18 в культуре МНК ПК.

3.4.2 Анализ распределения полиморфных вариантов гена ИЛ-18 среди здоровых доноров и больных ВГВ.

3.5 Использование рИЛ-18 для индукции специфического иммунного ответа in vitro.

3.5.1 Разработка протоколов получения дендритных клеток, презентирующих специфические антигены.

3.5.2 Влияние рИЛ-18 на функциональную активность МНК больных гепатитом В, культивированных с ДК.

3.5.3 Влияние рИЛ-18 на эффекторные функции МНК, сокультивированных с ДК больных туберкулезом легких.

3.6 Генетически модифицированные растения - новый источник получения рекомбинантных белков.

3.6.1 Получение трансгенной моркови, экспрессируующей ген ИЛ-18 человека.

3.6.2 Биологическая характеристика трансгенного растения Daucus carota L., несущего ген ИЛ-18 человека.

3.6.2.1 Влияние трансгенной моркови, несущей ген чИЛ-18, на спленоциты мышей.

3.6.2.2 Влияние трансгенной моркови, экспрессируюгцей ген ИЛ-18 человека, на иммунный ответ in vivo у мышей.

3.6.2.3 Противоопухолевая активность трансгенного растения моркови, несущего ген ИЛ-18.

Введение диссертации по теме "Клиническая иммунология, аллергология", Якушенко, Елена Владимировна, автореферат

Актуальность

Современные знания о системе эндогенных иммуномодуляторов свидетельствуют об их универсальном значении в регуляции функций практически всех систем организма. В медицине используется множество иммуномодуляторов, однако, они неравноценны по своей эффективности и по ряду других свойств. Эндогенные иммуномодуляторы имеют ряд принципиальных преимуществ по сравнению с экзогенными (химического, бактериального или растительного происхождения), поскольку свои эффекты оказывают через специфические рецепторы и являются естественными регуляторами функциональной активности различных типов клеток. В связи с этим использование их в качестве лекарственных препаратов для лечения и профилактики бактериальных, вирусных, грибковых инфекций, паразитарных болезней, злокачественных опухолей, аутоиммунных, неврастенических, аллергических и эндокринных расстройств; первичных и вторичных иммунодефицитов; при болезнях, сопровождающихся нарушениями функций иммунной систем, а также гуморальных медиаторов активации и дифференцировки в клеточных технологиях представляется перспективным.

В настоящее время в клинической практике иммунокоррекции используется ряд лекарственных препаратов на основе естественных иммунорегуляторных молекул (ИФНа, ФНО, ИЛ-1, ИЛ-2, ГМ-КСФ, Г-КСФ и т.д.). Например, препарат на основе ИЛ-10 Беталейкин усиливает лейкопоэз, восстанавливает костномозговое кроветворение, активирует нейтрофилы, усиливает дифференцировку предшественников иммунокомпетентных клеток, пролиферацию лимфоцитов, синтез цитокинов и антител. Применяется при токсической лейкопении, возникающей при химио- и радиотерапии злокачественных опухолей, и в качестве протектора лейкопоэза при необходимости проведения химиотерапии в условиях лейкопенического фона. Основным показателем к использованию препарата являются вторичные иммунодефицитные состояния различного генеза [11]. Ронколейкин (Россия) или Пролейкин (США) - рекомбинантный ИЛ-2. Препарат усиливает рост, дифференцировку и активацию Т- и В-лимфоцитов, моноцитов, макрофагов и вспомогательных клеток, активирует естественные киллеры и цитотоксические Т-лимфоциты. Ронколейкин применяют в комплексной терапии для лечения септических состояний различной этиологии, сопровождающихся иммуносупрессией [1], а также для лечения рака почки. Также в клинической практике используются препараты интерферона-a (Реаферон, Реальдирон, Вэллферон (Wellcome Foundation Ltd.), Интрон-А (Schering-Plough), Роферон-А (Hoffman La Roche Ltd.)), ФНОа (Бефнорин, Бердск), ИЛ-ip (Арил, С.-Петербург), ИЛ-8 (Окталейкин, С.-Петербург), ИЛ-18 (Iboctadekin, GlaxoSmithKline). Зарегистрированы также цитокины зарубежных фирм: Нейпоген (рекомбинантный Г-КСФ) производства Швейцарии и Эбермин (рекомбинантный эпидермальный фактор роста) производства Кубы и некоторые другие.

Вместе с тем клиническое применение цитокинов сталкивается с рядом трудностей, которые связаны с тем, что зачастую цитокины обладают плейотропностью эффектов, их рецепторы экспрессируются на многих типах клеток, в связи с чем использование эндогенных иммуномодуляторов сопровождается нежелательными эффектами. Для эффективного и безопасного клинического применения необходимо всестороннее изучение влияния цитокинов на функциональную активность иммунокомпетентных клеток (ИКК) и формирование иммунных реакций. Нужно отметить, что разные цитокины имеют разную значимость для регуляции иммунных реакций, одни регулируют тип иммунного реагирования и запускают каскад иммунных реакций (ИФН, ИЛ-12, ИЛ-17, ИЛ-23, ФНО, ИЛ-1), другие регулируют только отдельные этапы и фрагменты иммунного реагирования (ИЛ-5, ИЛ-13, М-КСФ, ИЛ-27 и др.).

Интерлейкин-18 (ИЛ-18) в ряду иммунорегуляторных медиаторов занимает особое положение, так как он является одним из ключевых цитокинов формирования врожденного и приобретенного иммунного ответа, дифференцировки и функциональной активности макрофагов, дендритных клеток и Т-лимфоцитов. ИЛ-18 стимулирует продукцию ИФН-у, ГМ-КСФ [59, 260], ФНО [69, 156], ИЛ-1 [198], ИЛ-2 [123], молекул адгезии [148, 268] и факторов апоптоза РаБ/ТазЬ [77], что способствует активации цитотоксических Т-лимфоцитов, НК-клеток и формированию эффективного противоинфекционного и противоопухолевого иммунного ответа [103, 121, 261]. Однако, поскольку ИЛ-18, как и многие другие иммунорегуляторные цитокины, обладает плейотропностью, его биологические эффекты в ряде случаев могут быть нежелательными или непредсказуемыми. Так, например, в литературе публикуются неоднозначные данные о способности ИЛ-18 стимулировать Тх1 или Тх2 типа, использование рекомбинантного ИЛ-18 при инфекционных или онкологических процессах приводит к стимуляции продукции провоспалительных цитокинов и молекул адгезии, что на ряду со стимуляторным эффектом в отношении формирования протективного иммунного ответа может иметь негативные последствия, поскольку этот белок может стать причиной развития воспаления или метастазирования. Кроме того, ИЛ-18 может стимулировать дифференцировку Тх2, продуцирующих ИЛ-4 [272], что также может неоднозначно влиять на формирование клеточного (протективного) иммунного ответа. В целом, следует отметить, что в связи с наличием столь разнообразных активностей у этого цитокина, он принимает участие не только в защитных реакциях организма, но также и в патогенезе многих заболеваний, сопровождающихся хроническим воспалением и деструкцией тканей. Показано участие ИЛ-18 в механизмах формирования таких патологических состояний как, болезнь Крона [195], ревматоидный артрит [254, 264], метаболический синдром [255], аллергии [163], диабет [209], атеросклероз [105, 280] и др.

И все же наиболее выраженной активностью ИЛ-18 принято считать способность стимулировать дифференцировку Тх1типа и продукцию ими ИФН-у, что в итоге приводит к активации клеточного звена иммунного ответа, что необходимо в случае онкологических заболеваний, а также инфекционных процессов (вирусных и бактериальных).

Противоопухолевую активность ИЛ-18 проявляет через стимуляцию продукции ИФН-у, оксида азота N0 [121, 103], снижение ангиогенеза [237], повышение активности НК-клеток и цитотоксических Т-лимфоцитов [151], повышение экспрессии апоптогенного фактора Fas-ligand [77]. В экспериментах in vitro также показано, что ИЛ-18 способен стимулировать экспрессию молекул адгезии (ICAM-1 и VCAM) [148].

ИЛ-18 участвует в противовирусной защите организма, в частности, в формировании иммунного ответа против антигенов вируса гепатита В. Протективный иммунный ответ в течении вирусного гепатита В (ВГВ) связан с индукцией клеточного звена иммунной системы и реализуется посредством Т хелперов 1 типа. Активность адаптивного звена иммунной системы напрямую зависит от представления антигена Т-клеткам и их направленной дифференцировки. Представление антигена и определение типа иммунного ответа осуществляется антигенпрезентирующими клетками, в частности, дендритными клетками (ДК). Направленность иммунных реакций определяется профилем цитокинов, продуцирующихся ДК. Важное значение в патогенезе хронического вирусного гепатита В принимают цитокины провоспалительного ряда (ИНФ-а, ИНФ-у, ИЛ-1, ФНО) и, в частности, ИЛ-18. Показано, что ИЛ-18 ингибирует репликацию ВГВ в печени трансгенных мышей [290]. С другой стороны, повышение уровня эндогенного ИЛ-18 при хронических заболеваниях печени связано с активацией механизмов иммунного повреждения печени, опосредованного через Fas-лиганд. У пациентов с хроническим вирусным гепатитом В снижена продукция ИНФ-у и ИЛ-18 мононуклеарными клетками периферической крови. Снижение продукции цитокинов может быть связано с генетическими механизмами. В функционально-активных участках промотора гена ИЛ-18 обнаружено несколько одиночных нуклеотидных полиморфизмов. Эти полиморфизмы, находящиеся в позициях -607С/А и -137G/C, могут влиять на уровень продукции ИЛ-18 и вероятность развития хронического течения вирусного гепатита В.

Протективный иммунный ответ на М. tuberculosis связан с индукцией эффекторных функций Т-хелперов 1 типа, что в свою очередь зависит от представления им антигена и дифференцировки «наивных» Т-клеток, что осуществляется дендритными клетками как основными антиген-презентирующими клеточными элементами. Эффективность иммунного ответа при бактериальной инфекции также зависит и от иммунорегуляторных факторов, непосредственно определяющих состояние иммунной системы в норме и при патологии, в частности ИЛ-18. При микобактериальной инфекции ИЛ-18 стимулирует продукцию ИФН-у Т-клетками и НК-клетками, тем самым, способствуя активации макрофагов и уничтожению М ^¿еги/аш-инфицированных клеток. Однако у пациентов, больных туберкулезом наблюдается значительное снижение продукции ИЛ-18 и ИФН-у. При этом в ряде работ отмечают роль ИЛ-18 при М. tuberulosis-индуцированном синтезе ИФН-у в дифференцировке наивных Т-клеток в Т-хелперы 1 типа при этой патологии [266].

В связи с тем, что ИЛ-18 участвует в патогенезе некоторых заболеваний, блокатор ИЛ-18 - ИЛ-18 связывающий белок (ИЛ-18СБ), представляющий собой физиологическую ловушку-рецептор, может являться перспективным фактором для отмены нежелательных действий ИЛ-18. ИЛ-18 СБ, являющийся циркулирующим антагонистом ИЛ-18, конститутивно экспрессируется спленоцитами и относится к суперсемейству иммуноглобулинов. ИЛ-18СБ связывает ИЛ-18 путем формирования высоко аффинного комплекса (Кс1=400рМ) и тем самым нейтрализует эффекторные функции цитокина ИЛ-18 [172].

Данные о значительной роли ИЛ-18 в регуляции большого числа иммунных реакций позволяют предположить, что в ближайшем будущем ИЛ-18 и ИЛ-18СБ займут свое достойное место в арсенале препаратов для борьбы с множеством патологических состояний человека.

В качестве продуцентов для получения белков-цитокинов медицинского назначения, в настоящее время широко используются клетки бактерий, дрожжей и млекопитающих. Однако такие системы имеют определенные недостатки. В клетках прокариот не происходят посттрансляционная модификация и фолдинг многих эукариотических белков. Использование клеток дрожжей и млекопитающих ограничено высокой себестоимостью выхода рекомбинантных белков [211]. По сравнению с вышеупомянутыми системами экспрессии, растения, как продуценты иммунорегуляторных белков, имеют ряд преимуществ: гликозилирование и фолдинг белков схож с таковыми в клетках млекопитающих, культивирование растений не требует дорогостоящего оборудования, а сельскохозяйственные масштабы продукции гарантируют доступность рекомбинантного препарата. Исследования в этой области идут в направлении создания трансгенных растений несущих опухолевые, инфекционные антигены или иммунорегуляторные цитокины, с целью моделирования специфических иммунных реакций. В ряде случаев, например, при использовании трансгенных растений в качестве "съедобных вакцин" выделение белка в чистом виде не требуется [57].

В связи с вышесказанным на сегодняшний момент является актуальным исследование механизмов действия и максимально широкого спектра биологических эффектов рекомбинантного ИЛ-18, получаемого из различных источников (бактериальные и растительные продуценты). Основываясь на знаниях об особенностях эффектов ИЛ-18, актуальным направлением является разработка протоколов и схем использования этого белка в клинической практике для применения в фармакологии и клеточных технологиях с целью коррекции иммунопатологических состояний, связанных с несостоятельностью клеточного звена иммунного ответа. Поскольку существуют данные об эффективности перорального введения антигенов и цитокинов, а также есть полученные в последние годы результаты по использованию трансгенных растений, нам представлялось актуальным в данной работе оценить эффекты перорального введения трансгенного растения Daucus carota L., несущего ген ИЛ-18 человека.

Цель работы: изучить биологические эффекты ИЛ-18 in vitro и на экспериментальных моделях животных in vivo, эффективность его использования в клеточных технологиях, а также при пероральном применении в составе трансгенных растений.

В рамках поставленной цели решались следующие задачи:

1. Охарактеризовать иммунохимическую и биологическую активность рекомбинантного человеческого ИЛ-18, полученного по оригинальной методике, в реакции иммуноанализа, по способности стимулировать продукцию ИФН-у, ФНО мононуклеарными клетками in vitro и реакцию гиперчувствительности замедленного типа in vivo.

4. Изучить ассоциированность аллельного полиморфизма промотора гена ИЛ-18 в позициях -607 и -137 с уровнем его продукции мононуклеарными клетками периферической крови человека.

5. Изучить частоту встречаемости аллельных вариантов в промоторе гена ИЛ-18 в позициях -607 и -137 в мононуклеарных клетках здоровых доноров и больных вирусным гепатитом В.

Положения, выносимые на защиту

ИЛ-18 и ИЛ-18СБ оказывают противоопухолевые эффекты в зависимости от типа и стадии опухолевого процесса.

Полиморфные варианты в промоторном участке гена ИЛ-18 (в позициях -607 и -137) ассоциированы с различными уровнями продукции белка и частотой встречаемости у больных хроническим вирусным гепатитом В.

Использование рИЛ-18 эффективно для стимуляции клеточных иммунных реакций при взаимодействии ДК, презентирующих различные антигены, и мононуклеаров периферической крови.

Использование трансгенных растений, экспрессирующих ген ИЛ-18 человека, эффективно для модуляции иммунных реакций при пероральном применении.

Научная новизна

Теоретическая и практическая значимость исследования.

Блокирование продукции ФНО в культурах МНК в присутствии рИЛ-18 СБ свидетельствует о важной роли системы ИЛ-18/ИЛ-18СБ в регуляции провоспалительной активности мононуклеарных клеток. Способность ИЛ-18 ингибировать рост ортотопической солидной меланомы В16, а ИЛ-18 СБ -гематогенной метастатической меланомы указывает на существование различных механизмов подавления опухолевого роста указанными белками. Выявленная ассоциация продукции ИЛ-18 с аллельными вариантами промоторного региона гена ИЛ-18 в позициях -607 и -137 свидетельствует о генетической детерминированности уровня продукции ИЛ-18. В свою очередь установленное возрастание частоты встречаемости генотипов, ассоциированных с низким уровнем продукции ИЛ-18 при хроническом вирусном гепатите В указывает на патогенетическую значимость ИЛ-18 при данной патологии.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на: 1) 6-й отчетной конференции ГУ НИИКИ СО РАМН (Новосибирск, 2003г), 2) 7-ом Всероссийском научном форуме с международным участием имени В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2003г), 3) объединенном иммунологическом форуме (Екатеринбург, 2004г.), 4) 8-ом Всероссийского научном форуме с международным участием имени В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2004г), 5) конференции «Технология и онкология» (Санкт-Петербург, 2005г), 6) 4-ой конференции иммунологов Урала (Уфа, 2005г), 7) Всероссийском научном симпозиуме «Цитокины, стволовая клетка, иммунитет» (Новосибирск, 2005г), 8) Всероссийской научно-практической конференции посвященной 15-летнему юбилею Красноярского Краевого Центра по профилактике и борьбе со СПИД и другими инфекционными заболеваниями. «Дни иммунологии в Сибири» (Красноярск, 2005г), 9) Московской международной конференции «Биотехнология и медицина» (Москва, 2006г), 10) конференции «Иммунопатогенез и иммунотерапия основных заболеваний человека: от эксперимента к клинике» 7-ой отчетной конференции ГУ НИИКИ СО РАМН (Новосибирск, 2006г), 11) Московской международной конференции «Биотехнология и медицина» (Москва, 2006г), 12) Российской научно-практической конференции «Современные технологии в иммунологии: иммунодиагностика и иммунотерапия» (Курск, 2006г), 13) III Международной конференции "Фундаментальные науки - медицине"

Новосибирск, 2007г), 14) Межрегиональной научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири» (Омск, 2007г), 15) Межрегиональной научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири» (Красноярск, 20 Юг), 16) Всероссийской научной конференции «Молекулярно-генетичекие основы функционирования цитокиновой сети в норме и при патологии» (Новосибирск, 20 Юг), 17) Annual conference on cancer immunotherapy and vaccination (Czech Republic, Mikulov, 2011). Апробация диссертации состоялась на расширенном заседании Проблемной комиссии МНС 55.07 «Иммунология» с участием сотрудников НИИ клинической иммунологии СО РАМН 30 июня 2011 г.

Внедрение в практику

По результатам проведенных исследований и разработанных технологий получено 3 патента:

Сенников С.В., Якушенко Е.В., Хрипко О.П., Козлов В.А. Способ генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с активностью против клеток, инфицированных вируса гепатита В // Патент на изобретение №2366707 Российская Федерация. Приоритет от 11.03.2008 опубликовано 10.09.2009 Бюл №25.

Дейнеко Е.В., Шумный В.К., Филипенко Е.А., Загорская А.А., Сидорчук Ю.В., Филипенко М.Л., Власов В.В., Сенников С.В., Козлов В.А., Якушенко Е.В. Способ получения трансгенных растений моркови, продуцирующих интерлейкин-Ю человека // Патент на изобретение №2374321 Российская Федерация. Приоритет от 12.12.2007, опубликовано 27.11.2009

Сенников С.В., Якушенко Е.В., Шевченко Ю.А., Лаушкина Ж.А., Свистельник А.В., Козлов В.А. Способ генерации антиген-специфических противотуберкулезных клеток // Патент на изобритение №2378373

Российская Федерация приоритет от 04.02.08. опубликовано 10.01.2010г. Бюл. №1.

Заключение диссертационного исследования на тему "Интерлейкин-18: биологические эффекты и перспективы клинического применения."

выводы

1. Рекомбинантный ИЛ-18 человека, полученный по оригинальной методике (продуцент E.coli), связывается с моно- и поликлональными анти-ИЛ-18 антителами, стимулирует продукцию ИФНу, ФНО в культурах МНК человека и реакцию гиперчувствительности замедленного типа у экспериментальных животных in vivo, что свидетельствует о специфической иммунохимической активности выделенного белка и его способности активировать клеточный иммунитет.

2. Рекомбинантный ИЛ-18 связывающий белок человека, полученный по оригинальной методике (продуцент E.coli), взаимодействует с поликлональными анти-ИЛ-18СБ антителами, в экспериментах in vitro отменяет стимулирующий эффект рИЛ-18 на продукцию ФНО мононуклеарными клетками человека и снижает ЛПС-индуцированную летальность экспериментальных животных in vivo, что подтверждает его специфические иммунохимические свойства и блокирующий эффект в отношении ИЛ-18.

3. Рекомбинантный ИЛ-18 связывающий белок снижает уровень продукции ФНО, стимулированный КонА, до спонтанного уровня, что свидетельствует о роли ИЛ-18 в регуляции провоспалительной активности мононуклеарных клеток.

4. Рекомбинантные белки ИЛ-18 и ИЛ-18СБ обладают противоопухолевой активностью в модели ортотопической солидной меланомы В16 и гематогенной метастатической меланомы В16, соответственно, что указывает на существование различных механизмов подавления опухолевого роста указанными белками.

7. ИЛ-18 в культурах МНК больных хроническим вирусным гепатитом В восстанавливает исходно сниженный Тх1 ответ и усиливает генерацию цитотоксических Т-клеток, о чем свидетельствует усиление пролиферативной активности МНК, продукции ИФН-у и возрастание доли Т-клеток с внутриклеточным содержанием ИФН-у и перфорина при сокультивировании с ДК, нагруженными антигеном вируса гепатита В.

8. Совместное культивирование ДК, нагруженных антигеном М. Tuberculosis (ESAT6) и МНК больных туберкулезом легких в присутствии рИЛ-18 приводит к усилению антиген-специфических клеточных реакций, что подтверждается возрастанием продукции ИФН-у, а также увеличением количества ИФНу-продуцирующих- и цитотоксических Т-лимфоцитов.

9. Пероральное применение трансгенной по гену ИЛ-18 моркови Daucus carota L. приводит к усилению продукции ИФН-у спленоцитами, увеличению реакции гиперчувствительности замедленного типа и угнетению опухолевого роста в уретан-индуцированной модели аденокарциномы легких у мышей, что свидетельствует о наличии биологического эффекта ИЛ-18 в составе трансгенного растения.

10.Рекомбинантный белок ИЛ-18 обладает рядом специфических биологических эффектов и может быть эффективен для стимуляции клеточных иммунных реакций при онкологических состояниях, а также в клеточных технологиях при разработке дендритно-клеточных вакцин для модуляции иммунного ответа при инфекционных процессах.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итак, в результате проведенных исследований получены два рекомбинантных белка человека ИЛ-18 и его антагонист - ИЛ-18 связывающий белок, а также генетически модифицированное растений моркови, экспрессиирующее ген ИЛ-18 человека. Рекомбинантные белки ИЛ-18 и ИЛ-18СБ определяются иммунохимически, связываясь со специфическими антителами в тесте иммуноанализа, стабильны при хранении и обладают специфической биологической активностью. А именно, рчИЛ-18 стимулирует продукцию ИФНу и ФНО МНК ПК человека, увеличивает выраженность реакции ГЗТ у мышей, сдвигая баланс в сторону клеточного иммунного ответа. Рекомбинантный ИЛ-18СБ, как растворимый рецептор ИЛ-18, блокирует его действие, отменяя стимулированную экзо- и эндогенным ИЛ-18 продукцию ФНОа. При этом, следует отметить, что продукция ФНО в ответ на КонканавалинА зависит главным образом от эндогенного ИЛ-18, поскольку добавление в культуру его блокатора - ИЛ-18СБ снижает КонА-стимулированную продукцию ФНО до спонтанного уровня. В эксперименте in vivo ИЛ-18 СБ отменяет ЛПС-индуцированную летальность мышей, опосредованную главным образом последовательной индукцией продукции ИЛ-18, ИФНу и FasL гепатоцитами, из чего также можно заключить, что ИЛ-18 является одним из ключевых цитокинов, опосредующих каскад реакций, вызванных компонентом бактериальной стенки ЛПС. Также в системе in vivo показано, что оба препарата рчИЛ-18 и рчИЛ-18СБ обладают противоопухолевой активностью в разных моделях, что связано с различными механизмами их противоопухолевого действия. ИЛ-18 через ингибирование ангиогенеза, стимуляцию продукции ФНОи ИФНу, увеличение цитотоксичности НК- и Т-клеток при внутривенном введении снижает вес ортотопической меланомы В16 и увеличивает выживаемость экспериментальных животных. ИЛ-18СБ снижает количество метастатических очагов в легких мышей в гематогенной метастатической модели меланомы В16, подавляя экспрессию молекул адгезии, стимулированную эндогенным ИЛ-18.

В связи с вышесказанным очевидно, что использование рИЛ-18 может быть эффективным в случаях когда требуется стимуляция продукции провоспалительных молекул и активация иммунного ответа, а также для лечения онкологических состояний, однако следует учитывать его проонкогенную активность в ряде случаев, поэтому нужно использовать его под контролем клинических параметров. При угрозе метастазирования, например, после операционных вмешательств при солидных опухолях с высоким метастатическим потенциалом, возможно использование блокатора ИЛ-18-ИЛ-18СБ.

Кроме того, одним из путей избежать нежелательных эффектов при введении в организм рИЛ-18, как мощного провоспалительного фактора, является использование его в клеточных технологиях, когда иммунокомпетентные клетки активируются в системе in vitro и уже затем переносятся пациенту. В представленной работе проводилось исследование возможности использования рИЛ-18 для активации функциональной активности дендритных и мононуклеарных клеток больных хроническим вирусным гепатитом В и туберкулезом легких. В исследованиях in vitro показано, что использование рИЛ-18 при совместном культивировании специфических аутологичных дендритных и мононуклеарных клеток больных вирусным гепатитом В и туберкулезом является эффективным способом активации последних, что проявляется в значительно более выраженном усилении их пролиферативного потенциала, стимуляции уровня продукции ИФНу и формировании цитотоксических клеток, экспрессирующих перфорин, по сравнению с клетками, культивированными в тех же условиях, но без рИЛ-18. То есть, использование рИЛ-18 в клеточных технологиях для стимуляции клеточных иммунных реакций является эффективным и перспективным подходом повышения эффективности дендритно-клеточных вакцин.

Очевидно, что биологическая эффективность эндогенного ИЛ-18 и соответственно эффективность иммунного ответа зависит от уровня его продукции. Полиморфизм генов цитокинов, в частности в промоторном регионе, может быть одним из механизмов, который участвует в формировании индивидуальной вариабельности уровня продукции белка. При патологии этот феномен имеет значение, поскольку цитокины являются ключевым фактором формирования эффективного иммунного ответа. Известно, что одиночные нуклеотидные полиморфизмы в позициях -607С/А и -1370/С расположены в промоторе гена ИЛ-18 и следовательно могут влиять на уровень продукции белка ИЛ-18. В результате проведенных исследований, показано, что аллель С и генотип СС в позиции -137 промотора гена ИЛ-18 ассоциирован со сниженной ЛПС-стимулированной продукцией ИЛ-18, аллель А и генотип С А в позиции -607 связан с увеличением уровня ЛПС-стимулированной продукции ИЛ-18 МНК ПК здоровых доноров. Пониженная спонтанная продукция ИЛ-18 ассоциирована с гапло-генотипами -607СС/-137СС и -607АА/-1370С, наличие гапло-генотипа -607СК /-137СЫ ассоциировано с повышенной спонтанной продукцией ИЛ-18 в сравнении с гапло-генотипами -607АА/-137СМ и -607СМ/-137СС. Увеличение ЛПС-стимулированной продукции ИЛ-18 ассоциировано с гаплогенотипом -607С1<Г/-13701^ в сравнении с -607СМ/-137СС. Эти данные указывают на взаимосвязь аллельного полиморфизма промотора гена ИЛ-18 в позиции -607 и - 137 с уровнем его продукции. При анализе распределения генотипов среди здоровых и больных индивидов было показано, что больные хроническим ВГВ характеризуются снижением частоты встречаемости генотипа -607АА и -607АА/-137СО и увеличением частоты встречаемости генотипа -607СС/-137СС по сравнению со здоровыми донорами, что указывает на роль генетического фактора в патогенезе вирусного гепатита В.

Исходя из полученных нами данных можно утверждать, что ИЛ-18 играет патогенетическую роль в несостоятельности иммунного ответа при гепатите В, возможно в ряду других иммуноактивных молекул, и по крайней мере у части пациентов. Очевидно, что исследования подобного рода должны быть широкомасштабными и охватывать весь спектр молекул, участвующих в патогенезе того или иного заболевания.

Итак, в наших экспериментах показано, что использование рекомбинантного ИЛ-18 может быть эффективным как при введении в организм, так и при использовании в клеточных технологиях.

Получение рекомбинантных белков для терапевтических целей - одно из наиболее приоритетных направлений современной биотехнологии. Традиционно для этих целей используются системы экспрессии рекомбинантных белков в клетках Е.соН, дрожжах и клетках млекопитающих. Сегодня в связи с развитием биотехнологии стало возможным создание генетически модифицированных растений, экспрессирующих различные белковые молекулы и антигены, и создание на их основе съедобных вакцин, а также использование их в качестве альтернативного источника иммунорегуляторных молекул. Растения для производства рекомбинантных белков медицинского назначения для фармакологии имеют ряд преимуществ: экономичность, возможность широкомасштабного производства при сохранении умеренной стоимости продукта, отсутствие проблем, связанных с безопасностью заражения вирусами животных.

Трансгенное растение Daucus carota L., несущее ген ИЛ-18 человека, было получено при сотрудничестве трех институтов: ИХБФМ СО РАН, ИЦиГ СО РАН, ВНИИССОК РАСХН. Исследование биологической активности трансгенных растений при пероральном применении в экспериментальных моделях на мышах показало, что ИЛ-18, экспрессирующийся и продуцирующийся в растительных клетках, обладает теми же свойствами что и рекомбинантный белок. Установлено, что пероральное употребление трансгенной моркови несущей ген ИЛ-18 человека, в течение 16 дней увеличивает продукцию ИФНу спленоцитами мышей, стимулирует реакцию гипечувствительности замедленного типа, ингибирует опухолевый процесс в модели уретан-индуцированной аденокарциномы легких. Предполагаемым механизмом действия трансгенной моркови, экспрессирующей ген ИЛ-18 человека, может быть местное действие на иммунокомпетентные клетки Пейеровых бляшек кишечника. Полученные данные свидетельствуют о том, что ИЛ-18, продуцирующийся в трансгенной моркови, обладает той же активностью, что и рекомбинантный белок, а использование генетически модифицированных растений для активации иммунных реакций является перспективным.

Итак, в результате проведенных исследований, нами показано, что полученный нами рекомбинантный человеческий ИЛ-18 обладает иммунорегуляторной активностью, эффективен при использовании в клеточных технологиях для активации функциональной активности дендритных и мононуклеарных клеток у больных хроническим вирусным гепатитом В и туберкулезом легких. Кроме того, продемонстрировано, что ИЛ-18 может участвовать в механизмах несостоятельности иммунного ответа при хронизации и прогрессии гепатита В. А также показано, что ИЛ-18 эффективен при пероральном применении в составе трансгенных растений.

Таким образом, ИЛ-18 является одним из перспективных иммунорегуляторных факторов для применения в клинической практике как для парэнтерального введения, так и в клеточных технологиях. При этом не следует забывать о негативных эффектах этого цитокина и использовать его дифференцированно, обоснованно и под контролем клинических параметров, при этом есть пути избегания его негативных эффектов, благодаря возможности блокировать его активность с помощью ИЛ-18 связывающего белка.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2012 года, Якушенко, Елена Владимировна

1. Агеев Н.Л., Шамрай H.A., Овечкин A.B., Захарова H.A., Стрельцова Е.И.,

2. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. Томск: Изд-во Том. Ун-та, 1992.- 86С.

3. Гублер Е.В. Вычислительные методы анализа и распознавания патологических процессов.- Л.: Медицина, 1978.

4. Иммунология. Методы исследования. Под. Ред. И.Лефковитса, М."Мир", 1983

5. Кузнецова A.B., Данилова Т. И., Гладских О. П. и др. Дендритные клетки и их использование в иммунотерапии // Молекулярная медицина 2003- № З.-С. 3-17.

6. Лакин Г.Ф. БИОМЕТРИЯ: уч. пособие для биол. спец. вузов 4-е изд. перераб. и доп. - М.: Высш.шк., 1990. - 352 с

7. Ложкин И.Д. Симпатическая иннервация и продукция интерлейкина-1 макрофагами при канцерогенезе. Дисс. На соискание уч. Степени кандидата медицинских наук. Новосибирск 1996

8. Мостеллер Ф., Тьюки Дж. Анализ данных и регрессия: (пер. с англ.).- М.: Финансы и статистика, 1982.- 497 с.

9. Свирщевская Е.В., Митрофанов B.C., Шендерова Р.И., Чужова Н.М. Иммунитет при туберкулезе и аспергиллезе (обзор) //Проблемы медицинской микологии 2005. - Т.7, №1- С.3-13.

10. Ю.Симбирцев А.С., Громова А.Ю. Функциональный полиморфизм генов регуляторных молекул воспаления // Цитокины и воспаление.- 2005.- Т. 4.1. с. 1-12

11. П.Симбирцев А. С., Интерлейкин-1: от эксперимента в клинику // Медицинская Иммунология.-2001.- Т.З, № 3.-С.431-438.

12. Agnese DM, Calvano JE, Hahm SJ, et al. Human toll-like receptor 4 mutations but not CD 14 polymorphisms are associated with an increased risk of gramnegative infections. //J Infect Dis.- 2002,- V. 15, N 186,- P.l522-5.

13. Aizawa Y., Akita K., Taniai M., Torigoe K., Mori Т., Nishida Y., Ushio S., Nukada Y., Tanimoto Т., Ikegami H., Ikeda M., Kurimoto M. Cloning and expression of interleukin-18 binding protein // FEBS Lett. -1999. -V. 445. -P. 338-42.

14. Akgun M, Saglam L, Kaynar H, Yildirim AK et. al. Serum IL-18 levels in tuberculosis: Comparison with pneumonia, lung cancer and healthy controls // Respirology-2005,- V. 10, № 3.- P. 295-9.

15. Akita K, Ohtsuki T, Nukada Y, et al. Involvement of caspase-1 and caspase-3 in the production and processing of mature human interleukin 18 in monocytic THP.l cells // J Biol Chem.-1997.-272(42).-P.26595-603

16. Asian N, Yurdaydin C, Wiegand J, Greten T, Ciner A, Meyer MF, Heiken H, Kuhlmann B, Kaiser T, Bozkaya H, Tillmann HL, Bozdayi AM, Manns MP, Wedemeyer H. Cytotoxic CD4 T cells in viral hepatitis // J Viral Hepat.- 2006.-13(8).-P.505-14

17. Banda N.K., Vondracek A., Kraus D., Dinarello C.A., Kim S.H., Bendele A., Senaldi G., Arend W.P. Mechanisms of inhibition of collagen-induced arthritis by murine IL-18 binding protein // J Immunol. 2003. -V. 170. -P. 2100-5.

18. Barbulescu K., Becker C., Schlaak J.F., Schmitt E. IL-12 and IL-18 differentially regulate the transcriptional activity of the human IFNgamma promoter in primary CD4+ T lymphocytes // J Immunol. -1998. -V. 160. -P. 3642-3647.

19. Barnes PF, Wizel B. Type 1 cytokines and the pathogenesis of tuberculosis //Am J Respir Crit Care Med. 2000. -Vol.161, № 6. - p. 1773^.

20. Bazan J.F., Timans J.C., Kastelein R.A. A newly defined interleukin-1? // Nature. -1996. -V. 379. -P. 6566-591.

21. Bellamy R Thomas HC, Ruwende C, Corrah T, et al. Tuberculosis and chronic hepatitis B virus infection in Africans and variation in the vitamin D receptor gene.// J Infect Dis. 1999. - Vol. 179. - p. 721-724.

22. Ben-Ari Z, Mor E, Papo O, Kfir B, Sulkes J, Tambur AR, Tur-Kaspa R, Klein T. Cytokine gene polymorphisms in patients infected with hepatitis B virus //Am J Gastroenterol.- 2003.-98(l).-P.144-50.

23. Bentel J.M., Lykko A.W., Smith G.J. Cloned murine non malignant, spontaneously transformed and chemical tumor-derived cell lines related to the type 2 pneumocytes // Cell Biol Int Rep. 1989. - V. 13. - №9. - P.729-738.

24. Bessis N., Boissier M.C. Novel pro-inflammatory interleukins: potential therapeutic targets in rheumatoid arthritis // Joint Bone Spine. -2001. -V. 68. -P. 477-81.

25. Beutler B. Innate immunity: an overview.// Mol Immunol. .-2004.-V.40, N 12.-P.845-59.

26. Biet F., Laurent Kremer L., Isabelle Wolowczuk I., Delacre M., Locht C. Mycobacterium bovis BCG Producing Interleukin-18 Increases Antigen-Specific Gamma Interferon Production in Mice //INFECTION AND IMMUNITY. 2002. - Vol. 70, №. 12. - p. 6549-6557

27. Biet F, Locht C, Kremer L. Immunoregulatory functions of interleukin 18 and its role in defense against bacterial pathogens // J Mol Med (Berl).- 2002.-80(3).-P. 147-62

28. Boehm U, Klamp T, Groot M, Howard JC. Cellular responses to interferon-y. //Annu Rev Immunol. 1997. - Vol. 15. - p. 749-795.

29. Boraschi D, Dinarello CA. IL-18 in autoimmunity: review. Eur Cytokine Netw. 2006 Dec;17(4):224-52.

30. Boyum A. Separation of leucocytes from blood and bone marrow // Scand J Clin Lab Invest. -1968. -V .21. -P. 97.

31. Bozkaya H, Bozdayi M, Turkyilmaz R, et al. Circulating IL-2, IL-10 and <PHO-a in chronic hepatitis B: their relations to HBeAg status and the activity of liver disease.// Hepatogastroenterology. 2000. - Vol. 47. - p. 1675-1679.

32. Burns J.M., Dairaghi D.J., Deitz M., Tsang M., Schall T.J. Comprehensive mapping of poxvirus vCCI chemokine-binding protein. Expanded range of ligand interactions and unusual dissociation kinetics // J Biol Chem. -2002. -V. 277. -P. 2785-9.

33. Calderara S., Xiang Y., Moss B. Orthopoxvirus IL-18 binding proteins: affinities and antagonist activities //Virology. -2001. -V. 279. -P. 22-6.

34. Cameron LA, Taha RA, Tsicopoulos A, Kurimoto M, et. al. Airway epithelium expresses interleukin-18 // Eur Respir J. 1999 - Vol. 14, № 3. - p. 553-9

35. Canaday DH, Wilkinson RJ, Li Q, Harding CV, Silver RF, Boom WH. CD4(+) and CD8(+) T cells kill intracellular Mycobacterium tuberculosis by a perforin and Fas/Fas ligand-independent mechanism // J Immunol.- 2001.- 167(5).-P.2734-42

36. Cao R., Farnebo J., Kurimoto M., Cao Y. Interleukin-18 acts as an angiogenesis and tumor suppressor // FASEB J. -1999. -V. 13. -P. 2195-202.

37. Carfi A., Smith C.A., Smolak P.J., McGrew J., Wiley D.C. Structure of a soluble secreted chemokine inhibitor vCCI (p35) from cowpox virus // Proc Natl Acad Sci USA. -1999. -V. 96. -P. 12379-83.

38. Carotenuto P, Artsen A, Osterhaus AD, Pontesilli O. Reciprocal changes of na'ive and effector/memory CD8+ T lymphocytes in chronic hepatitis B virus infection // Viral Immunol.- 2011.-24(1 ).-P.27-33

39. Channarong S, Mitrevej A, Sinchaipanid N, Usuwantim K, Kulkeaw K, Chaicumpa W. Cloning, protein expression and immunogenicity of HBs-murine IL-18 fusion DNA vaccine // Asian Pac J Allergy Immunol.-2007.-25(4).-P. 233-42.

40. Chisari F.V., Ferrari C. Hepatitis B virus immunopathology // Springer Semin Immunopathol. -1995. Vol. 17. - p. 261-81.

41. Collins FS, McKusick VA.Implications of the Human Genome Project for medical science. JAMA. 2001 Feb 7;285(5):540-4.

42. Companjen A., van der Wei L., van der Fits L., Laman J., Prens E. Elevated interleukin-18 protein expression in early active and progressive plaque-type psoriatic lesions // Eur Cytokine Netw. -2004. -V. 15. -P. 210-6.

43. Culhane A.C., Hall M.D., Rothwell N.J., Luheshi G.N. Cloning of rat brain interleukin-18 cDNA// Mol Psychiatry. -1998. -V. 3. -P. 362-6.

44. Cunningham A.J. A method of increased sensitivity for detecting single antibody-forming cells //Nature. -1965. V. 207. -P. 1106-7.

45. Daniell H., Streatfield S., Wycoff K. Medical molecular farming: production of antibodies, biopharmaceuticals and edible vaccines in plants // Trends in Plant Sci. -2001.-V. 6. -P. 219-226.

46. Dao T., Ohashi K., Kayano T., Kurimoto M., Okamura H. Interferon-gamma-inducing factor, a novel cytokine, enhances Fas ligand-mediated cytotoxicity of murine T helper 1 cells // Cell Immunol. -1996. -V. 173. -P. 230-5.

47. Dinarello C.A. Interleukin-18. //Methods. -1999. -V. 19. -P. 121-32.

48. Eaton AD, Xu D, Garside P. Administration of exogenous interleukin-18 and interleukin-12 prevents the induction of oral tolerance // Immunology.-2003.-108(2).-P. 196-203.

49. Everettabcd B.M., Bansale S., Rifaif N. et al. Interleukin-18 and the risk of future cardiovascular disease among initially healthy women // Atherosclerosis. 2009. - Vol. 202. - P. 282-288

50. Faggioni R, Cattley RC, Guo J, et al. IL-18-binding protein protects against lipopolysaccharide- induced lethality and prevents the development of Fas/Fas ligand-mediated models of liver disease in mice // J Immunol. -2001. -V. 167. -P. 5913-20.

51. Fantuzzi G, Dinarello CA. Interleukin-18 and interleukin-1 beta: two cytokine substrates for ICE (caspase-1) //J Clin Immunol.-1999.-19(1)/-P. 1-11

52. Fantuzzi G., Banda N.K., Guthridge C., et al. Generation and characterization of mice transgenic for human IL-18-binding protein isoform a // J Leukoc Biol. -2003. -V. 74. -P. 889-96.

53. Farrar MF, Schreiber RD. The molecular cell biology of interferon-y and its receptor.// Annu Rev Immunol. 1993. -Vol. 11. - p. 571- 611.

54. Fassbender K., Mielke O., Bertsch T., Muehlhauser F., Hennerici M., Kurimoto M., Rossol S. Interferon-gamma-inducing factor (IL-18) and interferon-gamma in inflammatory CNS diseases //Neurology. -1999. -V. 53. -P. 1104-6.

55. Fujioka N., Akazawa R., Ohashi K., et al. Interleukin-18 protects mice against acute herpes simplex virus type 1 infection // J Virol. -1999. -V. 73. -P. 2401-9.

56. Fukami T., Miyazaki E., Matsumoto T., Kumamoto T., Tsuda T. Elevated expression of interleukin-18 in the granulomatous lesions of muscular sarcoidosis // Clin Immunol. -2001. -V. 101. -P. 12-20.

57. Garcia M, Vargas JA, Castejon R, Navas E, Durantez A. Flow-cytometric assessment of lymphocyte cytokine production in tuberculosis // Tuberculosis (Edinb).-2002.-82(l).-P.37-41.

58. Giedraitis V, He B, Huang WX, Hillert J. Cloning and mutation analysis of the human IL-18 promoter: A possible role of polymorphisms in expression regulation.// J Neuroimmunol.- 2001.- Vol. 112.- p. 146-152 3

59. Golab J. Interleukin 18~interferon gamma inducing factor—a novel player in tumour immunotherapy? // Cytokine. -2000. -V. 12. -P. 332-8.

60. Gracie JA, Robertson SE, Mclnnes IB. Interleukin-18 // J Leukoc Biol.- 2003.-73(2).-P.213-24

61. Gutzmer R, Langer K, Mommert S, et al. Human dendritic cells express the IL-18R and are chemoattracted to IL-18 // J Immunol.-2003.-171(12).-P.6363-71

62. Hanekom WA, Mendillo M, Manca C, Haslett PA, Siddiqui MR, Barry C 3rd, Kaplan G. Mycobacterium tuberculosis inhibits maturation of human monocyte-derived dendritic cells in vitro // J Infect Dis.-2003.-188(2).-P.257-66

63. Hayashi N., Mita E. Involvement of Fas system-mediated apoptosis in pathogenesis of viral hepatitis // J Viral Hepat. -1999. -V. 6. -P. 357-65.

64. Heberle-Bors E., Charvat B., Thompson D. et al. Genetic analysis of T-DNA insertion into tobacco genome // Plant Cell Rep. -1988. -V. 7. -P. 571-574

65. Heijtink RA, Janssen HL, Hip WC, Osterhaus AD, Schalm SW. Interferon-a therapy for chronic hepatitis B: early response related to pre-treatment changes in viral replication.// J Med Virol. 2001. - Vol. 63. - p. 217-219.

66. Higa S., Hirano T., Mayumi M., et al. Association between interleukin-18 gene polymorphism 105A/C and asthma // Clin Exp Allergy. 2003. - Vol. 33. - p. 1097-102.

67. Hirankarn N, Kimkong I, Kummee P, Tangkijvanich P, Poovorawan Y. Interleukin-lbeta gene polymorphism associated with hepatocellular carcinoma in hepatitis B virus infection.//World J Gastroenterol. 2006. - Vol. 12(5). - p. 776-9

68. Hirsch CS, Toossi Z, Vanham G, Johnson JL, Peters P, Okwera A, Mugerwa R, Mugyenyi P, Ellner JJ. Apoptosis and T cell hyporesponsiveness in pulmonary tuberculosis // J Infect Dis.-1999.-179(4).-P.945-53.

69. Ho LP, Davis M, Denison A, Wood FT, Greening AP.Reduced interleukin-18 levels in BAL specimens from patients with asthma compared to patients with sarcoidosis and healthy control subjects // Chest. 2002. -Vol. 121. № 5. - p. 421-6.

70. Hodgson PD, Grant MD, Michalak TI. Perforin and Fas/Fas ligand-mediated cytotoxicity in acute and chronic woodchuck viral hepatitis.// Clin Exp Immunol. 1999. - Vol. 118. - p. 63-70.

71. Horsch R.B., Fraley R.T., Rogers S.G. et al. Inheritance of functional foreign genes in plants // Science. -1984. -V. 223. -P. 496-499

72. Hoshino T, Kawase Y, Okamoto M, et. al. Cutting edge: IL-18-transgenic mice: in vivo evidence of a broad role for IL-18 in modulating immune function // J Immunol.- 2001. Vol. 166, № 12. -p.7014-8.

73. Hoshino T., Wiltrout R.H., Young H.A. IL-18 is a potent coinducer of IL-13 in NK and T cells: a new potential role for IL-18 in modulating the immune response // J Immunol. -1999. -V. 162. -P. 5070-7.

74. Hu KQ. Occult hepatitis B virus infection and its clinical implications.// J Viral Hepat. 2002. - Vol. 9. - p. 243-257.

75. Hultgren O., Eugster H.P., Sedgwick J.D., Korner H., Tarkowski A. TNF/lymphotoxin-alpha double-mutant mice resist septic arthritis but display increased mortality in response to Staphylococcus aureus // J Immunol. -1998. -V. 161. -P. 5937-42.

76. Im SH, Kim SH, Azam T, Venkatesh N, Dinarello OA, Fuchs S, Souroujon MC. Rat interleukin-18 binding protein: cloning, expression, and characterization // J Interferon Cytokine Res.- 2002.-22(3).-P.321-8.

77. Iwai Y, Hemmi H, Mizenina O, Kuroda S, Suda K, Steinman RM. An IFN-gamma-IL-18 signaling loop accelerates memory CD8+ T cell proliferation // PLoS One.- 2008.-3(6):e2404.

78. Jablonska E., Puzewska W., Charkiewicz M. Effect of IL-18 on leukocyte expression of iNOS and phospho-IkB in patients with squamous cell carcinoma of the oral cavity. //Neoplasma. -2006. -V. 53. -P. 200-5.

79. Jarnjak-Jankovic S, Hammerstad H, Saeboe-Larssen S, Kvalheim G, Gaudernack G. A full scale comparative study of methods for generation of functional Dendritic cells for use as cancer vaccines.// BMC Cancer. 2007. -Vol. 7.-p. 119.

80. Jefferis BJ, Papacosta O, Owen CG, Wannamethee SG, Humphries SE, Woodward M, Lennon LT, Thomson A, Welsh P, Rumley A, Lowe GD, Whincup PH Interleukin 18 and coronary heart disease: Prospective study and systematic review. Atherosclerosis. 2011 Apr 8.

81. Jia H.Y., Du J., Zhu S.H., Ma Y.J., Chen H.Y., Yang B.S., Cai H.F. The roles of serum IL-18, IL-10, TNF-alpha and sIL-2R in patients with chronic hepatitis C // Hepatobiliary Pancreat Dis Int. -2002. -V. 1. -P. 378-82.

82. Kalina U., Ballas K., Koyama N., Kauschat D., Miething C., Arnemann J., Martin H., Hoelzer D., Ottmann O.G. Genomic organization and regulation of the human interleukin-18 gene // Scand J Immunol. 2000. -Vol. 52. - p. 52530.

83. Kampfer H., Kalina U., Muhl H., Pfeilschifter ., Frank S. Counterregulation of interleukin-18 mRNA and protein expression during cutaneous wound repair in mice // J Invest Dermatol. -1999. -V. 113. -P. 369-74.

84. Kaser A., Kaser S., Kaneider N. C., Enrich B., et. al. Interleukin-18 attracts plasmacytoid dendritic cells (DC2s) and promotes Thl induction by DC2 sthrough IL-18 receptor expression // Blood. 2004. - V. 103, № 2 - p. 64855.

85. Kashiwamura S., Ueda H., Okamura H. Roles of interleukin-18 in tissue destruction and compensatory reactions // J Immunother. -2002. -V. 11. -P. S4-11.

86. Kato M., et.al. Expression of multilectin receptors and comparative FITC-dextran uptake by human dendritic cell // Int. Immunol.- 2000. -Vol. 11. p. 1511-1519.

87. Kawakami K., Qureshi M.H., Zhang T., Okamura H., Kurimoto M., Saito A. IL-18 protects mice against pulmonary and disseminated infection with Cryptococcus neoformans by inducing IFN-gamma production // J Immunol. -1997. -V. 159. -P. 5528-34.

88. Kim SH, Cho D, Hwang SY, Kim TS.Efficient induction of antigen-specific, T helper type 1-mediated immune responses by intramuscular injection with ovalbumin/interleukin-18 fusion DNA //Vaccine.-2001.-19(30).-P.4107-14.

89. Kimura K, Kakimi K, Wieland S, Guidotti LG, Chisari FV. Interleukin-18 inhibits hepatitis B virus replication in the livers of transgenic mice. // J Virol.-2002.-76(21 ).-P. 10702-7

90. Kinjo Y, Kawakami K, Uezu K, Yara S, et. al. Contribution of IL-18 to Thl response and host defense against infection by Mycobacterium tuberculosis: a comparative study with IL-12p40 HJ Immunol. 2002. - Vol. 169, № 1. - p. 323-9.

91. Kitching A.R., Tipping P.G., Kurimoto M., Holdsworth S.R. IL-18 has IL-12-independent effects in delayed-type hypersensitivity: studies in cell-mediated crescentic glomerulonephritis // J Immunol. -2000. -V. 165. -P. 4649-57.

92. Kito T., Kuroda E., Yokota A., Yamashita U. Cytotoxicity in glioma cells due to interleukin-12 and interleukin-18-stimulated macrophages mediated by interferon-gamma-regulated nitric oxide // J Neurosurg. -2003. -V. 98. -P. 38592.

93. Kohyama M., Saijyi K., Hayashida M., Yasugi T., Kurimoto M., Direct activation of human CD8+ cytotoxic T lymphocytes by interleukin-18 // Cancer Res. -1998. -V89. -P. 1041-1046.

94. Kolber D.L., Knisely T.L., Maione T.E. Inhibition of development of murine melanoma lung metastases by systemic administration of recombinant platelet factor 4 // J Natl Cancer Inst. -1995. -V. 87. -P. 304-9.

95. Konenkov VI, Prokofiev VF, Shevchenko AV, Golovanova OV, Smolnikova MV.Polymorphism of Immune Response Genes as a Factor for Predisposition to Development of Diseases. Russ J Immunol. 2001 Jul;6(2): 123-130.

96. Kramvis A, Kew M, Francois G. Hepatitis B virus genotypes.// Vaccine. -2005. Vol. 23. - p. 2409-2423

97. Lai CL, Chien RN, Leung NW, et al. A one-year trial of lamivudine for chronic hepatitis B. Asia Hepatitis Lamivudine Study Group.// N Engl J Med. -1998.-Vol. 339(2).-p. 61-8.

98. Lauwerys B.R., Renauld J.C., Houssiau F.A. Synergistic proliferation and activation of natural killer cells by interleukin 12 and interleukin 18 // Cytokine. -1999. -V. 11.-P. 822-30.

99. Lee S.Y., Huang C.K., Zhang T.F., Schofield B.H., Burks A.W., Bannon G.A., Sampson H.A., Li X.M. Oral administration of IL-12 suppresses anaphylactic reactions in a murine model of peanut hypersensitivity // Clin Immunol. -2001. -V. 101. -P. 220-8

100. Li J, Han Y, Jin K, Wan Y, Wang S, Liu B, Liu Y, Lu S, Huang Z. Dynamic changes of cytotoxic T lymphocytes (CTLs), natural killer (NK) cells, and natural killer T (NKT) cells in patients with acute hepatitis B infection // Virol J.-2011.-2;8:199

101. Liew F.Y., Mclnnes I.B. Role of interleukin 15 and interleukin 18 in inflammatory response //Ann Rheum Dis. -2002. -V. 61. -P. 100-2.

102. Liu YJ. Dendritic cell subsets and lineages, and their functions in innate and adaptive immunity.// Cell.- 2001.- Aug 10;106(3):259-62.

103. Loc AS. The maze of treatment of hepatitis B. //N Eng J Med. 2005. - Vol. 352.-p. 2743-2746.

104. Locarnini S. Molecular pathogenesis of viral hepatitis // J Gastroenterol Hepatol.- 2000.- Suppl:G46-8.

105. Mahmoud R.A., el-Ezz S.A., Hegazy A.S. Increased serum levels of interleukin-18 in patients with diabetic nephropathy // Ital J Biochem. -2004. -V. 53.-P. 73-81.

106. Masood E. As consortium plans free SNP map of human genome. Nature. 1999 Apr 15;398(6728):545-6.

107. Maurer CA, Friess H, Kretschmann B, Wildi S, Muller C, Graber H, Schilling M, Biichler MW. Over-expression of ICAM-1, VCAM-1 and ELAM-1 might influence tumor progression in colorectal cancer // Int J Cancer.- 1998.-79(1).-P.76-81.

108. Mayne M., Cheadle C., Soldman S., Cermelli C., Yamoto Y., Gene expression profile of herpesvirus-infected T cells obtained using immunomicroarrays: induction of proinflammatory machanisms // Journel of Virology. -2001. -V. 75. -P. 11641-11650.

109. Menassa R., Nguyen V., Jevnikar A. et al. A self-contained system for the field production of plant recombinant interleukin-10 // Mol. Breeding. -2001. -V. 8.-P. 177-185

110. Merendino RA, Gangemi S, Ruello A, Bene A, Losi E, Lonbardo G, Purello-Dambrosio R Serum levels of interleukin-18 and sICAM-1 in patients affected by breast cancer: preliminary considerations // Int J Biol Markers.- 2001.-16(2).-P. 126-9.

111. Migita K, Maeda Y, Abiru S, Nakamura M, Komori A, Miyazoe S, Nakao K, Yatsuhashi H, Eguchi K, Ishibashi H. Polymorphisms of interleukin-lbeta in Japanese patients with hepatitis B virus infection.// J Hepatol. 2007. - Vol. 46(3).-p. 381-6.

112. Mohamadzadeh M, Luftig R. Dendritic cells: In the forefront of immunopathogenesis and vaccine development A review.// J Immune Based Ther Vaccines. - 2004 . - Vol. 2(1).- p.l

113. Moller B., Kukoc-Zivojnov N., Kessler U., Rehart S., Kaltwasser J.P., Hoelzer D., Kalina U., Ottmann O.G. Expression of interleukin-18 and its monokine-directed function in rheumatoid arthritis // Rheumatology (Oxford). -2001. -V. 40. -P. 302-9.

114. Monteleone G., Trapasso F., Parrello T., Biancone L., Stella A., Iuliano R., Luzza F., Fusco A., Pallone F. Bioactive IL-18 expression is up-regulated in Crohn's disease // J Immunol. -1999. -V. 163. -P. 143-7.

115. Morel J.C., Park C.C., Woods J.M., Koch A.E. A novel role for interleukin-18 in adhesion molecule induction through NF kappa B and phosphatidylinositol (PI) 3-kinase-dependent signal transduction pathways // J Biol Chem. -2001. -V. 276. -P. 37069-75.

116. Muhl H., Kampfer H., Bosmann M., Frank Radeke H., Pfeilschifter J. Interferon-gamma mediates gene expression of IL-18 binding protein in nonleukocytic cells // Biochem Biophys Res Commun. 2000. -V. 267. -P. 9603.

117. Nakanishi K, Tsutsui H, Yoshimoto T Importance of IL-18-induced super Thl cells for the development of allergic inflammation. Allergol Int. 2010 Jun;59(2):137-41.

118. Nakanishi K., Yoshimoto T., Tsutsui H., Okamura H. Interleukin-18 is a unique cytokine that stimulates both Thl and Th2 responses depending on its cytokine milieu // Cytokine Growth Factor Rev. -2001. -V. 12. -P. 72.

119. Neutra M.R. Current concept in mucosal immunity. Role of M cells in transepithelial transport of antigens and pathogens to the mucosal immune system // AJP. -1998. -V. 74. -P.785-791

120. Nigou J, Zelle-Rieser C, Gilleron M, Thurnher M, Puzo G. Mannosylated lipoarabinomannans inhibit IL-12 production by human dendritic cells: evidence for a negative signal delivered through the mannose receptor // J Immunol.- 2001.-166(12).-P.7477-85

121. Nolan K.F., Greaves D.R., Waldmann H. The human interleukin 18 gene IL 18 maps to Ilq22.2-q22.3, closely linked to the DRD2 gene locus and distinct from mapped IDDM loci // Genomics. -1998. -V. 51. -P. 161-3.

122. Nold M., Hauser I.A., Hofler S., Goede A., Eberhardt W., Ditting T., Geiger H., Pfeilschifter J., Muhl H. IL-18BPa:Fc cooperates with immunosuppressive drugs in human whole blood // Biochem Pharmacol. -2003. -V. 66. -P. 505-10.

123. Nolsoe R.L., Pociot F., Novick D., Rubinstein M., Kim S.H., Dinarello C.A., Mandrup-Poulsen T. Mutation scan of a type 1 diabetes candidate gene: the human interleukin-18 binding protein gene // Ann N Y Acad Sei. 2003. - Vol. 1005.-p. 332-9.

124. Novick D., Kim S.H., Fantuzzi G., Reznikov L.L., Dinarello C.A., Rubinstein M. IL-18 binding protein: a novel modulator of the Thl cytokine response // Immunity. -1999. -V. 10. -P. 127-36.

125. Ogura T., Ueda H., Hosohara K., Tsuji R., Nagata Y., Kashiwamura S., Okamura H. Interleukin-18 stimulates hematopoietic cytokine and growth factor formation and augments circulating granulocytes in mice // Blood. -2001. -V. 98. -P. 2101-7.

126. Okamura H., Kashiwamura S., Tsutsui H., Yoshimoto T., Nakanishi K. Regulation of interferon-gamma production by IL-12 and IL-18 // Curr Opin Immunol. -1998. -V. 10. -P. 259-64.

127. Okamura H., Tsutsi H., Komatsu T., Yutsudo M., Hakura A., Tanimoto T., Torigoe K., Okura T., Nukada Y., Hattori K., et al. Cloning of a new cytokine that induces IFN- gamma production by T cells // Nature. -1995. -V. 378. -P. 8891.

128. Okamura H., Tsutsui H., Kashiwamura S., Yoshimoto T., Nakanishi K. Interleukin-18: a novel cytokine that augments both innate and acquired immunity //Adv Immunol. -1998. -V. 70. -P. 281-312.

129. Olee T., Hashimoto S., Quach J., Lotz M. IL-18 is produced by articular chondrocytes and induces proinflammatory and catabolic responses // J Immunol. -1999. -V. 162. -P. 1096-100.

130. Olson J.K., Girvin A.M., Miller S.D. Direct activation of innate and antigen-presenting functions of microglia following infection with Theiler's virus // J Virol. -2001. -V. 75. -P. 9780-9.

131. Omoto Y, Tokime K, Yamanaka K., et al. Human mast cell chymase cleaves pro-IL-18 and generates a novel and biologically active IL-18 fragment //J Immunol.- 2006.- V. 15, N177(12).-P.8315-9.

132. O'Neill D.W., Adams S., Bhardwaj N. Manipulating dendritic cell biology for the active immunotherapy of cancer. //Blood.- 2004.- Vol. 104(8).- p. 22352246.

133. Osaki T., Peron J.M., Cai Q., Okamura H., Robbins P.D., Kurimoto M., Lotze M.T„ Tahara H. IFN-gamma-inducing factor/IL-18 administration mediates IFN-gamma- and IL-12-independent antitumor effects // J Immunol. -1998. -V. 160. -P. 1742-9.

134. Palucka KA, Taquet N, Sanchez-Chapuis F, Gluckman JC. Lipopolysaccharide can block the potential of monocytes to differentiate into dendritic cells // J Leukoc Biol.- 1999.- 65(2).- P. 232-40.

135. Papermaster B.W., Gilliland C.D., McEntire J.E., Smith M.E., Buchok S.J. Lymphokine-mediated immunotherapy studies in mouse tumor systems // Cancer. -1980. -V. 45. -P. 1248-53.

136. Park H, Byun D, Kim TS, Kim YI, Kang JS, Hahm ES, Kim SH, Lee WJ, Song HK, Yoon DY, Kang CJ, Lee C, Houh D, Kim H, Cho B, Kim Y, Yang YH, Min KH, Cho DH. Enhanced IL-18 expression in common skin tumors. Immunol Lett. 2001 Dec 3;79(3):215-9.

137. Park H.J., Kim J.E., Lee J.Y., Cho B.K., Lee W.J., Kim T., Yoon D., Cho D. Increased expression of IL-18 in cutaneous graft-versus-host disease // Immunol Lett. -2004. -V. 95. -P. 57-61.

138. Park S, Cheon S, Cho D. The dual effects of interleukin-18 in tumorprogression // Cell Mol Immunol.-2007.-4(5).-P.329-35.

139. Parnet P., Garka K.E., Bonnert T.P., Dower S.K., Sims J.E. IL-lRrp is a novel receptor-like molecule similar to the type I interl eukin-1 receptor and its homologues T1/ST2 and IL-1R AcP // J Biol Chem. -1996. -V. 271. -P. 3967-70.

140. Pechkovsky DV., Goldmann T, Vollmer E, et.al. Interleukin-18expression byalveolar epithelial cells typell in tuberculosisandsarcoidosis //FEMS Immunology & Medical Microbiology. 2006. -Vol. 46. - p. 30 - 38

141. Pietrzak A., Lecewicz-Torun B., Chodorowska G., Rolinski J. Interleukin-18 levels in the plasma of psoriatic patients correlate with the extent of skin lesions and the PASI score //Acta Derm Venereol. -2003. -V. 83. -P. 262-5.

142. Pirhonen J., Sareneva T., Kurimoto M., Julkunen I., Matikainen S. Virus infection activates IL-1 beta and IL-18 production in human macrophages by a caspase-1-dependent pathway // J Immunol. -1999. -V. 162. -P. 7322-9.

143. Plitz T., Saint-Mezard P., Satho M., Herren S., Waltzinger C., de Carvalho Bittencourt M., Kosco-Vilbois M.H., Chvatchko Y. IL -18 binding protein protects against contact hypersensitivity // J Immunol. -2003. -V. 171. -P. 116471.

144. Puren A.J., Fantuzzi G., Gu Y., Su M.S., Dinarello C.A. Interleukin-18 (IFNgamma-inducing factor) induces IL-8 and IL-lbeta via TNFalpha production from non-CD 14+ human blood mononuclear cells // Clin Invest. -1998. -V. 101.-P. 711-21.

145. Rajeswari D. N., Selvaraj P., Jawahar M.S., Adhilakshmi A.R et.al. Elevated percentage of perforin positive cells in active pulmonary tuberculosis // Indian J Med Res. -2006. -V. 123. p 687-690

146. Rapicetta M, Ferrari C, Levrero M. Viral determinants and host immune responses in the pathogenesis of HBV infection.// J Med Virol. -2002. Vol. 67.-p. 454-457.

147. Ray C.A., Black R.A., Kronheim S.R., Greenstreet T.A., Sleath P.R., Salvesen G.S., Pickup D.J. Viral inhibition of inflammation: cowpox virus encodes an inhibitor of the interleukin-1 beta converting enzyme // Cell. -1992. -V. 69. -P. 597-604.

148. Richter L., Thanavala Y., Arntzen C. et al. Production of hepatitis B surface antigen in transgenic plants for oral immuni-zation // Nature Biotechnol. -2000. -V. 18.-P. 1167-1171.

149. Robertson MJ, Mier JW, Logan T Clinical and biological effects of recombinant human interleukin-18 administered by intravenous infusion to patients with advanced cancer. Clin Cancer Res. 2006 Jul 15; 12(14 Pt 1):4265-73.

150. Rollwagen RM., Baqar S. Oral cytokine administration // Immunol Today.1996. -V. 17. -P. 548-5

151. Romero JF, Ibrahim GH, Renggli J, Himmelrich H, Graber P, Corradin G. IL-12p40-independent induction of protective immunity upon multiple Plasmodium berghei irradiated sporozoite immunizations // Parasite Immunol.-2007.-29(1 l).-P.541-8.

152. Rothe H., Hibino T., Itoh Y., Kolb H., Martin S. Systemic production of interferon-gamma inducing factor (IGIF) versus local IFN-gamma expression involved in the development of Thl insulitis in NOD mice // J Autoimmun.1997.-V. 10. -P. 251-6.

153. Rothe H., Jenkins N.A., Copeland N.G., Kolb H. Active stage of autoimmune diabetes is associated with the expression of a novel cytokine, IGIF, which is located near Idd2 // J Clin Invest. -1997. -V. 99. -P. 469-74.

154. Rothe H., Kolb H. The APC1 concept of type I diabetes // Autoimmunity.1998. -V. 27. -P. 179-84.

155. Russel C., Clarke L. Recombinant proteins for genetic disease // Clinical Genet. -1999 -V. 55. -P. 389-394.

156. Ryo K., Kamogawa Y., Ikeda I., Yamauchi K., Yonehara S., Nagata S., Hayashi N. Significance of Fas antigen-mediated apoptosis in human fulminant hepatic failure //Am J Gastroenterol. -2000. -V. 95. -P. 2047-55.

157. Sareneva T., Matikainen S., Kurimoto M., Julkunen I. Influenza A virus-induced IFN-alpha/beta and IL-18 synergistically enhance IFN-gamma gene expression in human T cells // J Immunol. -1998. -V. 160. -P. 6032-8.

158. Senkevich T.G., Koonin E.V., Bugert J.J., Darai G., Moss B. The genome of molluscum contagiosum virus: analysis and comparison with other poxviruses //Virology. -1997. -V. 233. -P. 19-42.

159. Sennikov S.V., Krysov S.V., Injelevskaya T.V., Silkov A.N., Grishina L.V., Kozlov V.A. Quantitative analysis of human immunoregulatory cytokines by electrochemiluminescence method // J Immunol Methods. -2000. -V. 275. -P. 81-8.

160. Shams H, Wizel B, Weis SE, Samten B, Barnes PF. Contribution of CD8(+) T cells to gamma interferon production in human tuberculosis // Infect Immun.-2001.-69(5).-P.3497-501

161. Shapiro L., Puren A.G., Barton H.A., Novick D., Su M.S., Dinarello C.A., Interleukin 18 stimulates HIV type 1 in monocytic cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1998. -V. 95. -P. 12550-12555.

162. Shigehara K, Shijubo N, Ohmichi M, Yamada G, et. a Increased levels of interleukin-18 in patients with pulmonary sarcoidosis. //Am J Respir Crit Care Med. 2000. - Vol.162, № 5. - p. 1979-82.

163. Shouval D, Ilan Y. Immunization against hepatitis B through adoptive transfer of immunity.//Intervirology. 1995. - Vol. 38(1-2). - p. 41-6.

164. Shouval D. Hepatitis B vaccines // J Hepatol.-2003.-39 Suppl 1.-P.70-6.

165. Smith V.P., Bryant N.A., Alcami A. Ectromelia, vaccinia and cowpox viruses encode secreted interleukin-18-binding proteins // J Gen Virol. -2000. -V. 81. -P. 1223-30.

166. Son Y.I., Dallal R.M., Mailliard R.B., Egawa S., Jonak Z.L., Lotze M.T. Interleukin-18 (IL-18) synergizes with IL-2 to enhance cytotoxicity, interferon-gamma production, and expansion of natural killer cells // Cancer Res. -2001. -V. 61.-P. 884-8.

167. Stenger S, Mazzaccaro RJ, Uyemura K, Cho S, Barnes PF, Rosat JP, Sette A, Brenner MB, Porcelli SA, Bloom BR, Modlin RL. Differential effects of cytolytic T cell subsets on intracellular infection //Science.-1997.-276(5319).-P.1684-7

168. Stober D, Schirmbeck R, Reimann J. IL-12/IL-18-dependent IFN-gamma release by murine dendritic cells // J Immunol.- 2001.-167(2).-P.957-65

169. Streatfield S., Jilka J., Hood E. et al. Plant-based vaccines: unique advantages // Vaccine. -2000. -V. 19. -P. 2742-2748

170. Strobel S. Immunity induced after a feed of antigen during early life: oral tolerance v. Sensitisation // Proc Nutr Soc. -2001. -V. 60. -P. 437-42

171. Sugama S., Cho B.P., Baker H., Joh T.H., Lucero J., Conti B. Neurons of the superior nucleus of the medial habenula and ependymal cells express IL-18 in rat CNS // Brain Res. -2002. -V. 958. -P. 1-9.

172. Sugawara I, Yamada H, Kaneko H, Mizuno S, Takeda K, Akira S. Role of interleukin-18 (IL-18) in mycobacterial infection in IL-18-gene-disrupted mice //Infect Immun. 1999. - V.67, № 5. - p. 2585-9.

173. Sun Y, Chen HY, Xin SJ.Effect of IL-18 on peripheral blood mononuclear cells of chronic hepatitis B and hepatitis B virus DNA released by HepG2.2.15 cell lines.// Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 2004 . - Vol. 3(2). - p. 230-4.

174. Szkaradkiewicz A., Jopek A., Wysocki J. Effects of IL-12 and IL-18 on HBcAg-specific cytokine production by CD4 T lymphocytes of children with chronic hepatitis B infection// Antiviral Res.- 2005.- Apr.- Vol. 66(1).- p. 2327.

175. Takada T, Suzuki E, Ishida T, Moriyama H, Ooi H, Hasegawa T, Tsukuda H, Gejyo F Polymorphism in RANTES chemokine promoter affects extent of sarcoidosis in a Japanese population.// Tissue Antigens. -2001. Vol. 58(5). -p. 293-8.

176. Takahashi H.K., Weitz-Schmidt G., Iwagaki H., Yoshino T., Tanaka N., Nishibori M. Hypothesis: the antitumor activities of statins may be mediated by IL-18. // J Leukoc Biol. -2006. -V. 80. -P. 215-6.

177. Tan J., Crucian B.E., Chang A.E., Aruga E., Aruga A., Dovhey S.E., Tanigawa K., Yu H. Interferon-gamma-inducing factor elicits antitumor immunity in association with interferon-gamma production // J Immunother. -1998. -V. 21. -P. 48-55.

178. Tanaka F., Hashimoto W., Okamura H., Robbins P.D., Lotze M.T., Tahara H. Rapid generation of potent and tumor-specific cytotoxic T lymphocytes by interleukin 18 using dendritic cells and natural killer cells // Cancer Res. -2000. -V. 60. -P. 4838-44.

179. Tanaka-Kataoka M., Kunikata T., Takayama S., Iwaki K., Ohashi K., Ikeda M., Kurimoto M. In vivo antiviral effect of interleukin 18 in a mouse model of vaccinia virus infection // Cytokine. -1999. -V. 11. -P. 593-9.

180. Tang TJ, Kwekkeboom J, Mancham S, et al. Intrahepatic CD8+ T-lymphocyte response is important for therapy-induced viral clearance in chronic hepatitis B infection.// J Hepatol. 2005. - Vol. 43(1) . - p. 45-52. Epub 2005 Apr 25.

181. Tascon RE, Soares CS, Ragno S, Stavropoulos E, Hirst EM, Colston MJ. Mycobacterium tuberculosis-activated dendritic cells induce protective immunity in mice // Immunology.-2000.-.-99(3).-P.473-80.

182. Thio CL, Carrington M, Marti D, et al. Class II HLA alleles and hepatitis B virus persistence in African Americans. //J Infect Dis. 1999. - Vol. 179. - p. 1004-1006.

183. Tominaga K., Yoshimoto T., Torigoe K., Kurimoto M., Matsui K., Hada T., Okamura H., Nakanishi K. IL-12 synergizes with IL-18 or IL-1 beta for IFN-gamma production from human T cells // Int Immunol. -2000. -V. 12. -P. 15160.

184. Tomura M., Zhou X.Y., Maruo S., Ahn H.J., Hamaoka T., Okamura H., Nakanishi K., Tanimoto T., Kurimoto M., Fujiwara H. A critical role for IL-18 in the proliferation and activation of NK1.1+ CD3- cells // J Immunol. -1998. -V. 160. -P. 4738-46.

185. Torigoe K., Ushio S., Okura T., Kobayashi S., Taniai M., Kunikata T., Murakami T., Sanou O., Kojima H., Fujii M., Ohta T., Ikeda M., Ikegami H.,

186. Kurimoto M. Purification and characterization of the human interleukin-18 receptor // J Biol Chem. -1997. -V. 272. -P. 25737-42.

187. Tracey K.J., Cerami A. Tumor necrosis factor, other cytokines and disease // Annu Rev Cell Biol. -1993. -V. 9. -P. 317-43.

188. Troseid M, Seljeflot I, Arnesen HThe role of interleukin-18 in the metabolic syndrome. Cardiovasc Diabetol. 2010 Mar 23;9:11.

189. Tsutsui H, Matsui K, Okamura H, Nakanishi K. Pathophysiological roles of interleukin-18 in inflammatory liver diseases.// Immunol Rev. 2000. - Vol. 174.-p. 192-209.

190. Tsutsui H., Nakanishi K., Matsui K., Higashino K., Okamura H., Miyazawa Y., Kaneda K. IFN-gamma-inducing factor up-regulates Fas ligand-mediated cytotoxic activity of murine natural killer cell clones // J Immunol. -1996. -V. 157. -P. 3967-73.

191. Ueno N., Kashiwamura S., Ueda H., Okamura H., Tsuji N.M., Hosohara K., Kotani J., Marukawa S. Role of interleukin 18 in nitric oxide production and pancreatic damage during acute pancreatitis. // Shock. -2005. -V. 24. -P. 564-70.

192. Vankayalapati R, Wizel B, Weis SE, Samten B, Girard WM, Barnes PF. Production of Interleukin-18 in Human Tuberculosis //The Journal of Infectious Diseases. 2000. -Vol. 182. - p.234-9

193. Wang W., Tanaka T., Okamura H., Sugita M., Higa S., Kishimoto T., Suemura M. // Interleukin-18 enhances the production of interleukin-8 by eosinophils. -2001.-V. 31.-P. 1010-6.

194. Wei X.Q., Leung B.P., Arthur H.M., Mclnnes I.B., Liew F.Y. Reduced incidence and severity of collagen-induced arthritis in mice lacking IL-18 // J Immunol. -2001. -V. 166. -P. 517-21.

195. Wen W., Zhang L., Xiao H. The transcription and expression of IL-18 gene in HBV infectors // Zhonghua Yi Xue ZaZhi. -2001. -V. 81. -P. 655-8.

196. Wong CK, Ho CY, Ko FW, Chan CH, Ho AS, Hui DS, Lam CW. Proinflammatory cytokines (IL-17, IL-6, IL-18 and IL-12) and Th cytokines (IFN-gamma, IL-4, IL-10 and IL-13) in patients with allergic asthma // Clin Exp Immunol.- 200l.-125(2).-P. 177-83.

197. Worku S, Hofit DF. Differential effects of control and antigen-specific T cells on intracellular mycobacterial growth // Infect Immun.-2003.-71 (4).-P. 1763-73

198. Xiang Y., Moss B. IL-18 binding and inhibition of interferon gamma induction by human poxvirus-encoded proteins // Proc Natl Acad Sei U S A. -1999.-V. 96. -P. 11537-42.

199. Xu B., Aoyama K., Yu S., Kitani A., Okamura H., Kurimoto M., Matsuyama T., Matsushita T. Expression of interleukin-18 in murine contact hypersensitivity // J Interferon Cytokine Res.-1998.-V. 18. -P. 653-9.

200. Xu D., Chan W.L., Leung B.P., Hunter D., Schulz K., Carter R.W., Mclnnes I.B., Robinson J.H., Liew F.Y. Selective expression and functions of interleukin 18 receptor on T helper (Th) type 1 but not Th2 cells // J Exp Med.-1998.-V. 188. -P. 1485-92.

201. Xu D, Trajkovic V, Hunter D, Leung BP, Schulz K, Gracie JA, Mclnnes IB, Liew FY. IL-18 induces the differentiation of Thl or Th2 cells depending upon cytokine milieu and genetic background.//Eur J Immunol.-2000.-30(11).-P.3147-56

202. Yamada G, Shijubo N, Shigehara K, Okamura H, Kurimoto M, Abe S. Increased Levels of Circulating Interleukin-18 in Patients with Advanced

203. Tuberculosis // Am J Respir Crit Care Med. 2000. - Vol.161, № 6. - p. 17869.

204. Yamaoka-Tojo M, Tojo T, Wakaume K, Kameda R, Nemoto S, Takahira N, Masuda T, Izumi T. Circulating interleukin-18: A specific biomarker for atherosclerosis-prone patients with metabolic syndrome. Nutr Metab (Lond). 2011 Jan 20;8:3.

205. Yang H., Leland J.K., Yost D., Massey R.J. Electrochemiluminescence: a new diagnostic and research tool. ECL detection technology promises scientists new "yardsticks" for quantification //Biotechnology (NY). -1994. -V. 12. -P. 193194.

206. Yoon J.W., Jun H.S., Santamaría P. Cellular and molecular mechanisms for the initiation and progression of beta cell destruction resulting from the collaboration between macrophages and T cells //Autoimmunity. -1998. -V. 27. -P. 109-22.

207. Yoshikai Y., Miake S., Matsumoto T., Nomoto K., Takeya K. Effect of stimulation and blockade of mononuclear phagocyte system on the delayed footpad reaction to SRBC in mice // Immunology. -1979. -V. 38. -P. 577-83.

208. Yoshimoto T., Mizutani H., Tsutsui H., Noben-Trauth N., Yamanaka K., Tanaka M, Izumi S., Okamura H., Paul W.E., Nakanishi K. IL-18 induction of IgE: dependence on CD4+ T cells, IL-4 and STAT6 // Nat Immunol. -2000. -V. l.-P. 132-7.

209. Zhang PA, Wu JM, Li Y, Yang XS. Association of polymorphisms of interleukin-18 gene promoter region with chronic hepatitis B in Chinese Han population.//World J Gastroenterol. 2005. - Vol. 11(11). - p. 1594-8.

210. Zhao Y.X., Tarkowski A.,Impact of interferon-gamma receptor deficiency on experimental Staphylococcus aureus septicemia and arthritis // J Immunol. -1995.-V. 155.-P. 5736-42.

211. Zheng B.J., Zhou J., Qu D., Siu K.L., Lam T.W. Selective functional deficit in dendritic cell~T cell interaction is a crucial mechanism in chronic hepatitis B virus infection // J Viral Hepat. 2004. - Vol. 11. - p. 217-24.